CN114848617A - 一种中药单体姜黄素在制备治疗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药学技术领域，公开了一种中药单体姜黄素在制备治疗肿瘤药物中的应用。中药单体姜黄素在制备肿瘤药物中肿瘤细胞抑制浓度为320μM；肿瘤细胞凋亡诱导浓度为10μM和20μM。肿瘤细胞迁移浓度为10μM和20μM。本发明的中药单体通过多靶位调控PI3K/AKT、MEK5/ERK5两条关键信号通路，发挥抗前列腺癌进展的作用，达到增加治疗效果，减轻不良反应，提高生活质量，抑制激素非依赖性前列腺癌细胞增殖、侵袭、转移的效果。本发明的中药单体成分单一、明确，对于肿瘤的转移和复发也有显著的抑制作用，其抗肿瘤效果明确可靠。

Description

一种中药单体姜黄素在制备治疗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于医药学技术领域，尤其涉及一种中药单体姜黄素在制备治疗前列腺肿瘤药物中的应用。

背景技术

前列腺癌在欧美国家成年男性中一直都是最常见的癌症之一，位于男性泌尿系统恶性肿瘤中的首位。随着我国生活水平的提高和筛查技术的普及，前列腺癌的早期诊断率逐渐升高，近10年来我国前列腺癌发病率骤增，已在我国中老年男性中已成为一种常见疾病。目前已显示出几种可有效控制局部前列腺癌以及激素敏感性前列腺癌的手段，包括激素治疗，前列腺切除术和放疗。然而，随着治疗的进行，激素依赖性前列腺癌逐渐发展为不依赖雄激素的前列腺癌，尽管雄激素保持在去势水平，肿瘤细胞仍持续生长，疾病进展到去势抵抗阶段。

目前用于去势抵抗性前列腺癌的疗法主要包括细胞毒剂(如多西他赛/卡巴他赛)、靶向AR信号传导的新型激素疗法(如醋酸阿比特龙和恩杂鲁胺)、以镭223为代表的抗骨转移治疗、免疫疗法(如sipuleucel-T、帕博丽珠单抗)、靶向治疗(如奥拉帕尼)等治疗手段和不同药物联合治疗方式。尽管有多种可选择的治疗手段，转移性疾病的治疗最终受到耐药性的限制，转移性去势抵抗性前列腺癌仍然无法治愈，患者中位生存期不超过12个月，最终会死于前列腺癌。

不论新兴治疗手段和药物研发进展如何，前列腺癌的全球负担都在不断增加。因此，研究新型有效抗癌分子和相关途径来解决去势抵抗性前列腺癌的发生、发展、延长预期寿命并改善前列腺癌患者的生活质量成为当前热点。中草药的使用已有数千年的历史,对于各种疾病包括肿瘤的治疗都取得了十分宝贵的人体经验，丰富的中草药资源也为寻找新抗癌药提供了重要的物质基础。近年来，植物等天然产物作为抗肿瘤药物的机制研究已成为热点，这主要是由于它们在抗癌药物开发中的有效性以及较低的毒性。大量临床实践证据表明，中草药在前列腺癌的综合治疗中，可以提升人体正气，稳固肿瘤病灶，防止前列腺癌细胞的转移，使患者的前列腺特异性抗原水平下降，最终改善前列腺癌患者的生活质量，延长生存期。

因此，从丰富的中草药资源宝库中挖掘出有效中药单体并明确其作用机制具有重大的意义。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)现有技术中前列腺癌疾病尤其去势抵抗性前列腺癌治疗药物中存在治疗效果差。

(2)现有技术中前列腺癌疾病治疗药物没有结合姜黄素的特性在制备肿瘤起始和进展中干扰癌症生长药物中进行应用。

解决以上问题及缺陷的难度为：前列腺癌进展到去势抵抗阶段预示着生存时间减少、生活质量降低，现有治疗方式疗效有限。中药具有多靶点的效应，但中药复方成分复杂，具体作用机制不明确，不容易被西方国家接受。姜黄素是中药单体成分，在前列腺癌中抗癌作用显著，但通过口服的生物利用度低。

解决以上问题及缺陷的意义为：本发明中姜黄素是从姜科植物姜黄的干燥根茎提取的一种多酚，是姜黄素家族最重要的组成部分之一，能够影响和调节多种分子靶点和信号传导途径。美国国家癌症研究所将姜黄素提名为抗癌药，在包括肺癌、乳腺癌、血液肿瘤、胃癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌等恶性肿瘤中都有很好的治疗作用。姜黄素可以在肿瘤起始和进展中干扰癌症生长，参与诱变多条生物学途径发挥抗肿瘤作用，如癌基因的表达，细胞周期的调控，细胞的凋亡和转移等。本发明可以更好地提高前列腺癌的治疗效果，还可以推动中医药的国际化与现代化。

发明内容

为克服相关技术中存在的问题，本发明公开实施例提供了一种中药单体姜黄素在制备治疗前列腺肿瘤药物中的应用。

所述技术方案如下：一种中药单体姜黄素在制备治疗肿瘤药物中的用途。

在一实施例中，所述中药单体姜黄素分子式结构如下式(Ⅰ)：

在一实施例中，所述中药单体姜黄素在制备肿瘤药物中肿瘤细胞抑制浓度为300～400μM。优选320μM。

所述中药单体姜黄素在制备肿瘤药物中肿瘤细胞凋亡诱导浓度为5～30μM。优选10μM和20μM。

所述中药单体姜黄素在制备肿瘤药物中肿瘤细胞迁移浓度为5～30μM。优选10μM和20μM。

本发明的另一目的在于提供一种中药单体姜黄素在制备治疗前列腺肿瘤药物中的应用。

在一实施例中，所述中药单体姜黄素分子式结构如下式(Ⅰ)：

所述中药单体姜黄素在制备前列腺肿瘤药物中肿瘤细胞抑制浓度为300～400μM；优选320μM。

所述中药单体姜黄素在制备前列腺肿瘤药物中肿瘤细胞凋亡诱导浓度为5～30μM；优选10μM和20μM。

所述中药单体姜黄素在制备肿瘤药物中肿瘤细胞迁移浓度为5～30μM。优选10μM和20μM。

本发明的另一目的在于提供一种所述用途中中药单体姜黄素在制备用于抑制肿瘤细胞增殖、肿瘤细胞凋亡、肿瘤细胞迁移药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述用途中中药单体姜黄素与其他药物联合制备肿瘤药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述用途中中药单体姜黄素制备的可注射流体、气雾剂、乳膏、凝胶剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、透皮贴剂或赋形剂。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：

本发明通过文献整理调研，初筛出中药单体姜黄素，进行多次实验研究，结果发现本发明中药单体姜黄素在抑制前列腺癌肿瘤细胞增殖、迁移和促进凋亡方面发挥了显著的作用，提供一种姜黄素的中药单体在制备治疗前列腺肿瘤药物中的应用。其抗癌作用具体机制明确，通过下调PI3K/AKT、MEK5/ERK5两条关键信号通路关键分子的表达发挥作用。对于恶性肿瘤的防止意义重大，在应用于制备治疗前列腺肿瘤药物方面具有广阔的前景。

本发明的中药单体成分单一、明确，对前列腺癌细胞增殖具有抑制作用且呈浓度依赖性增长；对凋亡诱导作用呈浓度依赖性增长；对迁移能力抑制作用呈浓度依赖性增长。所述中药单体疗效好，使用方便，安全无毒副作用，适用于前列腺癌各个阶段。本发明揭示了姜黄素对于前列腺癌肿瘤细胞起到杀伤作用的同时，对于肿瘤的转移和复发也有显著的抑制作用，其抗肿瘤效果明确可靠。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。

图1是本发明实施例提供的中药单体姜黄素在肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移中验证药效的方法流程图(实验流程图)；

图2是本发明实施例提供的姜黄素抑制RWPE-1细胞增殖图。图2中：图2(a)RWPE-1细胞在经过姜黄素处理24小时以后，姜黄素在浓度为0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM时各组在450nm的吸光度分别为1.40±0.03、1.34±0.03、1.32±0.03、1.32±0.03、1.31±0.03、1.31±0.03、1.29±0.03、1.28±0.03，与0μM组相比图；图2(b)姜黄素在浓度为5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、16μM、320μM时对RWPE-1细胞增殖的抑制率分别为：(5.31±0.41)％、(6.79±0.33)％、(6.81±0.97)％、(7.13±0.31)％、(7.52±0.68)％、(8.75±0.24)％、(9.83±0.50)％，随着姜黄素浓度增加，对细胞抑制率也增加效果图一；图2(c)姜黄素在浓度为5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、16μM、320μM时对RWPE-1细胞增殖的抑制率分别为：(5.31±0.41)％、(6.79±0.33)％、(6.81±0.97)％、(7.13±0.31)％、(7.52±0.68)％、(8.75±0.24)％、(9.83±0.50)％，随着姜黄素浓度增加，对细胞抑制率也增加效果图二；

图3是本发明实施例提供的姜黄素促进RWPE-1细胞凋亡图；图3中：图3(a))0μM、10μM、20μMRWPE-1细胞凋亡柱状图；图3(b)0μMRWPE-1细胞凋亡图；图3(c)10μMRWPE-1细胞凋亡图；图3(d)20μMRWPE-1细胞凋亡图。

图4是本发明实施例提供的姜黄素抑制LNCaP细胞增殖图；

图5是本发明实施例提供的姜黄素促进LNCaP细胞凋亡图；图5中：图5(a))0μM、10μM、20μMLNCaP细胞凋亡柱状图；图5(b)0μMLNCaP细胞凋亡图；图5(c)10μMLNCaP细胞凋亡图；图5(d)20μMLNCaP细胞凋亡图；

图6是本发明实施例提供的姜黄素抑制LNCaP细胞迁移图；图6中，图6(a)0μM、10μM、20μMLNCaP细胞迁移柱状图；图6(b)空白组0h细胞划痕；图6(c)空白组24h细胞划痕；图6(d)10μM组0h细胞划痕；图6(e)10μM组24h细胞划痕；图6(f)20μM组0h细胞划痕；图6(g)20μM组24h细胞划痕；

图7是本发明实施例提供的姜黄素抑制C4-2细胞增殖图；

图8是本发明实施例提供的姜黄素促进C4-2细胞凋亡图；图8中：图8(a))0μM、10μM、20μMC4-2细胞凋亡柱状图；图8(b)0μMC4-2细胞凋亡图；图8(c)10μMC4-2细胞凋亡图；图8(d)20μMC4-2细胞凋亡图；

图9是本发明实施例提供的姜黄素抑制C4-2细胞迁移图；图9中，图9(a)0μM、10μM、20μMC4-2细胞迁移柱状图；图9(b)空白组0h细胞划痕；图9(c)空白组24h细胞划痕；图9(d)10μM组0h细胞划痕；图9(e)10μM组24h细胞划痕；图9(f)20μM组0h细胞划痕；图9(g)20μM组24h细胞划痕。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本发明所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明提供一种中药单体姜黄素在制备治疗肿瘤药物中的用途。

在一优选实施例中，所述中药单体姜黄素分子式结构如下式(Ⅰ)：

在一实施例中，所述中药单体姜黄素在制备肿瘤药物中肿瘤细胞抑制浓度为300～400μM。优选320μM。

所述中药单体姜黄素在制备肿瘤药物中肿瘤细胞凋亡诱导浓度为5～30μM。优选10μM和20μM。

所述中药单体姜黄素在制备肿瘤药物中肿瘤细胞迁移浓度为5～30μM。优选10μM和20μM。

本发明还提供一种中药单体姜黄素在制备治疗前列腺肿瘤药物中的应用。

如图1所示，本发明提供一种中药单体姜黄素在肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移中验证药效的方法，包括：

S101，细胞培养：细胞的复苏、细胞培养以及细胞的传代。

S102，抑制RWPE-1肿瘤细胞增殖、肿瘤细胞凋亡试验。

S103，抑制LNCaP肿瘤细胞增殖、肿瘤细胞凋亡、肿瘤细胞迁移试验。

S104，抑制C4-2肿瘤细胞增殖、肿瘤细胞凋亡、肿瘤细胞迁移试验。

下面结合试验及实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

试验例1

姜黄素抑制RWPE-1细胞的增殖、促进RWPE-1细胞的凋亡

1.实验材料

1.1实验细胞

RWPE-1细胞(非致瘤性人前列腺上皮细胞)。

1.2实验药物

姜黄素(成都埃法生物科技有限公司，CAS号：458-37-7)。

1.3实验主要试剂及仪器

2.细胞培养

2.1细胞的复苏

从-80℃冰箱中取出冻存的细胞，迅速将冻存管放入已经预热的37℃的水浴锅，并使其摇动，待冻存管中液体融化，外喷酒精消毒，放入超净台；细心的吸出细胞悬液放入已装有10mL培养液的离心管中，稍吹打细胞，放入离心机1000rpm离心5min，弃上清液，再用8-10mL培养液重新吹打细胞，并移入培养皿，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2.2细胞培养

将细胞用含10％胎牛血清、1％双抗(青霉素-链霉素混合溶液)、89％PRMI1640培养基完全培养液，置于37℃含5％CO₂的恒温培养箱中培养。

2.3细胞的传代

将培养皿从37℃、5％CO₂培养箱小心移入超净台，将培养皿中全部培养液吸出，并加入2mlPBS(phosphatebufferedsolution，磷酸盐缓冲溶液)，轻柔洗涤，吸出PBS，然后加入约1mL0.25％胰酶，将培养瓶置于37℃、5％CO₂培养箱2分钟使之进行消化。然后在倒置显微镜下进行观察，待细胞质回缩、细胞由梭形变成圆形时，在培养皿中加入4mL培养液使之终止消化；用移液器反复吹打细胞使之悬浮，然后将其装入15mL离心管中，在离心机中以1000rpm离心5min，弃上清液，再重新加入8mL细胞培养液，摇晃均匀，放入37℃、5％CO2培养箱中。

3.姜黄素对RWPE-1细胞生物学行为的影响

3.1.细胞增殖实验

选取生长状况良好、对数期的RWPE-1细胞，用0.25％胰酶消化，继而用完全培养液重悬细胞，然后进行细胞计数；在96孔板加进细胞悬液100μL(细胞数为5×10³个)，边缘用无菌PBS填充，置37℃含5％CO₂细胞培养箱中培养细胞24h；24h后，将板中的培养液去掉，根据实验分组加入不同浓度药物，另设实验对照组(含培养液和细胞)、空白对照组(只加正常培养液，不加细胞)、160μM姜黄素药物组吸光度扣除组(只加正常培养液和姜黄素溶液，不加细胞)、320μM姜黄素药物组吸光度扣除组(只加正常培养液姜黄素溶液，不加细胞)，每组设3个平行孔，将96孔板置于37℃含5％CO₂细胞培养箱中继续培养24h；给药24h后，然后在每个孔中加入10μL浓度为5mg/ml的CCK-8溶液，注意避光，再将细胞培养2.5h；利用酶联免疫检测仪，并设置波长等于450nm测量各个孔的吸光度的数值；计算细胞抑制率，细胞抑制率(％)＝(对照组-实验组)/(对照组-空白组)*100％；重复3次，结果取平均值。如图2是姜黄素抑制RWPE-1细胞增殖图。其中，RWPE-1细胞在经过姜黄素处理24小时以后，姜黄素在浓度为0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM时各组在450nm的吸光度分别为1.40±0.03、1.34±0.03、1.32±0.03、1.32±0.03、1.31±0.03、1.31±0.03、1.29±0.03、1.28±0.03，与0μM组相比，每组OD值差异均有统计学意义(P＜0.05)，具体结果见图2(a)。姜黄素在浓度为5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、16μM、320μM时对RWPE-1细胞增殖的抑制率分别为：(5.31±0.41)％、(6.79±0.33)％、(6.81±0.97)％、(7.13±0.31)％、(7.52±0.68)％、(8.75±0.24)％、(9.83±0.50)％，随着姜黄素浓度增加，对细胞抑制率也增加，最大药物浓度为320μM，最高抑制率为(9.83±0.50)％，姜黄素对RWPE-1细胞作用的IC50未得出，具体结果图2(b)、图2(c)。

3.2.细胞凋亡实验

选取生长状况良好、对数期的RWPE-1细胞，用0.25％胰酶消化，继而用完全培养液重悬细胞，然后进行细胞计数；在6孔板的空白组和实验组对应孔加入2.5ml细胞数为3×10⁵个的细胞悬液，空白组和实验组周边的孔均加入2mlPBS，置37℃含5％CO₂细胞培养箱中培养细胞24h(使细胞贴壁完全)；给药：24h后，将板中的培养液去掉，根据实验分组加入不同浓度药物，将6孔板置于37℃含5％CO₂细胞培养箱中继续培养24h；将每个孔中的培养液收集到15ml离心管中，随后用无菌PBS轻柔清洗细胞1-2次，每孔内加入0.3ml胰蛋白酶，待镜下观察细胞形态开始回缩变圆，随后加入1ml的完全培养基终止消化，收集细胞；将细胞用离心机在800r/min条件下离心3min，倒掉上清液；加入无菌PBS缓冲液重悬细胞并进行细胞计数，将1×10⁵个细胞用离心机在800r/min的条件下离心3min，倒掉上清液；使用冷PBS缓冲液洗细胞两次，再用1XBindingBuffer缓冲液制成100μL细胞悬液加入Falcon试管中；在冰上避光分别加入AnnexinV和PI染料各5ul，再向各实验管中分别加入1xBindingBuffer缓冲液400ul；避光孵育10-20min，用流式细胞仪进行检测；重复3次，结果取平均值。如图3是姜黄素促进RWPE-1细胞凋亡图。图3(a))0μM、10μM、20μMRWPE-1细胞凋亡柱状图；图3(b)0μMRWPE-1细胞凋亡图；图3(c)10μMRWPE-1细胞凋亡图；图3(d)20μMRWPE-1细胞凋亡图。其中，RWPE-1细胞在经过10μM、20μM姜黄素处理24小时以后，对早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率都有促进作用。空白组、10μM组、20μM组早期凋亡率分别为：(0.87±0.04)％、(3.95±1.82)％、(4.79±0.82)％，随着姜黄素浓度升高，凋亡率增加，10μM组、20μM组与空白组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，20μM组与10μM组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。空白组、10μM组、20μM组晚期凋亡率分别为：(3.20±0.35)％、(4.35±2.11)％、(8.24±0.63)％，随着姜黄素浓度升高，凋亡率增加，10μM组与空白组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，20μM组与空白组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，20μM组与10μM组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。空白组、10μM组、20μM组总凋亡率分别为：(4.07±0.38)％、(8.30±0.43)％、(13.03±1.45)％，随着姜黄素浓度升高，凋亡率增加，10μM组、20μM组与空白组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，20μM组与10μM组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。具体结果见图3(a)、图3(b)、图3(c)、图3(d)。

4.实验结果

姜黄素对RWPE-1细胞的增殖具有抑制作用且抑制作用呈浓度依赖性增长，姜黄素浓度在320μM时对细胞增殖抑制作用最强，对RWPE-1细胞最高抑制率为(9.83±0.50)％；姜黄素对RWPE-1细胞的凋亡诱导作用呈浓度依赖性增长，10μM姜黄素作用于RWPE-1细胞的凋亡率为：(8.30±0.43)％；20μM姜黄素作用于RWPE-1细胞的凋亡率为：(13.03±1.45)％。

试验例2

姜黄素抑制LNCaP细胞的增殖、促进LNCaP细胞的凋亡、抑制LNCaP细胞的迁移

1.实验材料

1.1实验细胞

LNCaP细胞(激素依赖性人前列腺癌细胞)。

1.2实验药物

姜黄素(成都埃法生物科技有限公司，CAS号：458-37-7)。

1.3实验主要试剂及仪器

同上

2.细胞培养

同上

3.姜黄素对LNCaP细胞生物学行为的影响

3.1细胞增殖实验

选取生长状况良好、对数期的LNCaP细胞，用0.25％胰酶消化，继而用完全培养液重悬细胞，然后进行细胞计数；在96孔板加进细胞悬液100μL(细胞数为5×10³个)，边缘用无菌PBS填充，置37℃含5％CO₂细胞培养箱中培养细胞24h；24h后，将板中的培养液去掉，根据实验分组加入不同浓度药物，另设实验对照组(含培养液和细胞)、空白对照组(只加正常培养液，不加细胞)、160μM姜黄素药物组吸光度扣除组(只加正常培养液和姜黄素溶液，不加细胞)、320μM姜黄素药物组吸光度扣除组(只加正常培养液姜黄素溶液，不加细胞)，每组设3个平行孔，将96孔板置于37℃含5％CO₂细胞培养箱中继续培养24h；

给药24h后，然后在每个孔中加入10μL浓度为5mg/ml的CCK-8溶液，注意避光，再将细胞培养2.5h；利用酶联免疫检测仪，并设置波长等于450nm测量各个孔的吸光度的数值；计算细胞抑制率，细胞抑制率(％)＝(对照组-实验组)/(对照组-空白组)*100％；重复3次，结果取平均值。如图4所示是姜黄素抑制LNCaP细胞增殖图。

其中，LNCaP细胞在经过姜黄素处理24小时以后，在姜黄素浓度为0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM时各组在450nm的吸光度分别为1.79±0.05、1.62±0.04、1.57±0.06、1.47±0.05、1.13±0.02、0.92±0.01、0.33±0.02、0.18±0.02，与0μM组相比，每组OD值差异均有显著统计学意义(P＜0.001)，具体结果见图4(a)。姜黄素在浓度为5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、16μM、320μM时对LNCaP细胞增殖的抑制率分别为：(10.28±0.86)％、(14.94±1.34)％、(19.05±0.69)％、(39.43±0.57)％、(51.88±2.17)％、(87.55±1.34)％、(96.78±1.30)％，随着姜黄素浓度增加，对细胞抑制率也增加，最大药物浓度为320μM，最高抑制率为(96.78±1.30)％，黄素对LNCaP细胞作用的IC50为56.09μM，具体结果见图4(b)、图4(c)。

3.2细胞凋亡实验

选取生长状况良好、对数期的LNCaP细胞，用0.25％胰酶消化，继而用完全培养液重悬细胞，然后进行细胞计数；在6孔板的空白组和实验组对应孔加入2.5ml细胞数为3×10⁵个的细胞悬液，空白组和实验组周边的孔均加入2mlPBS，置37℃含5％CO2细胞培养箱中培养细胞24h(使细胞贴壁完全)；给药：24h后，将板中的培养液去掉，根据实验分组加入不同浓度药物，将6孔板置于37℃含5％CO₂细胞培养箱中继续培养24h；将每个孔中的培养液收集到15ml离心管中，随后用无菌PBS轻柔清洗细胞1-2次，每孔内加入0.3ml胰蛋白酶，待镜下观察细胞形态开始回缩变圆，随后加入1ml的完全培养基终止消化，收集细胞；将细胞用离心机在800r/min条件下离心3min，倒掉上清液；加入无菌PBS缓冲液重悬细胞并进行细胞计数，将1×10⁵个细胞用离心机在800r/min的条件下离心3min，倒掉上清液；使用冷PBS缓冲液洗细胞两次，再用1XBindingBuffer缓冲液制成100μL细胞悬液加入Falcon试管中；在冰上避光分别加入AnnexinV和PI染料各5ul，再向各实验管中分别加入1xBindingBuffer缓冲液400ul；避光孵育10-20min，用流式细胞仪进行检测；重复3次，结果取平均值。

如图5所示是姜黄素促进LNCaP细胞凋亡图。图5中：图5(a))0μM、10μM、20μMLNCaP细胞凋亡柱状图；图5(b)0μMLNCaP细胞凋亡图；图5(c)10μMLNCaP细胞凋亡图；图5(d)20μMLNCaP细胞凋亡图。

其中，LNCaP细胞在经过10μM、20μM姜黄素处理24小时以后，对早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率都有促进作用。空白组、10μM组、20μM组早期凋亡率分别为：(4.24±0.94)％、(6.64±1.07)％、(10.12±2.76)％，随着姜黄素浓度升高，凋亡率增加，10μM组与空白组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，20μM组与空白组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，20μM组与10μM组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。空白组、10μM组、20μM组晚期凋亡率分别为：(4.40±0.86)％、(5.70±0.86)％、(15.20±0.89)％，随着姜黄素浓度升高，凋亡率增加，10μM组与空白组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，20μM组与空白组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，20μM组与10μM组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。空白组、10μM组、20μM组总凋亡率分别为：(8.64±0.27)％、(12.34±0.21)％、(25.32±1.89)％，随着姜黄素浓度升高，凋亡率增加，10μM组、20μM组与空白组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，20μM组与10μM组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。具体结果见图5所示是姜黄素促进LNCaP细胞凋亡图。图5中：图5(a))0μM、10μM、20μMLNCaP细胞凋亡柱状图；图5(b)0μMLNCaP细胞凋亡图；图5(c)10μMLNCaP细胞凋亡图；图5(d)20μMLNCaP细胞凋亡图。

3.3划痕迁移实验

在6孔板对照组和实验组对应孔的背后，用标记笔划5条横穿孔且间隔0.5～1cm的均匀横线；选取生长状况良好、对数期的LNCaP细胞，0.25％胰酶消化，继而用培养基重悬细胞，然后进行细胞计数；在6孔板加进细胞悬液2.5ml(细胞数为5×10⁵个)，其余孔用无菌PBS填充，置37℃含5％CO₂细胞培养箱中培养细胞24h(使细胞贴壁完全)；细胞培养24h后，用垂直于6孔板背后的横线且垂直于直尺的200ul枪头进行划痕；PBS洗细胞3次，去除划下的细胞；对照组加入2.5ml无血清1640培养基，药物组加入2.5ml10uM、20uM姜黄素无血清1640培养基；将6孔板置于37℃5％CO₂培养箱培养。在0、24h时间点将6孔板置于100倍倒置显微镜下拍照；进行数据分析。如图6所示是姜黄素抑制LNCaP细胞迁移图。

其中，LNCaP细胞在经过姜黄素处理24小时以后，随着姜黄素浓度升高，细胞迁移距离减少，姜黄素在浓度为0μM、10μM、20μM时各组细胞的迁移距离分别为(583.01±18.66)μm、(368.24±17.03)μm、(259.81±12.25)μm，20μM组与10μM组细胞迁移距离与空白组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，20μM组细胞迁移距离与10μM组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，具体结果见图6(a)0μM、10μM、20μMLNCaP细胞迁移柱状图；图6(b)空白组0h细胞划痕；图6(c)空白组24h细胞划痕；图6(d)10μM组0h细胞划痕；图6(e)10μM组24h细胞划痕；图6(f)20μM组0h细胞划痕；图6(g)20μM组24h细胞划痕。

4.实验结果

姜黄素对LNCaP细胞的增殖具有抑制作用且抑制作用呈浓度依赖性增长，姜黄素浓度在320μM时对细胞增殖抑制作用最强，对LNCaP细胞最高抑制率为(96.78±1.30)％；姜黄素对LNCaP细胞的凋亡诱导作用呈浓度依赖性增长，10μM姜黄素作用于LNCaP细胞的凋亡率为：(12.34±0.21)％；20μM姜黄素作用于LNCaP细胞的凋亡率为：(25.32±1.89)％；姜黄素可有效抑制LNCaP细胞的迁移能力，且抑制作用呈浓度依赖性增长。空白组、10μM组、20μM组，LNCaP细胞的迁移距离分别为(583.01±18.66)μm、(368.24±17.03)μm、(259.81±12.25)μm。10μM组姜黄素对LNCaP细胞的迁移的抑制率为：36.84％；20μM组姜黄素对LNCaP细胞的迁移的抑制率为：55.44％。

试验例3姜黄素抑制C4-2细胞的增殖、促进C4-2细胞的凋亡、抑制4-2细胞的迁移

1.实验材料

1.1实验细胞

C4-2细胞(激素非依赖性人前列腺癌细胞)，购自于天津泰润隆科技有限公司。

1.2实验药物

姜黄素(成都埃法生物科技有限公司，CAS号：458-37-7)。

1.3实验主要试剂及仪器

同上

2.细胞培养

同上

3.姜黄素对C4-2细胞生物学行为的影响

3.1.细胞增殖实验

选取生长状况良好、对数期的C4-2细胞，用0.25％胰酶消化，继而用完全培养液重悬细胞，然后进行细胞计数；在96孔板加进细胞悬液100μL(细胞数为5×10³个)，边缘用无菌PBS填充，置37℃含5％CO₂细胞培养箱中培养细胞24h；24h后，将板中的培养液去掉，根据实验分组加入不同浓度药物，另设实验对照组(含培养液和细胞)、空白对照组(只加正常培养液，不加细胞)、160μM姜黄素药物组吸光度扣除组(只加正常培养液和姜黄素溶液，不加细胞)、320μM姜黄素药物组吸光度扣除组(只加正常培养液姜黄素溶液，不加细胞)，每组设3个平行孔，将96孔板置于37℃含5％CO₂细胞培养箱中继续培养24h；

给药24h后，然后在每个孔中加入10μL浓度为5mg/ml的CCK-8溶液，注意避光，再将细胞培养2.5h；利用酶联免疫检测仪，并设置波长等于450nm测量各个孔的吸光度的数值；计算细胞抑制率，细胞抑制率(％)＝(对照组-实验组)/(对照组-空白组)*100％；重复3次，结果取平均值。如图7所示是姜黄素抑制C4-2细胞增殖图。

其中，C4-2细胞在经过姜黄素处理24小时以后，在姜黄素浓度为0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM、320μM时各组在450nm的吸光度分别为1.08±0.04、0.93±0.03、0.89±0.02、0.82±0.03、0.75±0.03、0.55±0.01、0.46±0.01、0.19±0.01，与0μM组相比，每组OD值差异均有显著统计学意义(P＜0.001)，具体结果见图7(a)。姜黄素在浓度为5μM、10μM、20μM、40μM、80μM、16μM、320μM时对C4-2细胞增殖的抑制率分别为：(15.49±0.25)％、(19.67±1.33)％、(27.26±0.63)％、(34.15±0.23)％、(55.60±1.08)％、(65.01±0.99)％、(92.15±1.32)％，随着姜黄素浓度增加，对细胞抑制率也增加，最大药物浓度为320μM，最高抑制率为(92.15±1.32)％，姜黄素对C4-2细胞作用的IC50为61.49μM，具体结果见图7(b)、图7(c)。

3.2.细胞凋亡实验

选取生长状况良好、对数期的C4-2细胞，用0.25％胰酶消化，继而用完全培养液重悬细胞，然后进行细胞计数；在6孔板的空白组和实验组对应孔加入2.5ml细胞数为3×10⁵个的细胞悬液，空白组和实验组周边的孔均加入2mlPBS，置37℃含5％CO2细胞培养箱中培养细胞24h(使细胞贴壁完全)；给药：24h后，将板中的培养液去掉，根据实验分组加入不同浓度药物，将6孔板置于37℃含5％CO₂细胞培养箱中继续培养24h；将每个孔中的培养液收集到15ml离心管中，随后用无菌PBS轻柔清洗细胞1-2次，每孔内加入0.3ml胰蛋白酶，待镜下观察细胞形态开始回缩变圆，随后加入1ml的完全培养基终止消化，收集细胞；将细胞用离心机在800r/min条件下离心3min，倒掉上清液；加入无菌PBS缓冲液重悬细胞并进行细胞计数，将1×10⁵个细胞用离心机在800r/min的条件下离心3min，倒掉上清液；使用冷PBS缓冲液洗细胞两次，再用1XBindingBuffer缓冲液制成100μL细胞悬液加入Falcon试管中；在冰上避光分别加入AnnexinV和PI染料各5ul，再向各实验管中分别加入1xBindingBuffer缓冲液400ul；避光孵育10-20min，用流式细胞仪进行检测；重复3次，结果取平均值。

其中，C4-2细胞在经过10μM、20μM姜黄素处理24小时以后，对早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率都有促进作用。空白组、10μM组、20μM组早期凋亡率分别为：(3.92±0.50)％、(5.56±0.72)％、(10.71±2.63)％，随着姜黄素浓度升高，凋亡率增加，10μM组与空白组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，20μM组与空白组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，20μM组与10μM组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。空白组、10μM组、20μM组晚期凋亡率分别为：(2.62±0.23)％、(5.11±0.61)％、(8.56±2.80)％，随着姜黄素浓度升高，凋亡率增加，10μM组与空白组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，20μM组与空白组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，20μM组与10μM组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。空白组、10μM组、20μM组总凋亡率分别为：(6.54±0.35)％、(10.67±0.17)％、(19.27±0.19)％，随着姜黄素浓度升高，凋亡率增加，10μM组、20μM组与空白组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，20μM组与10μM组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。具体结果见图8所示是姜黄素促进C4-2细胞凋亡图。图8(a))0μM、10μM、20μMC4-2细胞凋亡柱状图；图8(b)0μMC4-2细胞凋亡图；图8(c)10μMC4-2细胞凋亡图；图8(d)20μMC4-2细胞凋亡图。

3.3.划痕迁移实验

在6孔板对照组和实验组对应孔的背后，用标记笔划5条横穿孔且间隔0.5～1cm的均匀横线；选取生长状况良好、对数期的C4-2细胞，0.25％胰酶消化，继而用培养基重悬细胞，然后进行细胞计数；在6孔板加进细胞悬液2.5ml(细胞数为5×10⁵个)，其余孔用无菌PBS填充，置37℃含5％CO₂细胞培养箱中培养细胞24h(使细胞贴壁完全)；细胞培养24h后，用垂直于6孔板背后的横线且垂直于直尺的200ul枪头进行划痕；PBS洗细胞3次，去除划下的细胞；对照组加入2.5ml无血清1640培养基，药物组加入2.5ml10uM、20uM姜黄素无血清1640培养基；将6孔板置于37℃5％CO₂培养箱培养。在0、24h时间点将6孔板置于100倍倒置显微镜下拍照；进行数据分析。

其中，C4-2细胞在经过姜黄素处理24小时以后，随着姜黄素浓度升高，细胞迁移距离减少，姜黄素在浓度为0μM、10μM、20μM时各组细胞的迁移距离分别为(934.43±37.99)μm、(712.39±52.40)μm、(558.83±66.35)μm，20μM组与10μM组细胞迁移距离与空白组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，20μμM细胞迁移距离与10μM组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，具体结果见图9所示是姜黄素抑制C4-2细胞迁移图。图9(a)0μM、10μM、20μMC4-2细胞迁移柱状图；图9(b)空白组0h细胞划痕；图9(c)空白组24h细胞划痕；图9(d)10μM组0h细胞划痕；图9(e)10μM组24h细胞划痕；图9(f)20μM组0h细胞划痕；图9(g)20μM组24h细胞划痕。

4.实验结果

姜黄素对C4-2细胞增殖具有抑制作用且抑制作用呈浓度依赖性增长，姜黄素浓度在320μM时对细胞增殖抑制作用最强，对C4-2细胞最高抑制率为(92.15±1.32)％；姜黄素对C4-2细胞的凋亡诱导作用呈浓度依赖性增长，10μM姜黄素作用于C4-2细胞的凋亡率为：10.67±0.17)％；20μM姜黄素作用于C4-2细胞的凋亡率为：(19.27±0.19)％；姜黄素可有效抑制C4-2细胞的迁移能力，且抑制作用呈浓度依赖性增长。空白组、10μM组、20μM组，C4-2细胞的迁移距离分别为(934.43±37.99)μm、(712.39±52.40)μm、(558.83±66.35)μm。10μM组姜黄素对C4-2细胞的迁移的抑制率分别为：23.76％；20μM组姜黄素对C4-2细胞的迁移的抑制率分别为：40.20％。

在本发明上述实施例中。所述中药单体姜黄素在制备肿瘤药物中肿瘤细胞抑制浓度为300～400μM范围内的实验过程可如同上述实验步骤。所述中药单体姜黄素在制备肿瘤药物中肿瘤细胞凋亡诱导浓度为5～30μM范围内的实验过程可如同上述实验步骤。所述中药单体姜黄素在制备肿瘤药物中肿瘤细胞迁移浓度为5～30μM范围内的实验过程可如同上述实验步骤。在此不一一列举。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的公开后，将容易想到本公开的其它实施方案。本申请旨在涵盖本公开的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本公开的一般性原理并包括本公开未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本公开的真正范围和精神由所附的权利要求指出。

应当理解的是，本公开并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本公开的范围应由所附的权利要求来限制。

Claims (10)

1.一种中药单体姜黄素在制备治疗肿瘤药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述中药单体姜黄素分子式结构如下式(Ⅰ)：

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述中药单体姜黄素在制备肿瘤药物中肿瘤细胞抑制浓度为300～400μM。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述中药单体姜黄素在制备肿瘤药物中肿瘤细胞凋亡诱导浓度为5～30μM。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述中药单体姜黄素在制备肿瘤药物中肿瘤细胞迁移浓度为5～30μM。

6.一种中药单体姜黄素在制备治疗前列腺肿瘤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述中药单体姜黄素分子式结构如下式(Ⅰ)：

所述中药单体姜黄素在制备前列腺肿瘤药物中肿瘤细胞抑制浓度为300～400μM；

所述中药单体姜黄素在制备前列腺肿瘤药物中肿瘤细胞凋亡诱导浓度为5～30μM；

所述中药单体姜黄素在制备肿瘤药物中肿瘤细胞迁移浓度为5～30μM。

8.一种如权利要求1～5任意一项所述用途中中药单体姜黄素在制备用于抑制肿瘤细胞增殖、肿瘤细胞凋亡、肿瘤细胞迁移药物中的应用。

9.一种如权利要求1～5任意一项所述用途中中药单体姜黄素与其他药物联合制备肿瘤药物中的应用。

10.一种利用权利要求1～5任意一项所述用途中中药单体姜黄素制备的可注射流体、气雾剂、乳膏、凝胶剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、透皮贴剂或赋形剂。

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