CN104840456A - 芹菜素在制备治疗胰腺癌药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属制药领域，涉及中药单体芹菜素在制备治疗胰腺癌药物中的用途。本发明采用CCK-8法评估，反复筛选、优化和对胰腺癌SW1990细胞增殖的抑制作用药效试验，筛选出抗肿瘤作用强的有效单体芹菜素。进一步进行芹菜素对人胰腺癌SW1990干细胞Sonic Hedgehog信号通路干预试验，结果表明，芹菜素能明显抑制胰腺癌干细胞增殖，下调胰腺癌干细胞比例，同时减弱胰腺癌干细胞自我更新能力，流式检测CD24⁺CD44⁺细胞比例显著下降，无血清培养肿瘤干细胞球数目减少，同时显著下调Sonic Hedgehog信号通路成员在mRNA和蛋白水平的表达，所述的中药单体芹菜素可作为单独唯一活性成分用于制备治疗胰腺癌的药物。

Description

芹菜素在制备治疗胰腺癌药物中的用途

技术领域

本发明属制药领域，涉及治疗胰腺癌药物，具体涉及中药单体芹菜素在制备治疗胰腺癌药物中的用途。

背景技术

现有技术关于肿瘤的研究显示，尤其在对血液肿瘤，脑瘤和乳腺癌的研究中均已证实肿瘤干细胞的存在，还有研究发现了一个在肿瘤发生和发展中发挥主要任务的细胞亚群，其特征是特有性的表达CD44，CD24和ESA（epithelial-specific antigen，上皮细胞特有抗原），研究显示，在胰腺癌细胞中存在有约0.2–0.8%的细胞表达CD44+CD24+ESA+，与其它胰腺癌细胞相比其成癌特性高100倍，CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞可以自我复制，能够分化子代细胞，表现干细胞特性，被认为是胰腺癌干细胞。高表达Sonic Hedgehog(简称SHH，中文常译作“音猬因子”)信号是胰腺癌干细胞的重要特征。SHH信号通路可以通过调控正常干细胞的自我复制以及祖细胞的增殖或分化以维持组织的稳定。Chenwei Li等人报道了在胰腺癌干细胞的自我复制和胰腺癌成瘤过程均有SHH信号通路的参与，SHH信号在胰腺癌干细胞的自我复制及肿瘤微环境的形成过程发挥重要作用。

目前临床对于胰腺癌的主要治疗方法包括手术、放疗、化疗和中药治疗等。实践显示，放化疗、介入治疗可取得短时间疗效,但同时带给胰腺癌患者更多的烦恼,原因是由于这些局部疗法对癌细胞和人体正常细胞无辨别能力,在杀死癌细胞的同时也损害了人体大量正常组织细胞,强烈的毒副作用一般使患者难以耐受,还带来很大的肝肾毒性；手术治疗效果较差,术后病人容易出现一系列并发症,不利于患者的康复;中医治疗胰腺癌常遵循的治疗原则有整体治疗的原则、辨症施治的原则和扶正祛邪的原则。中医药整体观指导的阴阳平衡理论与中药复方多途径药理作用特点，其优点在于毒副作用小,不会对患者的身体造成创伤,而且还会有效降低其他的治疗方法对患者身体的创伤,从而能够取得较好的治疗效果，安全易接受。近年来，业内开展了一些治疗胰腺癌中药有效组分或成分的研究，并发现了一些具有不同程度的抑制胰腺癌细胞作用的中药有效组分或成分，然而，无论传统中药复方如QYHJ(清胰化积方)还是单一的有效成分，皆有其不足之处。传统中药复方由于成分复杂，难以明了其所含成分，使其制剂存在一定的可控性、稳定性的困扰，这也是中医药国际化的难题之一；而单一组分或成分可能失去中医整体观治疗复杂疾病的特色优势；针对该难题，本申请的发明人拟通过对人胰腺癌干细胞的抑制及其机理的研究，提供新的治疗胰腺癌药物，尤其是提供中药单体芹菜素在制备胰腺癌药物中的新用途。

发明内容

本发明目的是提供一种新的治疗胰腺癌药物，具体涉及中药单体芹菜素在制备治疗胰腺癌药物中的用途。所述的中药单体芹菜素能明显抑制胰腺癌干细胞增殖，下调胰腺癌干细胞比例，同时可减弱胰腺癌干细胞自我更新能力，尤其可作为单独唯一活性成分用于制备治疗胰腺癌的药物。

本发明在QYHJ(清胰化积方)的基础上，以其中八种已被认知的、能被分离提取或购买的有效组分或单体（野黄芩苷、黄芩素、槲皮素、木犀草素、芹菜素、熊果酸、齐墩果酸和山奈酚）为研究对象，采用CCK-8法评估，反复筛选、优化和对胰腺癌SW1990细胞增殖的抑制作用药效验证试验，筛选出抗肿瘤作用最强的有效单体芹菜素。

本发明对上述八种中药单体对胰腺癌SW1990细胞增殖抑制作用的比较试验结果显示，所述的中药单体野黄芩苷、黄芩素、槲皮素、木犀草素、芹菜素、熊果酸、齐墩果酸和山奈酚均具有不同程度抑制胰腺癌干细胞增殖，下调胰腺癌干细胞比例，同时减弱胰腺癌干细胞自我更新能力的作用；其中，芹菜素抗胰腺癌干细胞作用最强。

本发明所述的中药单体成分可通过常规提取方法或商业采购获得；本发明的实施例中，中药单体野黄芩苷、黄芩素、槲皮素、木犀草素、芹菜素、熊果酸、齐墩果酸和山奈酚均购自上海中药标准化研究中心。

本发明中，芹菜素，又称芹黄素，化学结构式为5,7,4’-三羟基黄酮，其分子式为C₁₅H₁₀O₆，相对分子量为270。具有式（Ⅰ）的结构，

本发明进一步进行了芹菜素对人胰腺癌SW1990干细胞Sonic Hedgehog信号通路干预试验，芹菜素下调人胰腺癌SW1990干细胞比例，抑制胰腺癌干细胞自我更新能力，芹菜素抑制Sonic Hedgehog信号通路的表达等试验，经系列的试验表明，所述的芹菜素能明显抑制胰腺癌干细胞增殖，下调胰腺癌干细胞比例，同时减弱胰腺癌干细胞自我更新能力，流式检测CD24⁺CD44⁺细胞比例显著下降，含生长因子的无血清培养肿瘤干细胞球数目减少，同时显著下调Sonic Hedgehog信号通路成员在mRNA和蛋白水平的表达，具体表现为，芹菜素可不同程度地抑制SHH，PTCH1，SMO和GLI1mRNA表达，其中PTCH1、SMO和GLI1基因mRNA的表达下调呈剂量依赖性，在50uM浓度时效果最显著(p<0.01)(Fig.2-7)，提示芹菜素对胰腺癌干细胞的调控作用是通过抑制Sonic Hedgehog信号通路来实现的。

本发明所述的中药单体芹菜素可作为药物有效成分用于制备治疗胰腺癌的药物，尤其是作为单独唯一活性成分用于制备治疗胰腺癌的药物，进一步，可与药学上可接受的药物载体或辅料按常规方法制成临床常用制剂，所述制剂的剂型，包括颗粒剂、片剂、胶囊剂等口服固体制剂。

附图说明

图1显示了QYHJ方中8中常见单体干预48h对SW1990细胞增殖的影响。

图2显示了不同浓度芹菜素干预24h，48h和72h对SW1990细胞和BxPC-3活力影响。

图3显示了不同浓度芹菜素干预48h对SW1990细胞和BxPC-3凋亡的影响。

图4显示了不同浓度芹菜素干预48h对SW1990细胞和BxPC-3细胞中胰腺癌干细胞比例的影响。

图5A，B分别为不同浓度芹菜素干预7d对SW1990细胞和BxPC-3细胞中胰腺癌干细胞成球能力的影响。

图6不同浓度芹菜素对Sonic Hedgehog信号通路蛋白水平的影响，其中，

A为蛋白印迹法检测不同浓度芹菜素（10uM,20uM,50uM）干预SW1990细胞和BxPC-3细胞48h后Sonic Hedgehog信号通路成员蛋白表达的影响；B-E为不同浓度芹菜素干预SW1990细胞和BxPC-3细胞48h后Sonic Hedgehog信号通路成员蛋白相对表达量；*与DMSO对照组比较，P<0.05。

图7不同浓度芹菜素对Sonic Hedgehog信号通路mRNA水平的影响，

其中，A为RT-PCR检测不同浓度芹菜素（10uM,20uM,50uM）干预SW1990细胞和BxPC-3细胞48h后Sonic Hedgehog信号通路成员mRNA表达的变化；B-E为不同浓度芹菜素干预SW1990细胞和BxPC-3细胞48h后Sonic Hedgehog信号通路成员mRNA相对表达量；*与DMSO对照组比较，P<0.05。

具体实施方式

本发明的中药单体芹菜素明显抑制胰腺癌干细胞增殖，下调胰腺癌干细胞比例，同时减弱胰腺癌干细胞自我更新能力以及影响Sonic Hedgehog信号通路mRNA水平的有益效果通过下述实验证实。

实施例1

一、实验材料

1.细胞

人胰腺癌SW1990细胞系、BxPC-3细胞系均购自ATCC(American Type CultureCollection)。

2.主要试剂

1）单体：中药单体野黄芩苷、黄芩素、槲皮素、木犀草素、芹菜素、熊果酸、齐墩果酸和山奈酚均购自上海中药标准化研究中心。

2）细胞培养及体外检测相关试剂：RPMI1640、胎牛血清试剂购自Gibco或Hyclon公司，谷氨酰胺购自Hyclon公司，青链霉素双抗、丙酮酸钠购自Sigma公司。bFGF，EGF，B27购自Invitrogen公司。

3）体外增殖检测试剂盒WST-8based Colorimetric Assay Cell Counting kit8(CCK-8)购自日本本同仁化学研究所。

4）流式细胞仪检测试剂：细胞凋亡检测AnnexinV/PI试剂盒购自Invitrogen公司，CD24-PE抗体，CD44-APC抗体购自BD公司。

5）RT-PCR相关试剂：TRIzol Reagent RNA提取试剂购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis kit、PCR试剂盒PCR Master Mix(2×)购自Fermentas公司，DNA分子量标准购自天根生化科技(北京)有限公司。SHH，PTCH1，SMO，GLI1基因引物、内参GAPDH引物均由上海生物工程技术有限公司合成。

6）Westenb blot相关试剂：哺乳动物蛋白提取试剂盒、PMFS、蛋白浓度检测试剂盒(BCA法)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、5×蛋白上样缓冲液均购自北京康为世纪生物科技有限公司。兔抗人Shh，PTCH1,GLI1，GAPDH购自Cell SignallingTechnology公司。鼠抗人Smo多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗购自Santa Cruz公司。封闭液为脱脂奶粉溶于1×TPBS，终浓度5%。PVDF膜(0.22μm)购自Millipore公司。其他试剂均为国产分析纯试剂。

二、实验方法

1）细胞培养

SW1990和BxPC-3细胞用含有10%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、1％的青链霉素双抗、1mM丙酮酸钠的RPMI1640进行培养，所有细胞均在37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养，每2～3天更换培液一次。传代时用0.25%的胰蛋白酶消化，按1：3的比例传代。

2）CCK-8法检测芹菜素对细胞活力的影响

方法同上，芹菜素干预浓度为2uM，5uM，10uM，20uM，40uM，60uM，80uM，干预24h，48h和72h。

3）流式细胞仪检测细胞凋亡

按照AnneXinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒protocol所描述的步骤进行以下操作：取各组细胞行胰酶消化，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，每组细胞做3个重复。细胞消化下来后，转移到离心管内，1500rpm离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞。1500rpm离心5分钟，弃上清，加入195μl AnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞，常温下避光孵育10分钟。加入10μl碘化丙啶(Pl)染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测，AnnexinV-FITC为FH1通道(绿色荧光)，PI为FH2(红色荧光)。每次流失细胞仪检测以20000个细胞为检测单位。

4)流式细胞仪检测检测胰腺癌干细胞比例

将单细胞悬液调整浓度为2×10⁵/ml，铺6孔板，1ml/孔。QYHJ方干预48h后，胰酶消化，用含2％胎牛血清的RPMI-1640冲洗2次，每次5分钟1000rpm，重新悬浮于100μl含2％胎牛血清的RPMI-1640中，调整浓度为10⁶/100μL。加入20ul CD24-PE,20ul CD44-APC流式抗体冰上孵育30min，用含2％胎牛血清的RPMI-1640冲洗2次，每次5分钟1000rpm，重新悬浮于100μl含2％胎牛血清的RPMI-1640中。以不加抗体加4'，6二脒基-2-苯吲哚盐酸(DAPI)（1μl/ml终浓度）的细胞作为阴性对照。流式细胞仪分析胰腺癌干细胞比例变化情况。

5）无血清培养成球实验

以干细胞培养液（无血清，含bFGF20ug/ml，EGF10ug/ml，B2750×）调整细胞浓度为500/ml，接种于超低粘附6孔板中，每孔2ml，每隔3－4天换液一次。1周后计数克隆球形成数。评价克隆形成率变化情况。

6）RT-PCR检测

引物设计

从GenBank中检索出人SHH，PTCH1，SMO，GLI1和GAPDH基因序列号及相应序列，采用Premier5.0引物设计软件设计引物，并通过BLAST排除产物同源序列，表1是RT-PCR引物碱基序列。

表1

细胞或组织总RNA提取

组织样本称取液氮保存的组织100mg，加入1ml TRIzol Reagent，匀浆。按0.2:1(氯仿:TRIREAGENT)的比例加入氯仿，盖严，置于旋涡混合器上振荡15s，冰上静置2min。于4℃12000×g条件下离心15min，RNA即溶解在上层水相中。将上层水相转移到新的离心管中，加入异丙醇沉淀RNA，比例为0.5:l（异丙醇:TRIzol REAGENT），冰上静置10min。于4℃12000×g条件下离心10min，RNA即沉淀于管底。弃上层液，加入lml75%的乙醇溶液洗涤RNA沉淀，7500×g、4℃条件下离心5min，弃上层液。重复上一步骤。吸干试管内乙醇，室温下自然干燥RNA沉淀10min（注意防止RNA彻底干燥，否则会大大降低RNA的溶解度）。用DEPC水溶解RNA。紫外吸收测定法测总RNA浓度:取1μl RNA溶液用99μl DEPC水稀释，用紫外分光光度仪检测RNA浓度及纯度(OD₂₆₀值及OD₂₆₀/OD₂₈₀比值)。OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8～2.0之间，样品总RNA(μg/μl)=OD₂₆₀×稀释倍数×40μg/ml。

逆转录（RT）：按照表2剂量将相关试剂加入于薄壁PCR管内，65℃孵育5min，随后于冰上冷却，并按表3所示依次加入试剂，42℃孵育60min，70℃加热5min以终止反应，随后于冰上冷却。于-80℃保存或用于real-time PCR实验。

表2RT反应体系一

表3RT反应体系二

PCR：取一只0.2ml PCR薄壁管，按表4依次加入下列组分(总体积50μl)，振荡混匀，94℃预变性5分钟，短暂离心，按表5循环条件反应进入循环。循环结束后进行PCR产物电泳及分析。三角烧瓶中加入2g琼脂糖粉及100ml1×TAE电泳缓冲液，置于微波炉内加热熔化后，冷却至约60℃后加5μg EB后灌制琼脂糖凝胶。取PCR反应产物8μl加入2μl6×上样缓冲液，混匀后点入凝胶加样孔内;另取4μl DNA分子量标准同时上样。80V条件下电泳至溴酚蓝迁移出适当距离后停止电泳。将凝胶置入Image Master VDS系统内对DNA条带进行扫描并分析条带的灰度值，以目的基因与内参GAPDH灰度值比值作为目的基因相对表达；

表4PCR反应体系

表5PCR循环条件反应体系

7）Western blot检测

蛋白提取及浓度测定

蛋白提取：组织样本称取100mg，置于冰上研磨棒研碎。加入lml RIPA裂解液(含10μl PMSF)，迅速混匀，冰上静置30min。4℃，12，000rpm离心15min。将上清移至另一离心管中，-80℃保存。

BCA法测定浓度：取PBS按表6稀释标准品。根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50：l)配制适量BCA工作液，充分混匀。各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。测定A595nm波长对应的OD值。根据标准曲线计算出蛋白浓度。

表6标准品的稀释

本发明中，采用统计软件SPSS17.0进行统计分析，计数资料均采用均数±标准差（x±s）来表示，进行多样本均数间比较的单因素方差分析，方差齐时，采用LSD法，方差不齐时，采用Games-Howell法，P<0.05提示具有统计学意义。

上述试验结果显示：

1.QYHJ复方中不同组分对胰腺癌SW1990细胞增殖抑制作用的比较结果如图1所示，其中显示，各中药不同单体具有不同程度的抗肿瘤作用，采用CCK-8法评估所述的八种单体（野黄芩苷、黄芩素、槲皮素、木犀草素、芹菜素、熊果酸、齐墩果酸和山奈酚）对胰腺癌SW1990细胞增殖的抑制作用，筛选出抗肿瘤作用最强的有效单体是芹菜素。表7是QYHJ复方中8中常见单体干预48h对SW1990细胞增殖的影响。

表7

2.芹菜素对人胰腺癌SW1990干细胞Sonic Hedgehog信号通路干预实验结果显示，

（1）不同浓度芹菜素对SW1990细胞和BxPC-3增殖有影响，其中，芹菜素干预SW1990细胞和BxPC-3可明显抑制细胞活力，但两者存在一定的差异。SW1990经浓度为10uM-60uM的芹菜素干预后，细胞活力呈现剂量依赖性下降，由92.36±3.12%大幅度下降至13.27±0.87%(P<0.01)；芹菜素干预SW1990细胞48h的IC₅₀为18.65uM；在芹菜素浓度一定的情况下，随着干预时间的延长，细胞活力呈现时间依赖性下降，但是，60uM以上浓度芹菜素干预48h抑制率达最高值，与干预72h结果无明显差异(P>0.01)；BxPC-3经不同浓度芹菜素干预不同时间，其细胞活力与对照相比，呈规则的剂量依赖性和时间依赖性(P<0.01)；芹菜素干预BxPC-3细胞48h的IC₅₀为36.84uM，明显高于SW1990细胞(P<0.01)。

表8是不同浓度芹菜素干预24h，48h和72h后SW1990细胞和BxPC-3活力。

表8

（2）不同浓度芹菜素能诱导SW1990细胞和BxPC-3细胞发生凋亡，SW1990细胞经不同浓度芹菜素干预48h后，凋亡细胞比例由8.21±0.02%提高至60.55±1.68%，BxPC-3细胞经不同浓度芹菜素干预48h后，凋亡细胞比例由13.23±0.40%提高至43.00±1.18%；与对照组相比差异具有统计学意义（如表9所示）。表9是不同浓度芹菜素干预48h后SW1990细胞和BxPC-3凋亡情况。

表9

（3）芹菜素能下调人胰腺癌SW1990干细胞比例，抑制胰腺癌干细胞自我更新能力，在芹菜素抑制SW1990细胞和BxPC-3细胞活力及增殖、促进细胞凋亡的同时，结果显示芹菜素可显著下调胰腺癌干细胞比例。在SW1990细胞中，DMSO对照组胰腺癌干细胞比例为9.47±0.43%，而不同浓度（10uM，20uM和50uM）芹菜素干预后，胰腺癌干细胞比例均呈不同程度的下降，分别为8.06±0.06%，7.24±0.48%和7.73±0.17%，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)；在BxPC-3细胞中，DMSO对照组胰腺癌干细胞比例为13.45±1.77%，而不同浓度（10uM，20uM和50uM）芹菜素干预后，胰腺癌干细胞比例均呈不同程度的下降，分别为12.40±2.40%，7.41±0.35%和6.11±1.21%，与对照组相比，20uM和50uM的芹菜素可显著下调胰腺癌干细胞比例(P<0.01)。表10是不同浓度芹菜素干预48h后SW1990细胞和BxPC-3中胰腺癌干细胞(CD24⁺CD44⁺细胞)比例的变化。

表10

（4）芹菜素能抑制胰腺癌干细胞自我更新能力，本发明中，采用无血清培养法检测胰腺癌干细胞的自我更新能力，结果显示，与DMSO对照组比较，芹菜素干预后SW1990细胞和BxPC-3细胞在含生长因子的无血清培养基中的肿瘤干细胞球数目明显减少，体积亦缩小。

（5）芹菜素能抑制Sonic Hedgehog信号通路的表达（如表11-18所示），在Western blot实验中SW1990细胞和BxPC-3细胞呈现类似的实验结果，即芹菜素干预后Sonic Hedgehog信号通路成员SHH、PTCH1、SMO、GLI-1等均有不同程度的下调。配体SHH在SW1990中表达下调仅见于50uM的芹菜素干预48h之后，而BxPC-3细胞SHH表达呈剂量依赖性下降；经20uM或50uM芹菜素干预48h后的SW1990细胞和BxPC-3均表现为PTCH1，SMO和GLI-1蛋白表达下调，与对照组相比，具有显著性差异(p<0.01)。本发明中，采用RT-PCR分析芹菜素对SW1990细胞和BxPC-3细胞Sonic Hedgehog信号通路成员mRNA的影响，结果显示，芹菜素能不同程度地抑制SHH，PTCH1，SMO和GLI1mRNA表达，其中PTCH1、SMO和GLI1基因mRNA的表达下调呈剂量依赖性，在50uM浓度时效果最显著(p<0.01)，该结果提示芹菜素对胰腺癌干细胞的调控作用是通过抑制SonicHedgehog信号通路来实现的（）。

表11不同浓度芹菜素干预48h后SW1990和BxPC-3细胞SHH蛋白相对表达量的变化

表12不同浓度芹菜素干预48h后SW1990和BxPC-3细胞PTCH1蛋白相对表达量的变化

表13不同浓度芹菜素干预48h后SW1990和BxPC-3细胞SMO蛋白相对表达量的变化

表14不同浓度芹菜素干预48h后SW1990和BxPC-3细胞GLI1蛋白相对表达量的变化

表15不同浓度芹菜素干预48h后SW1990和BxPC-3细胞SHH mRNA相对表达量的变化

表16不同浓度芹菜素干预48h后SW1990和BxPC-3细胞PTCH1mRNA相对表达量的变化

表17不同浓度芹菜素干预48h后SW1990和BxPC-3细胞SMO mRNA相对表达量的变化

表18不同浓度芹菜素干预48h后SW1990和BxPC-3细胞GLI1mRNA相对表达量的变化

Claims (5)

1.中药单体芹菜素作为单独唯一成分在制备治疗胰腺癌药物中的用途；所述的芹菜素其化学结构式为5,7,4’-三羟基黄酮，其分子式为C₁₅H₁₀O₆，相对分子量为270。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的芹菜素抑制胰腺癌干细胞增殖，下调胰腺癌干细胞比例，同时减弱胰腺癌干细胞自我更新能力。

3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的芹菜素在流式检测CD24⁺CD44⁺细胞比例显著下降，含生长因子的无血清培养肿瘤干细胞球数目减少。

4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的芹菜素下调Sonic Hedgehog信号通路成员在mRNA和蛋白水平的表达。

5.一种治疗胰腺癌药物，其特征在于，以中药单体芹菜素作为单独唯一活性成分和药学上可接受的药物载体或辅料制成。