CN109908137B - 青蒿素在杀伤乳腺癌干细胞的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种青蒿素在制备抑制或杀伤乳腺癌肿瘤干细胞的药物中的用途。青蒿素能够有效杀伤乳腺癌肿瘤干细胞，且与未发生干性演变的癌细胞相比，对肿瘤干细胞具有更强的杀伤效果，表现出了对肿瘤干细胞的选择性的高效杀伤。青蒿素具有诱导乳腺癌干细胞“铁死亡”的作用，将青蒿素与Fe₃O₄纳米颗粒联用，或进一步将磁性纳米颗粒偶联酪氨酸激酶样孤儿受体1抗体等靶向物，对乳腺癌干细胞的杀伤效果显著提高。本发明还公开了一种抑制或杀伤乳腺癌肿瘤干细胞的抗肿瘤药物组合物。本发明为特异性杀伤肿瘤干细胞的肿瘤治疗提供了新策略，对提高肿瘤疗效，减少肿瘤复发，改善肿瘤患者的生存质量，延长生存时间具有重要意义。

Description

青蒿素在杀伤乳腺癌干细胞的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及青蒿素在杀伤乳腺癌干细胞的癌症治疗药物中的应用。

背景技术

肿瘤干细胞也被称作肿瘤起始细胞，是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的一类细胞群。目前，临床上治疗肿瘤的方法能够在短期内杀死大部分肿瘤细胞，使肿瘤快速缩小，但却无法从根本上治愈肿瘤。因为这些疗法主要是针对肿瘤组织内的大多数已经分化的细胞，而不是肿瘤干细胞。即使绝大多数肿瘤细胞被杀死，但只要有幸存的肿瘤干细胞，仍然会造成肿瘤的复发和转移。目前临床上大部分抗肿瘤治疗对肿瘤干细胞不能产生很好的杀伤效果，并且在一定程度上还富集了肿瘤干细胞，进而造成肿瘤的耐药和复发。

肿瘤的复发和恶变，除了需要肿瘤干细胞作为“种子”，还需要其生长所需要的“土壤”，即由细胞外基质、内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞及细胞因子等组成的肿瘤微环境。肿瘤微环境中浸润的免疫细胞包括巨噬细胞、淋巴细胞、树突状细胞等，进一步形成了肿瘤免疫微环境，是决定肿瘤发展与治疗效果的重要因素。巨噬细胞是三阴乳腺癌微环境中含量最高的免疫细胞，它作为可塑性强的组织细胞，可因其所在微环境的不同而呈现多重特性，即可分为激活型(M1表型)和替代活化型(M2表型)两型。M1型分泌促炎因子，提呈抗原，参与正向免疫应答，发挥免疫监视作用。M2型分泌抗炎因子，下调免疫应答，具有免疫抑制功能，促进肿瘤进展。研究表明，肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)在肿瘤微环境中表型趋向M2型，在肿瘤细胞的增殖、侵袭、血管生成和免疫抑制中发挥重要的作用。M2型肿瘤相关巨噬细胞可引起肿瘤细胞干性演变为对药物不敏感的肿瘤干细胞。因此，将肿瘤相关巨噬细胞诱导为M1型，对肿瘤细胞干细胞的治疗具有临床意义。

FDA在2008年批准了Feraheme^TM(即Ferumoxytol，一种Fe₃O₄纳米颗粒)用于治疗慢性肾病患者的铁缺乏，后证明这种药物也可以用作核磁共振造影剂。近期研究证实Ferumoxytol可以使肿瘤相关巨噬细胞向M1型分化，从而抑制乳腺癌的生长以及肝肺转移。

青蒿素(ART)是传统中药黄花蒿中一种有过氧基团的倍半萜内酯天然产物，对红斑狼疮有较高疗效，2016年被证实具有抗肿瘤活性。使用铁螯合剂(如去铁胺)能使青蒿素失活，说明青蒿素对肿瘤的杀伤作用十分依赖于细胞内的铁。科学研究者认为铁激活的青蒿素通过释放具高烷化活性的碳中心自由基和活性氧(ROS)来损伤肿瘤细胞。另有研究认为，青蒿素的选择性归因于其优先靶向某些过表达的癌基因和蛋白质。

发明内容

本发明针对抗肿瘤药物难以抑制或杀灭肿瘤干细胞的技术问题，目的在于提供一种青蒿素用于制备抑制或杀伤乳腺癌肿瘤干细胞的癌症治疗药物的用途。

目前临床上大部分抗肿瘤治疗无法从根本上治愈肿瘤，这与肿瘤干细胞密切相关，幸存的肿瘤干细胞，仍然会造成肿瘤的复发和转移。因为这些疗法并非主要针对肿瘤干细胞，临床上大部分抗肿瘤治疗对肿瘤干细胞不能产生很好的杀伤效果，而且一定程度上还富集了肿瘤干细胞。本发明对常规化疗药物的实验研究证实了这一结论。

常规化疗药物，如阿霉素、顺铂、索拉菲尼、紫杉醇、氟尿嘧啶、吉西他滨等分别处理人肝癌细胞系HepG2、人骨肉瘤细胞系MNNG/HOS、人卵巢癌细胞系SKOV-3、人乳腺导管癌细胞BT-474、人非小细胞肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞系MCF7、人胃腺癌细胞系BGC-823、人乳腺癌细胞系MDA-MB-231等，具有选择性的高效杀伤力，但阿霉素、顺铂、索拉菲尼、紫杉醇、氟尿嘧啶、吉西他滨等传统药物处理相应的干细胞，对肿瘤干细胞的杀伤能力远远低于对应的肿瘤细胞。

本发明意外地发现，青蒿素能够有效杀伤乳腺癌肿瘤干细胞，且与未发生干性演变的癌细胞相比，对肿瘤干细胞具有更强的杀伤效果，表现出了对肿瘤干细胞的选择性的高效杀伤。虽然青蒿素对肝癌、卵巢癌、骨肉瘤等癌种的肿瘤干细胞，与未发生干性演变的癌细胞相比也表现出选择性的杀伤力，但乳腺癌之外的癌种的肿瘤干细胞对青蒿素的敏感性较低。

因此，本发明的第一个目的首先在于提供一种青蒿素在制备抑制或杀伤乳腺癌肿瘤干细胞的药物中的应用。

青蒿素对乳腺癌肿瘤干细胞具有选择性的高效杀伤作用，特别是三阴乳腺癌干细胞，包括人乳腺导管癌细胞BT-474、人乳腺癌细胞系MCF7、人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人乳腺癌细胞系T47D的干细胞。

将青蒿素与Fe₃O₄纳米颗粒联用，对乳腺癌干细胞的杀伤效果显著提高。这种效果来源于青蒿素具有诱导乳腺癌干细胞“铁死亡”的作用，青蒿素通过调控“铁死亡”通路来调控肿瘤干细胞的干性和活力。另外，青蒿素与氧化铁联用会产生Fenton效应，并增加青蒿素对乳腺癌干细胞“铁死亡”的作用，Fe₃O₄纳米颗粒自身也具有产生活性氧(ROS)的性能。另一方面，Fe₃O₄纳米颗粒可诱导肿瘤相关巨噬细胞分型极化，从而抑制肿瘤细胞干性演变，从根源上抑制肿瘤干细胞的形成，有助于肿瘤干细胞的杀伤。因此，氧化铁纳米颗粒是青蒿素抗肿瘤治疗，特别是抑制或杀伤乳腺癌肿瘤干细胞的“最佳伴侣”。

不同尺寸的Fe₃O₄纳米颗粒对提高青蒿素对乳腺癌干细胞的杀伤效果的作用不同，部分地与不同尺寸的Fe₃O₄纳米颗粒在肿瘤内累积量有关。优选的，所述Fe₃O₄纳米颗粒的尺寸为5-50nm，更优选地，Fe₃O₄纳米颗粒的尺寸为10-20nm。

为进一步提高Fe₃O₄纳米颗粒与青蒿素联用杀伤乳腺癌干细胞的效果，优选的，所述Fe₃O₄纳米颗粒表面修饰乳腺癌干细胞靶向的抗体(如ROR1抗体等)、配体或者蛋白质(如轻链铁蛋白等)。

优选地，所述Fe₃O₄纳米颗粒表面偶联酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)抗体，更优选地，Fe₃O₄纳米颗粒上ROR1抗体的数量为6-15个。

青蒿素、青蒿素与Fe₃O₄纳米颗粒联用、Fe₃O₄偶联ROR1抗体其杀伤乳腺癌干细胞的效果产生巨大变化，这种变化是意想不到的。青蒿素与Fe₃O₄纳米颗粒联用对乳腺癌干细胞的活性抑制能力产生了巨大的变化，其对乳腺癌干细胞的抑制后细胞活性百分比下降了近20倍，Fe₃O₄纳米颗粒偶联ROR1抗体后，氧化铁纳米颗粒与青蒿素联用又使腺癌干细胞的活性进一步下降了5-10倍。

基于上述发明，本发明的另一个目的是提供一种抑制或杀伤乳腺癌肿瘤干细胞的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，包括青蒿素和Fe₃O₄纳米颗粒。

所述的Fe₃O₄纳米颗粒的尺寸为5-50nm，优选地，Fe₃O₄纳米颗粒的尺寸为10-20nm。

进一步地，所述的Fe₃O₄纳米颗粒的表面偶联酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)抗体，优选地，Fe₃O₄纳米颗粒上ROR1抗体的数量为6-15个。

有益效果：本发明提出了一种青蒿素的新用途，即青蒿素在制备抑制或杀伤乳腺癌肿瘤干细胞的药物中的用途。青蒿素能够有效杀伤乳腺癌肿瘤干细胞，且与未发生干性演变的癌细胞相比，对肿瘤干细胞具有更强的杀伤效果，表现出了对肿瘤干细胞的选择性的高效杀伤。青蒿素具有诱导乳腺癌干细胞“铁死亡”的作用，将青蒿素与Fe₃O₄纳米颗粒联用，或进一步将磁性纳米颗粒偶联酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)抗体等靶向肿瘤干细胞，对乳腺癌干细胞的杀伤效果显著提高。对于肿瘤干细胞的抑制或杀伤，青蒿素的效果优于传统化疗药物阿霉素、顺铂、索拉菲尼、紫杉醇、氟尿嘧啶、吉西他滨等，本发明为特异性杀伤肿瘤干细胞的肿瘤治疗提供了新策略，对提高肿瘤疗效，减少肿瘤复发的新的抗肿瘤治疗具有启发，对改善肿瘤患者的生存质量，延长生存时间具有重要意义。

附图说明

图1是MDA-MB-231无血清培养0天(A)、3天(B)、7天(C)、10天(D)后的显微照片；

图2是青蒿素(ART)对MCF7细胞(A)、MCF7干细胞(B)、MDA-MB-231细胞(C)、MDA-MB-231干细胞(D)的半数抑制浓度(IC₅₀值)；

图3是300μg/mL青蒿素(ART)对MDA-MB-231细胞(B)、MDA-MB-231干细胞(D)作用24h后的细胞照片，图A、C分别为正常条件培养的MDA-MB-231细胞及MDA-MB-231干细胞；

图4为不同浓度氧化铁纳米粒(IONPs)对MDA-MB-231干细胞细胞活力的影响；

图5是8μg/mL青蒿素(ART)联合不同浓度的氧化铁纳米粒(IONPs)对MDA-MB-231干细胞的杀伤效果；

图6为60μg/mL氧化铁纳米粒(IONPs，Ferumoxytol)联合不同浓度的青蒿素(ART)对MDA-MB-231干细胞的杀伤效果；

图7不同尺寸氧化铁纳米粒(IONPs)的透射电镜(TEM)照片；

图8是不同尺寸氧化铁纳米粒(IONPs)的饱和磁化强度；

图9不同尺寸氧化铁纳米粒(IONPs)的荷瘤小鼠MRI成像效果，白色圆圈内为肿瘤所在部位；

图10为20μg/mL不同氧化铁纳米粒(IO-5，IO-10，IO-20，IO-50)联合8μg/mL的青蒿素(ART)对MDA-MB-231干细胞的杀伤效果；

图11为8μg/mL的青蒿素(ART)联合不同ROR1单抗偶联量的IO-10(IO-10-Ab)对MDA-MB-231干细胞的杀伤效果；

图12为8μg/mL的青蒿素(ART)联合了不同浓度的偶联ROR1单抗的IO-10(IO-10-Ab)与裸IO-10对MDA-MB-231干细胞的杀伤效果；

图13为细胞吞噬柠檬酸铁(Ferric citrate，FC)和IO-10后，MDA-MB-231细胞铁含量以及敲降转铁蛋白受体1(trfR1)的影响；

图14为细胞内ROS水平，以对照组数据为指标进行归一化处理；

图15流式细胞仪检测巨噬细胞极化；

图16图14流式细胞测试数据统计；

图17RT-qPCR检测巨噬细胞因子表达变化；

图18Western blot法检测体外MDA-MB-231细胞中上皮间质转化(EMT)标记物的蛋白表达水平；

图19为细胞TEM照片，分别为对照组(a)，IO-10组(b)，IO-10与青蒿素联用组(c)。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细说明，但是需要指出的是，本发明的保护范围并不受这些具体实施方式的限制，而是由权利要求书来确定。

本发明以下实施例中的实验方法，未注明具体条件的均为本领域常规方法，按照行业内标准手册中所述的条件进行，或者按照厂家提供的试剂盒流程进行。

本发明以下实施例中所使用的主要药物或试剂如下：

索拉菲尼(甲苯磺酸索拉非尼片，多吉美Nexavar，德国拜耳医药保健股份公司)；

阿霉素(盐酸多柔比星注射液，浙江海正药业股份有限公司)；

顺铂(顺铂注射液，诺欣，江苏豪森药业股份有限公司)；

紫杉醇(紫杉醇注射液，扬子江药业集团有限公司)；

氟尿嘧啶(氟尿嘧啶氯化钠注射液，福可，石家庄四药有限公司)；

吉西他滨(注射用盐酸吉西他滨，泽菲，江苏豪森药业股份有限公司)；

青蒿素(A110206，阿拉丁试剂)。

本发明以下实施例中使用细胞系及其培养方法如下：

人肝癌细胞系HepG2购自于ATCC细胞库，培养于含有10％胎牛血清(Gibco公司)的DMEM(江苏凯基生物技术股份有限公司)培养基；人骨肉瘤细胞系MNNG/HOS购自中国科学院细胞库，培养于含有10％胎牛血清(Gibco公司)的DMEM(江苏凯基生物技术股份有限公司)培养基；人卵巢癌细胞系SKOV-3购自于ATCC细胞库，培养于含有10％胎牛血清(Gibco公司)的McCoy's 5A(Thermo Fisher Scientific公司)培养基；人乳腺导管癌细胞BT-474购自中国科学院细胞库，培养于含有10％胎牛血清(Gibco公司)的RPMI-1640(江苏凯基生物技术股份有限公司)培养基；人非小细胞肺癌细胞A549购自中国科学院细胞库，培养于含有10％胎牛血清(Gibco公司)并添加2.5g/L NaHCO₃的F12K(中国科学院细胞库)培养基；人乳腺癌细胞系MCF7购自中国科学院细胞库，培养于含有10％胎牛血清(Gibco公司)、0.01mg/ml牛胰岛素(Sigma公司)的DMEM(江苏凯基生物技术股份有限公司)培养基；人胃腺癌细胞系BGC-823购自中国科学院细胞库，培养于含有10％胎牛血清(Gibco公司)的RPMI-1640(江苏凯基生物技术股份有限公司)培养基；人乳腺癌细胞系MDA-MB-231购自中国科学院细胞库，培养于含有10％胎牛血清(Gibco公司)的DMEM(江苏凯基生物技术股份有限公司)培养基；人乳腺癌细胞系T47D购自中国科学院细胞库，培养于含有10％胎牛血清(Gibco公司)的RPMI-1640(江苏凯基生物技术股份有限公司)培养基；所有细胞系均培养于37℃含5％CO₂培养箱中培养。

下面通过具体的实施例详细说明本发明。

实施例1肿瘤干细胞诱导及成球实验

通过本实施例构建了若干肿瘤干细胞的诱导和培养，为后续提供研究对象。

将HepG2、MNNG/HOS、SKOV-3、BT474、A549、MCF-7、BGC-823、MDA-MB-231、T47D细胞按照500个细胞/cm²的密度接种在1.2％聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)及95％乙醇包被的板(Sigma-Aldrich)中，培养在含有DMEM/Ham营养混合物F-12(1：1)的无血清培养基(SFM)中，并添加20ng/mL表皮生长因子(EGF，Invitrogen公司)，10ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子(hFGFb，Invitrogen公司)和2％B-27(Gibco)，持续14-21天。在温和离心球体形成后，每3天更换SFM。收集球形细胞并酶促解离(用0.05％胰蛋白酶，含0.53mM EDTA-4Na，15分钟，37℃)。然后用Hoechst 33342(Solarbio)染色细胞并通过FACS重新分选以检测成球(SP)细胞百分比。计数靶细胞，将1,000个靶细胞接种在补充EGF，hFGFb和B27的SFM中。收获细胞并计数，并重新铺设1,000个细胞用于第二轮和第三轮。对于每轮，在第7天计数菌落。肿瘤细胞SP百分比(％MFU)计算方法为形成的SP细胞的数量(≥50μm尺寸)除以铺板的细胞数并乘以100。

以人乳腺癌细胞系MDA-MB-231为例，MDA-MB-231细胞的SP形成结果如附图1所示，最初接种时(附图1A)，MDA-MB-231细胞是梭形贴壁生长，无血清培养3天(附图1B)后，开始形成10-20个细胞形成的细胞团，无血清培养7天(附图1C)后，乳腺癌细胞球增多，聚集成簇，无血清培养10天(附图1D)，细胞球的平均体积进一步增大，表明以人乳腺癌细胞系MDA-MB-231诱导的乳腺癌干细胞已初步形成。

实施例2细胞活力检测及药物半数抑制率计算

药物对细胞的半数抑制率(IC₅₀)通过细胞活力检测结果计算而得。收集处于对数生长期的各类细胞株按照2×10⁵个/mL浓度接种于96孔板，每孔接种100μL，每组设置6个复孔，按照各类细胞的培养条件过夜培养(24h)后，加入不同浓度的青蒿素等药物处理24h后，使用常规MTT(Sigma公司)法检测细胞活性。

青蒿素以及常规化疗药物对肿瘤及其干细胞的检测结果如表1所示，常规化疗药物索拉菲尼、阿霉素、顺铂、紫杉醇、氟尿嘧啶、吉西他滨等对肿瘤干细胞杀伤效果远低于普通癌细胞，而青蒿素则对多种肿瘤干细胞具有选择性的杀伤作用，其中乳腺癌干细胞对青蒿素的敏感性较高，青蒿素则对乳腺癌肿瘤干细胞具有选择性的高效杀伤作用。

青蒿素对MCF7、MDA-MB-231细胞和干细胞的半数抑制浓度(IC₅₀值)如附图2。

表1

实施例3青蒿素对MDA-MB-231及其干细胞形态影响

将对数生长期的MDA-MB-231细胞及其干细胞接种于六孔板中，加入300μg/mL青蒿素后培养24h，取出后，pH 7.4PBS缓冲液洗涤3次，于光学显微镜(Primovert，卡尔蔡司公司)下观察并拍照。结果如附图3所示，青蒿素对MDA-MB-231细胞形态影响不明显，而对MDA-MB-231干细胞的形态影响则较为明显，形态变化表明MDA-MB-231干细胞被青蒿素杀伤。

实施例4氧化铁纳米颗粒(Ferumoxytol)、青蒿素以及二者联合作用对MDA-MB-231干细胞的影响

取对数生长期的人乳腺癌干细胞MDA-MB-231-SC按照2×10⁵个/mL浓度接种于96孔板，每孔接种100μL，每组设置6个复孔，按照细胞的培养条件过夜培养(24h)后，分别加入0、20、40、60、80、100μg/mL氧化铁纳米粒(Ferumoxytol)共同培养24h，MTT法测试细胞活力。结果如表2(Ⅰ)和附图4所示，Ferumoxytol对MDA-MB-231-SC细胞活力没有明显的影响。

取对数生长期的人乳腺癌干细胞MDA-MB-231-SC按照2×10⁵个/mL浓度接种于96孔板，每孔接种100μL，每组设置6个复孔，按照细胞的培养条件过夜培养(24h)后，加入青蒿素(ART)8μg/mL，同时使用0、20、40、60、80、100μg/mL Ferumoxytol联合8μg/mL青蒿素(ART)对MDA-MB-231-SC作用24h后，MTT法测试细胞活力。结果如表2(Ⅱ)和附图5所示，表明青蒿素(ART)与氧化铁纳米颗粒联合使用能显著增强青蒿素(ART)对MDA-MB-231-SC细胞的抑制，其中60μg/mL的Ferumoxytol与青蒿素(ART)联用对MDA-MB-231-SC细胞活力的抑制性最强。

同样地，按照上述方法使用60μg/mL Ferumoxytol联合0、2、4、6、8、10μg/mL青蒿素(ART)对MDA-MB-231-SC作用24h后，MTT法测试细胞活力。结果如表2(Ⅲ)和附图6所示，Ferumoxytol与青蒿素联用对MDA-MB-231-SC细胞活力的抑制率与青蒿素浓度成正相关，当青蒿素(ART)达到6μg/mL后MDA-MB-231-SC活力迅速降低并趋于稳定。

实施例5不同尺寸氧化铁纳米颗粒的制备及表征

1)DMSA@Fe₃O₄纳米粒子

分别取28g FeCl₃·6H₂O和20g FeSO₄·7H₂O于80mL纯水中混匀，氮气保护下水浴加热至70℃，剧烈搅拌并加入氨水(25％)。搅拌10min后加入10-100mL油酸并在70℃下继续反应3h。反应结束后，水浴升温至90℃挥发氨水，冷却后磁分离并用乙醇和纯水分别清洗3次后置于正己烷中，得Fe₃O₄@OA的正己烷溶液。取Fe₃O₄@OA的正己烷溶液40mL(Fe₃O₄@OA纳米颗粒5mg/mL)，加入40mL的二巯基丁二酸(DMSA)丙酮溶液(DMSA2.5mg/mL)均匀混合，60℃加热冷凝回流反应5h，纯水清洗3次，磁分离后溶于去离子水中调pH至10，超声分散后调pH至7并置于透析袋中透析72h，磁分离得Fe₃O₄纳米颗粒，4℃保存备用。

通过在10-100mL范围内调节上述反应中油酸加入量，得到4种不同粒径的氧化铁纳米颗粒DMSA@Fe₃O₄，所得样品用透射电子显微镜TEM对其形貌及尺寸进行表征，结果如附图7所示，根据软件统计，4个样本的尺寸分别约为5nm，10nm，20nm及50nm，分别标记为IO-5、IO-10、IO-20及IO-50。

采用振动样品磁强计(VSM，7407，美国Lakeshore公司)对样品的饱和磁化强度进行检测。结果如附图8所示，表明IO-5、IO-10、IO-20、IO-50均为超顺磁性纳米颗粒，且饱和磁化强度分别约为50、80、60、70emu/g。

实施例6不同尺寸氧化铁纳米颗粒的MRI造影

取5周龄雌性BALB/c裸鼠(体重18g)4只，于右后背部皮下接种1×10⁶个MDA-MB-231细胞。根据公式计算肿瘤尺寸，公式如下：

肿瘤体积＝肿瘤长径×肿瘤短径²×π/6

当肿瘤尺寸达到150mm³时，按照铁含量5mg/kg经尾静脉注射分别注射IO-5、IO-10、IO-20、IO-50，24h后于室温下，通过磁共振扫描仪(Micro-7T，Bruker，德国)测定T1及T2值。结果如附图9所示，说明氧化铁纳米颗粒可实现MRI造影，且IO-10、IO-20的累积量更高。

实施例7不同尺寸氧化铁纳米颗粒与青蒿素联用对乳腺癌干细胞细胞活力的影响

取对数生长期的人乳腺癌干细胞MDA-MB-231-SC按照2×10⁵个/mL浓度接种于96孔板，每孔接种100μL，每组设置6个复孔，过夜培养(24h)后，加入20μg/mL不同尺寸氧化铁纳米颗粒及8μg/mL青蒿素，包括空白、IO-5、IO-10、IO-20及IO-50；处理24h后，通过MTT法测试细胞活力。结果如表2(Ⅳ)和附图10所示，四个样本中IO-5、IO-10、IO-20与青蒿素联用杀伤乳腺癌干细胞的效果强于单独的青蒿素，其中IO-10与青蒿素联用对MDA-MB-231-SC细胞活力的抑制率最强。

实施例8氧化铁纳米颗粒偶联ROR1单抗制备IO-10-Ab

取实施例5中制备的氧化铁纳米颗粒IO-10，在4个圆底烧瓶中依次按照含铁量1mg加入IO-10于pH为5.8的PBS缓冲液中，随后加入20μL碳二亚胺(EDC，10mg/mL)水溶液，10μLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS，10mg/mL)水溶液，置于300rpm/min的恒温摇床上反应2h。将不同量的酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1，10μg、20μg、40μg、80μg)抗体加入上述反应液中，调节反应液pH至8.0并在摇床上继续反应0.5h。反应结束后将反应液加至装填磁性颗粒的磁分离柱(自制)后，在外加磁场下以pH 7.2的PBS缓冲溶液冲洗磁分离柱，收集PBS缓冲液并用超滤离心管(截留分子量5000)浓缩PBS缓冲液，并通过BCA法检测未接枝的ROR1抗体量。4种接枝了ROR1抗体的磁性纳米颗粒在撤去外加磁场后，以pH 7.2的PBS缓冲溶液冲洗，通过磁分离分别对4个样本进行纯化后保存于4℃备用。

实施例9偶联不同ROR1抗体量的IO-10-Ab与青蒿素联用对MDA-MB-231-SC细胞的影响

以BCA试剂盒(碧云天公司)对实施例8的IO-10-Ab中的ROR1抗体的偶联量进行检测和计算。对未接枝的ROR1抗体含量进行定量，通过差减法计算确定4个IO-10-Ab样本所偶联的ROR1单抗含量，并按照文献(International Journal of Nanomedicine,2019,14:921–936.)的方法对每个IO-10粒子上的抗体量进行计算。

取对数生长期的人乳腺癌干细胞MDA-MB-231-SC按照2×10⁵个/mL浓度接种于96孔板，每孔接种100μL，每组设置6个复孔，过夜培养(24h)后，加入偶联不同个数ROR1抗体的IO-10-Ab样本处理24h后，通过MTT法测试细胞活力。结果如图11及表2(Ⅴ)所示，选用20μgROR1抗体投料量为最佳，最终获得的IO-10-Ab偶联量约为每个IO-10上11个ROR1抗体，此时杀伤效果最优。

实施例10IO-10-Ab及IO-10分别联用青蒿素对MDA-MB-231-SC细胞的杀伤

选用实施例8制备的IO-10-Ab，其中的IO-10-Ab偶联11个ROR1抗体，与青蒿素联用考察对MDA-MB-231-SC细胞的杀伤力。

取对数生长期的人乳腺癌干细胞MDA-MB-231-SC按照2×10⁵个/mL浓度接种于96孔板，每孔接种100μL，每组设置6个复孔，过夜培养(24h)后，加入0、5、10、20、40μg/mL浓度IO-10或者IO-10-Ab及8μg/mL浓度青蒿素处理24h后，通过MTT法测试细胞活力。结果如表2(Ⅵ)和附图12所示，IO-10-Ab与青蒿素联用对MDA-MB-231-SC杀伤效果明显高于IO-10与青蒿素联用。

实施例11抑制转铁蛋白受体对MDA-MB-231细胞内化IO-10量的影响

取对数生长期的MBA-MD-231细胞以1×10⁵个/孔铺于24孔板中，12h后每孔更换为200ul Opti-MEM无血清培养基(江苏凯基生物技术股份有限公司)待用。取20pmol的trfR1-siRNA(由广州锐博生物技术有限公司制备)加入150μl的Opti-MEM无血清培养基中，另取1μl的lipo3000转染试剂加入150μl的Opti-MEM无血清培养基，室温孵育5min。将上述含有siRNA和lipo3000的Opti-MEM无血清培养基混合并室温孵育15min后加入24孔板中，培养箱中孵育6h后更换新鲜有血清培养基。

分别按照铁含量300μg/mL的浓度加入柠檬酸铁(Ferric citrate，FC)和IO-10，按照所需条件培养细胞24后，消化并收集细胞，计数后置于6M HCl与1M HNO₃以等体积配比的酸液中溶解，并将终体积加热浓缩至1mL，最后使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)检测细胞铁含量并折算成pg/个细胞来统计。实验结果如附图13所示，与铁离子不同，氧化铁纳米颗粒不依赖于铁转运蛋白进入细胞，因此，trfR1敲降后，并未降低细胞内铁含量。

实施例12MDA-MB-231-SC细胞内活性氧(ROS)水平测试及铁螯合剂(DFO)的作用

取对数生长期的人乳腺癌干细胞MDA-MB-231-SC按照2×10⁵个/mL浓度接种于35mm细胞培养皿中，每孔接种200μL，每组设置6个复孔，过夜培养(24h)后。分别按照铁含量300μg/mL的浓度加入柠檬酸铁(Ferric citrate，FC)和IO-10，再分别加入100μM铁离子螯合剂(DFO，Novartis公司)。一共5个组，分别为对照组、FC组、IO-10组、FC+DFO组及IO-10+DFO组，每组设置4个复孔。采用DCFH-DA试剂盒法(S0033，碧云天公司)检测细胞内ROS水平。吸取条件培养基后并用PBS洗涤三次，加入1mL使用无血清培养基按照1:1000的比例稀释的10μM DCFH-DA溶液，并于37℃细胞培养箱中孵育20min，经无血清细胞培养液洗涤细胞三次，用流式细胞仪或者荧光酶标仪检测荧光强度，或者用荧光显微镜直接观察细胞的ROS水平。其中，酶标仪测量统计数据，如附图14所示，结果显示，Fe₃O₄纳米颗粒自身具有产生活性氧(ROS)的性能，且这一效果不同于游离的铁会被螯合剂(DFO)抑制，因此，相比于其他铁制剂，氧化铁纳米颗粒有望作为青蒿素抗肿瘤的“最佳伴侣”。

实施例13Fe₃O₄纳米颗粒诱导肿瘤相关巨噬细胞M1型极化,从而抑制MDA-MB-231细胞干性演变

取小鼠股骨和胫骨骨髓，以1×10⁷个细胞接种至10cm培养皿中，添加DMEM完全培养基及小鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导7天获得M0巨噬细胞。取1×10⁶个M0巨噬细胞种皿并加入IL-4诱导24h后以PBS清洗细胞收集细胞，即为M2型巨噬细胞。通过CD206和CD11双染色后，流式细胞术分选出CD11C+且CD206-的细胞记为M1型巨噬细胞；CD206+的细胞则记为M2型巨噬细胞。另外通过实时定量PCR(RT-qPCR)技术检测、CD206、瘤坏死因子-α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA4个巨噬细胞分型相关因子的表达水平。随后，按照铁含量300μg/mL的浓度加入Ferumoxytol或IO-10培养24h。通过Transwell的方法将这些巨噬细胞与MDA-MB-231共培养24h后，通过Western blot(专业技术人员常规实验方案检测)MDA-MB-231上皮标记物E-cadherin及间质(即干性)标记物Vimentin的表达水平。结果如附图15-18所示，验证了经氧化铁纳米颗粒诱导后，M2型巨噬细胞极化成M1型(附图15、16及附图17)，从而降低了MDA-MB-231细干性标志物表达水平(附图18)，即抑制了其干性演变。

实施例14青蒿素与Fe₃O₄纳米颗粒联用诱导肿瘤干细胞铁死亡

取对数生长期的人乳腺癌干细胞MDA-MB-231-SC按照2×10⁵个/mL浓度接种于35mm细胞培养皿中，分为三组，分别为(1)对照组；(2)300μg/mL IO-10；(2)300μg/mL IO-10及8μg/mL青蒿素；共同培养24后，分别收集细胞。以2.5％戊二醛固定4h，PBS洗涤后，使用1％锇酸固定液固定3h后再次用PBS漂洗；50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、90％乙醇与90％丙酮(1：1)混合液、90％丙酮依次固定20min，随后使用100％丙酮固定1h；纯丙酮+包埋液(2：1)孵育4h，纯丙酮+包埋液(1：2)室温过夜孵育，包埋液于37℃孵育3h；37℃孵箱过夜孵育，45℃烘箱孵育12h，调至60℃继续孵育24h；样品切片至50-60nm厚度，经3％醋酸铀-枸橼酸铅双染后，使用TEM观察、拍片。结果如附图19所示，通过细胞TEM表征表明，IO-10对线粒体形态无明显影响(图b)，而IO-10与青蒿素联用，则引起MDA-MB-231干细胞线粒体变小、膜密度增高、线粒体脊减少，出现铁死亡特征。

表2

Claims (5)

1.青蒿素在制备抑制或杀伤乳腺癌肿瘤干细胞的药物中的用途，所述的乳腺癌肿瘤干细胞为人乳腺导管癌细胞BT-474、人乳腺癌细胞系MCF7、人乳腺癌细胞系MDA-MB-231或人乳腺癌细胞系T47D的干细胞。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的青蒿素与Fe₃O₄纳米颗粒联用。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的Fe₃O₄纳米颗粒的尺寸为5～50nm。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述Fe₃O₄纳米颗粒表面修饰乳腺癌干细胞靶向的抗体、配体或者蛋白质。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述Fe₃O₄纳米颗粒表面偶联酪氨酸激酶样孤儿受体1抗体。

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