CN103961712A - 一种超顺磁四氧化三铁纳米粒子药物载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种超顺磁四氧化三铁纳米粒子药物载体，包括：由尺寸小于10nm的四氧化三铁纳米晶粒聚合而成的超顺磁四氧化三铁纳米粒子，在酸性条件下能释放二价铁离子；包覆在所述超顺磁四氧化三铁纳米粒子表面的无定形碳的碳层，在碱性条件下可分解；包覆在所述碳层表面的银纳米粒子及银纳米颗粒表面的多孔结构的二氧化硅层。该药物载体能装载天然药物青蒿素，克服青蒿素水溶性差的缺点，将更多的青蒿素通过静脉注射运送到肿瘤病灶部位，到达肿瘤部位后，由于肿瘤细胞处于酸性微环境，药物载体在细胞内释放二价铁离子，二价铁离子裂解青蒿素中的过氧桥产生自由基，破坏肿瘤细胞的蛋白质、DNA、细胞膜，最终杀死肿瘤细胞，提高青蒿素的抗癌疗效。

Description

一种超顺磁四氧化三铁纳米粒子药物载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药物载体领域，具体地说属于用化学方法合成的一种多孔纳米粒子，其具有荧光成像功能和磁共振成像功能，并具有pH响应性，可同时装载青蒿素抗癌药物和提供二价铁离子用于肿瘤治疗。

背景技术

癌症是人类目前面临的最大疾病威胁之一，化学治疗仍然是肿瘤治疗的主要手段之一，因此，对新的抗肿瘤药物的研究一直是国内外制药业研发的重点。目前临床上广泛使用的抗癌药物仍为人工合成的，这些药物在治疗癌症的同时均有很大的副作用。而天然抗癌药虽然有很长的使用历史，但许多天然产物进入临床试验后因缺乏疗效或毒副作用太大而被淘汰，所以很多年都没有新的天然抗癌药物在临床广泛使用。青蒿素是我国在世界上首先研制成功的一种抗疟新药，它是从我国民间治疗疟疾草药青蒿中分离出来的有过氧基团的倍半萜内酯药物，因为可以安全有效的治疗疟疾，挽救了全球特别是发展中国家的数百万人的生命，青蒿素的发现者屠呦呦获得2011年的拉斯克奖。青蒿素抗疟作用的分子机理主要是通过Fe裂解青蒿素的过氧桥结构产生大量的自由基。

近年来，有文献报道肿瘤细胞较正常组织细胞含有丰富的铁，青蒿素类化合物可能通过与铁结合产生自由基，藉此途径达到抗肿瘤的作用(Cancer Letters，179卷，151–156页)。但是肿瘤细胞中的铁含量与红细胞中相比仍然比较低。红细胞中的血红蛋白含有大量的铁，是人体中铁含量最丰富的细胞，其它细胞中铁的含量由其表面转铁蛋白受体数目决定，下表显示出不同细胞表面转铁蛋白受体的数目：

因为正常细胞与肿瘤细胞表面转铁蛋白受体的含量相差不大，因此要提高青蒿素的抗癌效率就必须额外引入铁。虽然有文献报道青蒿素能够治疗多种癌症，但这些结果均是将青蒿素与含铁物质与癌细胞共同培养或是先将癌细胞进行处理使其含有大量铁后再与青蒿素培养得到的(Free Radical Biology&Medicine,37卷,998–1009页)。此外，由于青蒿素不溶于水，在聚氧乙烯蓖麻油等常用药物溶剂中溶解度也不大，导致其生物利用度很低，严重影响了其药效的发挥。

发明内容

为了使青蒿素充分发挥其抗肿瘤作用，并作为一种天然抗癌药物在临床上得到广泛应用，本发明要解决的技术问题在于提供一种超顺磁四氧化三铁纳米粒子药物载体，能够将青蒿素输送到肿瘤病灶，并利用肿瘤细胞处于酸性的微环境，同时细胞内的溶酶体和核内体的pH在3.8-5.0之间的条件，让超顺磁四氧化三铁纳米粒子药物载体在细胞内环境下释放二价铁离子，二价铁离子裂解青蒿素中的过氧桥产生自由基，破坏肿瘤细胞的蛋白质、DNA、细胞膜，进而最终杀死肿瘤细胞。同时利用荧光成像和磁共振成像检测治疗效果。

为了解决本发明提出的上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供了一种超顺磁四氧化三铁纳米粒子药物载体，为多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的无多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子,包括：

超顺磁四氧化三铁纳米粒子，所述超顺磁四氧化三铁纳米粒子由尺寸小于10nm的四氧化三铁纳米晶粒聚合而成，在酸性条件下能释放二价铁离子；

包覆在所述超顺磁四氧化三铁纳米粒子表面的碳层，所述碳层为无定形碳，在碱性条件下可分解；

包覆在所述碳层表面的银纳米粒子；

包覆在所述银纳米粒子表面的二氧化硅层，所述二氧化硅层为多孔结构。

与现有技术相比，本发明提供的超顺磁四氧化三铁纳米粒子药物载体能够装载天然药物青蒿素，克服了青蒿素水溶性差的缺点，能够将更多的青蒿素通过静脉注射的方法运送到肿瘤病灶部位；当装载有青蒿素的超顺磁四氧化三铁纳米粒子药物载体到达肿瘤部位后，由于肿瘤细胞处于酸性的微环境，超顺磁四氧化三铁纳米粒子药物载体在细胞内环境下释放二价铁离子，二价铁离子裂解青蒿素中的过氧桥产生自由基，破坏肿瘤细胞的蛋白质、DNA、细胞膜，进而最终杀死肿瘤细胞，大程度的提高了青蒿素的抗癌疗效。

本发明还提供了一种超顺磁四氧化三铁纳米粒子药物载体的制备方法：

a)将碳包覆的四氧化三铁纳米粒子分散在NN二甲基甲酰胺溶液中，在70℃条件下，加入葡萄糖溶液，搅拌1h后，每隔30min逐滴加入硝酸银溶液，搅拌8h，然后冷却到室温，即得到表面沉积有银颗粒的碳包覆的四氧化三铁纳米粒子。

b)将按a)所述制得的表面沉积有银颗粒的碳包覆的四氧化三铁纳米粒子分散在乙醇溶液中，在50℃条件下，加入氨水搅拌30min后，逐滴加入正硅酸四乙酯的乙醇溶液，继续搅拌12h，然后冷却至室温，即得到二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳碳包覆的四氧化三铁纳米粒子。

c)将按b)所述制得的二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子分散在十六烷基三甲基溴化胺的水溶液中，在50℃条件下，加入碳酸钠搅拌10h，然后冷却到室温，即得到多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子。

d)超顺磁四氧化三铁纳米粒子药物载体装载天然抗癌药物青蒿素的方法，其特征在于将按7所述制得的多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子分散在丙酮溶液中，搅拌30min后加入6ml蒸馏水，继续搅拌直至体系中丙酮完全挥发。

优选的，所述的碳包覆的四氧化三铁纳米粒子按照以下方法制备：

将二茂铁分散于丙酮中，加入过氧化氢水溶液，密封、200℃～300℃下反应得到的。

优选的，在实施所述的b)前，先将表面沉积有银颗粒的碳包覆的四氧化三铁纳米粒子分散在十六烷基三甲基溴化铵的水溶液中搅拌3h，然后磁分离出表面沉积有银颗粒的碳包覆的四氧化三铁纳米粒子，其表面会带有正电荷。

本发明以在高压釜中水热分解二茂铁制备出碳包覆的四氧化三铁纳米粒子，用葡萄糖还原硝酸银的方法的在碳包覆的四氧化三铁表面沉积纳米银颗粒，采用溶胶凝胶技术有氨水水解正硅酸四乙酯在粒子表面包覆一层二氧化硅，在此过程中表面碳层会在氨水的作用下部分腐蚀，阳离子表活剂辅助腐蚀法将二氧化硅壳层腐蚀成多孔结构，同时碳层继续被腐蚀，使四氧化三铁表面裸露。利用纳米沉淀法将青蒿素装载到该多功能药物载体中。本发明将天然抗癌药物青蒿素装载到尺寸小于200nm的载体中，使其更容易通过静脉注射的方法到达肿瘤病灶，并被肿瘤细胞吞噬，克服了其疏水性差的缺点，同时利用肿瘤细胞的酸性环境，该药物载体能够释放出二价铁离子，二价铁离子裂解青蒿素中的过氧桥产生自由基，破坏肿瘤细胞的蛋白质、DNA、细胞膜，进而最终杀死肿瘤细胞，大程度的提高了青蒿素的抗癌疗效。本发明能够使青蒿素充分发挥其抗肿瘤作用，并作为一种天然抗癌药物在临床上得到广泛应用。

附图说明

图1为本发明实施例制备的多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子的原理图；

图2为本发明实施例制备的多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子的X射线衍射图谱；

图3为本发明实施例制备的多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子透射电镜照片；

图4为本发明实施例提供的装载了青蒿素的多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子红外光谱图；

图5为本发明实施例提供的装载了青蒿素的多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子在pH＝5的缓冲溶液中搅拌后上清液的紫外可见吸收谱图；

图6为本发明实施例提供的多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子与HeLa细胞培养后的荧光成像图片；

图7为本发明实施例提供的多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子与HeLa细胞培养后溶酶体标记的细胞荧光成像图片；

图8为本发明实施例提供的多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子与HeLa细胞培养后的生物切片透射电镜图片；

图9为本发明实施例提供的多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子与HeLa细胞培养后的细胞内二价铁离子含量变化图片；

图10为本发明实施例提供的多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子及其装载青蒿素后的细胞毒性实验结果图片。

具体实施方式

实施例1.

制备均匀的具有碳包覆的四氧化三铁纳米粒子，取0.3g二茂铁，溶解于30.0mL丙酮中，超声分散后再逐滴加入1.5ml的30％过氧化氢，搅拌30分钟后，将溶液转移到容量为50ml的高压釜里，密封加热至210℃，保温48h，然后冷却至室温，即得到黑色粉末状固体；然后乙醇和蒸馏水分别清洗样品3次，以除去该固体粉末中残余有机物；然后将样品干燥，即得到产物。

实施例2.

制备表面沉积有银颗粒的碳包覆的四氧化三铁纳米粒子，将按实施例1制得的碳包覆的四氧化三铁纳米粒子分散在NN二甲基甲酰胺溶液中，在70℃条件下搅拌，然后加入10ml葡萄糖的NN二甲基甲酰胺溶液(浓度为0.05g/ml)，继续搅拌1h后，向上述溶液中加入硝酸银的NN二甲基甲酰胺溶液(浓度为0.01M),加入方法为每隔30min逐滴加入2ml，待完全加入后，继续反应3h；然后乙醇和蒸馏水分别清洗样品3次，以除去该固体粉末中残余有机物；然后将样品干燥，即得到产物。

实施例3.

制备二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子，将按实施例2制得的表面沉积有银颗粒的碳包覆的四氧化三铁纳米粒子分散在十六烷基三甲基溴化铵的水溶液中(0,01M)，50℃条件下搅拌3h，然后蒸馏水和乙醇清洗样品1次；将清洗过的样品分散在40ml乙醇溶液中，在50℃条件下加入2ml氨水，搅拌30min后，逐滴加入正硅酸四乙酯的乙醇溶液，继续在50℃条件下搅拌12h；然后乙醇和蒸馏水分别清洗样品3次。

实施例4.

制备多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子，将按实施例3制得的二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子分散在9ml蒸馏水中，加入1ml十六烷基三甲基溴化铵水溶液(3mg/ml)，在50℃条件下搅拌30min，然后向溶液中加入100mg碳酸钠，继续搅拌10h；然后将样品分散在60ml含硝酸铵160mg的乙醇溶液中，回流12h以除去多余的十六烷基三甲基溴化铵，将产物在60℃条件下烘干12h，即得最终产物。

根据本实施例4产物的X射线衍射图(图2)，所有衍射峰位置分别对应于四氧化三铁和银颗粒的衍射面，显示产物为四氧化三铁和银；在23°有一个宽的衍射峰是属于二氧化硅的，产物的透射电子显微镜像(图3)可以看出产物为具有核壳结构的均匀球体，内部的四氧化三铁核的平均直径为132±6nm，外部的二氧化硅壳层的平均厚度为27nm，且为多孔结构。

实施例5.

多功能药物载体装载天然抗癌药物青蒿素，将按实施例4所述制得的多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子分散在丙酮溶液中，搅拌30min后逐滴加入6ml蒸馏水，继续搅拌直至体系中丙酮完全挥发。将样品磁分离分离后在室温下干燥，上清液收集后用紫外可见分光光度计检测药物装载量，装载量为484mg/g，用傅里叶红外光谱仪(FT-IR)检测药物装载情况。

根据本实施例5产物的红外光谱图(图4)，在1737cm^-1和800-1200cm^-1的峰是属于青蒿素的，说明青蒿素被装载到了药物载体内。

实施例6.

获得的装载了青蒿素的多功能药物载体在pH＝5的酸性环境下释放二价铁离子和药物的能力检测。将按实施例5所述制得的样品分散在pH＝5的缓冲溶液中，在37℃条件下搅拌5h，将产物磁分离后，取上清液，用紫外可见分光光度计检测。

根据本实施例6的上清液的紫外可见吸收谱图(图5)，在266nm有一吸收峰，该吸收峰是二价铁离子裂解青蒿素产生的中间产物的峰，说明在酸性条件下，二价铁离子和青蒿素同时从药物载体中释放出来并发生相互作用。

实施例7.

用荧光成像检技术检测根据实施例4制得的样品是否能被细胞吞噬。选用来自美国标准细胞库ATCC(Rockville,MD)的HeLa细胞作为靶细胞，HeLa细胞以单层形式生长在培养皿(Corning Glass Works)中，在细胞密度达到50％时加入根据实施例4制得的样品共同培养24小时，细胞用PBS缓冲溶液洗涤三次，加入新制的4％多聚甲醛的PBS溶液。成像实验在激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss LSM710)上进行。

荧光成像图片(图6)显示成像区域位于细胞内部，说明根据实施例4制得的样品能够进入细胞。

实施例8.

用溶酶体标记蛋白(如LAMP-1等)的方法进行根据实施例4制得的样品的亚细胞定位。HeLa细胞在硼硅酸盐盖玻片上培养，当密度达到50％后，用与脂质体均匀混合的GFP-LAMP-1对细胞进行转染，16h后向培养液中加入根据实施例4制得的样品继续培养24h。细胞用PBS缓冲溶液洗涤三次后保存在含有10％牛血清的培养基中(Hyclone,Logan,UT)，成像实验在激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss LSM710)上进行。荧光成像图片(图7)显示细胞内发光位置与溶酶体位置重合，说明根据实施例4制得的样品能够被细胞内吞进入细胞的溶酶体。

用生物切片透射成像的方法进行根据实施例4制得的样品的亚细胞定位。HeLa细胞以单层形式生长在培养皿(Corning Glass Works)中，在细胞密度达到50％时加入根据实施例4制得的样品共同培养24小时，收集细胞并用含有2.5％戊二醛的(Sigma)PBS缓冲液固定。脱水处理后将细胞嵌入环氧树脂粘结剂中，切割超薄切片，置于铜网上，进行透射电镜(TEM)成像。透射电镜图片(图8)显示实施例4制得的样品主要位于细胞内的溶酶体中。

实施例9.

用铁离子试剂盒(Catalog Number MAK025,Sigma)检测肿瘤细胞中二价铁离子含量。HeLa细胞以单层形式生长在96孔板(Corning Glass Works)中，在细胞密度达到50％时加入根据施例4制得的样品共同培养24小时，加入二价铁离子检测试剂，震荡使混合均匀，避光条件下使反应进行30min，然后加入二价铁离子探针试剂，避光反应60min。用光谱光度测量酶标仪在593nm处检测吸光度，根据标准的吸光度—二价铁离子浓度曲线计算出待测浓度。图片(图9)显示HeLa细胞吞噬实根据施例4制得的样品后，会有二价铁离子释放出来，细胞内铁离子含量升高到2.765nmol/L。

实施例10.

选取HeLa细胞，通过MTT实验研究粒子的生物相容性和装载青蒿素后的细胞毒性。以HeLa细胞作为靶细胞，用常用的四甲基偶氮唑盐(MTT)方法对根据施例4制得的样品的生物相容性以及载药后的抗肿瘤活性进行评估。HeLa细胞以单层形式生长在96孔板(CorningGlass Works)中，在细胞密度达到50％时加入相应的样品共同培养，实验分为4组，分别是不同浓度的根据实施例4、5制得的样品溶液，不同浓度青蒿素溶液各100ul和不加任何材料的对照组。细胞和粒子培养24小时后更换为新鲜培养基，并加入MTT溶液继续培养4h，使得存活的细胞线粒体上的琥珀酸脱氢酶将黄色的MTT转化为不溶于水的蓝紫色的甲瓒晶体，再以二甲亚砜(DMSO)充分溶解蓝紫色晶体形成甲瓒溶液，最后用酶标仪(ELISA)测定该衍生的MTT溶液的光学强度(最大吸收位置为570nm)，间接的反映活细胞的浓度。图片(图10)显示根据实施例5制得的样品对HeLa细胞的生长抑制率比单独的青蒿素高，说明将青蒿素装载到能释放二价铁离子的药物载体中，能提高青蒿素的抗癌疗效。

Claims (10)

1.一种超顺磁四氧化三铁纳米粒子药物载体，为多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子,其特征在于，包括：

超顺磁四氧化三铁纳米粒子，所述超顺磁四氧化三铁纳米粒子由尺寸小于10nm的四氧化三铁纳米晶粒聚合而成，在酸性条件下能释放二价铁离子；

包覆在所述超顺磁四氧化三铁纳米粒子表面的碳层，所述碳层为无定形碳，在碱性条件下可分解；

包覆在所述碳层表面的银纳米粒子；

包覆在所述银颗粒表面的二氧化硅层，所述二氧化硅层为多孔结构。

2.根据权利要求1所述的药物载体，其特征在于，所述药物载体具有荧光成像功能。

3.根据权利要求1所述的药物载体，其特征在于，所述药物载体具有磁共振成像功能。

4.根据权利要求1所述的药物载体，其特征在于，所述药物载体能够装载天然抗癌药物青蒿素。

5.根据权利要求1所述的药物载体，其特征在于，所述药物载体具有pH响应性，在酸性环境中能够释放出二价铁离子。

6.制备权利要求1所述的药物载体的方法，其特征在于将碳包覆的四氧化三铁纳米粒子分散在NN二甲基甲酰胺溶液中，在70℃条件下，加入葡萄糖和硝酸银溶液搅拌8h，然后冷却到室温，即得到表面沉积有银颗粒的碳包覆的四氧化三铁纳米粒子；将其分散在十六烷基三甲基溴化铵的水溶液中搅拌3h，然后磁分离出表面沉积有银颗粒的碳包覆的四氧化三铁纳米粒子，其表面会带有正电荷；然后将其分散在乙醇溶液中，在50℃条件下，加入氨水和正硅酸四乙酯搅拌12h，然后冷却至室温，即得到二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子；再将其分散在十六烷基三甲基溴化胺的水溶液中，在50℃条件下，加入碳酸钠搅拌10h，然后冷却到室温，即得到多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述碳包覆的四氧化三铁纳米粒子是将二茂铁分散于丙酮中，加入过氧化氢水溶液，密封、200℃～300℃下反应得到的。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，硝酸银溶液加入方法是每30min逐滴加入2ml。

9.权利要求1所述的药物载体在装载天然抗癌药物青蒿素中的应用，其特征在于将药物载体即多孔二氧化硅包覆的表面沉积有银颗粒的多孔碳包覆的四氧化三铁纳米粒子分散在丙酮溶液中，搅拌30min后加入6ml蒸馏水，继续搅拌直至体系中丙酮完全挥发。

10.权利要求1所述的药物载体在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用，其特征在于使用该药物载体装载青蒿素，将更多的青蒿素通过静脉注射运送到肿瘤病灶部位，到达肿瘤部位后，由于肿瘤细胞处于酸性微环境，药物载体在细胞内释放二价铁离子，二价铁离子裂解青蒿素中的过氧桥产生自由基，破坏肿瘤细胞的蛋白质、DNA、细胞膜，进而最终杀死肿瘤细胞。