CN105056244A - 一种介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系及其制备方法与应用，可有效解决介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系的制备，实现在制备治疗抗肿瘤药物中的应用问题，该体系是，透明质酸通过腙键与中空介孔磁性纳米粒化学连接，在水介质中形成纳米层，Fe2+依赖性抗肿瘤药物进入中空介孔磁性纳米粒的介孔内，构成介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系；所述介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系的粒径为20-500nm；所述和透明质酸为分子量为600-400000道尔顿，本发明远程定位调控肿瘤多机制治疗，经济和社会效益巨大。
Description
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系及其制备方法与应用。
背景技术
1．Fe2+供体和Fe2+依赖性药物（青蒿素类)共转运可显著增强治疗作用
青蒿素(artemisinin，ART)是从中药黄花蒿中分离得到的倍半萜内酯化合物，随后又合成了一系列衍生物（双氢青蒿素，青蒿琥酯等），被广泛用于疟疾的治疗。已有实验证明，青蒿素类药物（为了方便，以下文中以青蒿素（ART）代表）除具有上述治疗作用外，还对肿瘤细胞有很强的杀伤作用。
肿瘤细胞内的Fe2+能和青蒿素类分子内特有的过氧桥结构(-O-O-)反应，产生以碳原子为核心的自由基或亲电子化合物。此类产物为强烷化剂，通过攻击细胞膜性结构或直接氧化蛋白质分子，以及破坏DNA结构而诱发机体氧化应激反应，导致细胞死亡，为一类Fe2+依赖性抗肿瘤药物。因此，Fe2+是青蒿素类药物发挥其肿瘤细胞杀伤作用的必要条件。
那么如何使该类药物最大程度的发挥抗肿瘤作用呢？设计Fe2+和该类药物的共转运体系将会有效解决该问题。
有文献报道使用转铁蛋白（体内唯一能够转运铁离子的内源性蛋白）介导青蒿素类药物传递，从而实现Fe2+和该类药物的共转运，对人肝癌(HepG2)及肺癌(A549)细胞株均有良好的抗肿瘤效果。但是，该递药体系存在Fe2+转运量有限、载药量偏低、机制单一等缺点。
2．中空介孔四氧化三铁（HollowIONPs）的特点
HollowIONPs内部具有较大的中空结构，其中空和孔道结构均可荷载药物，具有很高的药物荷载能力。而且具有pH响应型释药功能。在人体中性环境下，HollowIONPs能够保持结构的完整性，而在肿瘤部位偏酸性环境下，HollowIONPs结构会逐步消蚀，荷载的药物随之释放进入肿瘤细胞，实现肿瘤靶部位定点释药的目的，减少药物的毒副作用。同时由于空心球壳层的保护作用，药物在输送过程中可避免与血浆蛋白或其他生物分子相互作用，因此，可保护药物避免被酶解。
另外，HollowIONPs在交变磁场照射下可以产生热和活性氧。与传统热疗方式（射频、超声、微波等）相比，交变磁场介导的热疗可以在更低的培养温度及更短时间内显著增加细胞膜及血脑屏障的穿透性，为肿瘤治疗提供了一个安全有效的治疗方式。利用HollowIONPs在交变磁场照射下产生活性氧的性质，可实现磁动力学治疗-化疗协同治疗目的。
3．透明质酸（HA）修饰纳米载体的优势
HA因其亲水性、良好的生物相容性、生物可降解性、非免疫原性、肿瘤靶向性（受体为CD44）等优势已作为药物载体或靶向分子应用于药物新型给药系统中,并已成为近年来肿瘤治疗研究的热点，被广泛应用于靶向分子成像、靶向药物以及基因治疗等方面。HA修饰的纳米粒不仅可以增加其亲水性和稳定性，延长血液循环时间,还能提高纳米粒的肿瘤靶向性。
另外，由于肿瘤处与正常组织处的pH差异，使pH响应性药物控释载体在治疗肿瘤方面有着很大优势。利用pH响应性化学键修饰纳米载体，是构建pH响应性载药体系的重要途径。而腙键具有显著的pH敏感性，在偏酸性生理环境下（如肿瘤，pH＜7）会很快水解，而在中性生理环境中则稳定存在（如血液，pH7.4）。因此利用腙键可实现客体分子在肿瘤部位的定点释放，具有广阔的应用前景，但至今未见有利用HollowIONPs对交变磁场的敏感性，可以通过交变磁场远程调控，实现对肿瘤的定位多机制治疗药物的公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系及其制备方法与应用，可有效解决介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系的制备，实现在制备治疗抗肿瘤药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，该体系是，透明质酸通过腙键与中空介孔磁性纳米粒（HollowIONPs）化学连接，在水介质中形成纳米层，Fe2+依赖性抗肿瘤药物进入中空介孔磁性纳米粒（HollowIONPs）的介孔内，构成介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系；所述介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系的粒径为20-500nm；所述和透明质酸为分子量为600-400000道尔顿。包括以下步骤：
(1)合成中空介孔磁性纳米粒(HollowIONPs)：室温下，将0.16-0.80g的十二烷基苯磺酸钠加入到15-75ml的乙二醇中，搅拌，成澄清透明溶液，然后将0.54-2.5g的氯化铁和0.93-4.5g的乙酸钠加入澄清透明溶液中，搅拌均匀，放入高压反应釜，密封，在150-200℃下反应8-20小时，析出黑色产物，用磁铁吸取黑色产物，弃去液体，黑色产物依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤至中性，将洗涤后的产物放在60℃的真空干燥箱中干燥12-24小时，成中空介孔磁性纳米粒(HollowIONPs)；
(2)中空介孔磁性纳米粒(HollowIONPs)与对羧基苯肼的合成反应：将0.2-0.8g的中空介孔磁性纳米粒溶解在pH7.4的PBS溶液中，得4mg/ml的中空介孔磁性纳米粒溶液，加入0.40-1.60g巯基乙胺（CYS），搅拌24h，透析，冻干，得HollowIONPs-CYS（巯基乙胺修饰的载体）；分别称取HollowIONPs-CYS50-80mg和HBA（对羧基苯肼）50-80mg加入到50-100mlpH7.4的PBS溶液中，超声溶解，分别加入EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）80-120mg和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）35-60mg，室温下氮气保护避光反应24-48小时，再用无水乙醇200-300ml沉淀，过滤，用无水乙醇洗涤除去EDC、NHS和多余的HBA，60℃真空干燥24h，得到HollowIONPs-HBA，4℃保存；
(3)HA（透明质酸）与HollowIONPs-HBA的反应：分别称取50-80mgHollowIONPs-HBA和80-100mgHA加入到50-60mlDMSO中，超声溶解，室温下避光搅拌24-48h，透析48-72h，每隔8h换液，除去DMSO和多余的HA，冷冻干燥得HA-HollowIONPs，4℃保存；
(4)HA-HollowIONPs负载Fe2+依赖性药物的制备：称取5-20mgHA-HollowIONPs载体，加入到2.5-40ml超纯水中，超声溶解，与乙醇或水溶解的Fe2+依赖性药物混合，经超声或高压均质处理，室温搅拌，采用透析、超滤或柱分离除去有机溶剂及游离药物，冻干，得介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系；
所述的Fe2+依赖性药物是含有过氧基团的倍半萜内酯化合物，优选自青蒿素类药物，包括青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚和二氢青蒿素。
本发明涉及一种具有介孔门控功能的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系。其方法为通过水热合成法制备多功能中空介孔磁性纳米粒（HollowIONPs）,以该材料为基体(比表面积大，容量大，密度小，Fe2+供体)，Fe2+依赖性药物(以青蒿素代表:ART)为药物模型,通过腙键连接透明质酸（HA）分子，实现肿瘤靶向性和药物释放的门控作用。该体系在交变磁场照射下产热和活性氧（ROS），并实现Fe2+供体与Fe2+依赖性药物共转运、药物定位释放、同一位点多机制治疗肿瘤（热、活性氧和化学药物），达到远程定位调控肿瘤多机制治疗的目的，经济和社会效益巨大。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明在具体实施中，介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系由以下步骤实现：
(1)合成中空介孔磁性纳米粒(HollowIONPs)：室温下，将0.3-0.6g的十二烷基苯磺酸钠加入到30-50ml的乙二醇中，搅拌，成澄清透明溶液，然后将1-2g的氯化铁和2-3.5g的乙酸钠加入澄清透明溶液中，搅拌均匀，放入高压反应釜，密封，在160-180℃下反应10-15小时，析出黑色产物，用磁铁吸取黑色产物，弃去液体，黑色产物依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤至中性，将洗涤后的产物放在60℃的真空干燥箱中干燥15-20小时，成中空介孔磁性纳米粒(HollowIONPs)；
(2)中空介孔磁性纳米粒(HollowIONPs)与对羧基苯肼的合成反应：将0.4-0.6g的中空介孔磁性纳米粒溶解在pH7.4的PBS溶液中，得4mg/ml的中空介孔磁性纳米粒溶液，加入0.8-1.2g巯基乙胺（CYS），搅拌24h，截留分子量3500的透析袋透析，冻干，得HollowIONPs-CYS（巯基乙胺修饰的载体）；分别称取HollowIONPs-CYS60-70mg和HBA（对羧基苯肼）60-70mg加入到65-85mlpH7.4的PBS溶液中，超声溶解，分别加入EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）90-110mg和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）40-50mg，室温下氮气保护避光反应30-40小时，再用无水乙醇230-270ml沉淀，0.22μm的微孔滤膜过滤，用无水乙醇洗涤除去EDC、NHS和多余的HBA，60℃真空干燥24h，得到HollowIONPs-HBA，4℃保存；
(3)HA（透明质酸）与HollowIONPs-HBA的反应：分别称取60-70mgHollowIONPs-HBA和85-95mgHA加入到53-57mlDMSO中，超声溶解，室温下避光搅拌30-40h，透析55-65h，每隔8h换液，除去DMSO和多余的HA，冷冻干燥得HA-HollowIONPs，4℃保存；
(4)HA-HollowIONPs负载Fe2+依赖性药物的制备：称取10-15mgHA-HollowIONPs载体，加入到10-30ml超纯水中，探头超声溶解，与乙醇或水溶解的Fe2+依赖性药物混合，经超声或高压均质处理，室温搅拌，采用透析、超滤或柱分离除去有机溶剂及游离药物，冻干，得介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系。
实施例2
本发明在具体实施中，介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系由以下步骤实现：
(1)合成中空介孔磁性纳米粒(HollowIONPs)：室温下，将0.16g的十二烷基苯磺酸钠加入到15ml的乙二醇中，搅拌，成澄清透明溶液，然后将0.54g的氯化铁和0.93g的乙酸钠加入澄清透明溶液中，搅拌均匀，放入高压反应釜，密封，在150-200℃下反应8-20小时，析出黑色产物，用磁铁吸取黑色产物，弃去液体，黑色产物依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤至中性，将洗涤后的产物放在60℃的真空干燥箱中干燥12-24小时，成中空介孔磁性纳米粒(HollowIONPs)；
(2)中空介孔磁性纳米粒(HollowIONPs)与对羧基苯肼的合成反应：将0.2g的中空介孔磁性纳米粒溶解在pH7.4的PBS溶液中，得4mg/ml的中空介孔磁性纳米粒溶液，加入0.40g巯基乙胺（CYS），搅拌24h，截留分子量3500的透析袋透析，冻干，得HollowIONPs-CYS（巯基乙胺修饰的载体）；分别称取HollowIONPs-CYS50mg和HBA（对羧基苯肼）50mg加入到50-100mlpH7.4的PBS溶液中，超声溶解，分别加入EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）80mg和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）35mg，室温下氮气保护避光反应24小时，再用无水乙醇200ml沉淀，0.22μm的微孔滤膜过滤，用无水乙醇洗涤除去EDC、NHS和多余的HBA，60℃真空干燥24h，得到HollowIONPs-HBA，4℃保存；
(3)HA（透明质酸）与HollowIONPs-HBA的反应：分别称取50mgHollowIONPs-HBA和80mg分子量12000道尔顿HA加入到50mlDMSO中，超声溶解，室温下避光搅拌24h，截留分子量14000透析48h，每隔8h换液，除去DMSO和多余的HA，冷冻干燥得HA-HollowIONPs，4℃保存；
(4)HA-HollowIONPs负载Fe2+依赖性药物的制备：称取5mgHA-HollowIONPs载体，加入到2.5ml超纯水中，探头超声溶解，与乙醇或水溶解的Fe2+依赖性药物混合，经超声或高压均质处理，室温搅拌，采用透析、超滤或柱分离除去有机溶剂及游离药物，冻干，得介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系。
实施例3
本发明在具体实施中，介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系由以下步骤实现：
(1)合成中空介孔磁性纳米粒(HollowIONPs)：室温下，将0.48g的十二烷基苯磺酸钠加入到45ml的乙二醇中，搅拌，成澄清透明溶液，然后将1.52g的氯化铁和2.72g的乙酸钠加入澄清透明溶液中，搅拌均匀，放入高压反应釜，密封，在175℃下反应14小时，析出黑色产物，用磁铁吸取黑色产物，弃去液体，黑色产物依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤至中性，将洗涤后的产物放在60℃的真空干燥箱中干燥18小时，成中空介孔磁性纳米粒(HollowIONPs)；
(2)中空介孔磁性纳米粒(HollowIONPs)与对羧基苯肼的合成反应：将0.5g的中空介孔磁性纳米粒溶解在pH7.4的PBS溶液中，得4mg/ml的中空介孔磁性纳米粒溶液，加入1.0g巯基乙胺（CYS），搅拌24h，截留分子量3500的透析袋透析，冻干，得HollowIONPs-CYS（巯基乙胺修饰的载体）；分别称取HollowIONPs-CYS65mg和HBA（对羧基苯肼）65mg加入到75mlpH7.4的PBS溶液中，超声溶解，分别加入EDC（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）100mg和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）47.5mg，室温下氮气保护避光反应36小时，再用无水乙醇250ml沉淀，0.22μm的微孔滤膜过滤，用无水乙醇洗涤除去EDC、NHS和多余的HBA，60℃真空干燥24h，得到HollowIONPs-HBA，4℃保存；
(3)HA（透明质酸）与HollowIONPs-HBA的反应：分别称取65mgHollowIONPs-HBA和90mgHA加入到55mlDMSO中，超声溶解，室温下避光搅拌36h，截留分子量14000的透析袋透析60h，每隔8h换液，除去DMSO和多余的HA，冷冻干燥得HA-HollowIONPs，4℃保存；
(4)HA-HollowIONPs负载Fe2+依赖性药物的制备：称取12.5mgHA-HollowIONPs载体，加入到21ml超纯水中，探头超声溶解，与乙醇或水溶解的Fe2+依赖性药物混合，经超声或高压均质处理，室温搅拌，采用透析、超滤或柱分离除去有机溶剂及游离药物，冻干，得介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系。
所述的介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系有效用于制备注射剂、口服剂或植入给药剂的抗肿瘤药物，实现介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系在制备注射剂、口服剂或植入给药剂的抗肿瘤药物中的应用。
所述的介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系有效用于制备抗肿瘤靶向给药、肿瘤部位的酸度敏感释药、肿瘤的化学治疗以及交变磁场照射下的肿瘤多机制治疗药物，实现介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系在制备抗肿瘤靶向给药、肿瘤部位的酸度敏感释药、肿瘤的化学治疗以及交变磁场照射下的肿瘤多机制治疗药物中的应用。
本发明提供了一种介孔门控型Fe2+供体和Fe2+依赖性药物共转运载药体系，选择具有高药物荷载量及生物相容性的中空介孔四氧化三铁纳米粒（HollowIONPs）作为基体材料，以青蒿素类药物为模型药物，构建一种交变磁场远程调控、介孔门控型磁性药物转运体系；该纳米体系的粒径为20-500nm,尺寸均一、分散性好；该体系主要具有以下特点：1)该载体在肿瘤弱酸性及还原性的特定环境下可作为Fe2+供体，实现Fe2+依赖性药物ART与Fe2+供体共转运，增强青蒿素类药物抗肿瘤作用；2)HollowIONPs在交变磁场下可产生热和活性氧，可与药物同位点发挥治疗作用；3)HollowIONPs中空多孔结构的高药物容量，可有效解决青蒿素类溶解性差的问题，并可使药物在靶部位缓释；4)载体具有门控释药功能。本发明还提供了一种介孔门控型Fe2+供体和Fe2+依赖性药物共转运载药体系的制备方法和应用。
本发明方法简单、有效的Fe2+供体和Fe2+依赖性药物共转运载药体系。由Fe2+供体(HollowIONPs载体)及Fe2+依赖性药物(青蒿素类，以ART代表)组成；荷载ART的HollowIONPs通过内吞作用进入肿瘤细胞，进一步分布在核内体和溶酶体等酸性细胞器中，HollowIONPs在酸性环境下分解，生成并释放Fe2+，Fe2+通过非酶促反应与ART的内过氧桥相互作用，生成活性自由基，从而有效杀死癌细胞，显著增强了ART的抗肿瘤效果。
本发明在HollowIONPs的表面化学修饰上透明质酸(HA)；采用腙键将HA连接到HollowIONPs的表面，封堵其介孔结构，到达肿瘤部位后，肿瘤细胞的弱酸性环境使得腙键快速分解，HA脱去，释放药物，实现门控效应。减少药物在到达肿瘤靶作用部位前的释放，实现药物的定点输送，最大程度的提高药物的疗效。最终达到改善其分散性及生物相容性、增加载药体系在体内循环时间、提高对肿瘤的靶向能力、实现药物的定点聚集释放目的。
本发明采用交变磁场照射给药后的肿瘤部位；利用HollowIONPs对交变磁场的敏感性，可以通过交变磁场远程调控，实现对肿瘤的定位多机制治疗（磁热及磁动力学治疗联合化疗）。交变磁场具有穿透组织或器官能力强，远程调控，无损伤性，可用于深部肿瘤治疗等特点。
所述的Fe2+供体和Fe2+依赖性药物共转运载药体系，可以用于注射、口服或植入给药。其中注射给药优选注射剂、冻干粉针，口服给药优选自片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂，植入给药优选自凝胶剂，溶液剂。
所述的介孔门控型Fe2+供体和Fe2+依赖性药物共转运载药体系，可用于肿瘤部位的靶向给药、肿瘤部位的酸度敏感释药、肿瘤的化学治疗以及交变磁场照射下的肿瘤多机制治疗。
有关试验资料如下：
一、HA-HollowIONPs在交变磁场下的产热效应
配制一系列浓度的HA-HollowIONPs水溶液，采用交变磁场以300kHz的功率进行照射，并于0、5、10、15、20、25、30min测量溶液的温度，证明HA-HollowIONPs纳米材料在交变磁场照射下具有较好的磁热效应，可用于肿瘤的磁热治疗。
二、HA-HollowIONPs在交变磁场下的活性氧生成测定
将HA-HollowIONPs与MCF-7细胞共孵育6h后，在交变磁场照射（300kHz）30min后，使用活性氧试剂盒检测细胞内活性氧的诱导生成量。经流式细胞仪检测，HA-HollowIONPs在交变磁场下活性氧产生具有浓度依赖性，浓度为20μg/ml和50μg/ml时，活性氧产生量分别为36.7%和59.8%。
三、HollowIONPs在酸性环境下的Fe2+生成测定
配制100μg/ml的HollowIONPs水溶液，溶剂分别为不同pH值的磷酸盐PBS缓冲液（7.4：模拟正常体液及4.0：模拟溶酶体）中，100r/min,37℃条件下震荡，每隔一定时间取出部分，采用邻二氮菲法测定Fe2+浓度。结果表明HollowIONPs在酸性环境下较容易分解产生Fe2+，这表明HollowIONPs在肿瘤酸性部位会环境敏感性的释放Fe2+，与Fe2+依赖性药物（如ART）产生协同作用。
四、HA-HollowIONPs在酸性环境下的药物控释
将HA-HollowIONPs/ART置于透析袋内（截留分子量MW=3500Da）中，浸入不同pH值的磷酸盐PBS缓冲液（7.4：模拟正常体液、6.5：模拟肿瘤组织及4.0：模拟溶酶体）中，100r/min,37℃条件下震荡，每隔一定时间取出部分，采用HPLC-MS法测定青蒿素，测定其浓度并计算释放速度。结果表明该制剂释药具有明显的酸度敏感性，释药速度为：pH4.0>pH6.5>pH7.4。
五、HA-HollowIONPs负载青蒿素载药体系的抗肿瘤活性测定
体外抗肿瘤活性（以人乳腺癌细胞株MCF-7为研究对象）：时间效应（有/无交变磁场）：用HA-HollowIONPs/ART对细胞进行一次处理，并同时用交变磁场照射一定时间后，在不同时间点考察其对肿瘤细胞生长的抑制作用（SRB法或其它方法测定）；剂量效应（有/无交变磁场）：用不同剂量HA-HollowIONPs/ART处理细胞，交变磁场照射一定时间，考察其对肿瘤细胞生长的抑制作用（SRB法或其它方法测定）。
以上实验均设不同实验组：HollowIONPs、HA-HollowIONPs、ART、HollowIONPs/ART、HA-HollowIONPs/ART等。结果表明HA-HollowIONPs/ART对细胞的抑制作用具有明显的时间依赖性及浓度依赖性，且ART及HA-HollowIONPs具有显著的协同抑瘤作用；与其它组相比，在交变磁场照射下HA-HollowIONPs/ART对肿瘤细胞的抑制作用最强。
体内抗肿瘤活性（有/无交变磁场）：将MCF-7细胞接种到裸鼠胁腹的皮下,隔天监测肿瘤的生长情况，并记录裸鼠的一般状况。当肿瘤体积达到100-300mm3时，将动物随机分组并开始处理（静脉注射）：①ART；②HollowIONPs；③HA-HollowIONPs；④HollowIONPs/ART；⑤HA-HollowIONPs/ART。同时设生理盐水对照组和阳性对照组。连续监测肿瘤体积直到动物处死为止。到第七周时，处死所有小鼠，取出肿瘤,称重。按照相对肿瘤增殖率T/C评价效果。
试验结果表明HA-HollowIONPs/ART在体内取得了显著的抑瘤效应，特别是在交变磁场照射下，相对肿瘤增值率最小。
经上述实验与实地应用，证明本发明与现有技术相比具有以下突出的优点和有益技术效果：
(1)中空介孔四氧化三铁（HollowIONPs）作为难溶性药物青蒿素及其类似物的载体，①实现Fe2+供体与Fe2+依赖性药物青蒿素的共转运，发挥肿瘤协同治疗作用，显著降低药物的使用剂量和毒副作用，提高药物的治疗效率；②有效解决其溶解性问题，实现药物有效负载及药物在肿瘤靶部位的控释；
(2)HollowIONPs具有交变磁场-热转换特性以及交变磁场-活性氧产生特性，采用交变磁场定向照射转运载体，所产生的热和活性氧与所荷载的药物可在同一位点发挥作用，达到远程调控定位多机制治疗目的，具有深度穿透，远程调控，无损伤性等特点；
(3)使用透明质酸（HA）通过腙键进行化学修饰，可以改善磁性载体的分散性及生物相容性，实现长循环、主动靶向、药物定点门控释放，提高了对肿瘤的治疗效果，开辟了治疗肿瘤药物的新途径，经济和社会效益巨大。
Claims (7)
1.一种介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系，其特征在于，该体系是，透明质酸通过腙键与中空介孔磁性纳米粒化学连接，在水介质中形成纳米层，Fe2+依赖性抗肿瘤药物进入中空介孔磁性纳米粒的介孔内，构成介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系；所述介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系的粒径为20-500nm；所述和透明质酸为分子量为600-400000道尔顿。
2.权利要求1所述的介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成中空介孔磁性纳米粒：室温下，将0.16-0.80g的十二烷基苯磺酸钠加入到15-75ml的乙二醇中，搅拌，成澄清透明溶液，然后将0.54-2.5g的氯化铁和0.93-4.5g的乙酸钠加入澄清透明溶液中，搅拌均匀，放入高压反应釜，密封，在150-200℃下反应8-20小时，析出黑色产物，用磁铁吸取黑色产物，弃去液体，黑色产物依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤至中性，将洗涤后的产物放在60℃的真空干燥箱中干燥12-24小时，成中空介孔磁性纳米粒；
(2)中空介孔磁性纳米粒与对羧基苯肼的合成反应：将0.2-0.8g的中空介孔磁性纳米粒溶解在pH7.4的PBS溶液中，得4mg/ml的中空介孔磁性纳米粒溶液，加入0.40-1.60g巯基乙胺，搅拌24h，透析，冻干，得HollowIONPs-CYS；分别称取HollowIONPs-CYS50-80mg和HBA50-80mg加入到50-100mlpH7.4的PBS溶液中，超声溶解，分别加入EDC80-120mg和NHS35-60mg，室温下氮气保护避光反应24-48小时，再用无水乙醇200-300ml沉淀，过滤，用无水乙醇洗涤除去EDC、NHS和多余的HBA，60℃真空干燥24h，得到HollowIONPs-HBA，4℃保存；
(3)HA与HollowIONPs-HBA的反应：分别称取50-80mgHollowIONPs-HBA和80-100mgHA加入到50-60mlDMSO中，超声溶解，室温下避光搅拌24-48h，透析48-72h，每隔8h换液，除去DMSO和多余的HA，冷冻干燥得HA-HollowIONPs，4℃保存；
(4)HA-HollowIONPs负载Fe2+依赖性药物的制备：称取5-20mgHA-HollowIONPs载体，加入到2.5-40ml超纯水中，超声溶解，与乙醇或水溶解的Fe2+依赖性药物混合，经超声或高压均质处理，室温搅拌，采用透析、超滤或柱分离除去有机溶剂及游离药物，冻干，得介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系；
所述的Fe2+依赖性药物为青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚和二氢青蒿素。
3.根据权利要求2所述的介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成中空介孔磁性纳米粒：室温下，将0.3-0.6g的十二烷基苯磺酸钠加入到30-50ml的乙二醇中，搅拌，成澄清透明溶液，然后将1-2g的氯化铁和2-3.5g的乙酸钠加入澄清透明溶液中，搅拌均匀，放入高压反应釜，密封，在160-180℃下反应10-15小时，析出黑色产物，用磁铁吸取黑色产物，弃去液体，黑色产物依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤至中性，将洗涤后的产物放在60℃的真空干燥箱中干燥15-20小时，成中空介孔磁性纳米粒；
(2)中空介孔磁性纳米粒与对羧基苯肼的合成反应：将0.4-0.6g的中空介孔磁性纳米粒溶解在pH7.4的PBS溶液中，得4mg/ml的中空介孔磁性纳米粒溶液，加入0.8-1.2g巯基乙胺，搅拌24h，截留分子量3500的透析袋透析，冻干，得HollowIONPs-CYS；分别称取HollowIONPs-CYS60-70mg和HBA60-70mg加入到65-85mlpH7.4的PBS溶液中，超声溶解，分别加入EDC90-110mg和NHS40-50mg，室温下氮气保护避光反应30-40小时，再用无水乙醇230-270ml沉淀，0.22μm的微孔滤膜过滤，用无水乙醇洗涤除去EDC、NHS和多余的HBA，60℃真空干燥24h，得到HollowIONPs-HBA，4℃保存；
(3)HA与HollowIONPs-HBA的反应：分别称取60-70mgHollowIONPs-HBA和85-95mgHA加入到53-57mlDMSO中，超声溶解，室温下避光搅拌30-40h，透析55-65h，每隔8h换液，除去DMSO和多余的HA，冷冻干燥得HA-HollowIONPs，4℃保存；
(4)HA-HollowIONPs负载Fe2+依赖性药物的制备：称取10-15mgHA-HollowIONPs载体，加入到10-30ml超纯水中，探头超声溶解，与乙醇或水溶解的Fe2+依赖性药物混合，经超声或高压均质处理，室温搅拌，采用透析、超滤或柱分离除去有机溶剂及游离药物，冻干，得介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系。
4.根据权利要求2所述的介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成中空介孔磁性纳米粒：室温下，将0.16g的十二烷基苯磺酸钠加入到15ml的乙二醇中，搅拌，成澄清透明溶液，然后将0.54g的氯化铁和0.93g的乙酸钠加入澄清透明溶液中，搅拌均匀，放入高压反应釜，密封，在150-200℃下反应8-20小时，析出黑色产物，用磁铁吸取黑色产物，弃去液体，黑色产物依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤至中性，将洗涤后的产物放在60℃的真空干燥箱中干燥12-24小时，成中空介孔磁性纳米粒；
(2)中空介孔磁性纳米粒与对羧基苯肼的合成反应：将0.2g的中空介孔磁性纳米粒溶解在pH7.4的PBS溶液中，得4mg/ml的中空介孔磁性纳米粒溶液，加入0.40g巯基乙胺，搅拌24h，截留分子量3500的透析袋透析，冻干，得HollowIONPs-CYS；分别称取HollowIONPs-CYS50mg和HBA50mg加入到50-100mlpH7.4的PBS溶液中，超声溶解，分别加入EDC80mg和NHS35mg，室温下氮气保护避光反应24小时，再用无水乙醇200ml沉淀，0.22μm的微孔滤膜过滤，用无水乙醇洗涤除去EDC、NHS和多余的HBA，60℃真空干燥24h，得到HollowIONPs-HBA，4℃保存；
(3)HA与HollowIONPs-HBA的反应：分别称取50mgHollowIONPs-HBA和80mg分子量12000道尔顿HA加入到50mlDMSO中，超声溶解，室温下避光搅拌24h，截留分子量14000透析48h，每隔8h换液，除去DMSO和多余的HA，冷冻干燥得HA-HollowIONPs，4℃保存；
(4)HA-HollowIONPs负载Fe2+依赖性药物的制备：称取5mgHA-HollowIONPs载体，加入到2.5ml超纯水中，探头超声溶解，与乙醇或水溶解的Fe2+依赖性药物混合，经超声或高压均质处理，室温搅拌，采用透析、超滤或柱分离除去有机溶剂及游离药物，冻干，得介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系。
5.根据权利要求2所述的介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成中空介孔磁性纳米粒：室温下，将0.48g的十二烷基苯磺酸钠加入到45ml的乙二醇中，搅拌，成澄清透明溶液，然后将1.52g的氯化铁和2.72g的乙酸钠加入澄清透明溶液中，搅拌均匀，放入高压反应釜，密封，在175℃下反应14小时，析出黑色产物，用磁铁吸取黑色产物，弃去液体，黑色产物依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤至中性，将洗涤后的产物放在60℃的真空干燥箱中干燥18小时，成中空介孔磁性纳米粒；
(2)中空介孔磁性纳米粒与对羧基苯肼的合成反应：将0.5g的中空介孔磁性纳米粒溶解在pH7.4的PBS溶液中，得4mg/ml的中空介孔磁性纳米粒溶液，加入1.0g巯基乙胺，搅拌24h，截留分子量3500的透析袋透析，冻干，得HollowIONPs-CYS；分别称取HollowIONPs-CYS65mg和HBA65mg加入到75mlpH7.4的PBS溶液中，超声溶解，分别加入EDC100mg和NHS47.5mg，室温下氮气保护避光反应36小时，再用无水乙醇250ml沉淀，0.22μm的微孔滤膜过滤，用无水乙醇洗涤除去EDC、NHS和多余的HBA，60℃真空干燥24h，得到HollowIONPs-HBA，4℃保存；
(3)HA与HollowIONPs-HBA的反应：分别称取65mgHollowIONPs-HBA和90mgHA加入到55mlDMSO中，超声溶解，室温下避光搅拌36h，截留分子量14000的透析袋透析60h，每隔8h换液，除去DMSO和多余的HA，冷冻干燥得HA-HollowIONPs，4℃保存；
(4)HA-HollowIONPs负载Fe2+依赖性药物的制备：称取12.5mgHA-HollowIONPs载体，加入到21ml超纯水中，探头超声溶解，与乙醇或水溶解的Fe2+依赖性药物混合，经超声或高压均质处理，室温搅拌，采用透析、超滤或柱分离除去有机溶剂及游离药物，冻干，得介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系。
6.权利要求1所述的介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系在制备注射剂、口服剂或植入给药剂的抗肿瘤药物中的应用。
7.权利要求1所述的介孔门控型的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系在制备抗肿瘤靶向给药、肿瘤部位的酸度敏感释药、肿瘤的化学治疗以及交变磁场照射下的肿瘤多机制治疗药物中的应用。
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