CN104689338A - 肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物的制法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物的制法及应用。所述制备方法为：首先以透明质酸，阿霉素等为原料制备出一种肿瘤靶向性酸敏前药；再通过共沉淀法并以氨基硅烷偶联剂修饰制备含氨基的磁性纳米粒子，最后通过酰胺反应将透明质酸肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子进行化学偶联。本发明得到的肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物具有良好的水分散稳定性，且磁性纳米粒子本身的超顺磁性不受影响，有利于磁性纳米粒子在体内的长循环；不仅如此，该纳米粒子还偶联了抗肿瘤药物阿霉素，能够有效地在肿瘤细胞等偏酸性的部分释放，有望用于肿瘤的诊断与治疗等领域。

Description

肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物的制法及应用

技术领域

本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物的制法及应用。

背景技术

在传统临床应用中，肿瘤的诊断和治疗是相对独立的过程，患者往往需要接受先诊断再治疗的过程，间隔时间较长，常常贻误了疾病治疗的最佳时期；此外，诊断用药物和治疗用药物常具有一定的副作用，分两次给药会增大患者不必要的痛苦和风险。因此，设计制备诊疗一体化的多功能分子影像探针具有重要意义。迄今为止，这类材料的研究多集中在能同时负载超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles，SPIO)和抗肿瘤药物的脂质体或两亲聚合物胶束方面。普通脂质体虽然具有被动靶向性，但存在靶向性低、稳定性差、且存在一定细胞毒性等缺点，限制了其在临床上的应用。Jinming Gao等(Nano Letters.2006,6:2427–2430)用聚乙二醇和聚乳酸的嵌段聚合物(PEG-PLA)通过自组装形成胶束同时包裹阿霉素和SPIO，并选用具有靶向功能配基的环状多肽cRGD修饰，制备出了肿瘤靶向输送阿霉素与SPIO的多功能聚合物胶束。然而，为制备用于形成胶束的两亲性聚合物，不仅需借助复杂的化学反应和合适的溶剂同时引入亲水性和疏水性大分子链段，还需通过多次调整反应配方体系和借助多种分析测试手段合成和表征一系列两亲性聚合物样品，以优化所需两亲性聚合物的结构和组成、确保有关胶束的形成；其次，两亲性聚合物形成胶束的过程通常十分复杂，易受聚合物本身结构、组成和浓度及溶剂体系组成、温度和pH值等影响，且难以控制；再者，两亲性聚合物胶束得率通常较低，同时包载SPIO和抗肿瘤药物的能力有限，在一些情况下对SPIO和抗肿瘤药物的包载量尚难达到临床使用的有效浓度；此外，为增强这类载体材料对肿瘤细胞的特异识别性，常需通过化学反应再引入肿瘤靶向性分子，不仅过程复杂、繁琐，而且有关修饰反应还易对拟制备的两亲性聚合物及其胶束结构和性能产生影响。

发明内容

为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物。

本发明的再一目的在于提供上述肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将透明质酸溶于水中，加入过量的己二酸二酰肼后调节溶液pH至6～8，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑，在20～40℃下搅拌反应8～24h，然后用水透析除去小分子，冻干得肼化透明质酸；

将肼化透明质酸溶于水中，加入盐酸阿霉素后调节溶液pH至5～6，在20～40℃下搅拌反应12～24h，然后将该溶液滴入到无水乙醇中沉淀，固体用无水乙醇多次洗涤至洗液中不含阿霉素并干燥后得到酰腙键键合的透明质酸-阿霉素前药；

(2)将二价铁盐与三价铁盐按比例混合溶于超纯水，在氮气氛围下，加入碱液，搅拌反应5～30min，升温至60～80℃继续反应0.5～2h，降温后用双蒸水冲洗产物并磁性分离至清液呈中性，而后依次用甲醇、甲醇/甲苯及甲苯冲洗，最终将产物分散于甲苯溶液中，在惰性气体保护下，加入0.1mL质量百分数为5％～99％的氨基硅烷偶联剂，在100～150℃下搅拌回流5～24h，反应结束后依次用甲醇和超纯水冲洗数次，得到含氨基的磁性纳米粒子；

(3)将步骤(1)制备的透明质酸-阿霉素前药溶于超纯水中，用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化1～4h，得到反应液A；然后将步骤(2)制备的含氨基的磁性纳米粒子超声分散于超纯水并加入反应液A中，在20～40℃下搅拌反应8～24小时；反应结束后，利用磁铁进行分离收集产物，并用去离子水冲洗以除去未反应的透明质酸及其它小分子物质，得到所述肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物(SPIO-HA-DOX)。

上述制备方法直接用肿瘤靶向透明质酸键合阿霉素前药与氨基化磁性纳米粒子通过酰胺反应化学偶联，制备出前药表面修饰的磁性纳米粒子。

所述的靶向性是由于所用材料透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是参与肿瘤发生、发展的重要分子之一，其特异性受体CD44在多种肿瘤细胞中呈现高表达，HA与CD44之间的相互作用可作HA靶向诊断或靶向治疗恶性肿瘤的基础。酸敏指药物与透明质酸的连接键为酰腙键。

上述制备方法通过化学偶联方法实现所述前药与磁性纳米粒子的有机结合，具体为，采用共沉淀法制备磁性纳米粒子，并用氨基硅烷偶联剂对其进行表面改性，而后通过酰胺缩合反应得到一种肿瘤靶向性酸敏前药化学修饰的磁性纳米粒子。

上述制备方法步骤(1)中所述透明质酸分子量可选范围为6～1500KDa，优选10～500KDa，更优选30～50KDa，来源于动物结缔组织中提取或者微生物发酵。

步骤(1)中所述的用水透析优选用截流分子量为1000～50000的透析袋，用去离子水或蒸馏水透析1～7天。

步骤(1)中所述己二酸二酰肼与透明质酸的质量比为1～25；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑，与透明质酸的摩尔比为(1～20)：1；阿霉素与透明质酸的质量比为(0.01～0.2)：1。

步骤(2)中所述甲苯溶液是指含有甲苯的溶剂体系，可以优选为甲苯、无水甲苯、或甲醇/甲苯混合体系等。

步骤(2)中所述二价铁盐优选为FeSO₄，三价铁盐优选为FeCl₃，所述二价铁盐与三价铁盐的摩尔比为1:(0.9～1.2)；步骤(2)中所述碱液为浓氨水与氢氧化钠溶液，浓氨水的质量百分比浓度为25～28％，碱液的摩尔浓度为2～5mol/L。

步骤(2)中所述惰性气体是指氮气或氩气。

步骤(2)中所述氨基硅烷偶联剂为3-氨丙基三甲氧基硅烷和3-氨丙基三乙氧基硅烷中的一种或多种。

步骤(3)中所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，与透明质酸的摩尔比为(1～20)：1。

步骤(3)中所述超声波频率为20～65kHz，超声处理5～30min，所述搅拌速率为400～1000r/min。

一种肿瘤靶向酸敏前药与磁性纳米粒子的偶联物，通过以上方法制备得到。

上述肿瘤靶向酸敏前药与磁性纳米粒子的偶联物在实现诊疗一体化上的应用。

本发明首先选用生物相容性好且具靶向肿瘤细胞表面CD44受体的透明质酸(Hyaluronic acid，HA)和临床中常见的抗肿瘤药物阿霉素为主要原材料合成一种肿瘤靶向性酸敏前药，再通过共沉淀法并以氨基硅烷偶联剂修饰制备出含氨基的磁性纳米粒子，然后通过酰胺反应将透明质酸前药与含氨基的磁性纳米粒子进行化学偶联，进而制备出同时具备诊断和治疗功效的多功能分子影像探针。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明通过酰腙键连接透明质酸与抗肿瘤药物阿霉素，由于酰腙键的独特性质，能够在肿瘤组织和细胞内等pH较低的酸性条件下快速释放出阿霉素。

(2)本发明通过偶联透明质酸前药与磁性纳米粒子制备了具有抗肿瘤前药修饰的磁性纳米粒子，解决了磁性纳米粒子本身水分散性差的问题。

(3)本发明直接用透明质酸前药修饰磁性纳米粒子，省去了在磁性纳米粒子上再继续修饰的一系列繁琐操作，同时利用透明质酸本身的性质，赋予纳米粒子肿瘤靶向性。

(4)本发明制备出的肿瘤靶向酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物有望应用于经静脉注射给药系统并同时达到显影的目的，因而在新型药物制剂方面具有一定的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中透明质酸-阿霉素前药的核磁表征图。

图2为实施例1中SPIO及SPIO-HA-DOX组的MR-T2 mapping成像图。

图3为实施例1中SPIO、SPIO-NH2和SPIO-HA-DOX的热失重对比图谱。

图4为实施例1中SPIO-HA-DOX水分散体系(0.2mg/mL)的电镜照片。

图5为实施例1中SPIO-HA-DOX组荷瘤裸鼠MR成像，(左)注射前，(右)注射1.5h后。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取0.5g透明质酸(HA，分子量10～500KDa)溶于100mL去离子水中，加入过量的己二酸二酰肼(ADH，6.5g)，搅拌使其溶解，用0.1M的盐酸调节反应液pH至6.8；称取0.96g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)以及0.68g 1-羟基苯并三唑(HOBt)，溶于二甲基亚砜(DMSO)与水的混合溶液中(1:1，v/v，10mL)，并将其滴入上述反应液中，再次用0.1M的盐酸调节溶液pH至6.8，室温下反应24h；反应结束后，在去离子水中透析3天(透析袋截留分子量为8000～10000)，冻干得肼化透明质酸(HA-ADH)；

称取0.1g HA-ADH溶于10mL超纯水搅拌使之溶解，加入2mg盐酸阿霉素，待其溶解后用三乙胺调节pH至6左右，20℃反应24h；反应结束后，将反应液滴入100mL无水乙醇中沉淀，用布氏漏斗抽滤，固体用20mL无水乙醇洗涤至洗液中不含阿霉素后于真空烘箱中40℃下干燥48h得产物，即为透明质酸-阿霉素(HA-DOX)前药；利用300MHz的核磁共振氢谱仪对其进行测定，结果如图1所示。

(2)配制1M的FeCl₃水溶液及1M的FeSO₄水溶液各10mL，按照摩尔比1:1混合后，用水稀释至100mL，向其中加0.1M的盐酸1.2mL调节pH至3.0，升温至30℃，消化30min，加入25％的NH₃·H₂O溶液48mL(5min内完成)，反应30min；升温至80℃，反应1h，以上过程均在N₂保护下快速搅拌进行；反应结束后，降至室温，用双蒸水冲洗并磁性分离至清液pH至中性得到超顺磁性纳米氧化铁(SPIO)；取1g SPIO，依次用50mL甲醇、甲醇/甲苯(50mL，v/v，1:1)及甲苯(50mL)冲洗，磁性分离后将所得SPIO粒子分散于100mL甲苯中得到SPIO分散液，并转移入三口瓶烧瓶中；

利用甲醇/甲苯(50mL，v/v，1:1)配制5.73M的3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，取0.1mL在5min内滴入上述SPIO分散液中，在N₂氛围及搅拌控制下回流(120℃)10h，改性所得SPIO粒子利用磁性分离收集，利用甲醇冲洗3次后，再用双蒸水冲洗5次，所得氨基硅氧烷修饰磁性纳米粒子(SPIO-NH₂)粒子分散于水中，超声分散后4℃下保存备用。

(3)取0.1g透明质酸-阿霉素前药于烧瓶中，加入20mL水，分别称取1.5倍摩尔量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌使之溶解，在室温下活化2h，得到反应液A；取0.15g SPIO-NH₂于100mL圆底烧瓶中，超声分散(超声波频率为20kHz；超声处理10min)，将SPIO-NH₂水分散液加入反应液A中，机械搅拌(400r/min)使之混匀，用1M的盐酸或者1M的氢氧化钠溶液调节pH至6.0，20℃下机械搅拌反应10h；反应结束后，利用磁铁进行分离收集，并利用去离子水冲洗以除去未反应的透明质酸及其它小分子物质，所得磁性粒子分散于水中，超声分散后，高速离心分离出去较大颗粒的产物，得到所述肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物(SPIO-HA-DOX)。

称取适量SPIO及SPIO-HA-DOX，加水稀释成铁浓度分别为0.09、0.18、0.27、0.36、0.45mmol/L的溶液，依次取上述浓度的样品稀释液5ml分装于5支管径为1cm的EP管中，进行T2map扫描，扫描结果如图2所示。扫描仪器：西门子3T MRI扫描仪，环形表面线圈，扫描序列：SE序列(TR:1000ms，TE：13.8ms/27.6ms/41.4ms/55.2ms/69.0ms，反转角：180°，层厚：3.0mm，平均激励次数：2，体素大小：0.5×0.5×3.0mm，图像矩阵：444×448。

图2显示了SPIO组及SPIO-HA-DOX组的MR-T₂ mapping成像图，两组的弛豫率分别为0.185×106M^-1s^-1和0.191×106M^-1s^-1，1；二者均高于SPIO作为磁共振造影剂T2驰豫率必需大于0.062×106M^-1s^-1的最低标准条件。这为实现体内外MRI对HA介导的肿瘤靶向MR成像分子探针SPIO-HA-DOX磁性纳米粒子的监测提供了可靠的保证。

采用TG-209 F1型热重分析仪(Netzsch，Germany)于氮气氛围下测量SPIO-HA-DOX的热失重曲线。测量范围为室温至900℃，升温速率为10℃/min。测试前将待测样品于40℃下真空干燥24h，结果如图3所示。图3显示了样品的热分解过程主要有3个阶段：第一阶段在200℃以下，主要为材料中滞留的水分与内部结合水的失去所致，质量损失约为3％；第二个阶段的热分解发生在200～400℃之间，该阶段发生了大分子骨架的断裂，形成稳定的中间产物，也有部分碳化物生成；第三阶段发生在550℃以上，这一阶段主要是中间产物及碳化物进一步氧化分解，最终剩余的为磁性粒子，质量分数约为83％。表明SPIO-HA-DOX表面的HA质量分数约为14％。

图4为SPIO-HA-DOX水分散体系(0.2mg/mL)的电镜照片，从图中可看到，在电镜下大约20nm左右，SPIO-HA-DOX可以较好地分散在水溶液中。

图5为SPIO-HA-DOX磁性纳米粒子经尾静脉注入HepG2荷瘤裸鼠前后MR成像图，图中肿瘤组织的T₂W信号强度(左)注射前，(右)注射1.5h后，在SPIO-HA-DOX组给药后，肿瘤组织不同时间点T₂W信号强度及信号变化率与平扫比较均有明显下降，且持续时间长，给药后24h T₂W信号强度仍可维持在较低水平。

实施例2

一种肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取1.0g透明质酸(HA，分子量130～500KDa)溶于100mL去离子水中，加入12.5g ADH，搅拌使其溶解，用0.1M的盐酸调节反应液pH至6.8；称取1.6g EDC及1.2g HOBt直接加入上述反应液中，再次用0.1M的盐酸调节溶液pH至6.8，30℃下反应16h；反应结束后，用0.1M氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0，在去离子水中透析3天(透析袋截留分子量为10000～14000)，冻干得HA-ADH；

称取0.5g HA-ADH溶于20mL超纯水中搅拌使之溶解，加入10mg盐酸阿霉素，待其溶解后用乙酸调节pH至5左右，25℃反应16h；反应结束后，将反应液滴入250mL无水乙醇中沉淀，抽滤，固体用50mL无水乙醇分多次洗涤后室温于真空烘箱中干燥得产物透明质酸-阿霉素前药。

(2)将0.5M的Fe²⁺和Fe³⁺溶液，按照摩尔比1:2混合，总体积30mL，混合后，用水稀释至100mL；氮气保护下逐滴加入25％的NH₃·H₂O溶液25mL(5min内完成)，反应30min；升温至80℃，反应1h；反应结束后，降至室温，用双蒸水冲洗并磁性分离至清液pH至中性，产物经磁分离洗涤多次后配制成20mg/mL的磁流体；取50mL磁流体，依次用50mL甲醇、甲醇/甲苯(50mL，v/v，1:1)及甲苯(50mL)磁分离洗涤，最终将所得SPIO粒子分散于100mL甲苯中得到SPIO分散液，并转移入三口瓶烧瓶中；

利用甲醇/甲苯(50mL，v/v，1:1)配制5.73M的3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，取0.1mL在5min内滴入上述SPIO分散液中，在氮气氛围及搅拌控制下于150℃回流5h；磁分离收集改性所得氨基化磁性纳米粒子(SPIO-NH₂)，依次利用甲醇和双蒸水冲洗数次，所得SPIO-NH₂粒子分散于水中，超声分散后4℃下保存备用。

(3)取0.45g所得透明质酸-阿霉素前药于烧瓶中，加入25mL水，分别称取等摩尔的EDC和1.2倍摩尔量的NHS搅拌使之溶解；取0.15g SPIO-NH₂于100mL圆底烧瓶中，超声分散(超声波频率为50kHz；超声处理10min)，得到反应液A；将SPIO-NH₂水分散液中加入反应液A中，机械搅拌(600r/min)使之混匀；调节pH至6.0，30℃下搅拌反应24h；反应结束后，利用磁铁进行分离收集，并利用去离子水冲洗以除去未反应的透明质酸及其它小分子物质，得到所述肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物(SPIO-HA-DOX)；产物经磁分离洗涤多次后制成2.0mg/mL的磁流体，经超声分散后4℃下保存备用。

将2.0mg/mL的磁流体加水稀释成铁浓度分别为0.09、0.18、0.27、0.36、0.45mmol/L的溶液，依次取上述浓度的样品稀释液5ml分装于5支管径为1cm的EP管中，进行T2map扫描。扫描仪器：西门子3T MRI扫描仪，环形表面线圈，扫描序列：SE序列(TR:1000ms，TE：13.8ms/27.6ms/41.4ms/55.2ms/69.0ms，反转角：180°，层厚：3.0mm，平均激励次数：2，体素大小：0.5×0.5×3.0mm，图像矩阵：444×448。所得样品驰豫率均大于0.062×106M^-1s^-1，可用作MR显影的对比剂。

实施例3

一种肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取0.5g透明质酸(HA，分子量500～1000KDa)溶于150mL去离子水中，加入8.0g己二酸二酰肼，搅拌使其溶解，用0.1M的乙酸调节反应液pH至6.8；称取1.8g EDC及1.2g HOBt，溶于DMSO与水的混合溶液中(1:1，v/v，10mL)，并将其滴入上述反应液中，25℃下反应24h；反应结束后，调节溶液pH至7.0，在去离子水中透析7天(截留分子量为10000～30000)，冻干得肼化透明质酸(HA-ADH)；称取0.5g HA-ADH搅拌使之溶解，加入10mg盐酸阿霉素，待其溶解后用三乙胺调节pH至6左右，25℃反应24h；反应结束后，将反应液滴入300mL无水乙醇中沉淀，用布氏漏斗抽滤，固体用50mL去离子水溶解后，用去离子水透析3天(透析袋截留分子量为10000～30000)，冷冻干燥后得到透明质酸-阿霉素前药。

(2)将0.5M的Fe²⁺和Fe³⁺溶液，按照摩尔比1:1混合，总体积40mL；混合后，用水稀释至100mL；氮气保护下逐滴加入26％的NH₃·H₂O溶液48mL(15min内完成)，快速升温至80℃，反应0.5h；反应结束后，降至室温，用双蒸水冲洗并磁性分离至清液pH至中性，产物经磁分离洗涤多次后制成20mg/mL的磁流体；取50mL磁流体，依次用50mL甲醇、甲醇/甲苯(50mL，v/v，1:1)及甲苯(50mL)磁分离洗涤；最终分散在甲醇/甲苯混合体系中(体积比1:10)得到SPIO分散液；

取0.1mL3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)滴入上述SPIO分散液中，在N₂氛围及搅拌控制下回流反应12h；产物经无水甲醇洗涤数次后，重新分散于超纯水中，制成表面覆盖氨基的磁性纳米粒子(SPIO-NH₂)超声分散后4℃下保存备用；

采用ZetaPALS(Brooken Haven，USA)表征样品表面的电位值。结果显示，SPIO因采用碱性介质下化学共沉淀的方法制备，粒子表面含有大量的羟基使其具有较强的Zeta电位负值；SPIO-NH₂水分散液中呈现正的Zeta电位值，因为APTES修饰后表面上有众多的氨基。

(3)取0.5g透明质酸-阿霉素前药于烧瓶中，加入20mL水，分别称取等摩尔的EDC和1.2倍摩尔量的NHS搅拌使之溶解，得到反应液A；

取0.1g SPIO-NH₂于100mL圆底烧瓶中，超声分散(超声波频率为20kHz；超声处理30min)；将SPIO-NH₂水分散液中加入反应液A中，机械搅拌(500r/min)使之混匀；调节pH至6.0，25℃下搅拌反应24h；反应结束后，利用磁铁进行分离收集，并利用去离子水冲洗以除去未反应的透明质酸及其它小分子物质，得到所述肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物(SPIO-HA-DOX)；产物经磁分离洗涤多次后制成2.0mg/mL的磁流体，经超声分散后4℃下保存备用。

实施例4

一种肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取0.5g透明质酸(HA，分子量30～50KDa)溶于100mL去离子水中，加入6.5gADH，搅拌使其溶解，用0.1M盐酸调节反应液pH至6.8；称取0.96g EDC及0.68g HOBt溶于二甲基亚砜与水的混合溶液中(1:1，v/v，10mL)，并将其滴入上述反应液中，用0.1M的盐酸调节溶溶液pH至6.8，25℃下反应12h；反应结束后，用去离子水中透析5天(透析袋截留分子量为8000)，冻干得肼化透明质酸(HA-ADH)；称取0.45g HA-ADH搅拌使之溶解，加入20mg的盐酸阿霉素，待其溶解后用三乙胺调节pH至6左右，25℃反应24h；反应结束后，将反应液滴入250mL无水乙醇中沉淀，砂芯漏斗抽滤，固体用50mL无水乙醇多次洗涤后于真空烘箱中干燥48h得产物透明质酸-阿霉素前药。

(2)配制1M的FeCl₃水溶液及1.2M的FeSO₄水溶液各10mL；按照摩尔比1:1混合后，用水稀释至100mL；用0.1M的盐酸调节pH至3.0，消化30min；加入5M的NaOH溶液50mL(10min内完成)，升温至80℃，反应2h，以上过程均在氩气保护下快速搅拌进行；反应结束后，用双蒸水冲洗并磁性分离至清液pH至中性，最终制成20mg/mL的磁流体；取50mL磁流体，经无水乙醇、无水甲醇，甲醇甲苯混合液、无水甲苯洗涤后，最终分散在无水甲苯中得到SPIO分散液；

加入0.1mL APTES，在氩气氛围100℃下搅拌回流反应8h；改性所得氨基修饰SPIO粒子利用磁性分离收集，利用甲醇冲洗3次后，再用双蒸水冲洗数次，最终硅氧烷修饰磁性纳米粒子(SPIO-NH₂)粒子分散于水中，制成10mg/mL的磁流体，超声分散后4℃下保存备用。

(3)取0.2g透明质酸-阿霉素前药于烧杯中，加入20mL水，分别称取等摩尔量的EDC和NHS搅拌使之溶解，反应2h，得到反应液A；取20mL的SPIO-NH₂磁流体于100mL圆底烧瓶中，超声分散(超声波频率为60kHz；超声处理10min)，将SPIO-NH₂水分散液中加入反应液A中，机械搅拌(1000r/min)使之混匀；40℃下搅拌反应24h；反应结束后，利用磁铁进行分离收集，并利用去离子水冲洗以除去未反应的透明质酸及其它小分子物质；所得磁性粒子分散于水中，超声分散后，高速离心分离出去较大颗粒的产物，得到所述肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物(SPIO-HA-DOX)。

在D/MAX 2200 VPC(RIGAKU，Japan)光谱仪上通过粉末法测定，在30kv/30mA的电流条件下，采用Cu Kα射线检测10o～70o的衍射谱。测定SPIO及SPIO-HA-DOX的XRD图谱。两种磁性粒子的XRD谱图中均出现了四氧化三铁的六个特征峰(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)，分别位于30.2、35.4、43.1、53.6、57.2和62.7处。XRD结果进一步证明Fe₃O₄的成功制备，且表面进行透明质酸改性后，Fe₃O₄的结晶结构未发生改变。

实施例5

一种肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取0.2g透明质酸(HA，分子量100～500KDa)溶于80mL去离子水中，加入过量的己二酸二酰肼(ADH，3.2g)，搅拌使其溶解，得反应液；称取0.32g EDC及0.24g HOBt，溶于二甲基亚砜与水的混合溶液中(1:1，v/v，10mL)，并将其滴入上述反应液中，用0.1M的盐酸调节溶液pH至6.8，40℃下反应24h；反应结束后，用0.1M氢氧化钠溶液调节溶液pH至7.0，用离子水中透析6天(透析袋截留分子量为10000)，冻干得肼化透明质酸(HA-ADH)；

称取0.15g HA-ADH搅拌使之溶解，加入15mg盐酸阿霉素，待其溶解后用乙酸调节pH至5左右，25℃反应24h；反应结束后，将反应液滴入500mL无水乙醇中沉淀，抽滤，固体用50mL去离子水重新溶解后，用去离子水透析3天(截留分子量为10000)，冷冻干燥后得到透明质酸-阿霉素前药。

(2)将1M的FeCl₂和FeCl₃溶液，按照摩尔比1:1混合，总体积20mL；混合后，在氮气保护下逐滴加入2M的NaOH溶液100mL，反应30min；升温至80℃，反应2h；反应结束后，降至室温，产物经磁分离洗涤多次后制成20mg/mL的磁流体；取50mL磁流体，依次用50mL甲醇、甲醇/甲苯(50mL，v/v，1:1)及甲苯(50mL)磁分离洗涤；最终将所得SPIO粒子分散于100mL甲苯中得到SPIO分散液，并转移入三口瓶烧瓶中；

利用甲醇/甲苯(50mL，v/v，1:1)配制5.73M的3-氨丙基三甲氧基硅烷溶液，取0.1mL滴入上述SPIO分散液中，在氮气氛围及搅拌控制下于110℃回流10h；改性所得SPIO粒子利用磁性分离收集，依次用甲苯、甲醇、甲醇水溶液，超纯水洗涤数次后，分散于超纯水中，超声分散后4℃下保存备用。

(3)取0.1g透明质酸-阿霉素前药于烧瓶中，加入20mL水，分别称取等摩尔的EDC·HCl和NHS搅拌使之溶解，在30℃下活化2h，得到反应液A；取0.15g SPIO-NH₂于100mL圆底烧瓶中，超声分散(超声波频率为50kHz；超声处理20min)；将SPIO-NH₂水分散液加入反应液A中，机械搅拌(800r/min)使之混匀；30℃下搅拌反应24h；反应结束后，利用磁铁进行分离收集，并利用去离子水冲洗以除去未反应的透明质酸及其它小分子物质，得到所述肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物(SPIO-HA-DOX)；产物经磁分离洗涤多次后制成2.0mg/mL的磁流体，经超声分散后4℃下保存备用；

分别选取pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液(0.02M)；pH6.0及pH7.4磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液(0.02M)作为释放介质，将所制备的SPIO-HA-DOX(5mL，0.2M)装入到截留分子量为3000的透析袋中，然后置于装有20mL释放溶液的离心管内，于37℃恒温振荡器避光震荡，在设定的时间间隔内，从透析袋中取出3mL溶液并补加3mL新鲜释放液，取出的溶液用紫外分光光度计检测480nm处的吸收值，根据之前测定的DOX在不同pH缓冲液中的标准曲线计算在此段时间内的药物释放量。累计释放率％＝(Wt/W)×100％   (1)

式中，Wt为t时刻溶液释放出的药物重量，W为负载的药物的总重量。

药物释放进行了24h后的结果显示，在pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液(0.02M)释放介质中能够放出将近40％的药物，而在pH6.0和pH7.4仅能放出28％和11％的药物。透明质酸键合阿霉素前药与磁性纳米粒子的偶联物在酸性条件下能有效的将药物释放出来。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将透明质酸溶于水中，加入过量的己二酸二酰肼后调节溶液pH至6～8，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑，在20～40℃下搅拌反应8～24h，然后用水透析除去小分子，冻干得肼化透明质酸；

将肼化透明质酸溶于水中，加入盐酸阿霉素后调节溶液pH至5～6，在20～40℃下搅拌反应12～24h，然后将该溶液滴入到无水乙醇中沉淀，固体用无水乙醇洗涤并干燥后得到透明质酸-阿霉素前药；

(2)将二价铁盐与三价铁盐按比例混合溶于超纯水，在氮气氛围下，加入碱液，搅拌反应5～30min，升温至60～80℃继续反应0.5～2h，降温后用双蒸水冲洗产物并磁性分离至清液呈中性，而后依次用甲醇、甲醇/甲苯及甲苯冲洗，最终将产物分散于甲苯溶液中，在惰性气体保护下，加入0.1mL质量百分数为5％～99％的氨基硅烷偶联剂，在100～150℃下搅拌回流5～24h，反应结束后依次用甲醇和超纯水冲洗数次，得到含氨基的磁性纳米粒子；

(3)将步骤(1)制备的透明质酸-阿霉素前药溶于超纯水中，用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化1～4h，得到反应液A；然后将步骤(2)制备的含氨基的磁性纳米粒子超声分散于超纯水并加入反应液A中，在20～40℃下搅拌反应8～24小时；反应结束后，利用磁铁进行分离收集产物，并用去离子水冲洗，得到所述肿瘤靶向性酸敏前药与磁性纳米粒子偶联物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述透明质酸分子量为6～1500KDa，所述的用水透析选用截流分子量为1000～50000的透析袋，用去离子水或蒸馏水透析1～7天。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述己二酸二酰肼与透明质酸的质量比为1～25，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑与透明质酸的摩尔比为(1～20)：1，阿霉素与透明质酸的质量比为(0.01～0.2)：1。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述二价铁盐为FeSO₄，三价铁盐为FeCl₃，所述二价铁盐与三价铁盐的摩尔比为1:(0.9～1.2)；步骤(2)中所述碱液为浓氨水与氢氧化钠溶液，浓氨水的质量百分比浓度为25～28％，碱液的摩尔浓度为2mol/L～5mol/L。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述惰性气体是指氮气或氩气。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述氨基硅烷偶联剂为3-氨丙基三甲氧基硅烷和3-氨丙基三乙氧基硅烷中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺与透明质酸的摩尔比为(1～20)：1。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述超声波频率为20～65kHz，超声处理5～30min，所述搅拌速率为400～1000r/min。

9.一种肿瘤靶向酸敏前药与磁性纳米粒子的偶联物，由权利要求1～8任一项所述制备方法得到。

10.权利要求9所述的肿瘤靶向酸敏前药与磁性纳米粒子的偶联物在实现诊疗一体化上的应用。