CN115501204B - 一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法 - Google Patents

一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，以透明质酸为载体，化学连接阿霉素前药和一氧化氮前药，制备前药聚糖(HA‑DOX‑JS‑K)，前药聚糖自组装成粒径为100nm的纳米药物，以降低药物输送过程中的泄露；到达肿瘤组织后，在肿瘤酸性微环境和高谷胱甘肽刺激下释放药物阿霉素，同时在谷胱甘肽/谷胱甘肽转移酶响应下释放一氧化氮，一氧化氮介导胶原降解，增强纳米粒子在实体瘤中渗透；透明质酸载体可通过CD44受体主动靶向肿瘤细胞，增加肿瘤细胞对纳米药物的摄取。本发明采用上述一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，通过两步级联递送，极大提高了纳米粒子在实体肿瘤细胞的累积，提高了纳米药物的递送效率。

Description

一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法。
背景技术
尺寸从100到200纳米不等的数十种抗癌纳米药物，已经被批准用于临床应用或临床试验。然而，许多证据表明，纳米药物虽然可以提高药物的生物安全性，但与小分子药物制剂相比，却无法提高疗效。
纳米药物抗肿瘤效率低下的主要原因是肿瘤组织固有的病理屏障对纳米药物从表层肿瘤向深层肿瘤的扩散构成了巨大的挑战，抗肿瘤药物不能充分内化到深层肿瘤，导致疗效不理想。因此，要解决纳米药物传递效率低下的问题，必须克服一系列不利的生物障碍，特别是肿瘤组织中密集的细胞外基质和纳米药物的非靶向性肿瘤摄取。
肿瘤微环境中的细胞外基质(ECM)，尤其是致密胶原，是将纳米颗粒递送至肿瘤的第一道屏障。肿瘤组织中紧密的胶原可以提高间质流体压力，阻止纳米颗粒的深度渗透。内源性分子一氧化氮(NO)是一种自由基，可与超氧阴离子反应形成更强大的氧化剂过氧亚硝酸盐(RNS)，以促进胶原降解，有望有效提高纳米药物在肿瘤部位的渗透性。
此外，肿瘤细胞对纳米药物的低摄取是药物递送的第二个障碍。主动靶向策略可以通过纳米颗粒上的配体和肿瘤细胞上的受体之间的特异性识别来增强药物递送系统的肿瘤摄取。CD44是各种癌细胞膜上的特异性受体，与透明质酸(HA)有很强的亲和力，保证了纳米颗粒的肿瘤吸收效率。因此，为了最终提高纳米颗粒的内化效率，结合肿瘤组织的深度渗透和增强肿瘤细胞对纳米颗粒的吸收的策略将能提高抗肿瘤治疗疗效。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，解决了上述背景技术中纳米药物输送效率低下的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，包括如下步骤：
S1、顺式乌头酸酐-阿霉素(CAD)的制备：将盐酸阿霉素溶于去离子水中并冰浴，将顺式乌头酸酐溶于1,4-二氧六环中，并在搅拌情况下将其缓慢加入盐酸阿霉素溶液中，然后缓慢加入浓度0.1～1M的氢氧化钠溶液；调节上述混合溶液的pH值至8.5～9.0，之后冰浴15～30min，再将pH值调整到7.0并搅拌20～40min，在室温下反应24小时后，向混合溶液中缓慢加入浓度为0.5～1.5M的冰盐酸，直到出现重沉淀，将混合物在冰上静置0.5～2h后10000rpm离心8～15min，收集沉淀并冻干，得到顺式乌头酸酐-阿霉素；
S2、一氧化氮前药(alkynyl-JS-K)的制备：将JS-K{O2-(2,4-dinitropheny l)-1-[(4-ethoxycarbonyl)piperazin-1-yl]diazen-1-ium-1,2-diolate}加入二氯甲烷中搅拌形成悬浊液，冰浴使悬浊液温度降至0℃后加入三乙醇胺，并搅拌至固体完全溶解，保持0℃条件下缓慢加入氯甲酸丙炔酸酯，冰浴搅拌反应1～2h至反应完全，得到反应液；向上述反应液中加入二氯甲烷稀释，然后用10％柠檬酸洗，水相用二氯甲烷提取一次后合并有机相，无水Na2SO4干燥、过滤、旋蒸得粗品，粗品柱纯化得淡黄色固体产物alkynyl-JS-K；
S3、HA-Az-Cys的制备：将透明质酸钠(HA)溶解在去离子水中，充分搅拌至透明质酸钠完全溶解，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应30分钟，之后加入3-叠氮丙基胺(Az)反应24小时，随后加入胱胺盐酸盐(Cys)反应24小时；将溶液装入截留分子量为3500Da的透析袋中，用去离子水透析3天，然后冻干得HA-Az-Cys；
S4、HA-DOX-JS-K的制备：将所述步骤S3中制备的HA-Az-Cys溶解在去离子水中，将所述步骤S1中制备的顺式乌头酸酐-阿霉素溶解在二甲基甲酰胺中，之后加入到HA-Az-Cys溶液中，然后向溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温下搅拌24～48h，将溶液装入截留分子量为3500～8000Da的透析袋中，用去离子水透析3天后冻干得HA-DOX；
将HA-DOX溶解在去离子水中，将所述步骤S2中制备的一氧化氮前药溶于四氢呋喃后加入到HA-DOX溶液中，然后向溶液中加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠，在氮气保护下室温反应24～48h，将混合物装入截留分子量为3500～8000Da的透析袋中，用去离子水透析3天后冻干得HA-DOX-JS-K；
S5、制备HA-DOX-JS-K NPs：将所述步骤S4中制备的HA-DOX-JS-K溶解在去离子水中，然后在室温下搅拌24～48h；HA-DOX-JS-K的亲疏水作用自组装为粒径100～400nm的纳米粒子，随后用0.45μm过滤器过滤去除杂质，得到纯净的HA-DOX-JS-K NPs。
优选的，所述步骤S1中，每60mL去离子水中加入100mg盐酸阿霉素，每1mL1,4-二氧六环加入0.1mmol顺式乌头酸酐，所述盐酸阿霉素和顺式乌头酸酐的摩尔比为1:(1～2)。
优选的，所述步骤S2中，每100mL二氯甲烷加入1.095gJS-K，所述JS-K和氯甲酸丙炔酸酯的摩尔比为1:(1～2)。
优选的，所述步骤S3中，所述透明质酸钠的分子量为4～20万，每50mL去离子水加入300mg透明质酸钠。
优选的，所述步骤S3中，所述透明质酸钠的羧基基团数与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:(2.8～3.2)，所述透明质酸钠的羧基基团数与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1.8～2.5)，所述透明质酸钠的羧基基团数与3-叠氮丙基胺的摩尔比为1:(0.3～0.7)，所述透明质酸钠的羧基基团数与胱胺盐酸盐的摩尔比为1:(0.2～0.5)。
优选的，所述步骤S4中，每50mL去离子水加入300mgHA-Az-Cys；所述HA-Az-Cys的羧基基团数与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:(2.8～3.2)，所述HA-Az-Cys的羧基基团数与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1.8～2.5)，所述HA-Az-Cys中叠氮基团数与五水硫酸铜的摩尔比为1:(0.2～0.4)，所述HA-Az-Cys中叠氮基团数与抗坏血酸钠的摩尔比为1:(0.4～0.8)。
优选的，按照质量分数计算，所述纳米给药系统中载有药物阿霉素的量为5％～30％，一氧化氮前药的量为5％～30％。
优选的，所述HA-DOX-JS-K结构式如下：
结构式中，m、n为结构单元数目。
因此，本发明采用上述的一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，制备的纳米粒子原料廉价易得、制备方法简单易重复、易于大规模加工生产，能够增强实体瘤的药物累积，具有良好的应用前景。
本发明一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，具有以下有益效果：
(1)透明质酸具有高水溶性、高生物相容性、易化学修饰等特点，是一种良好的药物载体，能够轻易地负载抗肿瘤药物DOX和JS-K。
(2)透明质酸能够与肿瘤细胞的CD44受体特异性结合，实现肿瘤靶向性，具有良好的生物安全性。
(3)透明质酸靶向纳米粒子给药系统能够通过pH和GSH响应性释放DOX，GSH/GST响应性释放NO。
(4)所释放的NO可以介导基质金属蛋白酶(MMP-2)降解细胞外基质(ECM)中的胶原蛋白，增加纳米粒子向肿瘤深处的渗透。
(5)NO与DOX可实现协同抗肿瘤的效果。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法实施例一中顺式乌头酸酐-阿霉素的紫外图；
图2为本发明一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法实施例一中HA-Az-Cys的核磁图谱；
图3为本发明一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法实施例一中HA-Az-Cys的红外图谱；
图4为本发明一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法实施例一中HA-DOX-JS-K的红外图谱；
图5为本发明一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法实施例一中HA-DOX-JS-K的紫外图谱；
图6为本发明一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法实施例一中HA-DOX-JS-KNPs的TEM图；
图7为本发明一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法实施例一中HA-DOX-JS-KNPs的水合粒径图；
图8为本发明一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法实施例二中HA-DOX-JS-K对DOX和JS-K的载药量图；
图9为本发明一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法实施例三中HA-DOX-JS-KNPs的DOX释放图；
图10为本发明一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法实施例三中HA-DOX-JS-KNPs的NO释放图；
图11为本发明一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法实施例四中L292细胞和4T1细胞的CLSM图和流式定量图；
图12为本发明一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法实施例五中DOX、HA-DOX NPs和HA-DOX-JS-KNPs在肿瘤的积累和渗透图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
实施例一
一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，包括如下步骤：
S1、顺式乌头酸酐-阿霉素(CAD)的制备：将100mg(0.172mmol)盐酸阿霉素溶于56mL去离子水中并进行冰浴，将31mg(0.2mmol)顺式乌头酸酐溶于2.8mL1,4-二氧六环中，并在搅拌情况下将其缓慢加入盐酸阿霉素溶液中，然后缓慢加入浓度为0.5M氢氧化钠溶液。将上述混合溶液的pH值调到9.0后冰浴20min，再将溶液pH值调整到7.0后搅拌30min，在室温下反应24小时，向混合物中缓慢加入浓度为1M的冰盐酸，直到出现重沉淀。将溶液在冰上静置0.5h后，10000rpm离心10min，收集沉淀物并冻干，得到顺式乌头酸酐-阿霉素。顺式乌头酸酐-阿霉素的紫外光谱图见图1。
S2、一氧化氮前药(alkynyl-JS-K)的制备：将1.095gJS-K{O2-(2,4-dinitrophenyl)-1-[(4-ethoxycarbonyl)piperazin-1-yl]diazen-1-ium-1,2-diolate}加入到100mL二氯甲烷中搅拌形成悬浊液，冰浴使悬浊液温度降至0℃后加入1mL三乙醇胺，并搅拌至固体完全溶解，保持0℃条件下缓慢加入0.656g氯甲酸丙炔酸酯，冰浴搅拌反应1.5h至反应完全，得到反应液。
向反应液中加入20mL二氯甲烷稀释，然后用2mL10％柠檬酸洗，水相用二氯甲烷提取一次后合并有机相，使用5g无水Na2SO4干燥、过滤、旋蒸得粗品，粗品柱纯化得1g淡黄色固体产物alkynyl-JS-K。
S3、HA-Az-Cys的制备：将300mg透明质酸钠(分子量＝80000)溶解在30mL去离子水中，充分搅拌至透明质酸钠完全溶解。再加入383mg(2.47mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和135mg(1.18mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应30分钟，再加入35.9mg(0.35mmol)3-叠氮丙基胺(Az)反应24小时。随后加入56mg(0.36mmol)胱胺盐酸盐(Cys)，继续反应24小时。混合溶液装入截留分子量为3500Da的透析袋中，用去离子水透析3天，然后冻干得HA-Az-Cys。HA-Az-Cys的核磁和红外图谱见图2、图3。
S4、HA-DOX-JS-K的制备：将100mgHA-Az-Cys溶解在20mL去离子水中，将80mg(0.11mmol)顺式乌头酸酐-阿霉素溶解在二甲基甲酰胺中，并加入到HA-Az-Cys溶液中。然后，向混合溶液中加入47mg(0.30mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和18.9mg(0.16mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌24h。将混合物装入截留分子量为3500Da的透析袋中，用去离子水透析3天后冻干得HA-DOX；
将100mgHA-DOX溶于20mL去离子水中，将76mg(0.19mmol)一氧化氮前药：溶于10mL四氢呋喃后加入到HA-DOX溶液中。然后，加入催化剂10mg(0.04mmol)五水硫酸铜和15mg(0.07mmol)抗坏血酸钠，在氮气保护下室温反应24h，将混合物装入截留分子量为3500Da的透析袋中，用去离子水透析3天后冻干得HA-DOX-JS-K。HA-DOX-JS-K的红外和紫外图谱见图4、图5。
S5、制备HA-DOX-JS-K NPs：将5mgHA-DOX-JS-K溶解在5mL去离子水中，然后在室温下搅拌24小时，通过HA-DOX-JS-K的亲疏水作用自组装成纳米粒子，随后用0.45μm的过滤器过滤去除杂质，得到纯净的HA-DOX-JS-K NPs。用TEM观察纳米粒子形貌，结果见附图6；用纳米粒度仪对其进行粒径分析，平均粒径为167nm(见附图7)。
实施例二
通过紫外可见分光光度计测试已知不同浓度的盐酸阿霉素(DOX)和一氧化氮前药(JS-K)，绘制标准曲线。将1mgHA-DOX-JS-K溶于1～10mL去离子水中，通过紫外可见分光光度计测试490nm和300nm的吸光度，通过盐酸阿霉素和一氧化氮前药的标准曲线计算HA-DOX-JS-K中盐酸阿霉素和一氧化氮前药的浓度。纳米粒子给药系统的载药率计算公式如下：
载DOX率＝包封DOX重量/纳米粒子重量×100％；
载JS-K率＝包封JS-K重量/纳米粒子重量×100％。
如图8所示，载DOX率为4.1％，载JS-K率为3.9％。
实施例三
通过透析法来研究HA-DOX-JS-KNPs的DOX体外释放行为。
用2mL实例1所制备的纳米粒子装入透析袋(MWCO 3500)中，放入20mLpH7.4、pH7.4+10mM GSH、pH5.4、pH5.4+10mM GSH这四种不同的条件中，37℃孵育。分别在0、0.16、0.5、1、2、4、8、10、12、24、32、48、72h时，取出100μL的透析袋外面的溶液，再补充100μL新鲜溶液。用酶标仪在490nm波长下检测吸光度。DOX的释放图见图9。
使用一氧化氮试剂盒来测试HA-DOX-JS-K NPs的NO释放行为。
将200uL实例1所制备的纳米粒子，分别放入2mLpH7.4、10μM GSH+5ng/mL GST、100μM GSH+5μg/mL GST、10mM GSH+5μg/mL GST中，37℃孵育不同时间。分别在0、0.16、0.5、1、2、4、8、10、12、24、32、48、72h时取50μL工作液加入96孔板中，加入50μL格里斯试剂I和50μL格里斯试剂II。用酶标仪测试540nm的吸光度，并根据一氧化氮标准曲线测试HA-DOX-JS-KNPs释放的一氧化氮含量，结果见附图10。
实施例四
使用CD44低表达的L929细胞和CD44高表达的4T1细胞来检测HA-DOX-JS-KNPs的靶向递送。首先，将L929细胞和4T1细胞分别与HA-DOX-JS-KNPs孵育4h。为了进一步确定透明质酸钠通过CD44受体增强HA-DOX-JS-KNPs的摄取，在与HA-DOX-JS-KNPs孵育之前，先用透明质酸钠溶液(10mg/mL)预处理L929细胞和4T1细胞2h，以阻断CD44受体的靶向。随后，用PBS洗涤细胞3次，并用4％多聚甲醛固定20分钟，用DAPI染色5min，使用共聚焦显微镜(CLSM)观察盐酸阿霉素的荧光强度，盐酸阿霉素激发波长为480nm，发射波长为590nm。此外，通过流式细胞仪来定量盐酸阿霉素的荧光强度。结果见附图11，(A)和(B)为L292细胞的CLSM图和流式图；(C)和(D)为4T1细胞的CLSM图和流式图。
实施例五
将携带原位4T1肿瘤(约200mm3)的小鼠以5mg/kg的DOX供体剂量静脉注射DOX、HA-DOX NPs和HA-DOX-JS-KNPs。注射后7天，处死小鼠，将肿瘤固定在4％多聚甲醛中并进行石蜡包埋切片，得到5μm厚组织切片，然后用抗3-硝基酪氨酸抗体(bs-8551R)和兔抗MMP-2抗体(bs-20705R)染色。用荧光显微镜拍摄肿瘤切片的图像，并用ImageJ软件分析其强度，用Masson染色查看胶原降解情况。此外，还对肿瘤组织进行冷冻切片处理，使用荧光显微镜观察DOX荧光，使用ImageJ软件进行定量，结果见附图12。
本发明一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，将具有CD44靶向的透明质酸作为载体材料，利用其可修饰的官能团，连接上具有pH敏感性和谷胱甘肽敏感性的阿霉素，以及谷胱甘肽/谷胱甘肽转移酶敏感性的一氧化氮前药。通过亲疏水作用自组装成粒径为100nm～400nm纳米粒子。
该纳米粒子在药物输送过程中可有效降低药物泄露，到达肿瘤组织后，可在较低pH和高含量谷胱甘肽下释放阿霉素，同时，一氧化氮前药可在谷胱甘肽/谷胱甘肽转移酶响应下释放一氧化氮。一氧化氮可介导实体瘤中的胶原降解，增加纳米粒子向肿瘤深处的渗透。此外，透明质酸载体可通过CD44受体主动靶向肿瘤细胞，增加药物的摄取。这两步极大地增强纳米粒子向实体瘤的累积，提高了抗肿瘤效率。
因此，本发明采用上述的一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，制备原料廉价易得、制备方法简单易重复、易于大规模加工生产，能够增强实体瘤的药物累积，具有良好的应用前景。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、顺式乌头酸酐-阿霉素的制备：将盐酸阿霉素溶于去离子水中并冰浴，将顺式乌头酸酐溶于1,4-二氧六环中，并在搅拌情况下将其缓慢加入盐酸阿霉素溶液中，然后缓慢加入浓度0.1～1M的氢氧化钠溶液；调节上述混合溶液的pH值至8.5～9.0，之后冰浴15～30min，再将pH值调整到7.0并搅拌20～40mi n，在室温下反应24小时后，向混合溶液中缓慢加入浓度为0.5～1.5M的冰盐酸，直到出现重沉淀，将混合物在冰上静置0.5～2h后10000rpm离心8～15mi n，收集沉淀并冻干，得到顺式乌头酸酐-阿霉素；
S2、一氧化氮前药alkynyl-JS-K的制备：将JS-K O2-(2,4-dinitrophenyl)-1-[(4-ethoxycarbonyl)piperazin-1-yl]diazen-1-ium-1,2-diolate加入二氯甲烷中搅拌形成悬浊液，冰浴使悬浊液温度降至0℃后加入三乙醇胺，并搅拌至固体完全溶解，保持0℃条件下缓慢加入氯甲酸丙炔酸酯，冰浴搅拌反应1～2h至反应完全，得到反应液；向上述反应液中加入二氯甲烷稀释，然后用10％柠檬酸洗，水相用二氯甲烷提取一次后合并有机相，无水Na2SO4干燥、过滤、旋蒸得粗品，粗品柱纯化得淡黄色固体产物alkynyl-JS-K；
S3、HA-Az-Cys的制备：将透明质酸钠溶解在去离子水中，充分搅拌至透明质酸钠完全溶解，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺反应30分钟，之后加入3-叠氮丙基胺反应24小时，随后加入胱胺盐酸盐反应24小时；将溶液装入截留分子量为3500Da的透析袋中，用去离子水透析3天，然后冻干得HA-Az-Cys；
S4、HA-DOX-JS-K的制备：将所述步骤S3中制备的HA-Az-Cys溶解在去离子水中，将所述步骤S1中制备的顺式乌头酸酐-阿霉素溶解在二甲基甲酰胺中，之后加入到HA-Az-Cys溶液中，然后向溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，在室温下搅拌24～48h，将溶液装入截留分子量为3500～8000Da的透析袋中，用去离子水透析3天后冻干得HA-DOX；
将HA-DOX溶解在去离子水中，将所述步骤S2中制备的一氧化氮前药溶于四氢呋喃后加入到HA-DOX溶液中，然后向溶液中加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠，在氮气保护下室温反应24～48h，将混合物装入截留分子量为3500～8000Da的透析袋中，用去离子水透析3天后冻干得HA-DOX-JS-K；
S5、制备HA-DOX-JS-K NPs：将所述步骤S4中制备的HA-DOX-JS-K溶解在去离子水中，然后在室温下搅拌24～48h；HA-DOX-JS-K的亲疏水作用自组装为粒径100～400nm的纳米粒子，随后用0.45μm过滤器过滤去除杂质，得到纯净的HA-DOX-JS-K NPs。
2.根据权利要求1所述的一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，每60mL去离子水中加入100mg盐酸阿霉素，每1mL1,4-二氧六环加入0.1mmol顺式乌头酸酐，所述盐酸阿霉素和顺式乌头酸酐的摩尔比为1:(1～2)。
3.根据权利要求1所述的一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，每100mL二氯甲烷加1.095gJS-K，所述JS-K和氯甲酸丙炔酸酯的摩尔比为1:(1～2)。
4.根据权利要求1所述的一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中，所述透明质酸钠的分子量为4～20万，每50mL去离子水加入300mg透明质酸钠。
5.根据权利要求1所述的一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中，所述透明质酸钠的羧基基团与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:(2.8～3.2)，所述透明质酸钠的羧基基团与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1.8～2.5)，所述透明质酸钠的羧基基团与3-叠氮丙基胺的摩尔比为1:(0.3～0.7)，所述透明质酸钠的羧基基团与胱胺盐酸盐的摩尔比为1:(0.2～0.5)。
6.根据权利要求1所述的一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中，每50mL去离子水加入300mg HA-Az-Cys；所述HA-Az-Cys的羧基基团与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:(2.8～3.2)，所述HA-Az-Cys的羧基基团与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1.8～2.5)，所述HA-Az-Cys中叠氮基团与五水硫酸铜的摩尔比为1:(0.2～0.4)，所述HA-Az-Cys中叠氮基团与抗坏血酸钠的摩尔比为1:(0.4～0.8)。
7.根据权利要求1所述的一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，其特征在于：按照质量分数计算，所述纳米给药系统中载有药物阿霉素的量为5％～30％，一氧化氮前药的量为5％～30％。
8.根据权利要求1所述的一种用于级联递送药物的透明质酸纳米给药系统的制备方法，其特征在于：所述HA-DOX-JS-K结构式如下：
结构式中，m、n为结构单元数目。
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