CN109966507A - 一种肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药及其制备方法与应用 - Google Patents

一种肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医用高分子材料技术领域，公开了一种基于CD44受体肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药及其制备方法与应用。本发明大分子纳米前药的分子结构如通式(1)所示：其中，R＝中的至少一种；通式(1)中，m和n分别为侧链肽链的聚合度，x为透明质酸的重复单元数；R1为苯基时，R2为乙酰基；R1为叔丁氧基时，R2为氢。本发明的大分子纳米前药可用于抗肿瘤药物的精准输送及抑制肿瘤细胞增殖药物的制备中，其在水中自组装形成纳米胶束后，主动识别肿瘤组织并被癌细胞吞噬，癌细胞内的低pH和高浓度GSH环境导致其结构中的酰腙键及二硫键断裂，使胶束解体，加速化疗药的释放，并最终杀死癌细胞。

Description

一种肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药及 其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料技术领域，特别涉及一种基于CD44受体肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药及其制备方法与应用。
背景技术
目前，化疗仍是治疗肿瘤的主要手段，但化疗的毒副作用常常导致化疗效果不尽如人意(Advanced Drug Delivery Reviews.2011,63,136-151)。使用聚合物纳米递药系统将药物精准输送至肿瘤组织的给药方式可以有效地减小化学药的毒副作用，进而改善化疗效果。要达到精准输药之目的，则可以在载药聚合物纳米粒的表面键合上肿瘤靶向分子，其就能以“主动靶向”的方式特异性地识别并渗透入肿瘤组织(Chemical Reviews.2018,118,6844-6892)。当这种“主动靶向”的载药聚合物纳米粒被肿瘤组织吸收后，纳米粒以内吞的方式进入肿瘤细胞，再进入溶酶体并释放药物至细胞质或细胞核。肿瘤细胞的生理条件参数低于正常的组织细胞，例如，肿瘤细胞的酸性高于正常细胞、细胞质内的还原性谷胱甘肽(GSH)的浓度高于正常细胞。因此，通过分子设计手段在“主动靶向”的聚合物纳米载体的分子结构内引入可在低pH、高GSH浓度条件下断裂的共价键，就可以让载体变得更加智能(Chemical Society Reviews.2017,46,3830-3852)。当载药纳米粒进入细胞后，这种智能响应可促使共价键断裂，然后导致载体的纳米结构解体，促使抗肿瘤药物被快速释放到细胞质。肿瘤细胞内药物浓度瞬间的增大可以杀死细胞，最终达到治疗癌症的效果。
众所周知，同时含亲水链段和疏水链段的两亲性共聚物可以用做药物载体，原因是两亲性共聚物可以依靠“亲水-疏水”平衡在水溶液中自组装成“核-壳”结构的纳米胶束。在自组装的过程中，疏水的小分子药物被包裹进胶束的疏水内核，这是聚合物胶束在血液循环的过程中保护药物的基本原理。若要实现“主动靶向”的功能，既可以将胶束壳层的亲水链段链接上主动识别肿瘤细胞的靶向分子，也可以直接使用本身就具有肿瘤靶向性的亲水链段。透明质酸(HA)是一种能够主动识别CD44蛋白的水溶性天然多糖类配体，而多数肿瘤的细胞膜表面高表达CD44。因此，若在制备聚合物载体时以HA为亲水链段，即能达到“主动靶向”的功能。通常，聚合物载体负载药物分子的过程主要依赖于“亲水-疏水”这一物理作用，这导致载体负载药物的效率极低。因此，当载药胶束进入肿瘤细胞后，药物在胞内的累积浓度不足以杀死肿瘤细胞，除非大大增加注射剂量，这显然在临床上不合实际(NatureReviews Materials 2016,1,16014)。若将药物以共价键的形式链接到共聚物的疏水链段，则可得到大分子前药，自组装后聚合物胶束的载药量就大大提高。除此之外，为了进一步增大肿瘤细胞内药物的累积浓度，使载体能够对低pH和高GSH浓度进行智能响应也必不可少。由此看来，通过合理的分子设计来开发并制备特异性识别肿瘤、药物负载效率高以及智能响应型抗肿瘤药物的聚合物递送载体，无疑是解决肿瘤化疗毒副作用的有效技术途径。
发明内容
为了克服上述现有技术中聚合物药物载体的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于CD44受体肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药。
本发明大分子纳米前药的亲水链段为透明质酸，疏水链段为由N-羧基环内酸酐开环聚合而得的多肽；亲水链段和疏水链段由二硫键联接；pH敏感的抗肿瘤药(如阿霉素、喜树碱、紫杉醇和多烯紫杉醇)的前药分子，被化学键合到疏水多肽的侧链；本发明大分子前药在水中自组装形成纳米胶束，可向肿瘤细胞中精准输送化疗药；本发明大分子前药的载药量高，具有pH和氧化还原双重响应的特点。
本发明另一目的在于提供一种上述大分子前药纳米颗粒的制备方法。
本发明再一目的在于提供上述大分子前药纳米颗粒在抗肿瘤药物(包括阿霉素、喜树碱、紫杉醇或多烯紫杉醇)的精准输送及抑制肿瘤细胞增殖药物的制备中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药，其分子结构如通式(1)所示：
(1)
其中，R＝
中的至少一种。
通式(1)中，m和n分别为侧链肽链的聚合度，x为透明质酸的重复单元数。其中，x优选为5-500。m和n均为正整数，二者之和为10-300，优选为10-100。R1为苯基时，R2为乙酰基；R1为叔丁氧基时，R2为氢。
R为含有阿霉素(DOX)、喜树碱(CPT)、紫杉醇(PTX)或多烯紫杉醇(DOC)母核结构的小分子前药；当R1为苯基、R2为乙酰基时，为紫杉醇(PTX)前药；当R1为叔丁氧基、R2为氢时，为多烯紫杉醇(DOC)前药。
如上，本发明的大分子前药的疏水链段为侧链同时含有呋喃和前药分子的肽链，亲水链段为透明质酸；前药分子通过pH敏感的酰腙键联接到多肽侧链，形成的载体是一种两亲性大分子前药；在水溶液中该大分子前药可以在水中自组装形成纳米胶束，可主动将化疗药输送到靶细胞；本发明大分子前药中，化疗药的载药量高且具有pH和GSH双重响应性。
本发明还提供一种上述肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药的制备方法，包括以下步骤：(1)合成末端叠氮修饰的透明质酸；(2)合成侧链含呋喃环的谷氨酸酯；(3)制备步骤(2)中谷氨酸酯相应的N-羧基环内酸酐单体；(4)合成末端含有炔基和二硫键、侧链含有呋喃的疏水多肽；(5)合成“透明质酸-多肽”两亲性嵌段共聚物；(6)合成含酰腙结构的6-马来酰亚胺化前药分子；(7)使用Diels-Alder反应，将步骤(6)的前药分子接枝到多肽侧链，得到大分子前药。
具体地，步骤(1)的过程和产物结构如下式(一)所示。
式(一)
其中，x为透明质酸的重复单元数，优选为5-500。
步骤(1)中，所述合成末端叠氮修饰的透明质酸，具体为利用叠氮丙胺与透明质酸链端的醛基之间的还原胺反应得到。所用透明质酸与叠氮丙胺的摩尔比优选为1:40-1:80；所述氰基硼氢化钠的摩尔量与叠氮丙胺相等。反应时间优选为48-240h。上述反应优选在常温条件下进行，溶剂体系为酸性缓冲溶液，pH优选为4-6。产物可用盐酸酸化后透析，冻干后得到产物。
步骤(2)的过程和产物结构如下式(二)所示。
步骤(2)中，所述合成侧链含呋喃环的谷氨酸酯，具体为谷氨酸、5-氯甲基2-呋喃甲酸乙酯在谷氨酸螯合铜、1,1,3,3-四甲基胍催化下反应得到。其中，所述的谷氨酸及谷氨酸螯合铜可以是左旋、右旋和外消旋构型。所用谷氨酸螯合铜、谷氨酸、5-氯甲-2-呋喃甲酸乙酯和1,1,3,3-四甲基胍的摩尔比优选为1:1.8:5:4-1:2.2:7:5。
式(二)
具体操作优选为将谷氨酸螯合铜和谷氨酸溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，再加入水；再加入四甲基胍于40-69℃下溶解2-3h，再加入DMF稀释，然后加入5-氯甲基2-呋喃甲酸乙酯后继续反应48-64h；得到产物。反应后体系可进行过滤、滤渣依次用水和丙酮洗，然后用乙二酸二乙胺二钠盐(EDTA)水溶液洗涤，抽滤后得到纯化产物。
步骤(3)的过程和产物结构如下式(三)所示。
式(三)
步骤(3)具体为将步骤(2)产物与三光气发生环化反应，得到N-羧基环内酸酐单体。其中，三光气与步骤(2)产物的摩尔比优选为1:2.5-1:3.5，更优秀优选为1:3.0-1:3.2；反应温度为70-90℃，优选为80-85℃；反应时间为2-5h，优选为3-4h。反应后，将含有产物的乙酸乙酯溶液用冰冷的0.5％碳酸氢钠水溶液萃取以除掉副产物HCl，无水硫酸钠干燥，过滤后旋蒸干有机溶液，得到浅褐色固体物，即为纯化的N-羧基环内酸酐单体。
步骤(4)的过程和产物结构如下式(四)所示。
步骤(4)具体为步骤(3)产物在引发剂2-炔丙基-(2-((2-氨基乙基)二硫)乙基)氨基甲酸酯引发作用下开环聚合，得到末端含有炔基和二硫键、侧链含有呋喃的疏水多肽。
所述引发剂2-炔丙基-(2-((2-氨基乙基)二硫)乙基)氨基甲酸酯和N-羧基环内酸酐单体的摩尔比为1:10-1:300，优选为1:10-1:100。所述聚合温度为0-35℃，优选为20-25℃；聚合时间为24-120h，优选为72-100h。所述聚合反应的溶剂体系为N,N-二甲基甲酰胺，结束时在乙醚中沉淀出产物，真空干燥得到浅黄色的固体多肽。
式(四)
其中，m+n之和为多肽的聚合度，m和n均为正整数，二者之和为10-300，优选为10-100。
步骤(5)的过程和产物结构如下式(五)所示。
式(五)
步骤(5)具体为将末端叠氮修饰的透明质酸与步骤(4)的产物疏水多肽通过“叠氮-炔”点击化学反应，得到两亲性嵌段共聚物。
其中，末端叠氮修饰的透明质酸和疏水多肽的摩尔比为1:0.3-1:0.8，优选为1:0.4-1:0.6。反应温度30-80℃，优选为50℃。反应时间为2-72h，优选为48h，反应在氮气保护下进行；反应结束后，将得到的反应溶液透析、冻干后得到目标产物。所述末端叠氮修饰的透明质酸的重复单元数，优选为5-500。
步骤(6)具体为利用含醛基的DOX、CPT、PTX或DOC前药与6-马来酰亚胺己酰肼(6-Mal-HA)之间的亲核加成反应，合成含酰腙结构的马来酰亚胺化前药分子，上述亲核加成反应通过常规反应即可实现。该前药分子结构中的酰腙键在低pH下可断裂。
其中，对于pH敏感的马来酰亚胺化DOX前药的合成反应式如下式(六)所示，DOX与6-马来酰亚胺己酰肼的摩尔比为1:1.0-1:1.5，优选为1:1.0-1:1.2；反应温度为室温；反应时间优选为48h；反应在无水甲醇中进行；反应结束后，将旋蒸后得到的固体粗产物在乙腈中重结晶。
式(六)
其中，pH敏感的马来酰亚胺化CPT前药的合成包含三步反应，反应式如下式(七)所示。
式(七)
第一步，10-羟基喜树碱和2-溴乙醇摩尔比为1:1.0-1:3.0，优选为1:1.5-1:2.0；10-羟基喜树碱和碳酸钾摩尔比为1:2.0-1:4.0，优选为1:2.0-1:3.0；溶剂为丙酮，反应温度为40-70℃，优选为60℃；反应时间为12-48h，优选为24h；反应结束后，过滤掉碳酸钾，溶剂蒸干后用柱色谱分离提纯。第二步，4-醛基苯甲酸和第一步产物的摩尔比为1:1.2-1:0.8，优选为1:1.0；对醛基苯甲酸、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的摩尔比为1:1.2:0.1-1:2.0:0.5，优选为1:1.5:0.1；反应溶剂为二氯甲烷，温度为10-30℃，优选为25℃。反应结束后，溶剂蒸干后用柱色谱分离提纯。第三步，6-Mal-HA与第二步产物的摩尔比为1:0.5-1:1.0，优选为1:0.8-1:1.0；反应温度为室温；反应时间为12-48h，优选为24h；反应在无水甲醇中进行；反应结束后，将旋蒸后得到的固体粗产物在乙腈中重结晶。
其中，pH敏感的马来酰亚胺化PTX或DOC前药的合成包含二步反应，反应式如下式(八)所示。
式(八)
第一步，PTX或DOC与4-醛基苯甲酸的摩尔比为1:1.0-1:1.2，优选为1:1.0；PTX或DOC与N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的摩尔比为1:1.2:0.1-1:2.0:0.5，优选为1:1.5:0.1；反应溶剂为二氯甲烷，温度为10-30℃，优选为25℃。反应结束后，溶剂蒸干后用柱色谱分离提纯。第二步，6-Mal-HA与第一步产物的摩尔比为1:0.5-1:1.0，优选为1:0.8-1:1.0；反应温度为室温；反应时间为12-48h，优选为24h；反应在无水甲醇中进行；反应结束后，将旋蒸后得到的固体粗产物在乙腈中重结晶。
步骤(7)的过程和产物结构如下式(九)所示。
式(九)
其中，m为侧链被化疗药接枝的多肽的聚合度，n是侧链未被接枝的多肽的聚合度。
步骤(7)具体为利用Diels-Alder反应，将步骤(6)得到的6-马来酰亚胺化前药分子接枝到步骤(5)的多肽侧链，得到肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子前药。其中，6-马来酰亚胺化前药分子与两亲性嵌段共聚物中的侧链呋喃的摩尔比为1:1.0-1:2.0，优选为1:1.0-1:1.5；反应温度为40-80℃，优选为40-60℃；溶剂优选为二甲基亚砜；反应48h后，在甲醇中沉淀出聚合物。
本发明的肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子前药可在水中自组装形成纳米颗粒。
具体过程如下：将本发明大分子纳米前药溶于DMSO溶液，浓度为1.0-25.0mg/mL，优选为5.0-10.0mg/mL；装入透析袋，室温条件下在水中透析，得到自组装的纳米颗粒。所述透析袋的分子量优选为3.5kDa。所述透析的时间优选大于等于24h。所得纳米颗粒的尺寸为20-300nm，优选为20-150nm。
本发明的肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药，其中亲水链段为肿瘤靶向的透明质酸，疏水多肽的侧链含有呋喃结构和含酰腙结构的阿霉素、喜树碱、紫杉醇或多烯紫杉醇；侧链的酰腙键在低pH条件下可以断裂；此外，“亲水-疏水”链段由在高GSH浓度下可断裂的二硫键联接；因此，该大分子前药在水中自组装形成纳米胶束后，可以主动识别肿瘤组织并被癌细胞吞噬；当进入癌细胞后，癌细胞内的低pH和高浓度GSH环境可以导致胶束解体，加速化疗药的释放，进而增大癌细胞内化疗药的累积浓度，并最终杀死癌细胞。
本发明的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药可用于抗肿瘤药物(包括阿霉素、喜树碱、紫杉醇或多烯紫杉醇)的精准输送及抑制肿瘤细胞增殖药物的制备中；本发明载药纳米粒子被癌细胞吞噬后可加速化疗药的释放，进而瞬间增大化疗药在癌细胞内的累积浓度，有效地杀死癌细胞。
本发明的制备方法结合了N-羧基环内酸酐开环聚合技术，“叠氮-炔”点击化学技术和Diels-Alder偶联技术；化疗药在多肽侧链的接枝率高、载药量大且载体的纯化特别简单。通过本发明方法，可以低成本、大批量地制备一类载药量高、能对肿瘤微环境进行相应的“主动靶向”聚合物基纳米递药系统，能有效地抑制癌细胞的增殖。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明的肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药在水溶液中可自组装形成纳米颗粒，化疗药的负载效率高。
(2)本发明大分子纳米前药可以主动靶向肿瘤细胞，被肿瘤细胞吸收后在低pH、高谷胱甘肽(GSH)的肿瘤微环境条件下解体，因此可以在肿瘤细胞中快速释放高浓度的化疗药，进而杀死肿瘤细胞。
(3)本发明提供了一种上述大分子前药纳米颗粒的制备方法，可获得高载药量的智能型聚合物纳米药，在肿瘤化疗方面有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例4中的最终产物的1H NMR图。
图2为实施例5中的最终产物的1H NMR图。
图3为实施例7中的胶束的粒径和Zeta电位分析结果。
图4为实施例8中的阿霉素的累积释放曲线。
图5为实施例9中在0-100μg/mL浓度范围内，4T1细胞的存活率变化曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中涉及的起始物料均可从商业渠道获得。各物料用量以质量体积份计，g、mL。
实施例1：式(一)中端叠氮透明质酸的合成
将透明质酸(4.8质量份)溶解在145体积份的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH5.6)中，然后向该溶液中加入叠氮丙胺(4.9质量份)和(2.8质量份)氰基硼氢化钠，室温下搅拌7天。将混合液浓缩后用透析袋(3.5kDa)透析，用盐酸酸化，搅拌30min后再次透析，冻干后得到白色固体产物。
实施例2：式(二)中含呋喃环的谷氨酸酯化产物的合成
分别将一水醋酸铜(41.2质量份)和谷氨酸(29.4质量份)溶于750体积份水。70℃条件下，将醋酸铜水溶液逐滴滴加到谷氨酸水溶液中，滴加完毕后室温反应48h。抽滤出沉淀，分别用适量的水和乙醇洗干净。70℃真空干燥24h得到谷氨酸螯合铜，产率90％。
将谷氨酸(5.5质量份)和谷氨酸铜螯合铜(3.38质量份)混悬在DMF(2体积份)和4体积份水的混溶液中，再逐滴加入1,1,3,3-四甲基胍(5.8体积份)。将混合物在40℃下持续搅拌2h，直至所有化合物溶解。此时，将DMF(16体积份)和5-(氯甲基)-2-呋喃甲酸乙酯(11.5质量份)缓慢加入该反应混合液中，室温搅拌48h。此时，加入丙酮(200体积份)搅拌过夜，析出固体，抽滤出粗产物并用少量丙酮洗涤2-3次。将固体悬浮于乙二胺四乙酸二钠盐水溶液(0.45M)中1h后过滤，用少量蒸馏水洗涤固体3次。真空干燥24h后得到固体产物，产率64％。
实施例3：式(三)中的N-羧基环内酸酐单体的合成
将0.05摩尔份的谷氨酸酯化产物用干燥的乙酸乙酯悬浮，升温至70℃时，分批次加入0.020摩尔份的三光气，加完后升温至85℃回流反应4h，期间通入N2鼓泡。反应结束后，将反应溶液冷却至室温，分别用冰水、0.5％的碳酸氢钠和冰水各萃取一次。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤掉硫酸钠后将溶剂旋蒸干。产物为淡黄色絮状晶体，产率为45％。
实施例4：式(四)中端炔基多肽的合成
先合成引发剂2-炔丙基-(2-((2-氨基乙基)二硫)乙基)氨基甲酸酯。将N,N'-羰基二咪唑(9.73质量份)加入60体积份干燥的无水二氯甲烷，再逐滴加入丙烯醇(1.94体积份)直到溶液澄清，室温反应2h。反应完成后用40体积份蒸馏水洗3次，有机相用无水硫酸钠干燥，旋蒸后得到透明液体，将此液体密封放置在-20℃冰箱中30min，得到白色固体产物。取上述白色固体(3.47质量份)溶解在20体积份二氯甲烷中，再取胱胺(4.4质量份)溶解在30体积份的二氯甲烷中。然后，将此溶液逐滴加入到胱胺的二氯甲烷溶液中，室温搅拌24h。反应结束后，旋蒸除掉溶剂，加入100体积份磷酸二氢钠(1M)溶液。再分别用30体积份乙醚萃取三次，收集水溶液。将此水溶液用1M的氢氧化钠溶液调节pH到9，再分别用40体积份乙酸乙酯萃取3次，收集有机相。旋蒸后得到黄色液体产物。产率为55％。
将实施例2中得到的N-羧基环内酸酐单体用无水DMF溶解，设置引发剂2-炔丙基-(2-((2-氨基乙基)二硫)乙基)氨基甲酸酯和单体的摩尔比为1：20。待单体溶解后，用注射器注入引发剂，室温反应72h。反应结束后，将溶液滴入乙醚中沉淀出聚合物，过滤后真空干燥，产率72％。产物的1H NMR如图1所示。
实施例5：式(五)中“透明质酸-多肽”嵌段共聚物的合成
取0.80质量份实施例1的末端叠氮修饰的透明质酸溶于20体积份的DMSO中；再加入实施实例4中的0.28质量份多肽、0.01质量份五水硫酸铜和0.0079质量份抗坏血酸钠。通入氮气30min后，50℃下反应48h，结束后将反应混合液透析72h，冷冻干燥后得到黄色固体产物，产率为89％。产物的1H NMR如图2所示。
实施例6：大分子前药的合成
阿霉素大分子前药的合成：第一步先合成6-马来酰亚胺己酰肼化阿霉素。将盐酸阿霉素(0.26质量份)和6-马来酰亚胺基己酰肼三氟乙酸盐(0.46质量份)溶解在88体积份无水甲醇中，再加入0.025体积份三氟乙酸，避光室温搅拌24h。反应结束后，将混合液旋蒸浓缩至10-15体积份。此时缓慢加入63体积份乙腈，静置48h后离心收集沉淀，沉淀再用少量乙腈洗涤2次。将离心得到的固体50℃下真空干燥过夜。产率70％。第二步，将0.38质量份的6-马来酰亚胺己酰肼化阿霉素和0.57质量份实施例5中的“透明质酸-多肽”嵌段共聚物混合，溶于12体积份的DMSO，在50℃下反应48h。反应结束后，将反应液滴入甲醇中沉淀出聚合物，反复离心洗涤3次，产率65％。
喜树碱大分子前药的合成：第一步，将20体积份的无水丙酮加入到10-羟基喜树碱(0.36质量份)、2-溴乙醇(0.19质量份)和碳酸钾(0.28质量份)的混合物中，60℃回流反应24h。反应结束后，过滤掉碳酸钾，溶剂蒸干后用柱色谱分离提纯(乙酸乙酯/正己烷，4：6)后得到产物10-羟乙基喜树碱，产率82％。第二步，将10-羟乙基喜树碱(0.41质量份)和4-醛基苯甲酸(0.15质量份)溶于20体积份的无水二氯甲烷，冰浴条件下加入0.36质量份的N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和0.013质量份的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，完毕后升温至25℃继续反应24h。反应结束后，溶剂蒸干后用柱色谱分离提纯(乙酸乙酯/正己烷，7：3)。第三步，将0.54质量份的第二步产物与0.34质量份的6-马来酰亚胺基己酰肼三氟乙酸盐的混合物溶解在50体积份的无水甲醇中，再加入0.025体积份的三氟乙酸，室温搅拌24h。反应结束后，将混合液旋蒸干，再用100体积份的乙酸乙酯溶解，0.5％的碳酸氢钠水溶液萃取，柱色谱分离提纯(乙酸乙酯/正己烷，9：1)，产率52％。第四步，将第三步得到的喜树碱前药(0.35质量份)和0.30质量份实施例5中的“透明质酸-多肽”嵌段共聚物混合，溶于12体积份的DMSO，在50℃下反应48h。反应结束后，将反应液滴入甲醇中沉淀出聚合物，反复离心洗涤3次，产率73％。
紫杉醇大分子前药的合成：第一步，将紫杉醇(0.85质量份)和4-醛基苯甲酸(0.15质量份)溶于50体积份的无水二氯甲烷，冰浴条件下加入0.36质量份的N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)和0.013质量份的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，完毕后升温至25℃继续反应24h。反应结束后，溶剂蒸干后用柱色谱分离提纯(乙酸乙酯/正己烷，3：7)。第二步，将0.49质量份的第二部步产物与0.17质量份的6-马来酰亚胺基己酰肼三氟乙酸盐混合物溶解在50体积份的无水甲醇中，再加入0.025体积份的三氟乙酸，避光室温搅拌24h。反应结束后，将混合液旋蒸干，用100体积份的乙酸乙酯溶解，0.5％的碳酸氢钠水溶液萃取后，硫酸镁干燥有机相，柱色谱分离提纯(乙酸乙酯/正己烷，5：5)，产率67％。第三步，将第二步得到的紫杉醇前药(0.68质量份)和0.30质量份实施例5中的“透明质酸-多肽”嵌段共聚物混合，溶于12体积份的DMSO，在50℃下反应48h。反应结束后，将反应液滴入乙酸乙酯中沉淀出聚合物，反复离心洗涤3次，产率85％。
多烯紫杉醇大分子前药的合成与紫杉醇大分子前药的合成相同。
实施例7：大分子前药纳米胶束的制备
将实施例6中的产物溶于DMSO(以阿霉素大分子前药为例)，再装入分子量为3500的透析袋中；每隔4h换一次去离子水，24h后收集透析袋中液体，得到纳米前药的胶束溶液。用马尔文粒度分析仪测定胶束的尺寸及分布、还有表面电位，结果如图3所示。如图3所示，纳米粒的平均粒径为188.6nm，非常适合载药聚合物纳米药的临床应用；纳米粒的表面电位为-32.7mV，这说明其表面为透明质酸，这保证了纳米粒的肿瘤靶向性。
实施例8：大分子前药纳米颗粒的pH和GSH响应性评价
以pH5.0、含10mM的GSH条件下的阿霉素的累积释放百分比的测定为例进行说明。首先，将3mL实施例7的大分子前药纳米胶束装入分子量为3500的透析袋中，放置于50mL的离心管中；向离心管中再加入27mL的pH为5.0、含10mM GSH的PBS缓冲溶液，37℃下以150转/min的速度震荡；分别在1h、2h、3h、4h、5h、7h、9h、12h、16h、24h、30h、36h、48h、72h、96h、120h、144h和168h时取出3mL透析袋外的水溶液，测定在485nm处阿霉素的吸光度，每次取样后补加3mL的缓冲溶液。根据自由阿霉素在去离子水中的标准曲线计算药物的累计释放百分比。其它pH和GSH浓度条件下的药物累计释放曲线的测定与以上步骤相同。如图4所示，纳米粒负载的阿霉素在pH为5.0，GSH浓度为10mM的条件下释放更快，这说明纳米粒有刺激响应性，因此可以到达肿瘤组织后在短时间内大量释放阿霉素，以杀死肿瘤细胞。其余大分子前药的测试结果与阿霉素大分子前药相似，在此不一一赘述。
实施例9：MTT法测定大分子纳米前药对4T1肿瘤细胞增殖的抑制
将4T1细胞以4000个/孔的密度种于96孔板，培养24h后吸出DMEM培养基；将实施例7的胶束水溶液用DMEM培养液按照一定的浓度梯度稀释，然后加入96孔板中；在培养箱中培养24h后，每孔加入10μL的MTT，继续培养4h后用酶标仪测量OD值；计算4T1细胞的存活率；以游离阿霉素为对照组，同时测定游离阿霉素对细胞存活率的影响。在0-100μg/mL浓度范围内，4T1细胞的存活率变化趋势如图5所示，其中以实施例5中产物的细胞毒性作为参照。如图5所示，大分子阿霉素前药纳米粒可以有效杀死肿瘤细胞，而多肽侧链没有接枝药物的载体对肿瘤细胞几乎没有任何毒性，这说明抗肿瘤活性来自于负载的阿霉素。其余大分子前药的测试结果与阿霉素大分子前药相似，在此不一一赘述。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药，其特征在于分子结构如通式(1)所示：
其中，
中的至少一种；
通式(1)中，m和n分别为侧链肽链的聚合度，x为透明质酸的重复单元数；R1为苯基时，R2为乙酰基；R1为叔丁氧基时，R2为氢。
2.根据权利要求1所述的肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药，其特征在于：所述的大分子前药在水中自组装形成纳米颗粒，具体过程如下：将所述大分子纳米前药溶于DMSO溶液，浓度为1.0-25.0mg/mL，装入透析袋，室温条件下在水中透析，得到自组装的纳米颗粒。
3.一种权利要求1-2任一项所述的肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)合成末端叠氮修饰的透明质酸；(2)合成侧链含呋喃环的谷氨酸酯；(3)制备步骤(2)中谷氨酸酯相应的N-羧基环内酸酐单体；(4)合成末端含有炔基和二硫键、侧链含有呋喃的疏水多肽；(5)合成“透明质酸-多肽”两亲性嵌段共聚物；(6)合成含酰腙结构的6-马来酰亚胺化前药分子；(7)使用Diels-Alder反应，将步骤(6)的前药分子接枝到多肽侧链，得到大分子前药。
4.根据权利要求3所述的肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药的制备方法，其特征在于：步骤(1)具体为利用叠氮丙胺与透明质酸链端的醛基之间的还原胺反应得到；所用透明质酸与叠氮丙胺的摩尔比为1:40-1:80；反应时间为48-240h。
5.根据权利要求3所述的肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药的制备方法，其特征在于：步骤(2)具体为谷氨酸、5-氯甲基2-呋喃甲酸乙酯在谷氨酸螯合铜、1,1,3,3-四甲基胍催化下反应得到；所用谷氨酸螯合铜、谷氨酸、5-氯甲-2-呋喃甲酸乙酯和1,1,3,3-四甲基胍的摩尔比为1:1.8:5:4-1:2.2:7:5。
6.根据权利要求3所述的肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药的制备方法，其特征在于：步骤(3)具体为将步骤(2)产物与三光气发生环化反应，得到N-羧基环内酸酐单体；其中，三光气与步骤(2)产物的摩尔比为1:2.5-1:3.5；反应温度为70-90℃；反应时间为2-5h。
7.根据权利要求3所述的肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药的制备方法，其特征在于：步骤(4)具体为步骤(3)产物在引发剂2-炔丙基-(2-((2-氨基乙基)二硫)乙基)氨基甲酸酯引发作用下开环聚合，得到末端含有炔基和二硫键、侧链含有呋喃的疏水多肽；其中，所述引发剂2-炔丙基-(2-((2-氨基乙基)二硫)乙基)氨基甲酸酯和N-羧基环内酸酐单体的摩尔比为1:10-1:300；所述聚合温度为0-35℃；聚合时间为24-120h。
8.根据权利要求3所述的肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药的制备方法，其特征在于：步骤(5)具体为将末端叠氮修饰的透明质酸与步骤(4)的产物疏水多肽通过“叠氮-炔”点击化学反应，得到两亲性嵌段共聚物；其中，末端叠氮修饰的透明质酸和疏水多肽的摩尔比为1:0.3-1:0.8；反应温度30-80℃；反应时间为2-72h。
9.根据权利要求3所述的肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药的制备方法，其特征在于：步骤(7)具体为利用Diels-Alder反应，将步骤(6)得到的6-马来酰亚胺化前药分子接枝到步骤(5)的多肽侧链，得到肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子前药；其中，6-马来酰亚胺化前药分子与两亲性嵌段共聚物中的侧链呋喃的摩尔比为1:1.0-1:2.0；反应温度为40-80℃。
10.权利要求1-2任一项所述的肿瘤靶向的pH和氧化还原双重响应的大分子纳米前药在抗肿瘤药物的精准输送及抑制肿瘤细胞增殖药物的制备中的应用。
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