CN115232192B - 一种偶氮类乏氧响应型二肽超分子单体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于高分子化合物技术领域，本发明提供了一种偶氮类乏氧响应型二肽超分子单体及其制备方法和应用。本发明通过液相合成方法的方法合成色氨酸‑甘氨酸甲酯，然后使用氢氧化锂进行水解脱去色氨酸‑甘氨酸甲酯上的甲基制备二肽；在二肽碳端通过酯化反应引入线性或树枝化烷氧醚；经三氟乙酸脱除Boc保护基，得到二肽三氟乙酸盐；最后二肽氮端通过酰胺化反应与乏氧响应偶氮苯基元连接，合成结构对称的偶氮类二肽超分子单体。本发明提供的偶氮类二肽超分子单体在溶液中经自组装形成乏氧响应的超分子聚合物，该超分子聚合物可作为肿瘤乏氧响应的药物载体及乏氧响应探针，实现肿瘤环境下对负载药物的靶向释放，从而提高肿瘤治疗的效果。
Description
技术领域
本发明涉及高分子化合物技术领域，尤其涉及一种偶氮类乏氧响应型二肽超分子单体及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是由于机体细胞失去正常调控，过度增殖而引起的疾病，也称恶性肿瘤。这些过度增殖的细胞会侵犯周围组织，甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。癌症是现在医学界难以攻克的课题之一，常规化疗药物因其对肿瘤组织的选择性差使其在肿瘤治疗中的效果大打折扣。因此基于肿瘤靶向药物载体的研究备受关注。乏氧是实体肿瘤显著的特征之一，肿瘤细胞过度生长和增殖导致对氧气需求无法满足或向其他部位传输氧气的能力下降，从而引起细胞内部的乏氧环境。因此基于肿瘤乏氧的特性从而开发针对性材料成为了解决问题的方案之一。但是在目前研究中，仍然存在大量的问题：一些药物分子水溶性差，生物利用率不高；多肽采用固相合成方法，合成剂量小、分离提纯周期长、合成成本高；上述各项情况成为了亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种偶氮类乏氧响应型二肽超分子单体及其制备方法和应用。
本发明提供了一种偶氮类乏氧响应型二肽超分子单体，本发明通过液相合成方法的方法合成色氨酸-甘氨酸甲酯，然后使用氢氧化锂进行水解脱去色氨酸-甘氨酸甲酯上的甲基制备二肽；在二肽碳端通过酯化反应引入线性或树枝化烷氧醚；经三氟乙酸脱除Boc保护基，得到二肽三氟乙酸盐；最后二肽氮端通过酰胺化反应与乏氧响应偶氮苯基元连接，合成结构对称的偶氮类二肽超分子单体。
本发明提供的偶氮类乏氧响应型二肽超分子单体在水中经自组装形成乏氧响应的超分子聚合物，该超分子聚合物可作为肿瘤乏氧响应的药物载体及乏氧响应探针，实现肿瘤环境下对负载药物的靶向释放，从而提高肿瘤治疗的效果。为新型肿瘤靶向纳米药物载体方面的研发提供基础。
附图说明
图1为实施例1中二肽超分子单体的核磁共振氢谱图；图2为实施例1中二肽超分子聚合物加入还原剂后随时间变化的紫外光谱图；图3为实施例1中二肽超分子聚合物加入还原剂后荧光强度与时间的变化关系图；图4为实施例1中二肽超分子聚合物加入还原剂后不同时间的峰值与时间的变换关系图；图5为实施例1中二肽超分子聚合物和萘普生的荧光强度图；图6为实施例1中0.02mg/mL的二肽超分子聚合物对萘普生的包覆和释放图；图7为实施例1中0.05mg/mL的二肽超分子聚合物对萘普生的包覆和释放图；图8为实施例2中二肽超分子单体的核磁共振氢谱图；图9为实施例2中二肽超分子聚合物加入还原剂后随时间变化的紫外光谱图；图10为实施例2中二肽超分子聚合物加入还原剂后荧光光谱变化图；图11为实施例2中二肽超分子单体加入还原剂后最大荧光强度与时间的关系曲线；图12为实施例2中0.05mg/mL的二肽超分子聚合物对萘普生的包覆图；图13为实施例2中0.1mg/mL的二肽超分子聚合物对萘普生的包覆图；图14为实施例2中不同浓度的二肽超分子聚合物对萘普生的包覆图；图15为实施例2中不同浓度的二肽超分子聚合物药物载体的细胞毒性对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种偶氮类乏氧响应型二肽超分子单体，具有如下所示结构：
所述n为0或1；
所述OEGs为
所述X为H、CH3或CH2CH3。
本发明提供了所述偶氮类乏氧响应型二肽超分子单体的制备方法，包含下列步骤：
(1)在碱性条件下，将甘氨酸甲酯盐酸盐、叔丁氧羰基保护的色氨酸、1-羟基苯并三唑和二氯甲烷混合后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐进行反应，得到化合物A；(2)将化合物A的甲醇溶液和一水合氢氧化锂溶液混合后进行水解反应，得到化合物B；(3)将化合物B、单体、二氯甲烷和4-二甲氨基吡啶混合后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐进行酯化反应，得到化合物C；(4)将化合物C的二氯甲烷溶液和三氟乙酸混合后进行反应，得到化合物D；(5)在碱性条件下，将化合物D、偶氮类单体、1-羟基苯并三唑和二氯甲烷混合后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐进行酰胺化反应，即得所述二肽超分子单体。
在本发明中，步骤(1)中所述甘氨酸甲酯盐酸盐和叔丁氧羰基保护的色氨酸的摩尔比优选为14～15：13～14，进一步优选为14.2～14.8：13.2～13.8，更优选为14.4～14.6：13.4～13.6。
在本发明中，所述甘氨酸甲酯盐酸盐和1-羟基苯并三唑的摩尔比优选为14～15：15～16，进一步优选为14.2～14.8：15.2～15.8，更优选为14.4～14.6：15.4～15.6。
在本发明中，所述甘氨酸甲酯盐酸盐和二氯甲烷的摩尔体积比优选为14～15mmol：40～60mL，进一步优选为14.2～14.8mmol：45～55mL，更优选为14.4～14.6mmol：48～52mL。
在本发明中，所述甘氨酸甲酯盐酸盐和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比优选为14～15：19～20，进一步优选为14.2～14.8：19.2～19.8，更优选为14.4～14.6：19.4～19.6。
在本发明中，步骤(1)中所述碱性条件的pH值优选为8～9，进一步优选为8.2～8.8，更优选为8.4～8.6；调节碱性条件所用试剂优选为N,N-二异丙基乙胺。
在本发明中，将甘氨酸甲酯盐酸盐、叔丁氧羰基保护的色氨酸、1-羟基苯并三唑和二氯甲烷混合后，调节pH值后将反应环境置换为保护气氛，所述保护气氛优选为氮气、氩气或氦气。
在本发明中，步骤(1)中所述混合的温度优选为-5～5℃，进一步优选为-4～4℃，更优选为-3～3℃；搅拌速度优选为250～350rpm，进一步优选为260～340rpm，更优选为280～320rpm；时间优选为15～20min，进一步优选为16～19min，更优选为17～18min。
在本发明中，混合结束后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐顺次进行保护气氛的置换和低温反应；所述保护气氛优选为氮气、氩气或氦气；所述低温反应的温度优选为-5～5℃，进一步优选为-4～4℃，更优选为-3～3℃；低温反应的时间优选为15～25min，进一步优选为16～24min，更优选为18～22min。低温反应结束后进行下一步的反应。
在本发明中，步骤(1)中所述反应的温度优选为20～30℃，进一步优选为22～28℃，更优选为24～26℃；时间优选为12～14h，进一步优选为12.5～13.5h，更优选为12.8～13.2h。
在本发明中，步骤(1)中反应结束后，留样，使用硅胶板确定反应完全，硅胶板中展开剂包含PE和EA，所述PE和EA的体积比优选为0.5～1.5：0.5～1.5，进一步优选为0.6～1.4：0.6～1.4，更优选为0.8～1.2：0.8～1.2；使用硫酸氢钾对反应体系进行萃取洗涤，所述硫酸氢钾的质量分数优选为8～12％，进一步优选为8.5～11.5％，更优选为9～10％；萃取洗涤结束后，进行二次萃取；所述二次萃取所用试剂优选为二氯甲烷，收集二次萃取中的下层溶液；将下层溶液进行干燥，所述干燥所用试剂优选为无水硫酸钠；将获得的有机相进行旋蒸，硅胶载样，层析法提纯，提纯所用试剂中PE和EA的体积比优选为1.8～2.2：2.8～3.2，进一步优选为1.9～2.1：2.9～3.1，更优选为2：3；提纯获得白色泡沫状产物，即为化合物A。
在本发明中，步骤(1)的反应过程如下所示：
在本发明中，步骤(2)中所述化合物A的甲醇溶液中化合物A和甲醇的摩尔体积比优选为2～3mmol：30～50mL，进一步优选为2.2～2.8mmol：35～45mL，更优选为2.4～2.6mmol：38～42mL。
在本发明中，所述一水合氢氧化锂溶液中一水合氢氧化锂和水的摩尔体积比优选为5.5～6mmol：8～12mL，进一步优选为5.6～5.9mmol：9～11mL，更优选为5.7～5.8mmol：9.5～10.5mL。
在本发明中，所述化合物A和一水合氢氧化锂的摩尔比优选为2～3：5.5～6，进一步优选为2.2～2.8：5.6～5.9，更优选为2.4～2.6：5.7～5.8。
在本发明中，将一水合氢氧化锂溶液逐滴滴加进化合物A的甲醇溶液中，滴加完毕后，计时反应。
在本发明中，步骤(2)中所述水解反应的温度优选为20～30℃，进一步优选为22～28℃，更优选为24～26℃；时间优选为1.5～2h，进一步优选为1.6～1.9h，更优选为1.7～1.8h。
在本发明中，反应结束后，进行点板操作，所述点板操作的展开剂包含PE和EA，所述PE和EA的体积比优选为1.8～2.2：2.8～3.2，进一步优选为1.9～2.1：2.9～3.1，更优选为2：3。旋蒸除去甲醇后加入水，所述水和化合物A的体积摩尔比优选为20～30mL：2～3mmol，进一步优选为22～28mL：2.2～2.8mmol，更优选为24～26mL：2.4～2.6mmol；使用硫酸氢钾调节pH值，所述硫酸氢钾的质量分数优选为8～12％，进一步优选为9～11％，更优选为9.5～10.5％；所述pH值优选为2～3，进一步优选为2.2～2.8，更优选为2.4～2.6；接着使用EA重复萃取，所述萃取的次数优选大于等于3次，进一步优选大于等于4次，更优选大于等于5次；在萃取期间，使下层水相的pH一直保持在2～3之间，加入无水Na2SO4对有机相进行干燥后过滤，将所得溶液进行旋蒸，旋蒸后加入二氯甲烷继续旋蒸，所述二氯甲烷和化合物A的体积摩尔比优选为3～5mL：2～3mmol，进一步优选为3.5～4.5mL：2.2～2.8mmol，更优选为3.8～4.2mL：2.4～2.6mmol；最后经油泵抽取后得黄色泡沫状的产物，即为化合物B。
在本发明中，步骤(2)的反应过程如下所示：
在本发明中，步骤(3)中所述单体优选为线性烷氧醚或树枝状烷氧醚。
在本发明中，所述线性烷氧醚优选为三乙二醇单乙醚、三乙二醇单甲醚、二乙二醇单乙醚或二乙二醇单甲醚。
在本发明中，所述线性烷氧醚购自上海贤鼎生物科技有限公司、上海毕得医药科技股份有限公司。
在本发明中，所述树枝状烷氧醚的合成方法，参照文献Macromolecules，2008,41(1):43-49，进行合成。
在本发明中，所述化合物B和单体的摩尔比优选为2～2.5：2.5～3，进一步优选为2.1～2.4：2.6～2.9，更优选为2.2～2.3：2.7～2.8。
在本发明中，所述化合物B和二氯甲烷的摩尔体积比优选为2～2.5mmol：25～35mL，进一步优选为2.1～2.4mmol：26～34mL，更优选为2.2～2.3mmol：28～32mL。
在本发明中，所述化合物B和4-二甲氨基吡啶的摩尔比优选为2～2.5：0.6～0.8，进一步优选为2.1～2.4：0.65～0.75，更优选为2.2～2.3：0.68～0.72。
在本发明中，所述化合物B和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比优选为2～2.5：2.5～3.5，进一步优选为2.1～2.4：2.6～3.4，更优选为2.2～2.3：2.8～3.2。
在本发明中，将化合物B、单体、二氯甲烷和4-二甲氨基吡啶混合后进行保护气氛的置换，所述保护气氛优选为氮气、氦气或氩气，所述置换的次数优选大于等于3次，进一步优选大于等于4次，更优选大于等于5次。
在本发明中，步骤(3)中所述混合的温度优选为-5～5℃，进一步优选为-4～4℃，更优选为-3～3℃；搅拌速度优选为250～350rpm，进一步优选为260～340rpm，更优选为280～320rpm；时间优选为25～35min，进一步优选为26～34min，更优选为28～32min。
在本发明中，混合结束后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，进行保护气氛的置换；所述保护气氛优选为氮气、氦气或氩气。
在本发明中，步骤(3)中所述酯化反应的温度优选为20～30℃，进一步优选为22～28℃，更优选为24～26℃；时间优选为10～14h，进一步优选为11～13h，更优选为11.5～12.5h。
在本发明中，步骤(3)中酯化反应结束后留样点板，点板的展开剂包含EA和PE，所述EA和PE的体积比优选为2～4：1，进一步优选为2.5～3.5：1，更优选为2.8～3.2：1；然后进行洗涤，洗涤所用试剂优选为硫酸氢钾，所述硫酸氢钾的质量分数优选为8～12％，进一步优选为9～11％，更优选为9.5～10.5％；洗涤结束后收集下层物质，表层物质使用饱和氯化钠水溶液进行洗涤，然后使用二氯甲烷进行萃取，所述萃取的次数优选大于等于3次，进一步优选大于等于4次，更优选大于等于5次；将萃取获得的溶液进行干燥过滤，所述干燥所用试剂优选为无水硫酸钠；将滤液进行旋蒸至溶液少许后加入硅粉再进行旋蒸，当硅胶粉呈现粉末状时，采用层析法提纯，展开剂中PE和EA的体积比优选为1.8～2.2：2.8～3.2，进一步优选为1.9～2.1：2.9～3.1，更优选为2：3，在此展开剂适量时，将展开剂极性进行调节，其中PE和EA的体积比优选为1：2～4，进一步优选为1：2.5～3.5，更优选为1：2.8～3.2；旋蒸后在进行油泵抽去残留溶剂得橘黄色油状物，即为化合物C。
在本发明中，步骤(3)的反应过程如下所示：
在本发明中，步骤(4)中所述化合物C的二氯甲烷溶液中化合物C和二氯甲烷的摩尔体积比优选为1.2～1.8mmol：3～5mL，进一步优选为1.3～1.7mmol：3.5～4.5mL，更优选为1.4～1.6mmol：3.8～4.2mL。
在本发明中，化合物C和三氟乙酸的摩尔体积比优选为1.2～1.8mmol：3～4mL，进一步优选为1.3～1.7mmol：3.2～3.8mL，更优选为1.4～1.6mmol：3.4～3.6mL。
在本发明中，将三氟乙酸滴加进化合物C的二氯甲烷溶液中，滴加完毕后开始计时反应。
在本发明中，步骤(4)中所述反应的温度优选为-5～5℃，进一步优选为-4～4℃，更优选为-2～2℃；搅拌速度优选为250～350rpm，进一步优选为260～340rpm，更优选为280～320rpm；时间优选为1.5～2h，进一步优选为1.6～1.9h，更优选为1.7～1.8h。
在本发明中，步骤(4)中反应结束后，使用乙酸乙酯来进行点样确定反应的完成，然后在体系中加入甲醇，所述甲醇和化合物C的体积摩尔比优选为20～40mL：1.2～1.8mmol，进一步优选为25～35mL：1.3～1.7mmol，更优选为28～32mL：1.4～1.6mmol；甲醇的作用是与溶液中多余的三氟乙酸进行脱水反应生成酯，加入甲醇后进行继续搅拌，继续搅拌的时间优选为30～40min，进一步优选为32～38min，更优选为34～36min；旋蒸除去溶液中多余的甲醇；然后加入二氯甲烷，二氯甲烷和化合物C的体积摩尔比优选为5～8mL：1.2～1.8mmol，进一步优选为6～7mL：1.3～1.7mmol，更优选为6.4～6.6mL：1.4～1.6mmol；所述二氯甲烷的加入次数优选大于等于3次，进一步优选大于等于4次，更优选大于等于5次；二氯甲烷的作用是除尽溶液中的甲醇，获得橘黄色油状物，即为化合物D。
在本发明中，步骤(4)的反应过程如下所示：
在本发明中，步骤(5)中所述碱性条件的pH值优选为8～9，进一步优选为8.2～8.8，更优选为8.4～8.6；调节碱性条件所用试剂优选为N,N-二异丙基乙胺。
在本发明中，所述偶氮类单体优选为4，4’-二羧基偶氮苯或4，4’-偶氮二苯基二乙酸。
在本发明中，将偶氮类单体、化合物D、1-羟基苯并三唑加入到二氯甲烷中后调节pH值；然后置换保护气氛，所述保护气氛优选为氮气、氦气或氖气，然后进行混合。
在本发明中，所述混合的温度优选为-5～5℃，进一步优选为-4～4℃，更优选为-2～2℃；搅拌速度优选为250～350rpm，进一步优选为260～340rpm，更优选为280～320rpm；时间优选为15～25min，进一步优选为16～24min，更优选为18～22min。
在本发明中，混合结束后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐进行保护气氛的置换，所述保护气氛优选为氮气、氦气或氖气；置换完成后，进行低温反应，所述低温反应的温度优选为-5～5℃，进一步优选为-4～4℃，更优选为-2～2℃；时间优选为10～30min，进一步优选为15～25min，更优选为18～23min。低温反应结束后，进行酰胺化反应。
在本发明中，所述酰胺化反应的温度优选为20～30℃，进一步优选为22～28℃，更优选为24～26℃；时间优选为10～12h，进一步优选为10.5～11.5h，更优选为10.8～11.2h。
在本发明中，酰胺化反应结束后点样来确定反应进行的程度，所述点样的展开剂包含二氯甲烷和甲醇，所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为25～35:1，进一步优选为26～34：1，更优选为28～32：1；然后采用硫酸氢钾溶液进行洗涤，所述硫酸氢钾溶液的质量分数优选为8～12％，进一步优选为9～11％，更优选为9.5～10.5％；使用二氯甲烷进行萃取，收集下层的有机相；将有机相使用饱和氯化钠水溶液进行萃取，然后使用无水硫酸钠进行干燥和过滤；将获得的有机相加入硅胶粉进行旋蒸，所述硅胶粉和步骤(5)中二氯甲烷的质量体积比优选为1～1.5g：20～40mL，进一步优选为1.1～1.4g：25～35mL，更优选为1.2～1.3g：28～32mL；旋蒸结束后进行柱色谱提纯，所述提纯所用展开剂包含二氯甲烷和甲醇，所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为25～35：1，进一步优选为26～34：1，更优选为28～32：1；然后采用体积比为15～25:1的二氯甲烷和甲醇进行TLC检测，更优选为20：1；检测结束后进行旋蒸，顺次进行抽水泵和抽油泵，得到橘黄色粘稠状液体，即为二肽超分子单体。
在本发明中，当步骤(3)中单体为线性烷氧醚时，步骤(5)中所述偶氮类单体和化合物D的摩尔比优选为0.5～0.6：1～1.2，进一步优选为0.52～0.58：1.05～1.15，更优选为0.54～0.56：1.08～1.12。
在本发明中，所述偶氮类单体和1-羟基苯并三唑的摩尔比优选为0.5～0.6：1.25～1.35，进一步优选为0.52～0.58：1.26～1.34，更优选为0.54～0.56：1.28～1.32。
在本发明中，所述偶氮类单体和二氯甲烷的摩尔体积比优选为0.5～0.6mmol：20～40mL，进一步优选为0.52～0.58mmol：25～35mL，更优选为0.54～0.56mmol：28～32mL。
在本发明中，所述偶氮类单体和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比优选为0.5～0.6：1.5～2.0，进一步优选为0.52～0.58：1.56～1.59，更优选为0.54～0.56：1.57～1.58。
在本发明中，当步骤(3)中单体为树枝状烷氧醚时，步骤(5)中所述偶氮类单体和化合物D的摩尔比优选为0.2～0.3：0.5～0.6，进一步优选为0.22～0.28：0.52～0.58，更优选为0.24～0.26：0.54～0.56。
在本发明中，所述偶氮类单体和1-羟基苯并三唑的摩尔比优选为0.2～0.3：0.5～0.6，进一步优选为0.22～0.28：0.52～0.58，更优选为0.24～0.26：0.54～0.56。
在本发明中，所述偶氮类单体和二氯甲烷的摩尔体积比优选为0.2～0.3mmol：20～40mL，进一步优选为0.22～0.28mmol：25～35mL，更优选为0.24～0.26mmol：28～32mL。
在本发明中，所述偶氮类单体和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比优选为0.2～0.3：0.65～0.75，进一步优选为0.22～0.28：0.66～0.74，更优选为0.24～0.26：0.68～0.72。
在本发明中，以4，4’-偶氮二苯基二乙酸为例，步骤(5)的反应过程如下所示：
本发明还提供了所述偶氮类二肽超分子单体在制备荧光探针材料和药物控释材料中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取14.46mmol的甘氨酸甲酯盐酸盐、13.14mmol的叔丁氧羰基保护的色氨酸和15.77mmol的1-羟基苯并三唑溶于50mL的二氯甲烷中，然后用N,N-二异丙基乙胺调节pH值为9，置换氮气，在0℃、300rpm条件下混合20min；然后加入19.71mmol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，置换氮气后在0℃条件下反应20min，然后在25℃下反应12h。反应结束后，使用硅胶板确定反应完全，其展开剂的极性为体积比1:1的PE和EA，当反应完成后，用10％KHSO4对整个反应体系进行萃取洗涤，再用DCM二次萃取一遍有机相，收集水相(上层摒弃)，将下层溶液用无水Na2SO4干燥过滤后，留样(以便观察下一步反应是否完全)。将过滤后的有机相置于圆底烧瓶，进行旋蒸，硅胶载样，经层析法提纯(PE:EA＝2:3，v:v)，得白色泡沫状产物，即为化合物A，记为Boc-WG-OMe，经过称量化合物A的质量为1.080g，收率为21.64％。
将2.88mmol的化合物A溶于40mL的甲醇中，将5.75mmol的一水合氢氧化锂溶于10mL的水中，将一水合氢氧化锂溶液逐滴滴加进化合物A的甲醇溶液中，滴加完毕后，在25℃条件下反应2h，反应结束后，点板留样(展开剂PE:EA＝2:3，v:v)。进行旋蒸操作，除去溶剂中的甲醇后，加入25mL的去离子水。再用10％的KHSO4调节pH为2.5，反应溶液用少量EA重复萃取4次，在萃取期间，使下层水相的pH一直保持在2-3之间，加入无水Na2SO4对有机相进行干燥后过滤，将所得溶液进行旋蒸，在溶液所留少许时，加入4mL的DCM再次进行旋蒸，最后经油泵抽取后得黄色泡沫状的产物，即为化合物B，记为Boc-WG-OH，经过称量化合物B的质量为0.7660g，收率为73.65％。
单体选用线性烷氧醚中的三乙二醇单乙醚，将2.12mmol的化合物B、2.76mmol的三乙二醇单乙醚和30mL的二氯甲烷混合，然后加入0.73mmol的4-二甲氨基吡啶，重复置换3次氮气后，在0℃、300rpm条件下反应30min；然后加入3.12mmol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，置换氮气后在25℃反应12h。酯化反应结束后留样点板(展开剂EA:PE＝3:1，v:v)，反应体系用10％KHSO4溶液洗涤，收集下层，表层用饱和NaCl的水溶液洗涤后，再用DCM萃取3次，将溶液汇总后用无水Na2SO4干燥后过滤并留样。将滤液进行旋蒸至溶液少许后加入硅粉再进行旋蒸，当硅胶粉呈现粉末状时，采用层析法提纯，展开剂极性为PE:EA＝2:3，在此展开剂适量时，将展开剂极性调节为PE:EA＝1:3，旋蒸后在进行油泵抽去残留溶剂得橘黄色油状物，即为化合物C，记为Boc-WG-TEG，经过称量化合物C的质量为0.6103g，收率为55.2％。
将1.46mmol(也即0.6103g)的化合物C和4mL的二氯甲烷混合，将3.46mL的三氟乙酸滴加进上述混合体系中，在0℃、300rpm条件下反应2h；反应结束后留样点板(展开剂为纯乙酸乙酯)，在体系中加入30mL的甲醇使其与溶液中多余的三氟乙酸进行脱水反应生成酯，进行搅拌30min后，旋蒸，除去溶液中多余的甲醇，后分5次加入5mL的DCM旋蒸以除尽溶液中的甲醇得橘黄色油状物，即为化合物D，记为TFA-WG-TEG，经过称量化合物D的质量为0.6103g，收率为100％。
取0.53mmol的4，4’-偶氮二苯基二乙酸，1.17mmol的化合物D、1.28mmol的1-羟基苯并三唑溶于30mL的二氯甲烷中，用N,N-二异丙基乙胺调节pH为9，置换氮气后在0℃、300rpm条件下反应20min，然后加入1.59mol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，置换氮气，在0℃条件下反应20min后，在25℃条件下酰胺化反应12h；反应结束后点样(展开剂的极性为DCM:MeOH＝30:1)，反应体系用10％KHSO4溶液洗涤，上层反应液用DCM再萃取一次，收集下层，即有机相，下层用饱和NaCl的水溶液进行萃取后，再用无水Na2SO4进行干燥后并进行过滤操作(留样)，将获得的有机相加入1.5g硅胶粉进行旋蒸，旋蒸结束后进行柱色谱提纯，其展开剂的极性为DCM:MeOH＝30:1，然后采用体积比为20:1的二氯甲烷和甲醇进行TLC检测，检测结束后进行旋蒸，顺次进行抽水泵和抽油泵，得到橘黄色粘稠状液体，即为二肽超分子单体，记为AZO-WG-TEG，经过称量二肽超分子单体的质量为223.6mg，收率为40.14％。
将本实施例合成的二肽超分子单体置于d6-DMSO中进行核磁共振检测，得到的核磁共振氢谱如图1所示。
因肿瘤细胞周围是乏氧的微环境且其周围的还原性物质(偶氮还原酶)的含量将会上升，会使偶氮苯的N＝N双键发生断裂，被还原为苯胺类化合物，从而使化合物的吸光度发生变化。采用Na2S2O4作为还原剂，模拟偶氮还原酶，检测还原前后紫外光谱的变化并判断还原后化合物结构的变化。具体操作如下：以DMF和10mg/mL碳酸钠的水溶液作为溶剂，在模拟体内肿瘤所造成的乏氧微环境时采用了还原剂Na2S2O4，配置0.02mg/mL的AZO-WG-TEG的溶液(2.5mL)两份，一份作为对照，一份加入0.05mmol/mL的Na2S2O4(50uL)，按照以上操作再配两份以用作荧光检测。观察随时间的变化其吸光度的变化，其紫外光谱图如图2所示，从图中可以得知，加入还原剂后，AZO-WG-TEG的峰发生右移，从283nm移到了319nm处，且随着时间的增加，吸光度的数值在逐渐下降，增加至100min后，发现偶氮基位置吸收峰基本消失，说明偶氮键完全断裂。
采用荧光光谱来探索AZO-WG-TEG分子在加入还原剂后其荧光强度的变化和时间的关系。具体操作如下：在0.02mg/mLAZO-WG-TEG溶液加入50uL浓度为0.05mmol/mLNa2S2O4还原剂后，观察此聚合物的荧光强度在100min内随时间的变化是否会发生变化。变化关系如图3所示，当还原剂刚加入到体系时，随着时间的增加，波长不断的发生蓝移现象且荧光强度不断的再增加，在70min后逐渐稳定下来，与上述超分子聚合加入还原剂后的紫外光谱变化规律一致。此现象的主要原因是溶液中的可被还原的AZO-WG-TEG已充分被还原，溶液中的FRET体系可被打破的量已被完全打破，色氨酸荧光完全显现出来，且不再呈现上升趋势。对不同时间和对应的峰值进行做图，结果如图4所示，从图中可以看到荧光强度随时间变化的趋势，稳定后的荧光是未加入还原剂时的8.4倍，因此，该超分子聚合物有作为乏氧响应荧光探针的应用潜力。
因乏氧响应型二肽分子AZO-WG-TEG为双亲分子，在溶液中容易自组装，其形成的组装体内部更为疏水，因此改造超分子组装体可以包覆一些疏水药物，可应用于抗肿瘤和乏氧荧光探针方面。基于此，将客体药物Nap和不同浓度的AZO-WG-TEG配置成溶液，研究超分子组装体对Nap的包覆和释放行为。具体操作如下：用DMF和10mg/mL碳酸钠的水溶液做溶剂并保持溶液一直在弱碱的情况下(以防Na2S2O4分解)，配制不同浓度的AZO-WG-TEG溶液以及相同浓度的萘普生溶液：包括0.02mg/mL AZO-WG-TEG和0.05mmol/mL AZO-WG-TEG、0.02mg/mL Nap、0.02mg/mLAZO-WG-TEG加0.02mg/mLNap、0.02mg/mLAZO-WG-TEG加0.02mg/mL Nap加0.05mmol/mL Na2S2O4、0.05mg/mL AZO-WG-TEG加0.02mg/mL Nap、0.05mg/mL AZO-WG-TEG加0.02mg/mL Nap加0.05mmol/mLNa2S2O4，在此过程中，始终保持溶液的总体积为3mL。结果如图5所示，可知0.02mg/mLAZO-WG-TEG组装体和0.05mg/mLAZO-WG-TEG组装体的荧光强度由于FRET作用使其都很小，而Nap的荧光强度在146.44左右，当Nap被0.02mg/mLAZO-WG-TEG组装体和0.05mg/mL AZO-WG-TEG组装体包覆时，使得荧光强度分别降至88.39和50.63。可以看出，AZO-WG-TEG的浓度越大，其形成的组装体对萘普生的包覆效果就越好。当还原剂加入后，图6为0.02mg/mL的AZO-WG-TEG对萘普生的包覆以及被还原后药物的释放情况图，图7为0.05mg/mL的AZO-WG-TEG对萘普生的包覆以及被还原后药物的释放情况图，从图6和图7中可以看出组装体中的偶氮键会发生断裂，组装体解除组装，并使包裹的Nap被释放出来，使荧光强度数值分别增加到121.61和108.49左右。这是由于在还原剂和萘普生的量相同的情况下，随着浓度的升高，断裂偶氮键的比率会随着浓度的增加相应减少，那么释放出来出来的药物的量也会相应较少，其还原后的荧光数值就会相对于低浓度的低。
实施例2
取14.68mmol的甘氨酸甲酯盐酸盐、13.28mmol的叔丁氧羰基保护的色氨酸和15.72mmol的1-羟基苯并三唑溶于40mL的二氯甲烷中，然后用N,N-二异丙基乙胺调节pH值为8.5，置换氮气，在-2℃、280rpm条件下混合15min；然后加入19.82mmol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，置换氮气后在-5℃条件下反应25min，然后在30℃下反应14h。反应结束后，使用硅胶板确定反应完全，其展开剂的极性为体积比1:1的PE和EA，当反应完成后，用10％KHSO4对整个反应体系进行萃取洗涤，再用DCM二次萃取一遍有机相，收集水相(上层摒弃)，将下层溶液用无水Na2SO4干燥过滤后，留样(以便观察下一步反应是否完全)。将过滤后的有机相置于圆底烧瓶，进行旋蒸，硅胶载样，经层析法提纯(PE:EA＝1.8:3.2，v:v)，得白色泡沫状产物，即为化合物A，记为Boc-WG-OMe，经过称量化合物A的质量为1.380g，收率为27.71％。
将2.47mmol的化合物A溶于50mL的甲醇中，将5.83mmol的一水合氢氧化锂溶于11mL的水中，将一水合氢氧化锂溶液逐滴滴加进化合物A的甲醇溶液中，滴加完毕后，在30℃条件下反应1.5h，反应结束后，点板留样(展开剂PE:EA＝2:3，v:v)。进行旋蒸操作，除去溶剂中的甲醇后，加入30mL的去离子水。再用12％的KHSO4调节pH为3，反应溶液用少量EA重复萃取5次，在萃取期间，使下层水相的pH一直保持在2-3之间，加入无水Na2SO4对有机相进行干燥后过滤，将所得溶液进行旋蒸，在溶液所留少许时，加入5mL的DCM再次进行旋蒸，最后经油泵抽取后得黄色泡沫状的产物，即为化合物B，记为Boc-WG-OH，经过称量化合物B的质量为0.7960g，收率为78.47％。
单体选用树枝状烷氧醚，将2.37mmol的化合物B、2.81mmol的树枝状烷氧醚和35mL的二氯甲烷混合，然后加入0.71mmol的4-二甲氨基吡啶，重复置换4次氮气后，在2℃、300rpm条件下反应25min；然后加入3.46mmol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，置换氮气后在30℃反应14h。酯化反应结束后留样点板(展开剂EA:PE＝3:1，v:v)，反应体系用12％KHSO4溶液洗涤，收集下层，表层用饱和NaCl的水溶液洗涤后，再用DCM萃取4次，将溶液汇总后用无水Na2SO4干燥后过滤并留样。将滤液进行旋蒸至溶液少许后加入硅粉再进行旋蒸，当硅胶粉呈现粉末状时，采用层析法提纯，展开剂极性为PE:EA＝2:3，在此展开剂适量时，将展开剂极性调节为PE:EA＝1:3，旋蒸后在进行油泵抽去残留溶剂得橘黄色油状物，即为化合物C，记为Boc-WG-G1，经过称量化合物C的质量为0.6002g，收率为51.6％。
将1.436mmol的化合物C和5mL的二氯甲烷混合，将3.8mL的三氟乙酸滴加进上述混合体系中，在-2℃、300rpm条件下反应1.5h；反应结束后留样点板(展开剂为纯乙酸乙酯)，在体系中加入30mL的甲醇使其与溶液中多余的三氟乙酸进行脱水反应生成酯，进行搅拌40min后，旋蒸，除去溶液中多余的甲醇，后分5次加入5mL的DCM旋蒸以除尽溶液中的甲醇得橘黄色油状物，即为化合物D，记为TFA-WG-G1，经过称量化合物D的质量为0.6002g，收率为100％。
取0.26mmol的4，4’-偶氮二苯基二乙酸，0.545mmol的化合物D、0.582mmol的1-羟基苯并三唑溶于30mL的二氯甲烷中，用N,N-二异丙基乙胺调节pH为9，置换氮气后在-5℃、350rpm条件下反应25min，然后加入0.567mol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，置换氮气，在-5℃条件下反应30min后，在20℃条件下酰胺化反应10h；反应结束后点样(展开剂的极性为DCM:MeOH＝30:1)，反应体系用10％KHSO4溶液洗涤，上层反应液用DCM再萃取一次，收集下层，即有机相，下层用饱和NaCl的水溶液进行萃取后，再用无水Na2SO4进行干燥后并进行过滤操作(留样)，将获得的有机相加入1.5g硅胶粉进行旋蒸，旋蒸结束后进行柱色谱提纯，其展开剂的极性为DCM:MeOH＝30:1，然后采用体积比为20:1的二氯甲烷和甲醇进行TLC检测，检测结束后进行旋蒸，顺次进行抽水泵和抽油泵，得到橘黄色粘稠状液体，即为二肽超分子单体，记为AZO-WG-G1，经过称量二肽超分子单体的质量为147.5mg，收率为41.76％。
将本实施例合成的二肽超分子单体置于d6-DMSO中进行核磁共振检测，得到的核磁共振氢谱如图8所示。
由于Na2S2O4在酸性或中性条件下会分解，所以整个反应体系应处于碱性环境中，并确保在还原过程中体系环境的pH值不会发生很大改变，因此选用碳酸钠的水溶液作为溶剂。配制0.05mg·mL-1的AZO-WG-G1的碳酸钠溶液，加入100μL的0.05mmoL·mL-1Na2S2O4的碳酸钠溶液，观察其紫外吸收强度随时间变化的关系。如图9所示，在刚加入Na2S2O4时，其吸收峰的位置向右偏移，并且紫外吸收强度有一个大幅度的增大，但随着时间的增加，紫外吸收强度开始逐渐降低，直至100min时紫外吸收强度趋于稳定。这是因为AZO-WG-G1中N＝N偶氮键逐渐被Na2S2O4还原使其断开，导致其紫外吸收强度逐渐降低，当其偶氮键完全被Na2S2O4还原使其断开后，其紫外吸收强度就趋于稳定。
进一步探究AZO-WG-G1超分子组装体被Na2S2O4还原时其荧光光谱随时间变化的关系。当偶氮苯基团与有机荧光基团WG-G1相连时会发生荧光共振能量转移(FRET)作用，即偶氮苯基团会发生极快的光致异构化从而导致非辐射弛豫现象，进而得到一种前荧光分子。而该分子的荧光表现为“关”的状态，导致AZO-WG-G1中的色氨酸发生荧光淬灭，从而不显现色氨酸的荧光。当AZO-WG-G1被Na2S2O4还原，AZO-WG-G1中的N＝N偶氮键被断开之后，偶氮苯基团被破坏，荧光共振能量转移作用消失，荧光恢复，从而显现出色氨酸的荧光。此时的主要发光基团为色氨酸，因此选用280nm为激发波长，在290nm-500nm波长范围内进行波谱扫描。
配制0.05mg·mL-1的AZO-WG-G1的碳酸钠溶液，加入100μL的0.05mmoL·mL-1Na2S2O4的碳酸钠溶液观察其荧光光谱的变化。由图10所示，在刚加入Na2S2O4时，荧光强度有一个大幅度的增加，但随着时间的延长，荧光强度增加幅度减小，大约在100min时，其荧光强度就趋于稳定。这是因为随着时间的增加，超分子组装体中所有的偶氮键至完全断裂，使色氨酸的荧光完全显现出来。以AZO-WG-G1被还原后的最大荧光强度随时间的变化作图得到最大荧光强度与时间的关系曲线，如图11所示，从中可以看到，AZO-WG-G1被还原后的最大荧光强度明显的增加，趋于稳定后的荧光强度是未被还原时的6.5倍，可见其荧光强度具有明显的变化。由此可见，AZO-WG-G1形成的超分子组装体有望作为荧光探针被用于医学领域。
AZO-WG-G1属于两亲性分子，在水溶液中通过多肽氢键、π-π堆积作用和疏水作用力可形成超分子组装体，组装体内部具有疏水性，可以包覆一些疏水药物分子，组装体外部树枝化的烷氧醚基元可以提高药物的溶解性以及延长药物在体内的保留时间。而当用Na2S2O4模拟肿瘤组织乏氧微环境时，偶氮苯基团被Na2S2O4还原，形成的超分子组装体就会解组装，从而释放被包覆的药物，实现对药物的靶向运输及释放。
以碳酸钠的水溶液为溶剂，配制0.05mg·mL-1的AZO-WG-G1溶液，0.02mg·mL-1的Nap溶液，AZO-WG-G1的浓度为0.05mg·mL-1加Nap的浓度为0.02mg·mL-1的混合溶液，以及AZO-WG-G1的浓度为0.05mg·mL-1加Nap的浓度为0.02mg·mL-1加Na2S2O4的浓度为0.145mg·mL-1的混合溶液探究AZO-WG-G1对萘普生的包覆作用，结果如图12所示，在超分子组装体对药物Nap包覆后，其荧光强度明显的下降，这说明部分的Nap被AZO-WG-G1所包覆，导致荧光发生淬灭。而超分子组装体在以Na2S2O4模拟肿瘤组织乏氧微环境条件下被还原后的荧光强度有明显升高，说明AZO-WG-G1被还原之后超分子组装体解组装，将被包覆的Nap释放出来，使其荧光又显现出来。
为了探究AZO-WG-G1的浓度对药物Nap包覆作用的影响，将AZO-WG-G1溶液的浓度增大一倍至0.1mg·mL-1，混合溶液中的Na2S2O4的浓度也增大一倍至0.29mg·mL-1，但Nap溶液的浓度保持不变，结果如图13所示，Nap被AZO-WG-G1包覆后以及被Na2S2O4还原后的荧光强度的变化与图12呈现一致的规律。由此可说明当其对药物进行包覆后进入肿瘤组织乏氧微环境中，也能实现对药物的释放。
对比不同浓度的AZO-WG-G1对Nap包覆的强弱，如图14所示，0.1mg·mL-1的AZO-WG-G1包覆Nap的荧光强度明显小于0.05mg·mL-1的AZO-WG-G1包覆Nap的荧光强度，并且浓度为0.1mg·mL-1的溶液比0.05mg·mL-1的溶液荧光强度升高数值更大，由此说明AZO-WG-G1高浓度形成的超分子组装体形成的组装体更大，对Nap的包覆作用更强。
将MC3T3-E1细胞培养在MEM中，接种在96孔微孔板内，静置过夜。用不同浓度的探针溶液(10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L)处理细胞，两天后向每孔平板注射MTT溶液。四小时后，弃去细胞培养基，并加入DMSO，通过酶标仪读取吸光度。并将未处理的细胞活力设置为1作为参考。结果如图15所示，在探针浓度为50μmol/L时，细胞活力仍能达到90％以上，说明AZO-WG-G1形成的超分子聚合物药物载体几乎没有细胞毒性，表现出良好的生物相容性。
由以上实施例可知，本发明提供了一种偶氮类二肽超分子单体，以色氨酸-甘氨酸合成的二肽为组装基元，引入线性烷氧醚和树枝状烷氧醚为亲水基团，偶氮苯为乏氧响应基团，制备了基于偶氮苯基元的乏氧响应二肽超分子单体。将二肽超分子单体在溶液中组装形成乏氧响应超分子聚合物药物载体，采用紫外光谱和荧光光谱研究了二肽超分子聚合物的乏氧响应行为，检测还原后的荧光、紫外的变化，从而判断二肽超分子聚合物在还原后结构所发生N＝N断键的行为。随着还原剂加入时间的延长，超分子聚合物的吸光度不断降低，荧光强度逐渐增强，因此该二肽超分子聚合物可用于乏氧响应探针。通过紫外光谱和荧光光谱探究了在模拟肿瘤组织乏氧微环境下，超分子聚合物药物载体的紫外吸收强度和荧光强度随时间的变化情况。实验发现该超分子组装体经乏氧响应后，荧光强度明显增加，该体系有望作为荧光探针被用于医学领域。通过细胞毒性实验发现，该乏氧响应超分子药物载体的细胞毒性小。另外利用荧光光谱探究了超分子聚合物药物载体对萘普生具有良好的包覆作用，在模拟肿瘤乏氧微环境下可以有效实现对药物的可控释放。因此，本发明为新型靶向乏氧环境的多肽超分子药物载体的制备提供了新的途径。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种偶氮类乏氧响应型二肽超分子单体，其特征在于，具有如下所示结构：
所述n为0或1；
所述OEGs为
所述X为H、CH3或CH2CH3。
2.权利要求1所述偶氮类乏氧响应型二肽超分子单体的制备方法，其特征在于，包含下列步骤：
(1)在碱性条件下，将甘氨酸甲酯盐酸盐、叔丁氧羰基保护的色氨酸、1-羟基苯并三唑和二氯甲烷混合后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐进行反应，得到化合物A；
(2)将化合物A的甲醇溶液和一水合氢氧化锂溶液混合后进行水解反应，得到化合物B；
(3)将化合物B、单体、二氯甲烷和4-二甲氨基吡啶混合后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐进行酯化反应，得到化合物C；
(4)将化合物C的二氯甲烷溶液和三氟乙酸混合后进行反应，得到化合物D；
(5)在碱性条件下，将化合物D、偶氮类单体、1-羟基苯并三唑和二氯甲烷混合后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐进行酰胺化反应，即得所述二肽超分子单体；
步骤(1)中所述甘氨酸甲酯盐酸盐和叔丁氧羰基保护的色氨酸的摩尔比为14～15：13～14；
所述甘氨酸甲酯盐酸盐和1-羟基苯并三唑的摩尔比为14～15：15～16；
所述甘氨酸甲酯盐酸盐和二氯甲烷的摩尔体积比为14～15mmol：40～60mL；
所述甘氨酸甲酯盐酸盐和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为14～15：19～20；
步骤(1)中所述碱性条件的pH值为8～9；调节碱性条件所用试剂为N,N-二异丙基乙胺；
步骤(1)中所述混合的温度为-5～5℃，搅拌速度为250～350rpm，时间为15～20min；
步骤(1)中所述反应的温度为20～30℃，时间为12～14h；
步骤(2)中所述化合物A的甲醇溶液中化合物A和甲醇的摩尔体积比为2～3mmol：30～50mL；
所述一水合氢氧化锂溶液中一水合氢氧化锂和水的摩尔体积比为5.5～6mmol：8～12mL；
所述化合物A和一水合氢氧化锂的摩尔比为2～3：5.5～6；
步骤(2)中所述水解反应的温度为20～30℃，时间为1.5～2h；
步骤(3)中所述单体为线性烷氧醚或树枝状烷氧醚；
所述化合物B和单体的摩尔比为2～2.5：2.5～3；
所述化合物B和二氯甲烷的摩尔体积比为2～2.5mmol：25～35mL；
所述化合物B和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为2～2.5：0.6～0.8；
所述化合物B和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为2～2.5：2.5～3.5；
步骤(3)中所述混合的温度为-5～5℃，搅拌速度为250～350rpm，时间为25～35min；
步骤(3)中所述酯化反应的温度为20～30℃，时间为10～14h；
步骤(4)中所述化合物C的二氯甲烷溶液中化合物C和二氯甲烷的摩尔体积比为1.2～1.8mmol：3～5mL；
化合物C和三氟乙酸的摩尔体积比为1.2～1.8mmol：3～4mL；
步骤(4)中所述反应的温度为-5～5℃，搅拌速度为250～350rpm，时间为1.5～2h；
步骤(5)中所述碱性条件的pH值为8～9，调节碱性条件所用试剂为N,N-二异丙基乙胺；
所述偶氮类单体为4，4，-二羧基偶氮苯或4，4，-偶氮二苯基二乙酸；
所述混合的温度为-5～5℃，搅拌速度为250～350rpm，时间为15～25min；
所述酰胺化反应的温度为20～30℃，时间为10～12h；
当步骤(3)中单体为线性烷氧醚时，步骤(5)中所述偶氮类单体和化合物D的摩尔比为0.5～0.6：1～1.2；
所述偶氮类单体和1-羟基苯并三唑的摩尔比为0.5～0.6：1.25～1.35；
所述偶氮类单体和二氯甲烷的摩尔体积比为0.5～0.6mmol：20～40mL；
所述偶氮类单体和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为0.5～0.6：1.5～2.0；
当步骤(3)中单体为树枝状烷氧醚时，步骤(5)中所述偶氮类单体和化合物D的摩尔比为0.2～0.3：0.5～0.6；
所述偶氮类单体和1-羟基苯并三唑的摩尔比为0.2～0.3：0.5～0.6；
所述偶氮类单体和二氯甲烷的摩尔体积比为0.2～0.3mmol：20～40mL；
所述偶氮类单体和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为0.2～0.3：0.65～0.75。
3.权利要求1所述偶氮类乏氧响应型二肽超分子单体在制备荧光探针材料和药物控释材料中的应用。
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