CN112535660B - 一种三级靶向的pH敏感型纳米载药胶束及其制备方法和用途 - Google Patents

一种三级靶向的pH敏感型纳米载药胶束及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN112535660B
CN112535660B CN202011463620.0A CN202011463620A CN112535660B CN 112535660 B CN112535660 B CN 112535660B CN 202011463620 A CN202011463620 A CN 202011463620A CN 112535660 B CN112535660 B CN 112535660B
Authority
CN
China
Prior art keywords
drug
nano
micelle
cprp
por
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011463620.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112535660A (zh
Inventor
陈万涛
李凡
王旭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Original Assignee
Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine filed Critical Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority to CN202011463620.0A priority Critical patent/CN112535660B/zh
Publication of CN112535660A publication Critical patent/CN112535660A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112535660B publication Critical patent/CN112535660B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6907—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a microemulsion, nanoemulsion or micelle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及纳米科技领域，特别是涉及一种三级靶向的pH敏感型纳米载药胶束及其制备方法和用途，本发明的纳米载药胶束经所述纳米胶束和药物自组装形成，所述纳米胶束包括疏水内核和亲水外壳，所述疏水内核包括光敏剂，所述亲水外壳包括能靶向整合素受体的配体、穿膜肽和聚乙二醇，所述穿膜肽一端连接光敏剂，另一端连接聚乙二醇，所述聚乙二醇还修饰能靶向整合素受体的配体。本发明的三级靶向的pH敏感型纳米载药胶束以精确地将药物从注射部位输送到细胞核，并且联合光动力治疗进一步杀伤癌细胞。本发明的纳米载药胶束在开发用于增强抗癌治疗的多功能纳米体系方面具有广阔的应用前景。

Description

一种三级靶向的pH敏感型纳米载药胶束及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及纳米科技领域，特别是涉及一种三级靶向的pH敏感型纳米载药胶束及其制备方法和用途。
背景技术
纳米载药系统作为一种新型的药物传递系统，近年来因其独特的性质而受到越来越多的关注，越来越多的纳米载药系统成功地转化为临床应用产品，在癌症治疗方面有着巨大的潜力。
纳米载药系统对难溶性化疗药物具有良好的增溶作用，可用于靶向给药和基于特殊肿瘤微环境的药物控释。首先，对于癌症的特异性治疗，设计和合成具有癌症靶向的纳米载体可以提高癌症组织周围的化疗药物富集浓度，从而提高癌症的治疗效果，同时也可以减少正常组织的非特异性吸收，以减轻其副作用。已有研究表明，纳米载药系统可通过增强通透和滞留(EPR)效应被动靶向肿瘤部位，从而实现高效的抗癌药物传递。在此基础之上，纳米载药系统还可以通过配体或抗体的表面修饰来提高纳米载药系统的主动靶向能力。其次，与正常组织相比，肿瘤组织具有一系列特殊的理化性质，包括弱酸环境、温度异常、蛋白酶过度表达、缺氧等。此外，肿瘤细胞具有特定的微环境，如溶酶体和内涵体的酸性pH值、细胞质中高浓度的还原性半胱氨酸或谷胱甘肽(GSH)和线粒体中高水平的氧化H2O2。因此，学者们根据以上肿瘤细胞特有的微环境，设计和研究了多种刺激敏感的纳米载体，以实现抗癌药物在肿瘤细胞中的快速、可控释放。然而，这些研究大多集中在以细胞质为靶向的纳米载体上，对细胞核靶向纳米载体的研究却很少。事实上，细胞核是细胞的“心脏”，是储存、复制和转录遗传物质的中心。此外，细胞核在细胞代谢、生长和分化中起着重要作用。而且，细胞核是典型的抗癌药物如阿霉素和9-硝基喜树碱有效发挥作用的部位。因此，开发核靶向纳米载体有望大大提高现有药物的抗癌效率，具有重要意义。
光动力疗法(PDT)是一种在时间和空间上都可以控制的新型癌症治疗模式，在各种类型的微创肿瘤治疗中出现并取得了良好的效果。目前少有发现其与纳米载药胶束的联用，即使联用其靶向性也较差。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种三级靶向的pH敏感型纳米载药胶束及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种纳米胶束，所述纳米胶束包括疏水内核和亲水外壳，所述疏水内核包括光敏剂，所述亲水外壳包括能靶向整合素受体的配体、穿膜肽和聚乙二醇，所述穿膜肽一端连接光敏剂，另一端连接聚乙二醇，所述聚乙二醇还修饰能靶向整合素受体的配体。
本发明还提供所述纳米胶束的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
1)将聚乙二醇与整合素受体的配体连接；
2)将穿膜肽通过酰胺化反应与光敏剂连接；
3)将步骤1)的产物通过腙键与步骤2)的产物连接。
本发明还提供所述纳米胶束在制备癌症治疗产品中的用途。
本发明还提供一种纳米载药胶束，其特征在于，所述纳米载药胶束经所述的纳米胶束和药物自组装形成。
一种纳米载药胶束的制备方法，将所述的纳米胶束与药物按照2：1～6：1的重量比混合反应，反应结束后即得纳米载药胶束。
如上所述，本发明的三级靶向的pH敏感型纳米载药胶束及其制备方法和用途，具有以下有益效果：本发明的纳米载药胶束性质稳定、安全性高、具有主动靶向传递功能、可负载疏水性小分子药物，可实现三级靶向，可解决现有技术中纳米药物载体的靶向性不强、生物利用度低、稳定性差、控释效果差等问题。三级靶向的pH敏感型纳米载药胶束，容易跨越人体内复杂的生理屏障，可以避免免疫系统的清除而顺利到达病灶，以精确地将药物从注射部位输送到细胞核，并且联合光动力治疗进一步杀伤癌细胞。本发明的纳米载药胶束在开发用于增强抗癌治疗的多功能纳米体系方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明纳米载药胶束的示意图。
图2显示为本发明的纳米胶束或纳米载药胶束的表征。A-F为cPRP化学反应合成各步骤的表征；G-J为空白胶束cPRP、载药胶束GNA002@cPRP以及二级纳米胶束GNA002@RP的粒径、电位和透射电镜表征；K为GNA002@cPRP的稳定性以及pH响应性的结果；L为GNA002@cPRP体外释放的结果。
图3显示为本发明的纳米胶束或纳米载药胶束的体外验证实验，其中A和B为cPRP纳米胶束的体外细胞摄取结果；C为cPRP纳米胶束的体外溶酶体逃逸结果；D为cPRP纳米胶束的体外细胞核分布情况；E为cPRP纳米胶束的体外穿透实验结果。
图4显示为本发明的空白纳米胶束或纳米载药胶束的体外抗癌功效结果。A为空白胶束和激光对正常细胞和肿瘤细胞的细胞毒性结果；B-F为GNA002@cPRP载药胶束对肿瘤细胞的细胞毒性结果；G为GNA002@cPRP载药胶束对诱导肿瘤细胞凋亡的结果。
图5显示为本发明的纳米载药胶束的体内分布结果。A-B为尾静脉注射DiD和DiD@cPRP后不同时间点的体内成像结果及肿瘤部位实时荧光定量结果；C-D为给药24小时后解剖出的肿瘤及主要器官的成像结果及荧光定量结果。
图6显示为本发明的纳米载药胶束的体内抗癌功效结果。A-D为HeLa荷瘤小鼠体内实验结果；E-H为HN6荷瘤小鼠体内实验结果；I为HeLa荷瘤小鼠肿瘤部位的H&E、Ki-67和TUNEL染色结果。
图7显示为本发明的纳米载药胶束的体内安全评价。
图8显示为本发明的纳米胶束的制备反应式。
具体实施方式
本发明首先提供一种纳米胶束，所述纳米胶束包括疏水内核和亲水外壳，所述疏水内核包括光敏剂，所述亲水外壳包括能靶向整合素受体的配体、穿膜肽和聚乙二醇，所述穿膜肽一端连接光敏剂，另一端连接聚乙二醇，所述聚乙二醇还修饰能靶向整合素受体的配体。
所述光敏剂包括卟啉(Por)或卟啉衍生物。在一种实施方式中，所述卟啉衍生物选自5-(4-羧苯基)-10,15,2-三苯基卟啉。光敏剂具有光动力作用，给予光敏剂后其半衰期在癌症和正常组织中是不同的。经过一段时间后，光敏剂在肿瘤中的浓度明显高于正常组织，形成了光敏剂在肿瘤中的选择性滞留。在特定波长的激发下，光敏剂激活产生细胞毒性活性氧(ROS)，特别是单线态氧，导致癌细胞坏死和凋亡。
在一种实施方式中，所述整合素受体为整合素ανβ3受体。
在一种实施方式中，所述能靶向整合素ανβ3受体的配体选自cRGD多肽或其变体。cRGD是一种三氨基酸肽，即含精-甘-天冬序列的多肽。cRGD变体例如为cRGDyC、cRGDfC。cRGD多肽或其变体可以有效地靶向癌细胞表面高表达的ανβ3受体。
所述穿膜肽相当于桥梁，其一端连接光敏剂，另一端连接聚乙二醇。在一种实施方式中，所述穿膜肽选自多聚精氨酸及其衍生物。所述多聚精氨酸包括R6、R7、R8、R9。较佳的，所述穿膜肽选自六聚精氨酸(R6)多肽。穿膜肽可穿过细胞膜。所述穿膜肽通过腙键连接聚乙二醇。腙键为pH敏感性化学键，pH≤5时发生断裂。
在一种实施方式中，所述聚乙二醇(PEG)的分子量为2000Da-3000 Da。PEG可以延长药物的体循环时间。
所述纳米胶束的zeta电位为-50～0mV。
所述纳米胶束的粒径为100～200nm。
在一种实施方式中，所述纳米胶束为cRGD-PEG-N＝CH-R6-Por，简写为cPRP，化学式如下：
Figure BDA0002829986990000041
本发明还提供所述纳米胶束的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
1)将聚乙二醇与整合素受体的配体连接；
2)将穿膜肽通过酰胺化反应与光敏剂连接；
3)将步骤1)的产物通过腙键与步骤2)的产物连接。
步骤1)和步骤2)无先后顺序限制。
在一种实施方式中，步骤1)中聚乙二醇的分子量为2000～3000Da Da。
在一种实施方式中，所述聚乙二醇包括经修饰的聚乙二醇和未经修饰的聚乙二醇。所述经修饰的聚乙二醇包括Mal-PEG-Hz。
所述整合素受体选自ανβ3受体。所述ανβ3受体的配体包括cRGD多肽及其变体。cRGD变体例如为cRGDyC、cRGDfC。
在一较佳实施方式中，所述聚乙二醇与整合素受体按摩尔比1：1～1：1.5的比例混合。
在一种实施方式中，反应时间为6～10小时。
在一种实施方式中，该反应在保护气下进行。所述保护气例如为氮气。
在一种实施方式中，该反应在催化剂下进行。所述催化剂选自三乙胺。
在一种实施方式中，步骤1)为Mal-PEG-Hz(马来酰亚胺-聚乙二醇-酰肼)与cRGD反应，制备获得cRGD-PEG-Hz，反应方程式如下：
Figure BDA0002829986990000042
在一种实施方式中，步骤2)中所述穿膜肽与光敏剂的连接还包括以下步骤：
a)将穿膜肽碳端巯基与带马来酰亚胺的氨基保护基团的化合物反应；
b)将步骤a)的产物与光敏剂混合，制备获得碳端末位氨基酸侧链被保护基团保护的穿膜肽-光敏剂；
c)脱去保护基团的保护；
d)将步骤c)的产物发生酰胺化反应，获得末端带醛基的穿膜肽-光敏剂。
所述穿膜肽选自多聚精氨酸及其衍生物。所述多聚精氨酸包括R6、R7、R8、R9。多聚精氨酸衍生物选自KR6C。
在一种实施方式中，步骤a)中所述氨基保护基团选自：酰化保护(即酸酐保护)、苄基保护或Boc保护。
所述光敏剂选自卟啉或卟啉衍生物。所述卟啉衍生物包括5-(4-羧苯基)-10,15,2-三苯基卟啉。
在一种实施方式中，步骤b)在多肽缩合试剂和/或催化剂条件下进行。所述多肽缩合试剂选自1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑丙[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)。所述催化剂选自N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。
在一种实施方式中，步骤a)和步骤b)的反应时间为0.5～2小时。
在一种实施方式中，该反应在保护气下进行。所述保护气例如为氮气。
在一种实施方式中，步骤a)和步骤b)均在有机溶剂中进行。一般的，所述有机溶剂选自DMF、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、二氧六环和N-甲基吡咯烷酮的一种或多种的任意混合。
在一种实施方式中，步骤a)为：将多肽KR6C和Mal-Boc混合发生迈克尔加成反应，获得KR6-Boc；步骤b)为：将KR6-Boc与Por在HATU、DIPEA的条件下反应，获得Por-R6-Boc，反应方程式如下：
Figure BDA0002829986990000061
在一种实施方式中，步骤c)为利用多肽切割液Por-R6-Boc，脱Boc保护，获得Por-R6-NH2，反应方程式如下：
Figure BDA0002829986990000062
在一种实施方式中，所述肽链切割液包括三氟乙酸、三异丙基硅烷以及水。
在一种实施方式中，步骤d)在多肽缩合试剂和/或催化剂条件下进行。所述多肽缩合试剂选自1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑丙[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)。所述催化剂选自N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。
在一种实施方式中，步骤d)的反应在保护气条件下进行。所述保护气例如为氮气。
在一种实施方式中，将步骤c)的产物Por-R6-NH2与5-甲酰基-2,4-二甲基-3-吡咯甲酸发生酰胺化反应，获得Por-R6-CHO，反应方程式如下：
Figure BDA0002829986990000071
在一种实施方式中，步骤3)中，步骤1)的产物与步骤2)的产物摩尔比例为1:1～1:3。
在一种实施方式中，步骤3)在催化剂下反应。所述催化剂选自冰醋酸。
在一种实施方式中，步骤3)的反应温度为24～30℃。
在一种实施方式中，步骤3)将步骤1)的cRGD-PEG-Hz和步骤2)的Por-R6-CHO混合，获得所述纳米胶束cRGD-PEG-N＝CH-R6-Por，反应方程式为：
Figure BDA0002829986990000072
本发明的制备方法稳定性良好、便于推广应用。
本发明还提供所述纳米胶束在制备癌症治疗产品中的用途。
在一种实施方式中，所述癌症治疗产品为纳米载药胶束。即所述纳米胶束在作为抗癌药物的载体中的用途。所述癌症治疗产品为能够抑制癌细胞的增殖、生长、分化和/或存活的药物。所述癌症治疗产品根据其组装的抗癌药物的种类不同，抑制不同癌细胞的增殖、生长、分化和/或存活。
本发明还提供一种纳米载药胶束，所述纳米载药胶束经所述纳米胶束和药物自组装形成。
所述纳米载药胶束包括所述纳米胶束、药物、水。
所述纳米载药胶束中药物组装于疏水内核中。
在一种实施方式中，所述纳米载药胶束的粒径为100-200nm。
所述药物选自疏水性药物。所述疏水性药物可以是化疗药物。例如阿霉素、GNA002、紫杉醇、顺铂、氟尿嘧啶、甲氨喋呤和喜树碱。
所述纳米载药胶束的药物载量为13％以上。
所述纳米载药胶束的zeta电位为-50～0mV。
所述纳米载药胶束的剂型为冻干粉针剂或水溶液针剂。
本发明的纳米载药胶束具有pH敏感性和核靶向性，结合光动力疗法，可用于协同治疗癌症。如图1所示，具体的，在这个纳米载药胶束中，使用光敏剂Por作为PDT生成剂，并固定抗癌药GNA002来作为疏水内核；以生物相容性高的cRGD-PEG作为主要的亲水外壳，可延长其全身循环。静脉注射后，首先通过纳米胶束的被动靶向作用靶向于肿瘤组织为第一级靶向，再通过cRGD主动靶向于肿瘤细胞膜表面的整合素受体为第二级靶向，胞吞进入肿瘤细胞后，被溶酶体吞噬，PEG与穿膜肽R6之间酸敏感的腙键发生断裂，形成以Por作为载药疏水内核、穿膜肽R6作为亲水外壳的二级纳米粒子，由于腙键断裂暴露出带正电荷的胺基以及R6表面多个带正电荷的胍基引发的质子海绵效应使溶酶体发生涨破，实现二级纳米粒子的溶酶体逃逸，通过穿膜肽R6继续靶向于细胞核为第三级靶向，在细胞核周围释放可在核内发生细胞毒性作用的GNA002后，实现GNA002核靶向的传递和化疗作用。同时，532nm激光照射诱导Por产生ROS，有效的用于癌症的协同治疗。鉴于其级联的pH敏感与核靶向功能，载有GNA002的cPRP纳米系统从注射部位输送到细胞核，并且联合光动力治疗对上皮组织来源的癌症(如HeLa，HN6，A375，HN30和MCF-7细胞)均表现出有效的细胞毒性。
本发明还提供一种纳米载药胶束的制备方法，将所述纳米胶束与药物按照2：1～6：1的质量比在有机溶剂中溶解后，逐滴滴入水中反应，反应结束后即得纳米载药胶束。
一般的，所述有机溶剂选自DMF、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、二氧六环和N-甲基吡咯烷酮的一种或多种的任意混合。
在一种实施方式中，反应时间为10～14小时。优选为11～13小时。
在一种实施方式中，反应在避光下进行。
较佳的，所述制备方法还包括：反应结束后将反应物在水中透析和/或过滤。在一种实施方式中，透析时间为10～14小时。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1.cPRP的构建与表征
本实施例的目的是制备一种pH敏感的核靶向纳米颗粒协同化学光动力疗法，以提高抗癌疗效。两亲性cRGD-PEG-N＝CH-R6-Por(cPRP)作为药物载体，cPRP合成反应如图8所示，合成步骤如下所述：
1.cRGD-PEG-Hz的合成：
将Mal-PEG-Hz与cRGD按1：1.25的比例溶于去离子水中，氮气保护下反应8小时，反应结束后用1000DA的透析袋透析1天，冻干得到cRGD-PEG-Hz。
2.Por-R6-Boc的合成：
将多肽KR6C和Mal-Boc按1：2的比例溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，在氮气保护下室温搅拌8小时反应得到KR6-Boc。同时将KR6C2倍量的5-(4-羧苯基)-10,15,2-三苯基卟啉(Por)和1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑丙[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)，以及KR6C4倍量的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)溶于无水DMF溶液中氮气保护下反应0.5小时，将反应完全的KR6-Boc溶液逐滴加入到上述反应液中，继续反应0.5小时，反应结束后用1000DA的透析袋在DMF溶液中透析一天，然后再于去离子水中继续透析一天，冻干得到Por-R6-Boc。
3.Por-R6-NH2的合成：
将提前配好的冰的切割液(90％三氟乙酸(TFA)，5％(三异丙基硅烷)Tis，5％H2O)溶解Por-R6-Boc，磁力搅拌器下反应2小时，冰乙醚沉降离心，收集沉淀，即为Por-R6-NH2。
4.Por-R6-CHO的合成：
将5-甲酰基-2,4-二甲基-3-吡咯甲酸，HATU，DIPEA按1：2：4的比例溶解于无水DMF中，在氮气保护下室温反应0.5小时，将提前溶解的Por-R6-NH2的无水DMF溶液逐滴加入上述反应液中，继续反应0.5小时，反应结束后用1000DA的透析袋在DMF溶液中透析一天，然后再于去离子水中继续透析一天，冻干得到Por-R6-CHO。
5.cRGD-PEG-N＝CH-R6-Por(cPRP)的合成：
将Por-R6-CHO和cRGD-PEG-Hz按1比1.5的比例溶解于无水甲醇中，加微量冰醋酸催化，28℃氮气保护下反应24小时，反应结束后用3000DA的透析袋在去离子水中透析两天，冻干得到cRGD-PEG-N＝CH-R6-Por。
利用UV-vis、ESI-MS、GPC和1H NMR结果验证了不同中间体的成功合成，证实了cPRP化学结构的正确性。首先，cRGD-PEG-Hz的紫外-可见光谱显示了cRGD在275nm处的特征吸收带，证明了cRGD肽的成功接枝(图2D)。然后飞行时间质谱结果证明一下各部分中间体合成成功，Por-R6-Boc(m/z[m+5H]5+：542.26868；[m+4H]4+：677.58392；[m+3H]3+：903.10840；)、Por-R6-NH2(m/z[m+5H]5+：522.258118；[m+4H]4+：652.57135；[m+3H]3+：869.75958；)和Por-R6-CHO(m/z[m+5H]5+：552.26801；[m+4H]4+：689.83350；[m+3H]3+：919.44159)验证了其分子量的正确性(图2A-C)。最后，GPC结果显示(图2E)，图中cPRP光谱中只有一个峰存在，表明没有多余的Por-R6-CHO残留，两个化合物的流出时间都证实了cPRP的成功合成。此外，cPRP在1H NMR结果中的特征峰被清楚地标记出来(图2F)，与GPC结果一致。
实施例2.cPRP和GNA002@cPRP纳米颗粒的理化性质以及稳定性和pH响应性
cPRP与GNA002通过疏水基团间相互作用将GNA002负载到纳米颗粒中，自组装成载药纳米颗粒，cPRP自组装成空白纳米颗粒，具体步骤为：将2mg GNA002和8mg cPRP溶于1mlDMF中，逐滴加入10ml磁力搅拌器搅拌的去离子水中，避光搅拌12小时，搅拌结束后再于去离子水中透析12小时，用0.2μm的滤头过滤透析袋内溶液即得GNA002@cPRP。8mg cPRP溶于1ml DMF中，逐滴加入10ml磁力搅拌器搅拌的去离子水中，搅拌12小时，结束后再于去离子水中透析12小时，用0.2μm的滤头过滤透析袋内溶液即得cPRP空白纳米颗粒。GNA002@cPRP的包封效率为71.49±1.21％，载量为14.29±0.24％；
GNA002@cPRP载药量和包封率的计算：
用高效液相色谱法测定包裹在cPRP纳米颗粒中的GNA002的数量，并与获得的游离GNA002的标准浓度曲线进行比较。将HPLC C18柱保持在30℃；流动相包括以1.0mL/min的速度流动的甲醇和水的混合物(90:10，v/v)；将10μL GNA002/甲醇溶液注入柱中。HPLC检测波长为360nm。载药量(DLC)和包封率(EE)采用以下公式计算：
载药量＝(负载GNA002的质量)/(投药量和空白纳米粒子的总质量)×100％
包封率＝(负载GNA002的质量)/(投药量)×100％。
此外，通过透射电镜观察纳米颗粒cPRP和GNA002@cPRP为均匀球形形貌，DLS检测到其zeta电位和平均粒径分别为-6.51±0.58和-6.23±0.11mV和126.30±0.62和156.67±0.47nm，PDI均较低(<0.3)(图2G-I)，显示了其粒径的均一性。
为了评价载药cPRP纳米粒的稳定性和pH响应性，用DLS法测定了其在不同介质中不同时间点的粒径变化。结果显示，在pH值为7.4的PBS缓冲液和含有血清和的培养基中的GNA002@cPRP粒径仅仅发生了微小尺寸变化，而在pH值为5.0的PBS缓冲液中，GNA002@cPRP粒径在前12小时内逐渐增大，在24小时时急剧减小(图2K)。表明GNA002@cPRP纳米颗粒在细胞培养和血液循环过程中表现出良好的稳定性，而当被溶酶体吞噬时，PEG与R6之间pH响应的腙键断裂，外层cRGD-PEG脱落，导致了R6介导的二级纳米颗粒的形成(GNA002@RP)，从而导致粒径急剧下降。GNA002@RP的zeta电位、平均粒径和PDI分别为11.83±0.23mV，102.17±0.67nm和0.27±0.01，TEM显示其形态为均匀球形，与DLS结果一致(图2G和2J)。此外，正电荷表面的GNA002@RP可促进纳米粒子实现从溶酶体中逃逸。
实施例3.GNA002@cPRP纳米粒子的体外药物释放
进一步研究GNA002@cPRP纳米粒子的体外释放情况，在pH值为7.4和5.0的PBS缓冲液中，在漏槽条件下测量GNA002的释放曲线(图2L)。结果显示在pH值为7.4时，只有大约10％的GNA002从GNA002@cPRP纳米颗粒中释放出来，表明GNA002@cPRP正常组织环境中的稳定性。然而，在pH5.0(模拟肿瘤细胞内酸性环境)时，近70％的GNA002在48小时时从GNA002@cPRP纳米颗粒中释放出来，表明GNA002@cPRP纳米粒子具有良好的pH响应性，从而实现从正常生理条件到肿瘤微环境的可控释放。此外，pH值为5.0时，释放曲线在前2h呈早期缓慢释放，随后在2h至12h出现快速释放，具体而言，2h释放的GNA002少于20％，10h后累积释放量高达60％。由此表明，前2h的低释放速率有助于减少GNA002到达肿瘤细胞核前的损失，保证纳米颗粒在血液循环过程中的稳定性，而在接下来的10h，出现的快速释放阶段，提高GNA002到达肿瘤细胞核后的利用率。
实施例4.cPRP纳米粒子的体外细胞摄取
为评价cPRP纳米粒的细胞摄取效率，分别以HeLa癌细胞作为模型细胞和DiD(荧光染料)作为模型药物，采用CLSM和流式细胞仪进行监测。在图3A中，HeLa细胞与DiD@cPRP纳米粒孵育1h和3h的结果显示，在HeLa细胞的胞浆中呈现明显的由弱到强的红色荧光聚集，而在同一时间段内，经过游离cRGD预处2h的HeLa细胞和DiD@cPRP纳米粒孵育的结果显示，红色荧光量在胞浆几乎没有增加，表明阻断整合素αvβ3受体抑制了细胞对DiD@cPRP纳米颗粒的摄取。
此外，用流式细胞仪定量研究了HeLa细胞对DiD@cPRP纳米颗粒的细胞摄取。结果如图3B所示在DiD@cPRP组以及DiD@cPRP加cRGD预处理组中，DiD的平均荧光强度(MFI)从1h到3h均呈上升趋势，说明纳米颗粒的吞噬作用具有时间依赖性，随着时间的推移可摄取量增加。此外，DiD@cPRP组的MFI在1h和3h时分别为12043和19768，均显著低于加cRGD预处理组，表明αvβ3受体介导的内吞作用有效地促进了细胞对cPRP纳米颗粒的摄取，与CLSM结果吻合较好。综上所述，cRGD介导的主动靶向作用是影响其摄取的关键因素，并能促进其进一步向癌细胞内部的扩散。
实施例5.cPRP纳米粒子的体外溶酶体逃逸
DiD@cPRP纳米粒通过内吞作用被细胞摄取后，我们用Lysotracker绿标记的HeLa细胞的溶酶体和以有红色荧光的DiD作为模型药物，在2小时和4小时时由CLSM进行检测。如图3C所示，在与游离DiD孵育2小时和4小时后，在HeLa细胞胞浆区可见由红、绿荧光共定位形成的黄色荧光，表明溶酶体吞噬了大部分的DiD。对于DiD@cPRP纳米颗粒组，在与DiD@cPRP孵育2小时后，在HeLa细胞胞浆区可见大量黄色荧光，表明溶酶体与DiD共定位。而在4小时时，只剩下少量的黄色荧光，大部分红色和绿色荧光独立存在，证实溶酶体的酸性环境触发了cPRP的腙键断裂，形成二级纳米粒子，其表面的胍基上有大量的正电荷，正电荷引发“质子海绵”效应促进纳米粒子实现溶酶体逃逸。
实施例6.cPRP纳米粒子的体外细胞核分布
为了研究cPRP纳米颗粒中的R6穿膜肽介导的细胞核靶向能力，我们用Hoechst33342标记HeLa细胞的细胞核和用带红色荧光的DiD作为模型药物，并用CLSM监测(图3D)。在培养4小时和8小时后，DiD@mPEG-CH＝N-PCL(mP)组在HeLa细胞的细胞核区域出现了少量的紫色荧光，这些紫色荧光是由红色和蓝色荧光共定位形成，证明仅有少量的DiD@mP纳米颗粒在与细胞共孵育8小时后进入到细胞核内。相反，在DiD@cPRP组，HeLa细胞的细胞核中观察了大量的紫色荧光，尤其是在8小时时，DiD@cPRP组的MFI比DiD@mP组高出近两倍，从而证明R6介导的cPRP纳米粒子可以有效促进药物进入细胞核，改善药物传递效率。
实施例7.肿瘤球体外穿透实验
以HeLa-肿瘤球作为三维肿瘤模型来评价cPRP的载药穿透能力(图3E)。在共孵育4小时后，我们发现DiD@cPRP组在20μm到60μm的层面中，中心视野的红色荧光强度均明显高于对照组DiD，证明cPRP纳米颗粒提高了药物的穿透能力。
实施例8.体外抗癌功效
通过CCK-8分别对空白cPRP纳米颗粒和激光的细胞毒性进行了检测。如图4A所示，利用0.781至100μg/mL的空白纳米颗粒处理或532nm激光照射处理后，六种细胞的细胞活力均保持在90％以上，证明空白cPRP或激光照射对正常或癌症细胞几乎没有细胞毒性。此外，使用相同的癌细胞系评估载有GNA002的cPRP纳米颗粒的体外抗癌效果，并将顺铂用作针对GNA002的阳性对照。图4B-F表明，经10分钟激光照射的GNA002@cPRP纳米颗粒组与GNA002独立组，未经激光照射的GNA002@cPRP纳米颗粒组和顺铂组相比，表现出最强的抗癌效力。并且在所有癌细胞实验中，激光照射的GNA002@cPRP组的半数最大抑制浓度(IC50)均显著低于其他各组，表明与单一疗法相比，化疗协同光动力治疗具有最令人满意的抑制作用。
应用ANNEXIN V-FITC/PI法对使用GNA002，GNA002@cPRP纳米颗粒伴有或不伴有激光照射组以及顺铂组处理的癌细胞的凋亡行为进行检测。结果如图4G所示，从HeLa到MCF-7的所有癌细胞中，激光照射组的GNA002@cPRP纳米粒子诱导的癌细胞凋亡率分别是51.22％、59.2％、37.61％、53.4％和41.04％，均高于其他三组，结果与CCK-8测定的抗癌疗效一致，表明协同GNA002化学和光动力疗法诱导癌细胞凋亡效果最佳。
实施例9.体内生物分布
HeLa荷瘤小鼠模型用于检测载有药物的cPRP纳米粒子在体内的分布。如图5A所示，整体而言，DiD@cPRP纳米颗粒组的红色荧光强度要显著强于DiD组，并且DiD@cPRP的红色荧光强度在8小时达到峰值，而后逐渐降低。相比之下，在任何时间节点，DiD组的肿瘤部位均未观察到红色荧光积累，对两组肿瘤部位处红色荧光强度的实时定量分析也再次证实了以上结果(图5B)。此外，在注射后24h也对离体的肿瘤组织和主要器官进行了荧光成像和定量分析(图5C-D)。DiD@cPRP组在肿瘤部位的平均荧光强度比独立使用DiD组高6.76倍。综上，这些结果证明了cPRP纳米颗粒具有突出的靶向肿瘤的聚集特性和持久的作用效应。
实施例10.体内抗癌功效
HeLa和HN6荷瘤小鼠模型用于评估GNA002@cPRP纳米颗粒的抗癌功效。如图6A和6E所示，在两种荷瘤小鼠模型中，用生理盐水和生理盐水结合激光进行治疗后，肿瘤在14天内呈现出快速的体积增长，这表明单用生理盐水和生理盐水结合激光对肿瘤治疗无效。此外，接受单独GNA002治疗组显示出较弱的肿瘤抑制功效，HeLa和HN6荷瘤小鼠模型的肿瘤抑制率(TIR)分别为44％和35％(图6C和6G)。相比之下，尽管接受顺铂治疗组显示出更好的抗癌功效，但在二次给药后的第10天(HeLa)和第12天(HN6)小鼠体重急剧下降，与使用激光的GNA002@cPRP纳米颗粒组相比，体重显著降低(图6B和6F)。HeLa和HN6荷瘤小鼠模型分别证明了顺铂治疗伴有较强的副作用和全身毒性作用。对于其他两组，即经过或不经过激光照射的GNA002@cPRP纳米颗粒组，均观察到令人满意的抑制肿瘤的效果，特别是经过激光照射的GNA002@cPRP组效果更加显著。HeLa和HN6荷瘤小鼠模型中，经过激光照射的GNA002@cPRP组体重几乎未见明显下降，肿瘤抑制率(TIR)分别达到了显著的94％和85％，表明其具有最佳的肿瘤抑制功效和良好的生物安全性。而且在第14天处死小鼠后，测量所有组的肿瘤重量。值得注意的是，经激光照射的GNA002@cPRP纳米颗粒处理的HeLa和HN6荷瘤模型小鼠，其肿瘤重量仅为生理盐水组的6.3％和6.7％，与其他五组模型相比差异显著，与肿瘤体积结果一致(图6D和6H)。综合以上结果发现，协同化学和光动力疗法显着提高了抗肿瘤效果。
应用组织学和免疫组化法，如H&E，Ki-67和TUNEL染色，进一步评估GNA002@cPRP纳米粒子的体内抗肿瘤效果。如图6I所示，H&E结果表明协同化学和POR诱导的光动力疗法可引起的癌细胞的大量坏死和凋亡。除此之外，在所有组中，经激光照射的GNA002@cPRP组的切片显示出最高的癌细胞TUNEL阳性率和最低的Ki-67阳性率，表明经激光照射的GNA002@cPRP可有效促进癌细胞凋亡并抑制其增殖，表明协同化学和光动力疗法可引发GNA002@cPRP更强的抗癌效力。
实施例11.体内生物安全
为了评估GNA002@cPRP纳米粒子的体内生物安全性，利用H&E法对6组小鼠的主要器官进行组织病理学评价。如图7所示，除了顺铂组小鼠的肺部和肝脏存在大量出血，GNA002组小鼠的脾脏出现散在出血点外，其他各组小鼠均无显著的组织损伤，表明GNA002@cPRP纳米粒子毒性较低。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (8)

1.一种纳米胶束，其特征在于，所述纳米胶束为cRGD-PEG-N＝CH-R6-Por，结构式为
Figure FDA0003767029670000011
n为整数。
2.权利要求1所述纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
1)将聚乙二醇与整合素受体的配体连接；所述聚乙二醇选自Mal-PEG-Hz，所述能靶向整合素ανβ3受体的配体选自cRGD，二者反应制备获得cRGD-PEG-Hz，反应方程式如下：
Figure FDA0003767029670000012
2)将穿膜肽通过酰胺化反应与光敏剂连接，包括以下步骤：
i.将多肽KR6C和Mal-Boc发生迈克尔加成反应，获得KR6-Boc；
ii.将KR6-Boc与Por在HATU、DIPEA的条件下反应，获得Por-R6-Boc；
iii.利用多肽切割液Por-R6-Boc，脱Boc保护，获得Por-R6-NH2；
iv.Por-R6-NH2与5-甲酰基-2,4-二甲基-3-吡咯甲酸发生酰胺化反应，获得Por-R6-CHO；以上步骤的反应方程式如下：
Figure FDA0003767029670000021
3)将步骤1)的产物通过腙键与步骤2)的产物连接。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)还包括以下特征中的一项或多项：
A.所述聚乙二醇与整合素受体的配体的摩尔比为1：1～1：1.5；
B.反应时间为6～10小时；
C.反应在保护气下进行；
D.反应在催化剂下进行。
4.权利要求1所述的纳米胶束在制备癌症治疗产品中的用途。
5.一种纳米载药胶束，其特征在于，所述纳米载药胶束经权利要求1所述的纳米胶束和药物自组装形成。
6.根据权利要求5所述的纳米载药胶束，其特征在于，所述药物为疏水性药物。
7.根据权利要求6所述的纳米载药胶束，其特征在于，所述疏水性药物选自阿霉素、GNA002、紫杉醇、顺铂、氟尿嘧啶、甲氨喋呤或喜树碱。
8.一种纳米载药胶束的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的纳米胶束与药物按照2：1～6：1的质量比混合反应，反应结束后即得纳米载药胶束。
CN202011463620.0A 2020-12-10 2020-12-10 一种三级靶向的pH敏感型纳米载药胶束及其制备方法和用途 Active CN112535660B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011463620.0A CN112535660B (zh) 2020-12-10 2020-12-10 一种三级靶向的pH敏感型纳米载药胶束及其制备方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011463620.0A CN112535660B (zh) 2020-12-10 2020-12-10 一种三级靶向的pH敏感型纳米载药胶束及其制备方法和用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112535660A CN112535660A (zh) 2021-03-23
CN112535660B true CN112535660B (zh) 2022-10-25

Family

ID=75020134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011463620.0A Active CN112535660B (zh) 2020-12-10 2020-12-10 一种三级靶向的pH敏感型纳米载药胶束及其制备方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112535660B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114404364B (zh) * 2022-01-18 2023-06-16 广西大学 一种可诱导肿瘤相关巨噬细胞m1型极化的光敏纳米胶束的构建及其抗肿瘤应用
CN115919766B (zh) * 2022-12-27 2023-10-24 国科宁波生命与健康产业研究院 一种复合纳米胶束及其制备方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103417480A (zh) * 2013-07-11 2013-12-04 四川大学 一种靶向整合素受体的新型多肽修饰的肿瘤靶向脂质体
CN103432582A (zh) * 2013-08-16 2013-12-11 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种rgd靶向卟啉聚合物纳米胶束的制备方法
CN108354901A (zh) * 2018-05-21 2018-08-03 中国医学科学院生物医学工程研究所 用于肿瘤化疗与光热联合治疗的pH/还原双重敏感多功能纳米胶束及其应用
CN108578364A (zh) * 2018-05-04 2018-09-28 天津医科大学口腔医院 偶联物、靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束及其制备方法及应用
CN109394691A (zh) * 2018-12-12 2019-03-01 青岛大学 一种多级pH敏感纳米载药系统
CN110448699A (zh) * 2019-06-12 2019-11-15 天津医科大学 包含功能性多肽修饰七甲川花菁素类染料的肿瘤细胞核靶向载药纳米粒子及制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6486004B2 (ja) * 2011-02-10 2019-03-20 ルプレヒト−カールス−ウニヴェルジテート ハイデルベルクＲｕｐｒｅｃｈｔ−Ｋａｒｌｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ 疎水性修飾ペプチドおよび肝臓特異的標的化のためのその使用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103417480A (zh) * 2013-07-11 2013-12-04 四川大学 一种靶向整合素受体的新型多肽修饰的肿瘤靶向脂质体
CN103432582A (zh) * 2013-08-16 2013-12-11 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种rgd靶向卟啉聚合物纳米胶束的制备方法
CN108578364A (zh) * 2018-05-04 2018-09-28 天津医科大学口腔医院 偶联物、靶向肿瘤活性氧响应性载药纳米胶束及其制备方法及应用
CN108354901A (zh) * 2018-05-21 2018-08-03 中国医学科学院生物医学工程研究所 用于肿瘤化疗与光热联合治疗的pH/还原双重敏感多功能纳米胶束及其应用
CN109394691A (zh) * 2018-12-12 2019-03-01 青岛大学 一种多级pH敏感纳米载药系统
CN110448699A (zh) * 2019-06-12 2019-11-15 天津医科大学 包含功能性多肽修饰七甲川花菁素类染料的肿瘤细胞核靶向载药纳米粒子及制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
可活化细胞穿膜肽在肿瘤治疗领域的应用;张利等;《药学学报》;20141212(第12期);全文 *
穿膜肽在肿瘤靶向治疗中的应用;张丽等;《肿瘤防治研究》;20151231(第10期);1043-1048 *
肿瘤微环境响应的智能纳米载体在肿瘤光动力治疗中的应用;蓝善优等;《中国激光》;20180102(第02期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112535660A (zh) 2021-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gao et al. Polymeric micelles encapsulating pH-responsive doxorubicin prodrug and glutathione-activated zinc (II) phthalocyanine for combined chemotherapy and photodynamic therapy
Yang et al. One-pot synthesis of pH-responsive charge-switchable PEGylated nanoscale coordination polymers for improved cancer therapy
Dong et al. Facile preparation of metal− organic frameworks-based hydrophobic anticancer drug delivery nanoplatform for targeted and enhanced cancer treatment
She et al. The potential of self-assembled, pH-responsive nanoparticles of mPEGylated peptide dendron–doxorubicin conjugates for cancer therapy
US10238750B2 (en) Porphyrin modified telodendrimers
Yin et al. Hypoxia-responsive block copolymer radiosensitizers as anticancer drug nanocarriers for enhanced chemoradiotherapy of bulky solid tumors
US10874609B2 (en) ß-cyclodextrin-based star-shaped polymer, a preparation method therefor and an integrated unimolecular micelle system for diagnosis and treatment thereof
CN107095859B (zh) 一种具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊及其制备方法
John et al. pH/redox dual stimuli-responsive sheddable nanodaisies for efficient intracellular tumour-triggered drug delivery
Geng et al. Combining anti-PD-1 antibodies with Mn2+-drug coordinated multifunctional nanoparticles for enhanced cancer therapy
CN112535660B (zh) 一种三级靶向的pH敏感型纳米载药胶束及其制备方法和用途
US20100009926A1 (en) Ph-sensitive polymeric micelles for drug delivery
CN109288813B (zh) 含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒及其制备方法
Liu et al. Inherently nitric oxide containing polymersomes remotely regulated by NIR for improving multi-modal therapy on drug resistant cancer
CN111479593B (zh) 奎尼酸-修饰的纳米粒子及其用途
US20130071482A1 (en) Block copolymer cross-linked nanoassemblies as modular delivery vehicles
CN113583178B (zh) 一种支化含糖聚合物基纳米粒子及其的制备方法和用途
CN104906076A (zh) 程序化多重靶向的树状大分子组装体药物递送系统及其制备方法和应用
CN103655587B (zh) 一种具高度肿瘤识别和环境响应释药能力的树状聚合物递药系统及其构建方法
Huo et al. Integrated metalloproteinase, pH and glutathione responsive prodrug-based nanomedicine for efficient target chemotherapy
Yang et al. Stepwise pH/reduction-responsive polymeric conjugates for enhanced drug delivery to tumor
AU2017372268B2 (en) VAP polypeptide and use thereof in preparation of drug for targeted diagnosis and treatment of tumour
Chen et al. pH and singlet oxygen dual-responsive GEM prodrug micelles for efficient combination therapy of chemotherapy and photodynamic therapy
Paul et al. Hypoxia alleviating platinum (IV)/chlorin e6-based combination chemotherapeutic-photodynamic nanomedicine for oropharyngeal carcinoma
Wang et al. Amphiphilic porphyrin-based supramolecular self-assembly for photochemotherapy: From molecular design to application

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant