CN104257628B - 载盐霉素胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明载盐霉素胶束及其制备方法和应用属于医药技术领域，本发明提供了一种载盐霉素具有高靶向性及渗透能力的小粒径胶束，是以DSPE‑PEG2000‑CRGDK共聚物为载体，包载盐霉素钠的胶束；本发明还提供该胶束的制备方法，以及在制备治疗肝癌药物中的应用。本发明的载盐霉素胶束，可达到同时靶向分化肝癌细胞和肝癌干细胞。本发明是肝癌治疗的一种新策略，利用胶束载体的优势，再联合高渗透性靶向多肽CRGDK达到靶向肝癌细胞和肝癌干细胞的效果，可以从其根源上治疗肝癌，具有广阔的运用前景。

Description

载盐霉素胶束及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于医药技术领域，具体的说，涉及一种载盐霉素胶束联合穿膜肽CRGDK靶向肝癌干细胞的药物制剂，及其制备与应用。

背景技术：

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，由于其恶性程度高、病情进展快，加上早期无明显症状以致就诊时肝脏已经受到严重损害，故治疗难度大、疗效差，病死率高，被称“癌中之王”。因此，肝癌的预防和治疗成为我国医药研究的一项重要任务。

由于肝癌发生时肝脏已经受到严重损害，因此导致具体治疗选择受到很大制约。目前尽管生物治疗与单一的手术治疗、放疗、化疗相比取得了很大的进展，但手术切除和肝癌移植仍是治疗肝癌的主要方法。然而长期随访发现多数肝癌根治性切除手术后仍发生肿瘤复发转移，其术后一年的复发率达3至4成，是乳腺癌的4倍。此外，传统的肝癌化疗进展不大，可能与多耐药基因有关。常用化疗药物仍为顺铂、阿霉素或表阿霉素、丝裂霉素、5-氟脲嘧啶或氟苷等。然而这些化疗药物不仅全身毒性严重，且通常也无明显疾病缓解或延命效果。目前的治疗方法存在一个共同问题：这些疗法中用于肝癌治疗的一线药物针对的都是已分化的肿瘤细胞，可以在较短时间内杀灭这类细胞，使肿瘤体积减小甚至消失，然而难以根除肝癌的复发，没有从根源上对肝癌进行治疗。因此肝癌迄今尚还处于一种严重缺乏有效治疗药物的尴尬境地。

随着人们对肝癌医学理论及临床实践的深入研究，特别是肿瘤分子生物学的飞速发展，越来越多的证据证明，肿瘤组织中存在一小部分具有高度增殖能力与自我更新能力的细胞群体，也具备多向分化的潜能。这类细胞被称为肿瘤干细胞(tumor stem cell,TSC)。它的数目极其稀少，但成瘤能力较普通肿瘤细胞大数百倍以上，是肿瘤发生、发展与维持的基础。TSC可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，被认为是肿瘤治疗失败和肿瘤复发的主要原因之一。因此，靶向肿瘤干细胞治疗为从本质上根除肿瘤提供了一条新的途径。

盐霉素是一种从白色链霉素的发酵液中分离提取得到的聚醚类离子载体型抗生素。它广泛应用于畜禽类动物鸡球虫病的防治，并且还能作为饲料添加剂以促进畜禽的生长。自2009年Gupta发表在CELL的文章中指出他们用高通量的方法发现盐霉素可以降低肿瘤干细胞的比例，其效力是常用抗乳腺癌药物紫杉醇的100倍后，盐霉素开始成为一种新型抗肿瘤药物受到研究人员的广泛关注(Gupta PB,Onder TT,Jiang G,等.Identification ofselective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening[J].Cell,2009,138(4):645～659.)。近些年关于盐霉素对人肿瘤细胞和肿瘤干细胞的研究突出表明了盐霉素优于传统化疗药，尤其是它可以通过一种或几种药物机制来诱导正常癌细胞和进展非常缓慢的肿瘤细胞的凋亡，也可以改变肿瘤干细胞对放、化疗的敏感性，或与其他抗癌药物联用来诱导肿瘤干细胞分化为较成熟细胞，提高其对治疗的敏感性。盐霉素不仅杀死了肿瘤干细胞，同时也消灭了正常肿瘤细胞和对细胞毒性药物，放射物，促进细胞凋亡药物的抵抗性较强的高度休眠的肿瘤细胞。目前，盐霉素被认为是三刃刀来对抗癌症，为临床恶性肿瘤的治疗提供了新的方向。

然而高浓度的TSC存在于实体瘤中含氧量低以及坏死的部位，游离的抗肿瘤药物不仅对基体存在较大毒性，也很难在整个肿瘤中均匀分布来渗透致死浓度进入TSC中。药物靶向传递并不令人十分满意，由于肿瘤血管结构紊乱以及肿瘤内部高的组织间隙压导致大多数靶向药物传递系统只能渗透3-5个细胞直径，并且主要沉积在周围的肿瘤血管中。因此需要一种载体能有效的包载游离药物、高效渗透肿瘤内部并选择性地杀伤肿瘤细胞，减少非靶向器官的药物积聚，降低对机体的毒副作用。文献报道，一种新型的线肽CRGDK(穿膜靶向肽，氨基酸序列为Cys-Arg-Gly-Asp-Lys)当结合或协同抗癌药物给药时可以显著提高抗癌药物进入实体瘤的渗透性(Gill KK,Kaddoumi A,Nazzal S.Mixed micelles of DSPE-PEG2000andvitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide:Enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lungcancer(NSCLC)cell lines[J].Eur J Pharm Sci,2012,46(1–2):64～71.)。

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000](DSPE-PEG₂₀₀₀)是两亲性分子共聚物，容易形成小粒径胶束，并具有较低的CMC值，现已被FDA批准用于临床。由它制成的脂质胶束本身具有良好的生物相容性，可以有效地增溶各种难溶性药物，降低药物的毒性。而且形成的小粒径胶束(<30nm)不仅可以逃避单核细胞吞噬作用，延长体内循环时间，增加药物在实体瘤的蓄积，还具有肿瘤组织高渗透能力，能有效地渗透入肿瘤组织内部，释放药物达到消灭肿瘤干细胞的致死浓度。

目前也尚无文献报道用DSPE-PEG2000-CRGDK共聚物为载体包载盐霉素制备的胶束来针对肝癌细胞和干细胞进行靶向给药。

发明内容：

本发明的目的是提供一种载盐霉素具有高靶向性及渗透能力的小粒径胶束及其制备方法，本发明的另一个目的是提供该胶束在制备治疗肝癌药物中的应用。

本发明人设想，选择新型的抗肿瘤药物盐霉素，用合成的可生物可降解的DSPE-PEG2000-CRGDK共聚物作为载体，包载抗肿瘤药物盐霉素，制备成粒径小于30nm的胶束，应该可以加强药物对肿瘤的靶向性与渗透性，消灭肝癌细胞和干细胞。

本发明的主要技术方案包括：

一、DSPE-PEG2000-CRGDK的合成：

所述的DSPE-PEG2000-CRGDK的合成方法，是将穿膜靶向肽CRGDK的巯基(—SH)与DSPE-PEG2000-MAL(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoeyhanolamine-N-[maleimid(polyethy-lene glycol)-2000])中的马来酰亚胺基团结合，形成接肽嵌段共聚物。

本发明人在CRGDK:DSPE-PEG2000-MAL重量比1:1至1:10中进行摸索，发现1:5w/w时，反应更完全；另外，本发明还选择了p H6.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液，使反应更充分。

二、载盐霉素DSPE-PEG2000-CRGDK混合胶束的制备：

技术关键在于，要寻找到最佳盐霉素包封率，本发明人将盐霉素与DSPE-PEG2000-CRGDK载体质量比值进行了优化。优化方法为：取不同盐霉素与载体质量比例进行制备，1:5至1:15，测其包封率，得出盐霉素与载体质量比为1:10时，制备的载药胶束盐霉素包封率最佳。

另外，本发明人还对水化的pH值进行优化，在pH 5.0、pH7.4、pH9.0中进行筛选，结果表明水化pH值在7.4时，粒径最理想，包封率最高。

三、载药胶束体外穿透肝癌干细胞能力的检测；

四、载药胶束体外抗肝癌干细胞活性的检测。

本发明的第一方面，是提供了一种载盐霉素胶束，该胶束为：首先合成DSPE-PEG2000-CRGDK共聚物作为载体，包载盐霉素钠，制备成粒径小于30nm的胶束；

所述的CRGDK和DSPE-PEG2000(DSPE-PEG2000-MAL)的重量比1:5；

所述的盐霉素钠与DSPE-PEG2000-CRGDK混合载体的质量比为1:10。

本发明的第二方面，是提供了上述的载盐霉素胶束的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

A.DSPE-PEG2000-CRGDK的合成

DSPE-PEG2000-CRGDK的合成，可参考文献Tuo Wei,Juan Liu,HuiliMa et al.Functionalized Nanscale Micelles Imprve Drug Delivery for CancerTherapy in Vitro and in Vivo.Nano Lett.2013,13,2528-2534。

较优的，步骤A为CRGDK与DSPE-PEG2000-MAL以1:5w/w，溶解于50mM的HEPES缓冲溶液中(pH 6.5)，在室温中持续搅拌48小时,混合物通过截留分子量1000的透析袋纯化；

B.载盐霉素胶束的制备

将步骤A制备的DSPE-PEG2000-CRGDK和DSPE-PEG2000溶解于氯仿中；另按混合载体质量的0.1倍量取盐霉素钠，溶解于甲醇中；将两种溶液混合，35℃下减压旋转蒸发4小时除去有机溶剂，形成干燥薄膜；向旋转蒸发瓶中加入pH7.4的磷酸盐缓冲液并充满氮气，水化30min；过50nm聚碳酸酯膜去除未包封的盐霉素钠。

较优的，步骤B.载盐霉素胶束的制备中，混合载体中DSPE-PEG2000-CRGDK和DSPE-PEG2000是按1:4w/w比例溶解于氯仿中。

本发明中，所用的DSPE-PEG2000及合成的DSPE-PEG2000-CRGDK属于嵌段共聚物，并且水性环境中可形成核-壳结构的球形胶束。

本发明中，DSPE-PEG2000-CRGDK混合载体是指DSPE-PEG2000-CRGDK和DSPE-PEG2000组成的载体，混合载体的量即为DSPE-PEG2000-CRGDK+DSPE-PEG2000的总量。出于制剂成本的考虑，DSPE-PEG2000-CRGDK在混合载体中的比例为10—50％，较优为20％。

本发明的第三方面，是提供了上述的载盐霉素胶束在制备治疗肝癌药物中的应用。

所述的应用，是指上述的载盐霉素胶束靶向已分化的肝癌干细胞。

本发明的胶束体外高靶向性及渗透能力的检测：

本发明用流式细胞仪及激光共聚焦显微镜检测肝癌细胞和肝癌干细胞中对含有荧光物质胶束的摄取能力，来评价胶束体外靶向性及渗透能力。流式细胞仪对肝癌细胞和干细胞内的荧光值进行定量分析，激光共聚焦显微镜对肝癌干细胞内荧光强弱进行定性分析。结果表明肝癌干细胞对胶束的摄取能力明显高于肝癌细胞。

本发明的载盐霉素胶束体外抗肝癌和肝癌干细胞活性：

本发明采用CCK-8法测定细胞在经不同药物浓度处理后细胞存活率，来评价药物和载药纳米粒的细胞毒性。细胞的生存曲线经对数模拟后，计算细胞的IC50来定量比较其细胞毒性大小。结果显示载盐霉素胶束无论对肝癌细胞还是肝癌干细胞的杀伤能力都高于游离盐霉素且盐霉素对肝癌干细胞的杀伤能力要高于肝癌细胞。

因此，本发明的载盐霉素胶束可达到同时靶向分化肝癌细胞和肝癌干细胞的作用。这是肝癌治疗的一种新策略，利用胶束载体的优势，再联合高渗透性靶向多肽CRGDK达到靶向肝癌细胞和肝癌干细胞的效果，可以从其根源上治疗肝癌，具有广阔的运用前景。

附图说明：

图1为DSPE-PEG2000-CRGDK的嵌段共聚物的合成，

其中A为CRGDK与DSPE-PEG2000-MAL的合成反应，B为MALDI-TOF-MS检测DSPE-PEG2000-MAL的分子量分布，C为MALDI-TOF-MS检测DSPE-PEG2000-CRGDK的分子量分布；

图2为薄膜分散法制备DSPE-PEG2000-CRGDK混合胶束的反应流程；

图3为DSPE-PEG2000-CRGDK混合胶束的表征，

其中A为胶束的水化粒径分布图，B为胶束的水化电位分布图，C为胶束的透射电镜图片；

图4为流式细胞仪检测肝癌和肝癌干细胞对胶束的摄取能力，

其中A为肝癌细胞对载荧光物质胶束摄取能力的对照组，B为肝癌细胞对载荧光物质胶束摄取能力的实验组，C为肝癌干细胞对载荧光物质胶束摄取能力的对照组，D为肝癌干细胞对载荧光物质胶束摄取能力的实验组；

图5为激光共聚焦检测肝癌和肝癌干细胞对胶束的摄取能力，

其中A为肝癌细胞摄取载荧光物质胶束(CFPE)，B为肝癌细胞摄取载荧光物质胶束(Phase contrast)，C为肝癌干细胞摄取载荧光物质胶束(CFPE)，D为肝癌干细胞摄取载荧光物质胶束(Phase contrast)；

图6为载盐霉素胶束及游离盐霉素对肝癌细胞和肝癌干细胞的半数抑制浓度(IC50)。

具体实施方式：

以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

材料和仪器：

激光粒度测定仪，英国马尔文仪器有限公司；

R系列旋转蒸发器，上海申生科技有限公司；

CRGDK线肽，吉尔生化有限公司；

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000](ammonium salt)(DSPE-mPEG2000)，Avanti Polar Lipids公司；1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethyleneglycol)-2000](DSPE-mPEG2000-MAL)，Avanti Polar Lipids公司；1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(carboxyfluorecein)(CFPE),Avanti Polar Lipids公司；

盐霉素钠，美国Sigma公司；

HPLC色谱纯度>93.8％；

透析袋(截留分子量1000)，上海绿鸟生物发展有限公司；

磷酸盐缓冲液(PBS),美国Hyclone公司；

乙腈及四氢呋喃为色谱纯，其他试剂均为分析纯；

碱性成纤细胞生长因子(bFGF)，以色列prospec公司；

内皮生长因子(EGF)、胰岛素，以色列prospec公司；

胎牛血清、胰酶、青链双抗、B27添加物，美国Gibico公司；

其他化学试剂均购自上海国药集团；

杜氏磷酸缓冲液(D-PBS),美国Thermo公司；

万分之一电子天平AL104,梅特勒托利多公司；

十万分之一电子天平MS205DU,梅特勒托利多公司；

透射电子显微镜JEM2100F，日本JEOL公司；

Zetasizer nano ZS激光粒度分析仪，英国马尔文公司；

岛津高效液相色谱仪LC-20A，日本岛津公司。

实施例1:DSPE-PEG2000-CRGDK的嵌段共聚物的合成

如图1A所示，精密称量0.3mgCRGDK与1.5mg DSPE-PEG2000-MAL溶解于2ml 50mM的HEPES缓冲溶液中(pH 6.5)，在室温中磁力搅拌48h，反应过程中CRGDK的巯基(—SH)与DSPE-PEG2000-MAL中的马来酰亚胺基团结合。反应结束后，将反应溶液装入透析袋中(Spectra/Por,MWCO1000)，在去离子水中透析24小时，其中每12h更换一次透析液。

透析结束将袋内溶液冻干待用。

结果如图1B所示，DSPE-PEG2000相对分子量集中在2800-3400，而图1C DSPE-PEG2000-CRGDK则在3500-4000出现峰值，增加的分子量数值与CRGDK的分子量700相符，结果表明CRGDK成功地连接到DSPE-PEG2000上。

实施例2:盐霉素钠胶束的制备

如图2所示，将1mg DSPE-PEG2000-CRGDK和4mg DSPE-PEG2000溶解于3ml氯仿中，另取0.5mg盐霉素钠溶解于1ml甲醇中，将上述两种溶液混合，35℃下减压旋转蒸发4h除去有机溶剂，形成干燥薄膜。向瓶中加入2mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液并充满氮气，水化30min。过50nm聚碳酸酯膜去除未包封的盐霉素钠。

通过薄膜分散法制备的胶束粒径在13nm(图3A)，zeta电位维持在-13mV左右(图3B)，透射电镜(图3C)表明本发明制备的DSPE-PEG2000-CRGDK混合胶束为球形，且具备典型的核-壳结构。通过该实验表明本发明制备的DSPE-PEG2000-CRGDK自组装胶束具备明确的微观结构。

实施例3：盐霉素胶束制备工艺的优化

(1)载体总量与盐霉素钠质量比的筛选

分别将(0.5、1、1.5)mg DSPE-PEG2000-CRGDK和(2,4,6)mgDSPE-PEG2000溶解于3ml氯仿中，另取0.5mg盐霉素溶解于1ml甲醇中，(即载体总量与盐霉素钠质量比分别为1:5,1:10,1:15)将上述两种溶液混合，35℃下减压旋转蒸发4h除去有机溶剂，形成干燥薄膜。向瓶中加入2mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液并充满氮气，水化30min。过50nm聚碳酸酯膜去除未包封的盐霉素钠。结果表明质量比为1:10时，胶束的包封率最高，详见表1。

表1：载体总质量与盐霉素钠质量比对胶束的影响(n＝3)

(2)水化PH值的筛选

将1mg DSPE-PEG2000-CRGDK和4mg DSPE-PEG2000溶解于3ml氯仿中，另取0.5mg盐霉素溶解于1ml甲醇中，将上述两种溶液混合，35℃下减压旋转蒸发4h除去有机溶剂，形成干燥薄膜。向瓶中加入2mL pH(5.0，7.4，9.0)的磷酸盐缓冲液并充满氮气，水化30min。过50nm聚碳酸酯膜去除未包封的盐霉素钠。结果表明水化PH值在7.4时，粒径最理想，包封率最高，详见表2。

表2：PH值对胶束的影响(n＝3)

实施例4:流式细胞仪检测肝癌和肝癌干细胞中对包载荧光物质胶束的摄取能力

(1)含有荧光物质胶束的制备。

将30μg CFPE荧光物质与0.5mg盐霉素共同溶于甲醇中，将1mgDSPE-PEG2000-CRGDK和4mg DSPE-PEG2000溶解于3ml氯仿中，采用薄膜分散发制备成含荧光物质的胶束。

(2)肝癌细胞对荧光物质胶束的摄取能力检测：

铺3×105个HepG2细胞在6孔板中，接种好的细胞于37℃，5％CO₂的条件下培养24h让细胞贴壁。对照组加入500μL PBS，实验组加入500μL胶束溶液。药物在37℃孵育2小时后，用PBS洗涤三次，用胰酶消化成单细胞悬液。PBS离心洗涤一次后，加入300μLPBS重悬细胞，流式上机分析绿色荧光强度。

(3)肝癌干细胞对荧光物质胶束的摄取能力检测：

铺3×105个HepG2细胞在6孔板中，接种好的细胞于37℃，5％CO₂的条件下培养24h让肝癌干细胞成团。对照组加入500μL PBS，实验组加入500μL胶束溶液。药物在37℃孵育2小时后，用PBS离心洗涤三次，用胰酶消化成单细胞悬液。PBS再次离心洗涤一次后，加入300μLPBS重悬细胞，流式上机分析绿色荧光强度。

通过比较肝癌细胞及干细胞荧光值(见图4)及激光共聚焦中细胞内荧光亮度(见图5)，可看出肝癌细胞(图4B)和肝癌干细胞(图4D)中荧光值明显高于其对照组(图4A，图4C)。且肝癌干细胞的荧光值(图4D)及荧光亮度(图5B)明显高于肝癌细胞(图4B，图5A)，说明肝癌干细胞对胶束的摄取能力比肝癌细胞更强。

实施例5:载盐霉素胶束体外抗肝癌的活性分析

(1)对于贴壁的HepG2细胞株

将对数期的HepG2细胞经胰酶消化，用含血清培养基重悬制成单细胞悬液，调整细胞密度至2×104个/mL，以2000个/孔的密度接种于96孔板中，即每孔加入0.1ml的单细胞悬液，接种好的细胞于37℃，5％CO₂的条件下培养24h，待细胞生长到合适密度。

向各孔分别加入10μL培养基稀释的药物，终浓度分别为0.02,0.08,0.74,2.22,6.67,20,60,120μM，每孔设6个副孔，加药后返回二氧化碳培养箱中继续培养48h。同时设不加细胞的空白溶度对照孔和不进行任何处理的阴性对照孔。孵育48h后小心吸弃上清液，每孔加入100μl浓度为10％的CCK-8溶液再孵育2h。然后置于酶标仪于490nm测定各孔OD值。细胞生存率(％)＝(实验组OD值－空白组OD值)/(阴性对照组OD值－空白组OD值)×100％。

(2)对于悬浮的HepG2干细胞

将对数期的HepG2细胞经胰酶消化后制成单细胞悬液，用无血清培养基重悬，得单细胞悬液，以2000个/孔的密度接种于96孔板中，即每孔加入0.1ml的单细胞悬液，接种好的细胞于37℃，5％CO₂的条件下培养24h，待细胞生长到合适密度。

向各孔分别加入10μL培养基稀释的药物，终浓度分别为0.02,0.08,0.74,2.22,6.67,20,60,120μM，每孔设6个副孔，加药后返回二氧化碳培养箱中继续培养48h。同时设不加细胞的空白溶度对照孔和不进行任何处理的阴性对照孔。孵育48h后，2000rad/min离心5min，小心吸弃上清液，每孔加入100μl浓度为10％的CCK-8溶液再孵育2h。然后置于酶标仪于490nm测定各孔OD值。细胞生存率(％)＝(实验组OD值－空白组OD值)/(阴性对照组OD值－空白组OD值)×100％

图6显示了游离盐霉素和盐霉素胶束对HepG2细胞及肿瘤干细胞毒性，可以得到以下结果：

(1)盐霉素和载盐霉素胶束对HepG2细胞及肿瘤干细胞的毒性具有浓度依赖性，随着盐霉素的浓度升高，细胞存活率显著下降。

(2)HepG2肿瘤干细胞对于盐霉素的敏感性比HepG2贴壁细胞。说明盐霉素对于肝癌干细胞有很好的疗效。

(3)载盐霉素胶束无论对HepG2贴壁细胞还是干细胞的抑制作用要强于游离盐霉素组，说明载药胶束可增强对肝癌细胞的抑制作用。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (6)

1.一种载盐霉素胶束，其特征在于，该胶束为：

以DSPE-PEG2000-CRGDK共聚物作为载体，包载盐霉素钠，粒径小于30nm的胶束；

所述的CRGDK和DSPE-PEG2000的重量比1:5；

所述的盐霉素钠与DSPE-PEG2000-CRGDK混合载体的质量比为1:10；

所述的载盐霉素胶束的制备方法如下：

将DSPE-PEG2000-CRGDK和DSPE-PEG2000溶解于氯仿中；另按混合载体质量的0.1倍量取盐霉素钠，溶解于甲醇中；将两种溶液混合，35℃下减压旋转蒸发4小时除去有机溶剂，形成干燥薄膜；向旋转蒸发瓶中加入pH7.4的磷酸盐缓冲液并充满氮气，水化30min；过50nm聚碳酸酯膜去除未包封的盐霉素钠。

2.一种如权利要求1所述的载盐霉素胶束的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

A.DSPE-PEG2000-CRGDK的合成；

B.载盐霉素胶束的制备

将DSPE-PEG2000和步骤A制备的DSPE-PEG2000-CRGDK溶解于氯仿中；另按混合载体质量的0.1倍量取盐霉素钠，溶解于甲醇中；将两种溶液混合，35℃下减压旋转蒸发4小时除去有机溶剂，形成干燥薄膜；向旋转蒸发瓶中加入pH7.4的磷酸盐缓冲液并充满氮气，水化30min；过50nm聚碳酸酯膜去除未包封的盐霉素钠。

3.根据权利要求2所述的载盐霉素胶束的制备方法，其特征在于，步骤A.DSPE-PEG2000-CRGDK的合成，为：

CRGDK与DSPE-PEG2000-MAL以1:5w/w，溶解于50mM的pH6.5的HEPES缓冲溶液中，在室温中持续搅拌48小时，混合物通过截留分子量1000的透析袋纯化。

4.根据权利要求2所述的载盐霉素胶束的制备方法，其特征在于，步骤B.载盐霉素胶束的制备中，混合载体中DSPE-PEG2000-CRGDK和DSPE-PEG2000是按1:4w/w比例溶解于氯仿中。

5.一种如权利要求1所述的载盐霉素胶束在制备治疗肝癌药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的载盐霉素胶束在制备治疗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述的应用是指所述的载盐霉素胶束靶向已分化的肝癌干细胞。