CN110384658A - 一种双靶修饰脂质体的制备方法 - Google Patents

一种双靶修饰脂质体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种双靶修饰脂质体的制备方法，其包括：1）将靶分子分别连接到磷脂分子上，靶分子包括甘草次酸和花生凝集素，连接后分别得到DSPE‑PEG2000‑GA和DSPE‑PEG2000‑PNA；2）取步骤1）中得到的DSPE‑PEG2000‑GA和DSPE‑PEG2000‑PNA，与大豆磷脂、胆固醇溶于氯仿中，采用薄膜分散法制备空白脂质体；3）取步骤2）中得到的空白脂质体，采用硫酸铵梯度法制备载药脂质体。本发明将靶分子先连接到磷脂上，在制备脂质体时与大豆磷脂和胆固醇一起加入，连接效率高，操作简单，利于转化。利用本发明的方法得到的双靶修饰的脂质体提高了靶向效率，对肝癌细胞有明显抑制作用。

Description

一种双靶修饰脂质体的制备方法
技术领域
本发明涉及靶向肿瘤药物研发领域，具体的说是一种双靶修饰的脂质体的制备方法。
背景技术
癌症是威胁人类健康的主要疾病，肝癌是继肺癌、大肠癌和胃癌后第四位致死癌症。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma HCC)发病率较高，在全球范围约占原发性肝癌的90%，是威胁人类生命健康的主要癌症之一。药物对肿瘤选择性低且易发生多药耐药，现在常规的治疗癌症的方式有手术治疗、放射疗法和化学疗法，上述方法均存在诸多弊端。靶向给药给癌症治疗带来了新希望。
脂质体是磷脂分子在水相中形成的双层人工膜，可将水溶性药物包封于其内核，将脂溶性药物包载在其疏水层，其具有良好的靶向性、缓释性、无免疫原性和易降解的优点，在靶向给药载体方面具有广阔的应用前景。将脂质体表面连接特定的配体（如抗体、多肽、激素、糖），使其特异性靶向肿瘤细胞，而不波及肿瘤周围正常的组织细胞，具有毒副作用小、药物生物利用度高、疗效显著等优势，极大的改善患者生存质量。
甘草次酸（Glycyrrhetinic acid, GA）是从中药甘草中提取的五环三萜类化合物。在肝细胞表面存在大量GA的结合位点（GA-R），肝肿瘤细胞的GA-R表达量是相邻正常肝组织的1.5-5倍。花生凝集素（peanut agglutinin, PNA）是一种来源于花生果实的植物凝集素蛋白，是一种常见的营养物质，对多种酶具有良好的抗性。PNA可与MUC1的核心位点(Gal- β(1-3)GalNAc)结合。MUC1是一种大分子量的结构性跨膜糖蛋白，具有高度糖基化的胞外结构域、跨膜区和胞浆尾巴，在恶性肿瘤细胞表面高表达，被认为是肿瘤治疗最有潜力的靶点。
在文献《PNA修饰的载长春碱阳离子脂质体对Lewis肺肿瘤细胞的抗肿瘤活性体内外研究》（Li, Xue-tao, He, Mei-li, Zhou, Zhi-yan, et al. The antitumor activityof PNA modified vinblastine cationic liposomes on Lewis lung tumor cells: Invitro and in vivo evaluation[J]. International Journal of Pharmaceutics,2015, 487(1-2):223-233）中，作者采用花生凝集素做配体，制备了载长春新碱的阳离子脂质体，增强了非小细胞肺癌的摄入，对荷瘤小鼠的抗肿瘤效果较好，花生凝集素修饰的脂质体增强了靶向作用，提高了药物疗效。
在文献《新型甘草次酸修饰的载姜黄素阳离子脂质体体外及H22荷瘤小鼠体内的抗肿瘤活性》（Chang Mingxiang, Wu Meimei, Li Hanmin. Antitumor activities ofnovel glycyrrhetinic acid-modified curcumin-loaded cationic liposomes invitro and in H22 tumor-bearing mice[J]. Drug Delivery, 25:1, 1984-1995）中，作者采用甘草次酸作为配体，制备了载姜黄素的阳离子脂质体，甘草次酸修饰的载姜黄素阳离子脂质体比游离的姜黄素抑制HepG2细胞增殖效果好，明显改善了H22荷瘤小鼠的各项生化指标，姜黄素的抗肿瘤作用在甘草次酸修饰的阳离子脂质体中明显增强了。
目前已上市的盐酸阿霉素长循环脂质体、长春新碱脂质体等脂质体药物中，仅有一种长循环脂质体，其他均为传统脂质体，未出现靶向脂质体。已上市的脂质体药物均通过被动靶向到达患病区域，被动靶向是通过巨噬细胞的吞噬作用到达肝脏、肾脏等靶器官，肝Kupffer 细胞起到主要的摄取作用，被动靶向制主要受到载药体系的粒径影响；靶向修饰的脂质体可以通过主动靶向到达目的地，主动靶向是指在材料外部接上特异性配体，在靶部位有特异性的受体与之结合，可以更有效地到达靶部位。
治疗肿瘤的方式中，手术切除是早期肿瘤常用的治疗方式，但是具有创伤大、易感染等缺点；放、化疗能杀伤肿瘤细胞，但缺乏选择性，对机体正常组织具有较大的副作用。因此，研究和发现靶向肿瘤药物，实现肿瘤精准治疗有重要意义。
由前述可知，目前已上市的脂质体制剂都为传统脂质体，无靶向修饰，靶向细胞通过被动靶向方式，靶向效率低，易对正常组织造成损伤。另外，目前基础研究多为单靶修饰脂质体，靶向不准确，靶向效率低，易对正常组织造成损伤。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种双靶修饰脂质体的制备方法，该制备方法靶分子连接效率高、操作简单、利于转化，且得到的双靶修饰的脂质体能提高靶向效率，能明显抑制癌细胞。
为解决上述技术问题，本发明的双靶修饰脂质体的制备方法包括如下步骤：
步骤1）将靶分子分别连接到磷脂分子上，靶分子包括甘草次酸和花生凝集素，连接后分别得到DSPE-PEG2000-GA和DSPE-PEG2000-PNA；
步骤2）取步骤1）中得到的DSPE-PEG2000-GA和DSPE-PEG2000-PNA，与大豆磷脂、胆固醇溶于氯仿中，采用薄膜分散法制备空白脂质体；
步骤3）取步骤2）中得到的空白脂质体，采用硫酸铵梯度法制备载药脂质体。
步骤1）中甘草次酸的连接具体包括如下流程：取0.1g 的DSPE-PEG2000-NH2溶于2mL氯仿中，加入0.11g的甘草次酸、0.11g的EDC和0.055gDMAP，室温搅拌反应24h，用纯水洗2-4次，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，减压浓缩溶液，转移至200mL无水乙醚中沉淀，过滤收集产物，将产物重复溶解沉淀2-4次，得到DSPE-PEG2000-GA。
步骤1）中花生凝集素的连接具体包括如下流程：取0.05g花生凝集素溶于2mL PBS缓冲液中，PBS缓冲液pH值为7.4，在水浴加热条件下加入0.05g 的DSPE-PEG2000-NH2至溶解完全，室温搅拌8h，然后将反应液转移至8000-14000Da的透析袋中透析纯化48h，收集溶液冷冻干燥后，得到DSPE-PEG2000-PNA。
步骤2）具体的包括：
步骤2.1）称取磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000-GA和DSPE-PEG2000-PNA溶于氯仿中,质量比为磷脂：胆固醇：DSPE-PEG2000-GA：DSPE-PEG2000-PNA=16：4：1：1，脂质浓度为30mg/mL，水浴超声促溶；
步骤2.2）将步骤2.1）得到的脂质溶液转移至100mL的茄形瓶中旋蒸，去除氯仿并形成脂质薄膜；旋蒸条件为压力0.04MPa、温度35℃、转速30rpm。
步骤3）具体的包括：
步骤3.1）将脂质薄膜加入4mL硫酸铵溶液进行水化，硫酸铵溶液浓度为70mg/mL，水化条件为温度50℃、转速40rpm、时间1h；
步骤3.2）将步骤3.1）得到的脂质体溶液经超声处理，超声功率5%、超声时间10min、超声2s停3s；
步骤3.3）将步骤3.2）得到的脂质体溶液依次过0.45μm滤膜三次、0.22μm的滤膜三次，然后置于8000-14000Da的透析袋中透析5h，得到空白脂质体；
步骤3.4）将步骤3.3）中所得空白脂质体，加入药溶液，药脂比为1：10，共同孵育，并置于8000-14000Da的透析袋中透析15h后即得到载药脂质体，孵育条件为转速40rpm、温度50℃、时间20min。
本发明方法的原理是：在肝细胞表面大量表达甘草次酸受体（GA-R），本发明中其中一个靶分子“甘草次酸”可以与之特异性结合，黏蛋白-1（mucin-1, MUC1）在恶性肿瘤中高表达，本发明中另一个靶分子“花生凝集素”可以特异性结合到其核心结构上，将两个靶分子分别连在磷脂分子上，再将连接后的靶分子连接到脂质体上，双靶修饰的脂质体可以靶向恶性肝癌，提高靶向效率。
本发明的有益效果是：
1）本发明的方法中，靶分子先连接到磷脂上，在制备脂质体时与大豆磷脂和胆固醇一起加入，连接效率高，操作简单，利于转化；
2）利用本发明的方法得到的双靶修饰的脂质体提高了靶向效率，对肝癌细胞有明显抑制作用。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
图1为本发明制备的双靶修饰的载药脂质体的透射电镜形态学观察图像；
图2.1为半个月内粒径变化曲线图；
图2.2为半个月内Zeta电位变化曲线图；
图3为体外累积释药曲线；
图4.1为激光共聚焦显微镜拍摄细胞摄入图；
图4.2为图4.1的DOX亮度的DOX，DOX-Lip，DOX-GA/PNA-Lip三个分组图片的量化对比图；
图5为双靶修饰的载药脂质体的细胞毒性实验中DOX，DOX-Lip，DOX-GA/PNA-Lip三种制剂浓度对肿瘤细胞杀伤作用量化对比图。
具体实施方式
本发明的双靶修饰脂质体的制备方法，包括如下步骤：
步骤1）将靶分子分别连接到磷脂分子上，靶分子包括甘草次酸和花生凝集素，连接后分别得到DSPE-PEG2000-GA和DSPE-PEG2000-PNA；
步骤2）取步骤1）中得到的DSPE-PEG2000-GA和DSPE-PEG2000-PNA，与大豆磷脂、胆固醇溶于氯仿中，采用薄膜分散法制备空白脂质体；
步骤3）取步骤2）中得到的空白脂质体，采用硫酸铵梯度法制备载药脂质体。
步骤1）中甘草次酸的连接具体包括如下流程：取0.1g 的DSPE-PEG2000-NH2溶于2mL氯仿中，加入0.11g的甘草次酸、0.11g的EDC和0.055gDMAP，室温搅拌反应24h，用纯水洗2-4次，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，减压浓缩溶液，转移至200mL无水乙醚中沉淀，过滤收集产物，将产物重复溶解沉淀2-4次，得到DSPE-PEG2000-GA。
步骤1）中花生凝集素的连接具体包括如下流程：取0.05g花生凝集素溶于2mL PBS缓冲液中，PBS缓冲液pH值为7.4，在水浴加热条件下加入0.05g 的DSPE-PEG2000-NH2至溶解完全，室温搅拌8h，然后将反应液转移至8000-14000Da的透析袋中透析纯化48h，收集溶液冷冻干燥后，得到DSPE-PEG2000-PNA。
步骤2）具体的包括：
步骤2.1）称取磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000-GA和DSPE-PEG2000-PNA溶于氯仿中，质量比为磷脂：胆固醇：DSPE-PEG2000-GA：DSPE-PEG2000-PNA=16：4：1：1，脂质浓度为30mg/mL，水浴超声促溶；
步骤2.2）将步骤2.1）得到的脂质溶液转移至100mL的茄形瓶中旋蒸，去除氯仿并形成脂质薄膜；旋蒸条件为压力0.04MPa、温度35℃、转速30rpm。
步骤3）具体的包括：
步骤3.1）将脂质薄膜加入4mL硫酸铵溶液进行水化，硫酸铵溶液浓度为70mg/mL，水化条件为温度50℃、转速40rpm、时间1h；
步骤3.2）将步骤3.1）得到的脂质体溶液经超声处理，超声功率5%、超声时间10min、超声2s停3s；
步骤3.3）将步骤3.2）得到的脂质体溶液依次过0.45μm滤膜三次、0.22μm的滤膜三次，然后置于8000-14000Da的透析袋中透析5h，得到空白脂质体；
步骤3.4）将步骤3.3）中所得空白脂质体，加入药溶液，药脂比为1：10，共同孵育，并置于8000-14000Da的透析袋中透析15h后即得到载药脂质体，孵育条件为转速40rpm、温度50℃、时间20min。
本发明方法的原理是：在肝细胞表面大量表达甘草次酸受体（GA-R），本发明中其中一个靶分子“甘草次酸”可以与之特异性结合，黏蛋白-1（mucin-1, MUC1）在恶性肿瘤中高表达，本发明中另一个靶分子“花生凝集素”可以特异性结合到其核心结构上，将两个靶分子分别连在磷脂分子上，再将连接后的靶分子连接到脂质体上，双靶修饰的脂质体可以靶向恶性肝癌，提高靶向效率。
为了进一步证明本发明制备方法和本发明双靶修饰脂质体带来的有益效果，下面分别从脂质体表征、体外释药实验、脂质体体外靶向实验、细胞毒性实验四个方面对本发明的双靶修饰载药脂质体进行实验验证。其中，步骤3.3）中所述的药溶液采用阿霉素溶液。
一）脂质体表征验证，脂质体表征包括脂质体粒径、Zeta电位分布、脂质体形态学分析、脂质体稳定性分析。下面分别进行实验验证。
1）脂质体粒径、Zeta电位分布：利用Malvern Zetasizer Nano ZS 90激光粒度仪（英国Malvern公司）测定空白脂质体及载药脂质体的粒径、Zeta电位分布，每次测定进行三次，结果如下表1所示，测定结果为：双靶修饰的脂质体粒径（Size）为107.62±1.28nm，聚合物分散性指数PDI为0.189±0.0063，Zeta电位为-23.76±1.11mV。
2）包封率、载药量测定：利用紫外分光光度法测定载药脂质体的包封率和载药量。取200μL脂质体稀释至3mL，加入2%的TrintonX-100破膜20min，用紫外分光光度计于478nm处测吸光值，带入阿霉素标曲中算得包封率（EE）为（94.07±3.65)%，载药量（DL）为（9.32±0.37)%，结果如下表1。
表1中，Lip：空白脂质体，GA/PNA-Lip：甘草次酸和花生凝集素双靶修饰脂质体，DOX-Lip：载阿霉素脂质体，DOX-GA/PNA-Lip: 载阿霉素甘草次酸和花生凝集素双靶修饰脂质体。
3）形态学分析：利用磷钨酸负染法，取适量双靶修饰的脂质体滴于铜网上，静置2-3min，用滤纸吸走多余液体，滴一滴1%磷钨酸染液于铜网上，静置1-2min，吸走多余液体，37℃烘干，用透射电子显微镜观察，结果如图1。结果显示：双靶修饰的脂质体分散良好，外观呈规则球形，大小均匀。
4）稳定性分析：将脂质体储存于4℃持续半个月的时间，每两天进行一次粒径及Zeta电位测定，分析其稳定性，结果见图2.1和图2.2。图2.1 为半个月内粒径变化曲线图，横坐标为时间，纵坐标为粒径大小，曲线a为GA/PNA-Lip粒径变化曲线，曲线b为Lip粒径变化曲线，从图中可见，曲线在小范围内波动，粒径没有明显变化。
图2.2为半个月内Zeta电位变化曲线图，横坐标为时间，纵坐标为Zeta电位大小，曲线c为Lip Zeta电位变化曲线，曲线d为GA/PNA-Lip Zeta电位变化曲线，从图中可见，曲线在小范围内波动，Zeta电位没有明显变化。结果显示：脂质体储存于4℃粒径及Zeta电位在一定范围内波动，脂质体稳定性良好。
二）体外释药实验
取2mL载药脂质体置于透析袋中，将透析袋放入装有50mL PBS的锥形瓶中，将锥形瓶放入摇床，恒温37℃，每分钟100转。每隔一定时间取出3mL PBS，并补充3mL新鲜PBS，用紫外分光光度计于478nm处测吸光值，带入阿霉素标曲中算得累积释药率，结果如图3。图3为体外累积释药曲线。其中一条曲线为DOX-GA/PNA-Lip累积释药曲线，另一条曲线为DOX-Lip累积释药曲线，横坐标为时间，纵坐标为累积释药百分比，由图可知在前6h表现为大量、迅速释放药物，6h后药物释放速度降低，并持续释药。结果显示：药物释放呈缓释特点，在6h前为突释，6h后仍可持续释药。
三）脂质体体外靶向实验
肝癌细胞SMMC-772按2×105个/孔铺于6孔板中，用含10%FBS的1640培养基中培养过夜后，加入不同剂型脂质体，孵育3h后，用激光共聚焦显微镜观察细胞靶向情况，结果如图4。图4为细胞摄入实验，可以反应脂质体的细胞靶向能力。左图4.1为激光共聚焦显微镜拍摄细胞摄入图片，图4.2为图4.1的DOX组亮度的DOX，DOX-Lip，DOX-GA/PNA-Lip三张图片的量化，即中间一竖列三图片。
图4.1中：竖列DOX，DOX-Lip，DOX-GA/PNA-Lip为三种不同药物处理组；横排DAPI,DOX,Merge为图片显示颜色，附图中无法示意颜色，具体实验验中，DAPI为蓝色，DOX为红色，Merge为前两者合并色。DAPI为公认染细胞核的染料，细胞摄入的强弱根据红色的深浅判断，由图可知DOX，DOX-Lip两组红色深浅相近，DOX-GA/PNA-Lip红色最深，由此可知双靶修饰的脂质体靶向性明显高于脂质体和游离阿霉素。结果显示：双靶修饰的脂质体靶向性明显高于脂质体和游离阿霉素。
四）细胞毒性实验
肝癌细胞SMMC-772按6000个/孔铺于96孔板中，用含10%FBS的1640培养基中培养过夜后，加入不同剂型脂质体，孵育48h后，加入10μL MTT（5mg/mL），再孵育4h，倒掉培养基，加入150μL DMSO，用酶标仪于490nm处测得吸光值，分析细胞活力，相对细胞活力计算公式为：细胞活性（%）=（OD（实验组）-OD（空白组））/（OD（对照组）/OD（空白组）），结果如图5。图5为双靶修饰的载药脂质体的细胞毒性实验，反应DOX，DOX-Lip，DOX-GA/PNA-Lip三种制剂对细胞的杀伤作用。横坐标为三种制剂分组，纵坐标为IC50值，IC50值即使得细胞半数致死时的药物浓度，IC50值约大则药物对细胞杀伤作用越低，由图中可知，DOX-GA/PNA-Lip组IC50值最低，因此可说明双靶修饰的载药脂质体对细胞毒性明显高于载药脂质体组和游离阿霉素组。结果可知：双靶修饰的载药脂质体对细胞毒性明显高于载药脂质体组和游离阿霉素组，游离阿霉素组IC50为1065ng/mL，载药脂质体组IC50为432.1ng/mL，双靶修饰载药脂质体组IC50为218.2ng/mL。
综上所述，本发明不限于上述具体实施方式。本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案的前提下，可做若干更改或修饰，上述更改或修饰均落入本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种双靶修饰脂质体的制备方法，其特征是包括如下步骤：
步骤1）将靶分子分别连接到磷脂分子上，靶分子包括甘草次酸和花生凝集素，连接后分别得到DSPE-PEG2000-GA和DSPE-PEG2000-PNA；
步骤2）取步骤1）中得到的DSPE-PEG2000-GA和DSPE-PEG2000-PNA，与大豆磷脂、胆固醇溶于氯仿中，采用薄膜分散法制备空白脂质体；
步骤3）取步骤2）中得到的空白脂质体，采用硫酸铵梯度法制备载药脂质体。
2.如权利要求1所述的双靶修饰脂质体的制备方法，其特征是步骤1）中甘草次酸的连接具体包括如下流程：取0.1g 的DSPE-PEG2000-NH2溶于2mL氯仿中，加入0.11g的甘草次酸、0.11g的EDC和0.055gDMAP，室温搅拌反应24h，用纯水洗2-4次，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，减压浓缩溶液，转移至200mL无水乙醚中沉淀，过滤收集产物，将产物重复溶解沉淀2-4次，得到DSPE-PEG2000-GA。
3.如权利要求1所述的双靶修饰脂质体的制备方法，其特征是步骤1）中花生凝集素的连接具体包括如下流程：取0.05g花生凝集素溶于2mL PBS缓冲液中，PBS缓冲液pH值为7.4，在水浴加热条件下加入0.05g 的DSPE-PEG2000-NH2至溶解完全，室温搅拌8h，然后将反应液转移至8000-14000Da的透析袋中透析纯化48h，收集溶液冷冻干燥后，得到DSPE-PEG2000-PNA。
4.如权利要求1所述的双靶修饰脂质体的制备方法，其特征是步骤2）具体的包括：
步骤2.1）称取磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000-GA和DSPE-PEG2000-PNA溶于氯仿中,质量比为磷脂：胆固醇：DSPE-PEG2000-GA：DSPE-PEG2000-PNA=16：4：1：1，脂质浓度为30mg/mL，水浴超声促溶；
步骤2.2）将步骤2.1）得到的脂质溶液转移至100mL的茄形瓶中旋蒸，去除氯仿并形成脂质薄膜；旋蒸条件为压力0.04MPa、温度35℃、转速30rpm。
5.如权利要求1所述的双靶修饰脂质体的制备方法，其特征是步骤3）具体的包括：
步骤3.1）将脂质薄膜加入4mL硫酸铵溶液进行水化，硫酸铵溶液浓度为70mg/mL，水化条件为温度50℃、转速40rpm、时间1h；
步骤3.2）将步骤3.1）得到的脂质体溶液经超声处理，超声功率5%、超声时间10min、超声2s停3s；
步骤3.3）将步骤3.2）得到的脂质体溶液依次过0.45μm滤膜三次、0.22μm的滤膜三次，然后置于8000-14000Da的透析袋中透析5h，得到空白脂质体；
步骤3.4）将步骤3.3）中所得空白脂质体，加入药溶液，药脂比为1：10，共同孵育，并置于8000-14000Da的透析袋中透析15h后即得到载药脂质体，孵育条件为转速40rpm、温度50℃、时间20min。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN115054700A (zh) * 2022-04-29 2022-09-16 潍坊医学院 一种共载盐酸伊立替康和卡培他滨的靶向脂质体及其制备方法和应用
CN115813859A (zh) * 2022-12-13 2023-03-21 五邑大学 一种甘草次酸配体脂质体及其制备方法和应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113546183A (zh) * 2021-07-30 2021-10-26 潍坊医学院附属医院 双靶点纳米靶向肝癌超声造影剂的制备方法
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CN114259573B (zh) * 2022-01-06 2023-06-20 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种含有胆碱酯酶重活化剂的脑靶向脂质体及其制备方法和用途
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CN115813859A (zh) * 2022-12-13 2023-03-21 五邑大学 一种甘草次酸配体脂质体及其制备方法和应用
CN115813859B (zh) * 2022-12-13 2024-05-17 五邑大学 一种甘草次酸配体脂质体及其制备方法和应用

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