CN115813859B

CN115813859B - 一种甘草次酸配体脂质体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115813859B
Application number: CN202211593284.0A
Authority: CN
Inventors: 陈静; 林园; 张溢民; 曾牡玲; 岑凯杰; 廖雅芝; 刘付锦; 李创南; 赵琦; 李英惠; 陈永豪
Original assignee: Wuyi University
Current assignee: Wuyi University
Priority date: 2022-12-13
Filing date: 2022-12-13
Publication date: 2024-05-17
Anticipated expiration: 2042-12-13
Also published as: CN115813859A

Abstract

本发明公开了一种甘草次酸配体脂质体及其制备方法和应用，所述甘草次酸配体脂质体的制备原料包括：膜材和甘草次酸‑1,12‑二氨基十二烷‑胆固醇琥珀酸单酯。脂质体的制备方法包括：在反应体系中，将所述甘草次酸‑1,12‑二氨基十二烷‑胆固醇琥珀酸单酯、所述磷脂和所述胆固醇混合反应后水化、均质化。本发明的甘草次酸配体脂质体具有较好的理化性质，制剂质量良好，在肝癌细胞具有较好的靶向性。

Description

一种甘草次酸配体脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机化学的技术领域，具体涉及一种甘草次酸配体脂质体及其制备方法和应用。

背景技术

原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)简称肝癌，致死率高居癌症死亡率前列，是严重威胁人类生命健康的重大疾病。肝癌以起病隐匿、高转移率和高复发率和高度异质性为特点，早期易转移与治疗后易复发成为引起患者死亡的最主要原因。肝实质细胞膜上存在丰富的甘草次酸受体，甘草次酸受体可以特异性识别甘草次酸及其衍生物，是实现对肝炎、肝癌疾病的靶向治疗的有效靶点。目前制备甘草次酸配体脂质体的主要方式是将甘草次酸直接链接在脂质体的磷脂双分子层内，这种链接方式不稳定，容易降低载药脂质体的包封率，此外甘草次酸基团容易从脂质体表面脱落而影响靶向效率。

因此，开发出一种能更好实现靶向的性脂质体材料是当务之急。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种甘草次酸配体脂质体及其制备方法和应用，本发明的甘草次酸配体脂质体在肝癌细胞具有较好的靶向性。

本发明的第二方面提出了一种所述的脂质体的制备方法。

本发明的第三方面提出了一种所述的脂质体在抗肝癌中药物中的应用。

根据本发明的第一方面实施例的一种甘草次酸配体脂质体，所述甘草次酸配体脂质体的制备原料包括：膜材和如式(Ⅰ)所示的甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯；

所述膜材包括磷脂和胆固醇；

根据本发明的第一方面的实施例至少具有以下有益效果：

现有的甘草次酸配体脂质体的主要方式是将甘草次酸直接链接在脂质体的磷脂双分子层内，这种链接方式不稳定，容易降低载药脂质体的包封率，此外甘草次酸基团容易从脂质体表面脱落而影响靶向效率。为了解决改缺陷，本发明的甘草次酸配体脂质体材料的甘草次酸镶嵌于脂质体的表面，被甘草次酸受体识别和结合，甘草次酸配体脂质体材料的亲脂性基团胆固醇作为脂质体的膜稳定剂，能提高甘草次酸与脂质体结合的稳定性。并通过肝癌细胞的摄取试验验证此甘草次酸配体脂质体材料在脂质体中能更好实现靶向性。

根据本发明的一些实施例，所述磷脂包括蛋黄卵磷脂。

根据本发明的一些实施例，所述胆固醇包括氢化胆固醇。

根据本发明的一些实施例，所述胆固醇和磷脂的质量比为1：8～12。

根据本发明的一些优选地实施例，所述胆固醇和磷脂的质量比为1：8。

根据本发明的一些更优选地实施例，所述胆固醇和磷脂的质量比为1：9。

根据本发明的一些优选地实施例，所述胆固醇和磷脂的质量比为1：10。

根据本发明的一些优选地实施例，所述胆固醇和磷脂的质量比为1：11。

根据本发明的一些优选地实施例，所述胆固醇和磷脂的质量比为1：12。

随着胆固醇的量增加，脂质体包封率先上升后下降，当磷脂与胆固醇的比例为9:1时的包封率具有最大值。

根据本发明的一些实施例，所述磷脂和所述甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯的质量比为1：0.02。

根据本发明的一些实施例，所述磷脂和所述甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯的质量比为1：0.04。

根据本发明的一些实施例，所述磷脂和所述甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯的质量比为1：0.06。

根据本发明的一些实施例，所述磷脂和所述甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯的质量比为1：0.08。

根据本发明的一些实施例，所述磷脂和所述甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯的质量比为1：0.1。

随着甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯含量的增加，包封率呈现先上升后下降的趋势，当配体占磷脂的8％时，包封率达到最大值。

根据本发明的第二方面实施例的一种所述的脂质体的制备方法包括：

在反应体系中，将所述甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯、所述磷脂和所述胆固醇混合反应后水化、均质化。

根据本发明的一些实施例，所述反应体系中还包括：溶剂1。

根据本发明的一些实施例，所述溶剂1包括三氯甲烷。

根据本发明的一些优选地实施例，所述的脂质体的制备方法包括：

在反应体系中，将所述甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯、所述磷脂、所述胆固醇、所述溶剂1混合反应后，脱溶后形成薄膜。水化、均质化、过滤得甘草次酸配体脂质体。

根据本发明的一些实施例，所述水化的步骤为将所述薄膜加入pH 7.4～8的PBS缓冲液在40～45℃下孵育。

根据本发明的一些实施例，所述水化的时间为20～40min。

根据本发明的一些优选地实施例，所述水化的时间为20min。

根据本发明的一些优选地实施例，所述水化的时间为25min。

根据本发明的一些更优选地实施例，所述水化的时间为30min。

根据本发明的一些优选地实施例，所述水化的时间为35min。

根据本发明的一些优选地实施例，所述水化的时间为40min。

随着水化时间的增加，包封率呈现先上升后下降的趋势，当水化时间为30min时，包封率达到最大值，且粒径合适。

根据本发明的一些实施例，所述均质化的时间为4～12min。

根据本发明的一些优选地实施例，所述均质化的时间为4min。

根据本发明的一些优选地实施例，所述均质化的时间为6min。

根据本发明的一些优选地实施例，所述均质化的时间为8min。

根据本发明的一些更优选地实施例，所述均质化的时间为10min。

根据本发明的一些优选地实施例，所述均质化的时间为12min。

结果表明，随着均质时间的增加，包封率呈现先上升后下降的趋势，当均质时间为10min时，包封率达到最大值，且粒径合适。

根据本发明的一些实施例，所述甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯的制备方法包括：

S1：将甘草次酸、1,12-二氨基十二烷、酸胺缩合试剂、缚酸剂1和溶剂2混合反应得到化合物(II)；

S2：使化合物(II)和化合物(III)反应，得到式(I)所示的甘草次酸-十

二烷-胆固醇化合物；

根据本发明的一些实施例，步骤S1中，所述甘草次酸和所述1,12-二氨基十二烷的摩尔比为1：0.8～1.25。

本发明利采用酸胺缩合和酰氯法来合成靶向脂质体医药纳米材料甘草次酸-十二烷-胆固醇(GA-DE-CL)，将甘草次酸(GA)通过以1，12-十二烷二胺(DE)作为脂肪碳链，然后与含有脂质体的膜材胆固醇的胆固醇琥珀酸单酯(CL)来共价结合，使得合成的GA-DE-CL具有类似脂质体的亲水亲脂的性质。本发明的合成方法简单，反应条件温和。

根据本发明的一些实施例，步骤S1中，按摩尔比计，所述缚酸剂1和所述甘草次酸为1：1.6～2.5。

根据本发明的一些实施例，步骤S1中，所述酸胺缩合试剂包括2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。

根据本发明的一些实施例，步骤S1中，所述缚酸剂1包括N,N-二异丙基乙胺。

根据本发明的一些实施例，步骤S1中，所述溶剂2包括N,N-二甲基甲酰胺。

根据本发明的一些实施例，步骤S1中，所述反应在无氧条件下进行。

根据本发明的一些优选地实施例，步骤S1中，包括将甘草次酸、酸胺缩合试剂、缚酸剂和溶剂2混合后加入1,12-二氨基十二烷反应。

根据本发明的一些优选地实施例，步骤S1中，所述甘草次酸、酸胺缩合试剂、缚酸剂和溶剂2混合的温度为0～5℃。

根据本发明的一些优选地实施例，步骤S1中，所述甘草次酸、酸胺缩合试剂、缚酸剂和溶剂2混合的时间为25-30min。

根据本发明的一些优选地实施例，步骤S1中，所述甘草次酸、酸胺缩合试剂、缚酸剂和溶剂2混合的方法包括磁力搅拌。

根据本发明的一些优选地实施例，步骤S1中，按重量比计，所述溶剂2和所述甘草次酸为1:6～9。

上述条件下甘草次酸、酸胺缩合试剂、缚酸剂和溶剂溶液混合后呈现无色。

根据本发明的一些优选地实施例，步骤S1中，所述将甘草次酸、酸胺缩合试剂、缚酸剂和溶剂2混合后加入1,12-二氨基十二烷反应中，所述反应的时间为4～5h。

根据本发明的一些优选地实施例，步骤S1中，还包括薄层色谱法(TLC)鉴别反应是否反应完全。

根据本发明的一些优选地实施例，所述TLC的展开体系为石油醚：乙酸乙酯＝1:2。

根据本发明的一些优选地实施例，步骤S1中，包括以下步骤：

S1.1：称量4-5mmol甘草次酸(GA)粉末，4-5mmol 2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)颗粒于反应釜中，加入磁石，在冰浴条件下，无氧环境中，依次加入15-18mLDMF，8-10mmol N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，搅拌25-30min，溶液呈现无色，在常温条件下，加入936.55mg1,12-二氨基十二烷(DE)原料溶解，溶液呈黄色，常温反应4～5h，用薄层色谱法进行鉴别反应是否反应完全；

S1.2：待TLC确定体系反应完全后，在室温条件加入水进行淬灭，将反应结束；

S1.3：将乙酸乙酯和水加入淬灭后的反应原液进行萃取6～8次，收集有机相层；

S1.4：向有机相层中加入无水硫酸镁，将水分除去后过滤，收集滤液；

S1.5：将滤液在旋转蒸发仪中浓缩后用柱层析法进行纯化，流动相为TLC所确定的展开体系，显色剂为对茴香醛，最后经波长为254nm的紫外灯和TLC板确认，得到化合物(II)(GA-DE)；

S1.6：将步骤S1.5纯化后收集到的溶液进行浓缩，获得纯净的化合物(II)。

步骤S1.3中的除水的过程中，当所加入的硫酸镁呈现流沙状，证明水分已除去。

根据本发明的一些实施例，步骤S2中，按摩尔比计，所述化合物(II)和化合物(III)为1：1～1.7。

根据本发明的一些实施例，步骤S2中，所述反应体系中还包括溶剂3，所述溶剂3包括二氯甲烷。

根据本发明的一些实施例，步骤S2中，所述反应体系中还包括缚酸剂2，所述缚酸剂2包括无水三乙胺。

根据本发明的一些实施例，步骤S2中，所述反应的时间为12～13h。

根据本发明的一些优选地实施方式中，步骤S2中，包括以下步骤：

S2.1:称量0.07-0.1mmolGA-DE于反应釜中加入磁石，在冰浴条件下，无水环境中，依次加入2.5mL二氯甲烷(DCM)，20-30μL无水三乙胺，并在冰浴条件下缓慢滴加化合物(III)胆固醇琥珀酸单酯酰氯浓缩液，搅拌5min，溶液呈现淡黄色，常温条件下反应12～13h后用薄层色谱法(TLC)进行鉴别反应是否反应完全；

S2.2:确定体系完全反应完后进行浓缩；

S2.3:用反向碳十八填料的柱层析法对浓缩后的产物进行纯化，流动相为甲醇，TLC鉴别体系为步骤S2.1所用的展开剂，显色剂为对茴香醛显色剂，最后经波长为254nm的紫外灯和TLC板确认得到甘草次酸-十二烷-胆固醇化合物(GA-DE-CL)；

S2.4:将步骤S2.3纯化后收集到的溶液进行浓缩，获得纯净的GA-DE-CL化合物。

根据本发明的一些实施例，所述化合物(III)的合成方法包括以下步骤：

在反应体系中，胆固醇琥珀酸单酯和二氯亚砜混合反应得到化合物(III)。

根据本发明的一些实施例，所述化合物(III)的合成方法中，所述反应体系中还包括溶剂。

根据本发明的一些实施例，所述化合物(III)的合成方法中，所述溶剂包括二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述化合物(III)的合成方法中，所述反应在无水条件下进行。

根据本发明的一些实施例，步骤S1中，按摩尔比计，所述胆固醇琥珀酸单酯和所述二氯亚砜为1：1.08～1.5。

根据本发明的一些优选地实施例，化合物(III)的合成方法包括以下步骤：

A1：称量0.10-0.12mmolCL粉末于反应釜中，冰浴条件下，无水环境中，依次加入2-3mLDCM溶剂，1-2mL DMF溶剂，搅拌5min，溶液呈现无色后加入0.13-0.15mmol二氯亚砜，常温条件反应4～5h，除去体系中剩下的二氯亚砜，得到黄色的化合物(III)胆固醇琥珀酸单酯酰氯浓缩液。

根据本发明的第三方面实施例的一种脂质体在抗肝癌中药物中的应用。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为磷脂与胆固醇质量比对包封率和粒径考察；

图2为配体比例对包封率和粒径的考察；

图3为超声时间对包封率和粒径的考察；

图4为水化时间对包封率何粒径的考察；

图5为甘草次酸配体脂质体透射电镜图；

图6为HepG2细胞对香豆素6荧光标记脂质体的摄取结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。本发明的原料均为市售购买。

实施例1

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法为以下步骤：

采用薄膜分散法制备甘草次酸配体脂质体(GDC-Lips)。以蛋黄卵磷脂和氢化胆固醇为膜材，其中磷脂与胆固醇的比例为9:1，甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯(GDC)占磷脂的8％，溶解于5mL的三氯甲烷中，转移至250mL单颈圆底烧瓶中，旋转蒸发器在40℃减压旋蒸除去三氯甲烷30min后形成均匀薄膜。随后加入pH 7.4的PBS缓冲液在40℃下孵育30min，高速分散机10000rpm下均质10min，0.22μm滤膜过滤3次，得甘草次酸配体脂质体。

甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯(GDC)的合成方法，为以下步骤：

合成GA-DE：

(1)取称量纸于电子天平上，然后进行去皮调零，使用药勺分别精密称量GA粉末(2g,4.25mmol,1.0eq)，HATU颗粒(1.616g,4.25mmol,1.0eq)于100mL圆底烧瓶中；在称好GA，HATU颗粒的圆底烧瓶加入磁石，然后用烧瓶夹夹紧，在冰浴条件下，依次加入DMF溶剂(15mL)，DIPEA溶剂(1.48mL,8.50mmol,2.0eq)，并在冰浴条件下使其充分搅拌25min，溶液呈现无色；待搅拌25min后，在常温条件下，加入DE原料(936.55mg,4.67mmol,1.1eq)，加入后，其慢慢溶解，溶液呈黄色；整个反应需要无氧环境，因此，使用三通阀并绑上气球，进行换气，往圆底烧瓶里连续充填3次氮气，确保空气被完全置换掉，然后封好；

反应在常温条件下进行，反应时间为4小时，待反应4小时后，用薄层色谱板进行鉴别反应是否反应完全；展开体系为：石油醚：乙酸乙酯＝1:2；

(2)待TLC确定体系反应完全后，然后室温条件在体系中加入1mL水进行淬灭，将反应结束；

(3)为了除去溶剂DMF，使用萃取的方式，有机相为乙酸乙酯，自来水为无机相，取一个250mL的分液漏斗，往里面加入100mL的乙酸乙酯，后倒入反应原液，并用少量乙酸乙酯洗净圆底烧瓶加入到漏斗中，用乙酸乙酯和水进行萃取，萃取6次，用锥形瓶收集有机相层；若在此过程中发生乳化，可以使用饱和食盐水进行破乳；

(4)往收集好有机相层的锥形瓶中加入无水硫酸镁，将水分除去，直到所加入的硫酸镁呈现流沙状，证明水分已除去，然后用漏斗将硫酸镁固体过滤掉；

(5)把滤液倒入蒸馏烧瓶中，使用旋转蒸发仪进行浓缩，得到比较干燥的固体；

(6)为了得到纯净的目标产物，用柱层析法进行纯化，流动相为TLC所确定的展开体系，显色剂为对茴香醛显色剂，最后经波长为254nm的紫外灯和TLC板确认，得到GA-DE目标产物；

(7)将纯化后收集到的溶液汇集到烧瓶中，进行浓缩，获得纯净的产物(1.515g)。

GA-DE的碳谱¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ:200.19,175.58,169.41,128.45,78.73,61.82,54.94,48.17,45.37,43.56,43.24,41.80,39.52,39.15,37.50,37.07,32.76,31.91,31.52,29.76,29.67,29.41,29.19,28.53,28.12,27.28,26.9,26.47,26.41,23.37,18.68,17.49,16.3；

GA-DE的氢谱¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ:5.74(1H,t,J＝5.7Hz),5.64(1H,

s),4.11(1H,q,J＝7.1Hz),3.24(2H,ddt,J＝27.3,10.6,6.1Hz),2.77(1H,d,J＝13.5Hz),2.32(1H,s),1.93(1H,dd,J＝12.8,2.9Hz)；

合成GA-DE-CL：

(1)取称量纸于电子天平上，然后进行去皮调零，使用药勺精密称量CL粉末(50mg,0.1027mmol,1.0eq)于50mL圆底烧瓶中；

(2)在称好DE的圆底烧瓶加入磁石，然后用烧瓶夹夹紧，在冰浴条件下，依次加入DCM溶剂(2.5mL)，DMF溶剂(1mL)，并在冰浴条件下使其充分搅拌5min，溶液呈现无色；

(3)待搅拌5min后，在冰浴条件下，加入二氯亚砜(0.13-0.15mmol)加入后，溶液呈淡黄色，搅拌5min，此时反应需要无水环境，因此，需要使用封口膜将圆底烧瓶瓶口封好，以免周围环境中的水分进入反应体系中破坏反应，反应在常温条件下进行，反应时间为4小时，待反应4小时后，用旋转蒸发器除去体系中剩下的二氯亚砜溶剂，得到黄色浓缩液，在此过程中需要在旋转收集球中加入体积为五分之一的饱和碳酸氢钠溶液；

(4)另取一个50ml圆底烧瓶，精密称量GA-DE(50mg,0.07662mmol,1eq)在称好GA-DE的圆底烧瓶加入磁石，然后用烧瓶夹夹紧，在冰浴条件下，依次加入DCM(2.5mL)，无水三乙胺(20μL,1.5eq)，并在冰浴条件下缓慢滴加胆固醇琥珀酸单酯酰氯浓缩液，使其充分搅拌5min，溶液呈现淡黄色；同样，此反应也需要无水环境，用封口膜将烧瓶瓶口封好，常温条件下反应12h；待反应12h，用薄层色谱板进行鉴别反应是否反应完全；展开体系为：环己烷：乙酸乙酯＝9:1；确定体系完全反应完后，用旋转蒸发器进行浓缩；

(5)用反向碳十八填料的柱层析法进行纯化，流动相为甲醇，TLC鉴别体系为步骤4所用的展开剂，显色剂为对茴香醛显色剂，最后经波长为254nm的紫外灯和TLC板确认，得到纯化的GA-DE-CL产物；

(6)将纯化后收集到的目标产物汇集到容器中，用旋转蒸发仪进行浓缩，获得纯净的GA-DE-CL化合物(20mg)。

GA-DE-CL的碳谱¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ173.11,173.02,154.05,130.03,122.73,74.63,64.35,56.71,56.13,50.04,42.31,39.72,39.52,38.06,36.96,36.60,36.18,35.79,33.38,32.51,31.91,31.84,30.75,30.70,30.66,29.87,29.71,29.68,29.54,29.33,28.23,27.70,27.23,27.18,26.18,25.50,25.37,24.68,24.45,24.28,23.82,22.83,22.70,22.57,21.03,19.30,19.14,18.72,11.86；

GA-DE-CL的氢谱¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ7.17(1H,s),5.34(1H,dd,J＝

11.0,5.3Hz),4.59(1H,ddq,J＝13.2,9.6,4.3Hz,),3.73–3.62(1H,m),2.75–2.60(4H,m,H67)；

甘草次酸配体脂质体透射电镜图如图5所示。

实施例2

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于磷脂与胆固醇的质量比为8:1，其余条件相同。

实施例3

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于磷脂与胆固醇的质量比为10:1，其余条件相同。

实施例4

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于磷脂与胆固醇的质量比为11:1，其余条件相同。

实施例5

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于磷脂与胆固醇的质量比为12:1，其余条件相同。

磷脂与胆固醇质量比对包封率和粒径考察如图1所示。

实施例6

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯(GDC)占磷脂的2％，其余条件相同。

实施例7

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯(GDC)占磷脂的4％，其余条件相同。

实施例8

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯(GDC)占磷脂的6％，其余条件相同。

实施例9

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯(GDC)占磷脂的10％，其余条件相同。

配体比例对包封率和粒径的考察如图2所示。

实施例10

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于均质4min，其余条件相同。

实施例11

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于均质6min，其余条件相同。

实施例12

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于均质8min，其余条件相同。

实施例13

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于均质12min，其余条件相同。

超声时间对包封率和粒径的考察如图3所示。

实施例14

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于水化时间20min，其余条件相同。

实施例15

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于水化时间25min，其余条件相同。

实施例16

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于水化时间35min，其余条件相同。

水化时间对包封率何粒径的考察如图4所示。

实施例17

一种甘草次酸配体脂质体的制备方法，本实施例和实施例1的区别在于水化40min，其余条件相同。

测试例1

采用磷钨酸染色法在透射电镜下观察实施例1中的甘草次酸配体脂质体的形态。将过柱好的甘草次酸配体脂质体滴加到铜网上，自然晾干后用1.5％磷钨酸水溶液染色，待其自然干燥后于透射电镜下观察脂质体的形态并拍照。

精密量取三组，0.1mL实施例1中的脂质体，稀释至1mL，室温下利用纳米粒度与Zeta电位仪测定脂质体混悬液的粒径与PDI分布情况，同时测定Zeta电位。结果如表1所示。

移取1mL实施例1中的甘草次酸配体脂质体混悬液上样，采用葡聚糖凝胶柱G-50(20.0cm×1.0cm)，用PBS缓冲液(pH值为7.4)洗脱，流速为0.5mL/min，1mL/管，收集含包载甘草次酸配体脂质体组分10mL，从组分中取0.2mL加甲醇溶液破乳并定容至1mL，利用液相色谱法测定包载甘草次酸配体含量(Ce)，另精密移取甘草次酸配体脂质体总混悬液0.05mL，通过甲醇溶液破乳并定容至1mL，测定脂质体的总DOC含量(Ct)，计算包封率。结果如表2所示。

表1粒径、PDI及Zeta电位

批号	粒径	PDI	Zeta电位
				实施例1	122.87±5.39	0.22±0.04	-32.50±1.81
实施例1	133.30±3.39	0.18±0.05	-28.95±1.63
				实施例1	124.97±2.87	0.24±0.05	-16.53±1.12

表2包封率及载药量的测定结果

测试例4

将处于对数生长期的HepG2细胞消化，计数并稀释成5×10⁵个/mL，接种于12孔板，每孔1mL，摇晃12孔板使细胞分散均匀，并转移至培养箱中避光培养24h(37℃，5％ CO₂)，待细胞贴壁以后，吸弃原培养基，PBS洗3次，加入以DMEM Basic培养基稀释的香豆素6荧光剂标记实施例中甘草次酸配体脂质体(GDC-Cou6-Lps)、香豆素6荧光剂(Cou6-Lps)，其中，香豆素6的浓度为0.02、0.05、0.1μg/mL，转移至培养箱中避光培养4h(37℃，5％ CO₂)。培养结束后，吸弃培养基，冷PBS洗3次，每孔0.5mL 4％多聚甲醛室温固定20min，吸弃多聚甲醛，冷PBS洗3次，每孔加入200μL DAPI染料室温染色20min，弃去DAPI溶液并用PBS洗3次，最后一次清洗结束后，12孔板内留下少量PBS，使用倒置荧光显微镜观察并拍照靶向摄取效率。

在荧光倒置显微镜的观察下，明场显示HepG2细胞的形态和分布，用DAPI染色液浸染后，细胞核在显微镜下呈现蓝色荧光，香豆素6荧光标记物被HepG2细胞摄取后，可呈现绿色荧光，并且可以看到在不同浓度下，甘草次酸配体脂质体都有很好的肝靶向性(结果如图6所示)。

在荧光倒置显微镜的观察下，发现香豆素6标记的空白脂质体有微弱的绿色荧光(图6-A3和C3)，当甘草次酸配体脂质体有非常明显的荧光，说明甘草次酸配体脂质体具有很好的肝靶向性。(A:0.1μg/mL香豆素6荧光标记脂质体；B:0.1μg/mL香豆素6荧光标记甘草次酸配体脂质体；C:0.2μg/mL香豆素6荧光标记脂质体；D:0.2μg/mL香豆素6荧光标记甘草次酸配体脂质体；1:明场；2:DAPI染细胞核显蓝色荧光；3:细胞摄取香豆素6后显绿色荧光)。

Claims

1.一种甘草次酸配体脂质体，其特征在于，所述甘草次酸配体脂质体的制备原料包括：膜材和如式(Ⅰ)所示的甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯；

所述膜材包括磷脂和胆固醇；

式（I）。

2.根据权利要求1所述的甘草次酸配体脂质体，其特征在于，所述磷脂包括蛋黄卵磷脂；所述胆固醇包括氢化胆固醇。

3.根据权利要求1所述的甘草次酸配体脂质体，其特征在于，所述胆固醇和磷脂的质量比为1：8~12。

4.根据权利要求1所述的甘草次酸配体脂质体，其特征在于，所述磷脂和所述甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯的质量比为1：0.02~0.1。

5.一种如权利要求1~4任一项所述的脂质体的制备方法，其特征在于，包括：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述水化的时间为20~40min。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述均质化的时间为4~12min。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述甘草次酸-1,12-二氨基十二烷-胆固醇琥珀酸单酯的制备方法包括：

S1：将甘草次酸、1,12-二氨基十二烷、酸胺缩合试剂、缚酸剂N,N-二异丙基乙胺和溶剂N,N-二甲基甲酰胺混合反应得到化合物（II）；

S2：使化合物（II）和化合物（III）反应，得到式（I）所示的甘草次酸-十二烷-胆固醇化合物；

。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述甘草次酸和所述1,12-二氨基十二烷的摩尔比为1：0.8~1.25。

10.一种如权利要求1所述的脂质体在制备抗肝癌药物中的应用。