CN105085437B - 3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸的两亲性衍生物及其用途 - Google Patents

3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸的两亲性衍生物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种3‑(1‑叔丁氧羰酰哌嗪‑4‑yl)丙酸的两亲性衍生物及其用途；本发明还涉及由所述的两亲性衍生物物制备的脂质体；所述用途为脂质体作为药物载体输送系统的用途。本发明的两亲性衍生物物制备而成的脂质体，与基因药物siRNA复合后，能形成粒径较小，分布均匀的复合物。同时在pH7.4环境下呈电中性，增加了脂质复合物的体内稳定性，减小因过多正电荷引起的细胞毒性。本发明提供的脂质体，可体外特异性抑制人非小细胞肺癌H1299‑Pgl3细胞的基因表达，并且可以体内特异性转载荧光基因药物进入正常小鼠肝脏细胞。

Description

3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸的两亲性衍生物及其用途
技术领域
本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及一种3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸的两亲性衍生物及其用途。
背景技术
基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。在过去的二十多年间，基因治疗在很多疾病治疗领域将研究从临床前推向了临床，对于由基因异常引起的，医药界至今难以解决的疾病如肿瘤等具有无可替代的优势。常见的基因药物有质粒DNA(plasmid DNA，pDNA)、反义寡核苷酸(antisense ODN)、小干扰RNA(siRNA)和小发卡RNA(shRNA)。具有RNAi干扰效应，能特异性沉默目的基因的siRNA是目前基因治疗研究的重点。
siRNA(Small interfering RNA)，又称为小干扰RNA，是长度20到25个核苷酸的双链RNA。通过与之序列互补的mRNA相结合，促使mRNA降解，介导转录水平的基因表达抑制，从而诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。siRNA的调控机制是通过互补配对来对相应靶位基因的表达进行沉默，因此具有高度的特异性。所以将其作为治疗药物，具有广阔的发展前景，对于恶性肿瘤、HIV等一系列病症的治疗具有重大意义。
基因治疗的关键是将基因药物体内输送到靶细胞，使其发挥作用。然而，将外源基因引入体内，其会被体内的核酸酶降解，在未进入靶细胞之前，便被降解成小分子核苷酸，从而失去治疗作用。因此，实现基因治疗的关键是高效、安全的基因递送系统。
基因载体在运送基因的时候要经历多个复杂的过程：通过血液循环到达靶细胞，细胞摄取，内涵体的逃逸，胞内运动，载体释放基因物质。其主要障碍主要是复杂血液环境的细胞外障碍和溶酶体酶降解的细胞内障碍。因此寻找良好的基因载体，使得靶基因到达靶点发挥效用，是基因载体研究者亟待解决的问题。
目前，在基因输送载体系统方面主要分为两大类：一是病毒载体系统；二是非病毒载体系统。病毒载体是一种天然的载体资源，病毒基因组结构简单，转染效率高，靶细胞特异性强，但其导向性差、携带能力低、免疫原性和潜在致瘤性的局限性，使其难以达到临床应用的要求。因此多样性、无免疫原性及易于控制生产的非病毒载体系统近年 来备受关注，并在很多治疗领域有所应用。常用的非病毒载体系统主要是脂质(cationic lipids)载体。
阳离子脂质的正电荷通过静电作用与带负电的基因药物结合，从而将基因物质浓缩包装成较小粒径的粒子。复合物较小的粒径降低了被体内巨嗜细胞识别、吞噬、清除的机会，提高了药物的体内生物利用度。同时，针对于肿瘤组织，复合物较小粒径更容易利用渗透和滞留效应从血管内皮细胞间隙透过进入肿瘤实质，增加在肿瘤组织的药物聚集。在转染方面，由于细胞表面略微带有负电，带正电的脂质体更容易吸附到细胞表面，通过内吞等机制进入细胞，大大增加了脂质体的转染能力。
目前阳离子脂质作为基因载体因其结构简单、操作简便、生物安全性高等特点成为了目前应用最为广泛的非病毒载体，但大部分制备过程复杂，不易进行放大生产。因此本发明尝试利用3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸，以其为结构基础，将其两亲性衍生物作为基因药物的载体系统。此类衍生物合成步骤简单，原材料简单易得，同时，能较好递送基因药物，成功解决了上述问题，达到了较好的基因治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸(即：3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-基)丙酸)的两亲性衍生物及其用途；该两亲性衍生物是以3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸结构为基础的两亲性衍生化合物。本发明的两亲性衍生化合物制备而成的胶束及脂质体，与基因药物siRNA复合后，能形成粒径较小，分布均匀的复合物纳米粒子。复合物在pH7.4环境下不带电或带负电，降低了与体内血液环境中带负电蛋白吸附的机会，增加了脂质复合物的体内稳定性，减小因过多正电荷引起的细胞毒性。本发明提供的脂质体，可将荧光素酶siRNA体外高效递送到人非小细胞肺癌H1299-Pgl3细胞，特异性抑制基因表达。同时载体系统可以体内特异性转载荧光基因药物进入正常小鼠肝脏细胞。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸的两亲性衍生物，其结构式如式(Ⅰ)所示：
其中，n＝1、2、3或4，R1为长碳链烷基或烷烃基，R2为长碳链烷基或烷烃基。也可以表示为：R1为碳链或亚油酸链，R2为碳链或亚油酸链。其结构如具有以下特点：哌嗪基-(CH2)n-酯键-R1and R2
优选地，R1为含12～18个碳原子的长碳链烷基或烷烃基，R2为含12～18个碳原子的长碳链烷基或烷烃基。如：
更优选地，所述R1为第九个碳原子位置上为双键或第九、十二个碳原子位置上为双键的长碳链烷烃基。如：
更优选地，所述R2为第九个碳原子位置上为双键或第九、十二个碳原子位置上为双键的长碳链烷烃基。如：
优选地，所述R1、R2为相同的基团。
优选地，其结构式如式(Ⅱ)所示：
第二方面，本发明涉及一种制备上述的两亲性衍生物的方法，所述方法包括如下步骤：
A、在四氢呋喃催化剂、红铝溶液的甲苯溶液的存在的条件下，含碳原子12-18的直链脂肪酸在室温下发生还原反应得到含碳原子12-18的直链脂肪醇；
B、在三乙胺、4-二甲氨基吡啶、甲烷磺酸酐催化剂的作用下，含碳原子12-18的直链脂肪醇在0℃下发生磺酸酯化反应得到中间产物3；
C、在二甲基甲酰胺、溴化锂催化剂作用下，中间产物3在45℃下反应得到中间溴化物4；
D、在镁、无水乙醚、甲酸乙酯催化剂作用下，中间产物4在40℃下发生格式反应生成中间产物5；
E、在氢氧化钠、四氢呋喃作用下，中间产物5在65℃下发生水解反应生成中间产物6。
F、在N，N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐催化剂作用下，中间产物6在50℃下发生酯化反应产生中间产物8；
G、在二甲基甲酰胺、碘化钠、碳酸钾的催化剂作用下，中间产物8在80℃下与N-甲基哌嗪发生氨基化反应，即得所述两亲性衍生物。
上述含碳原子12-18的直链脂肪酸结构式为：其中m＝1-7中任一整数，且第6个碳原子处为单键或双键，第9个碳原子处为单键或双键。
第三方面，本发明涉及一种含有上述的两亲性衍生物的脂质体，所述脂质体由所述两亲性衍生物、胆碱、胆固醇组成；所述脂质体中胆碱的重量百分比含量为20％～50％，胆固醇的重量百分比含量为10％～30％。所述胆碱优选二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。
第四方面，本发明涉及一种上述的脂质体的制备方法，所述方法包括如下步骤：
A、将两亲性衍生物的乙醇溶液、胆碱乙醇溶液、胆固醇乙醇溶液混合，形成脂质乙醇混合液；
B、将所述脂质乙醇混合液加入到pH<5.0的HEPES缓冲液中，搅拌，制得脂质体混悬液；
C、将脂质体混悬液在pH<5.0的HEPES缓冲液透析，去除乙醇；即得所述脂质体。
步骤B中，脂质体混悬液中含30wt.％乙醇。步骤C中，透析是在4℃下透析4h。
第五方面，本发明涉及一种上述的脂质体在制备基因药物输送载体中的用途，所述脂质体包载DNA、RNA、透明质酸或多肽。所述基因药物为DNA、RNA、透明质酸或多肽。该脂质体具有帮助基因药物穿过细胞外障碍和细胞内障碍的能力。
第六方面，本发明涉及一种脂质/基因复合物，所述脂质/基因复合物是由上述的脂质体包载基因生物分子而组成的。其包封率在30％以上。该基因生物分子包括DNA、RNA、透明质酸或多肽。
第七方面，本发明涉及一种上述的脂质/基因复合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
A、将两亲性衍生物的乙醇溶液、胆碱乙醇溶液、胆固醇乙醇溶液混合，形成脂质乙醇混合液；
B、将所述脂质乙醇混合液加入到pH<5.0的HEPES缓冲液中，搅拌，制得脂质体混悬液；
C、在所述脂质体混悬液中加入基因生物分子的DEPC水溶液，37℃孵育1-2h；
D、在pH<5.0的HEPES缓冲液透析，去除乙醇；继续PBS溶液透析，调整体系pH至中性，即得所述脂质/基因复合物。
步骤B中，脂质体混悬液中含30wt.％乙醇。步骤D中，在HEPES缓冲液中透析是在4℃下透析4h；在PBS溶液中透析是在4℃下透析12h；其中PBS溶液的pH值为7.4。步骤D中，优选调整体系pH至7.4。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明基于3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸结构为基础，制备的两亲性衍生化合物，从而改善优化了传统基因递送系统合成步骤复杂，不易放大生产的问题；
(2)本发明的两亲性衍生物制备而成的脂质体，与基因药物siRNA复合后，能形成粒径较小，分布均匀的复合物。同时在pH7.4环境下不带电或带负电，增加了脂质复合物的体内稳定性，减小因过多正电荷引起的细胞毒性，其作为基因药物载体对siRNA实现安全、有效递送；
(3)本发明的两亲性衍生物制备而成的脂质体，可体外有效转载基因药物进入细胞，特异性沉默目的基因；
(4)本发明的两亲性衍生物制备而成的脂质体，在溶酶体pH4.0的酸性条件下，化合物电离带正电，从而可以与溶酶体膜中的磷脂阴离子作用，形成适应非双层结构的离子对，继而破坏内涵体膜，实现内涵体逃逸。同时，可体内有效转载基因药物经过血液循环及细胞内障碍，进入肝脏细胞。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸的两亲性衍生物MPZ的结构图；
图2为3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸两亲性衍生物MPZ的反应流程示意图；
图3为3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸两亲性衍生物MPZ的质谱图；
图4为3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸两亲性衍生物MPZ的核磁图；
图5为3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸的两亲性衍生物M1的结构图；
图6为3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸的两亲性衍生物M2的结构图；
图7为MPZ脂质/luciferase-siRNA复合物凝胶阻滞电泳考察包封率示意图；
图8为M1脂质/luciferase-siRNA复合物凝胶阻滞电泳考察包封率示意图；
图9为M2脂质/luciferase-siRNA复合物凝胶阻滞电泳考察包封率示意图；
图10为MPZ脂质/luciferase-siRNA复合物H1299细胞转染基因沉默结果示意图；
图11为MPZ脂质/luciferase-siRNA复合物H1299细胞转染BCA蛋白结果示意图；
图12为M1脂质/luciferase-siRNA复合物H1299细胞转染基因沉默示意图；
图13为M1脂质/luciferase-siRNA复合物H1299细胞转染BCA蛋白结果示意图；
图14为M2脂质/luciferase-siRNA复合物H1299细胞转染基因沉默示意图；
图15为M2脂质/luciferase-siRNA复合物H1299细胞转染BCA蛋白结果示意图；
图16为MPZ脂质/Cy-5-siRNA复合物在体内给药后的肝脏细胞分布示意图；
图17为M1脂质/Cy-5-siRNA复合物在体内给药后的肝脏细胞分布示意图；
图18为M2脂质/Cy-5-siRNA复合物在体内给药后的肝脏细胞分布示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按章制造厂商所建议的条件。
实施例1、3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸两亲性衍生物MPZ
图1为3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸两亲性衍生物MPZ结构图；其合成方法如图2所示，具体为：N-甲基哌嗪、亚油酸等作为原料，按照如下步骤得到MPZ脂质。图3为两亲性化合物MPZ进行核磁共振图谱结果，图4为其质谱图谱结果。
步骤一：
将30g亚油酸(反应物1)及THF(320ml)加入反应器中。将73ml的红铝溶液(60％wt/vol)的甲苯溶液缓慢滴加至反应器中，滴加过程中保持温度在0℃左右。滴加完毕后，室温反应2小时。溶液冷却至0℃，缓慢加入饱和硫酸钠溶液。滴加完毕后，30min内滴入130ml乙酸乙酯，并剧烈搅拌。反应液过滤，固体用乙酸乙酯冲洗，合并有机相，浓缩。产物溶解于80ml乙酸乙酯中，用水洗两次，并用无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩有机相除去溶剂，得到中间产物2(28.8g)。
步骤二：
500ml反应器中加入25g中间产物2及210ml二氯甲烷(DCM)，然后加入53ml三乙胺及1.15g DMAP(2.0mol)，溶液冷却至-10℃。32.7g甲烷磺酸酐溶于45ml DCM中，缓慢滴加至反应器中，并保持反应液温度在0℃以下。滴加完毕，继续保持0℃反应1小时。反应完毕后，80ml冰水加入反应液中，水相用DCM抽提。合并有机相，有机相用稀盐酸，水及饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩有机相除去有机溶剂，得到产品3(32.3g)。
步骤三：
玻璃反应器中110ml DMF及30g产品3，冷却至-10℃。11.5g LiBr溶于110ml DMF，搅拌并缓慢滴加至反应器中，并保持反应液温度在0℃以下。滴加完毕后，反应液升温至45℃，搅拌过夜。反应完毕后，加入300ml水，并用240ml正己烷抽提，水相继续用2*45ml正己烷抽提。合并有机相，用水及饱和盐水洗涤，硫酸钠(17g)干燥。过滤，浓缩有机相除去有机溶剂，得到粗品27.5g。用60-120目硅胶纯化(正己烷为流动相)，得到纯品4约23g。
步骤四：
三口烧瓶中加入2.21gMg及12ml无水乙醚。反应器中充入氩气。20g产物4溶解于40ml无水乙醚中。氩气保护下，8ml该溶液滴加至反应器中，并继续加入0.2ml二溴甲烷。反应液在水浴中升温至40℃。反应开始后，移去热源，将剩余32ml溶液滴加至反应器中，让混合物保持轻微回流状态。滴加完毕后，加热使其保持回流状态反应。反应完毕后，反应液用冰浴冷却至10℃以下，然后缓慢加入甲酸乙酯的乙醚溶液(2.2ml溶于32ml乙醚中)。滴加完毕后，室温反应过夜。然后加入56ml冰水及10％的硫酸溶液，分离有机相，水相用乙醚抽提。合并有机相，用盐水洗涤，硫酸钠干燥。过滤，浓缩有机相除去有机溶剂，得到粗品(醇及甲酸酯混合物)16g。粗品用100mlTHF溶解，加入NaOH溶液(7.5g溶于150ml水中)，加热至65℃反应18小时。反应完全后，反应物冷却至室温，并用乙醚抽提，合并有机相，用40ml盐水洗涤。硫酸钠干燥。过滤，浓缩有机相。粗品用60-120目硅胶纯化(4％乙醚/正己烷)，得到纯品DLM6a(11.6g)(产率40％)。
步骤五：
三口烧瓶加入DLM1.1g和10ml DCM。依次加入溴丙酸477mg，EDC.HCL747mg，DMAP38mg，DIPEA0.8ml。反应器在油浴中升温至50℃，搅拌反应18-20小时。反应完毕后，15ml水加入反应液中，溶液分层，水相用DCM抽提。合并有机相，有机相用盐水洗涤，硫酸钠干燥。过滤，浓缩有机相除去有机溶剂，得到粗产品1.5g。用60-120目硅胶纯化(正己烷为流动相)，得到纯品8约800mg(57.8％)。
步骤六：
三口烧瓶中加入8(800)mg，加入DMF40ml使其完全溶解，依次加入N-甲基哌嗪(1200mg)，NaI180mg，K2CO3350mg，反应器在油浴中升温至80℃，搅拌反应36小时。反应完毕后，加入水20ml，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥、过滤。浓缩有机相除去有机溶剂，得到粗产品1.1g。用60-120目硅胶纯化(1％甲醇/二氯甲烷为流动相)，得到纯品13(440mg)(54％)。
对两亲性化合物MPZ进行质谱图谱、核磁图谱分析，由图3、4可知，所得MPZ化合物纯度大于95％，其分子量与理论值相近，为分子量683g/mol。
脂质化合物DLin-MC2-MPZ13：
MS(ES+):C45H82N2O2,calculated683.6376,found683.6439；
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.36-5.39(8H)，4.9(1H)，2.74-2.79(4H)，2.5(2H)；2.33(3H)；2.05-2.07(8H)；1.5(8H)；1.28-1.37(42H)；0.89-0.92(6H)。
实施例2、3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸两亲性衍生物M1
图5为3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸两亲性衍生物M1的结构图；其制备具体为：选用N-甲基哌嗪、棕榈酸等作为原料，按照实施例1合成方法合成，所不同之处在于：步骤1中，反应物1为棕榈酸，其他合成步骤、合成原理及原料完全相同。得到M1脂质；均经过HPLC纯化和质谱鉴定，纯度大于95％，分子量与理论值相符。
实施例3、3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸两亲性衍生物M2
图6为3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸两亲性衍生物M2结构图；其制备具体为：选用N-甲基哌嗪、油酸等作为原料，按照实施例1合成方法合成，所不同之处在于：步骤1中，反应物1为油酸，其他合成步骤、合成原理及原料完全相同。得到M2脂质。均经过HPLC纯化和质谱鉴定，纯度大于95％，分子量与理论值相符。
实施例4、M1脂质体
本实施例利用两亲性衍生化合物M1与辅助脂质，按照不同比例制备了脂质体。
其制备方法包括如下步骤：
1.制备样品溶液
M1乙醇溶液、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)乙醇溶液、胆固醇(Cholesterol，CHOL)乙醇溶液配制：以电子天平称取一定量M1、DPPC或CHOL，加入无水乙醇使之成为10mg/ml,并以之作为贮备液；
4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液(HEPES buffer)的配制：以电子天平称取HEPES，加入去离子水,用盐酸溶液调pH,使之成为5mM pH4.0，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理，灭菌后，以之作为贮备液；
2.脂质体的制备：
1)取出M1化合物,胆固醇(CHOL)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)贮备液，室温下平衡半小时；
2)分别按表1所示的摩尔比，量取M1乙醇溶液、DPPC乙醇溶液、CHOL乙醇溶液至5ml离心管混合；
3)取5Mm pH4.0HEPES Buffer于5ml离心管中，30℃预热，5-10min；将vortex涡旋仪调至shake II档，在涡旋搅拌下，将脂质乙醇混合液缓慢加入5mM pH4.0HEPES buffer中，涡旋搅拌1～2min，制备含30％乙醇的脂质体混悬液；
4)将步骤3)得到的脂质体混悬液放在透析袋内，置于5mM pH4.0HEPES buffer中4℃下透析12h出去乙醇。
5)激光散射粒度分析仪(PCS)测定纳米粒子粒径分布、电动电势(zeta电位)，使用的仪器是英国马尔文公司的ZetaSizer3000H激光粒度仪，使用He-Ne离子激光(λ0＝633nm)为入射光，动力学光散射试验在25℃进行，反射角为1.33，角度为90°。连续检测三次的平均值作为得到的数据。
效果验证：
通过对不同脂质组分组成、不同脂质组分比例制备的M1脂质体的表征如表1所示；
表1
实施例5、M2脂质体
本实施例利用两亲性衍生化合物M2与辅助脂质，按照不同比例制备了脂质体。
其制备及表征方法如实施例3脂质体制备方法。
效果验证：
不同原料、不同比例制备的M2脂质体的表征如下表2所示：
表2
Lipid components zeta 粒径 PDI
M2/DPPC/Chol(40/20/40mol) 70.00±0.19 136.6±1.7 0.205±0.002
M2/DPPC/Chol(40/30/40mol) 74.00±0.31 161.7±1.0 0.143±0.011
实施例6、MPZ脂质体
本实施例利用两亲性衍生化合物MPZ与辅助脂质，按照不同比例制备了脂质体。
其制备及表征方法如实施例3脂质体制备方法。
效果验证：
不同原料、不同比例制备的MPZ脂质体的表征如下表3所示：
表3
Lipid components zeta 粒径 PDI
MPZ/DPPC/Chol(40/20/40mol) 70.31±0.22 154.8±3.0 0.131±0.035
MPZ/DPPC/Chol(40/30/40mol) 71.24±0.21 156.2±1.0 0.105±0.011
实施例7、MPZ脂质体/基因复合物
本实施例利用MPZ脂质制备的脂质体，按照不同比例N/P与siRNA制备了脂质/基因复合物，并对其进行表征。
其方法如下：
1.空白脂质体制备：制备方法及处方比例如实施例4脂质体制备方法；
2.脂质/基因复合物制备：
1)配制小干扰RNA(siRNA)溶液：将siRNA用DEPC水溶解，使之成为1mg/ml，并以之作为贮备液；
2)按不同siRNA/脂质总量(N/P)比，取适量siRNA溶液，将未透析的脂质体混悬液放置在vortex涡旋仪上，缓慢加入siRNA溶液，37℃孵育1-2h；
3)将制备好的复合物置于5mM pH4.0HEPES buffer中，4℃下透析4h，除去体系中的乙醇。然后取出，继续在0.01M pH7.4PBS溶液中，4℃下透析12h，将体系pH调为7.4，接近体液pH，即得脂质/基因复合物。透析结束收集于1.5ml离心管中，4℃保存备用；
3.脂质/基因复合物在不同pH环境下的带电情况及粒子均一度以及对siRNA的包封情况表征：
1)激光散射粒度分析仪(PCS)测定在0.01M pH7.4PBS中透析除去乙醇的脂质/基因复合物的粒径分布及粒子zeta电位，考察复合物在pH7.4中性条件下的带电情况及粒径分布；
2)激光散射粒度分析仪(PCS)测定在5mM pH4.0HEPES buffer中透析除去乙醇的脂质/基因复合物的粒径分布及粒子zeta电位，考察复合物在pH4.0条件下的带电情况及粒径分布；
3)用凝胶电泳仪，利用利用“分子筛”和“电泳”的双重作用，分离未稳定包裹的siRNA，从条带结果分析对siRNA包封情况。
效果验证：
(1)不同原料比例、不同N/P比制备的MPZ脂质体/基因复合物的表征如表4所示，由结果可以看出，MPZ两亲性化合物制备的脂质体包裹基因药物siRNA后，形成了粒径较小且分布均匀的复合纳米粒子。同时，复合物在近血液环境pH7.4的条件下为负电性，大大减小了阳离子脂质过剩的正电性引起的毒性。而包裹了siRNA的脂质/基因复合物在近核内体pH4.0的条件下带正电，说明其进入细胞内的核内体后可以因电荷反应与负电性的膜融合，逃逸出核内体，免受酶降解失活。同时，由图7的凝胶电泳阻滞结果来看，在100：1、50:1、20:1三个复合比下制备的复合物电泳条带几乎没有显示，而20:1组的复合物，脂质体被破膜后，观察有明显条带，因此说明MPZ脂质体对siRNA进行了完全包封，能保护其不受外界环境的破坏。因此，从以上两点可以看出，MPZ两亲性化合物制备的脂质体具有帮助基因药物穿过细胞外障碍和细胞内障碍的能力。
表4
实施例8、M1脂质体/基因复合物
本实施例利用M1两亲性化合物制备的脂质体，按照不同比例N/P与siRNA制备了脂质/基因复合物，并对其进行表征。
其方法如下：
实验方法如实施例7复合物表征。
效果验证：
(1)不同原料比例、不同N/P比制备的M1脂质体/基因复合物的表征如表5所示，由结果可以看出，M1两亲性化合物制备的脂质体包裹基因药物siRNA后，形成了粒径较小且分布均匀的复合纳米粒子。同时，复合物在近血液环境pH7.4的条件下为负电性，大大减小了阳离子脂质过剩的正电性引起的毒性。而包裹了siRNA的脂质/基因复合物在近核内体pH4.0的条件下带正电，说明其进入细胞内的核内体后可以因电荷反应与负电性的膜融合，逃逸出核内体，免受酶降解失活。因此，从以上可以看出，M1脂质制备的脂质体具有帮助基因药物穿过细胞外障碍和细胞内障碍的能力。同时，由图8的凝胶电泳阻滞结果来看，在100：1、50:1、20:1三个复合比下制备的复合物电泳条带几乎没有显示，而20:1组的复合物，脂质体被破膜后，观察有明显条带，因此说明M1脂质体对siRNA进行了完全包封，能保护其不受外界环境的破坏。
表5
实施例9、M2脂质体/基因复合物
本实施例利用M2两亲性化合物制备的脂质体，按照不同比例N/P与siRNA制备了脂质/基因复合物，并对其进行表征。
其方法如下：
实验方法如实施例7复合物表征。
效果验证：
(1)不同原料比例、不同N/P比制备的M2脂质体/基因复合物的表征如表6所示，由结果可以看出，M2两亲性化合物制备的脂质体包裹基因药物siRNA后，形成了粒径较小且分布均匀的复合纳米粒子。同时，复合物在近血液环境pH7.4的条件下为负电性，大大减小了阳离子脂质过剩的正电性引起的毒性。而包裹了siRNA的脂质/基因复合物在近核内体pH4.0的条件下带正电，说明其进入细胞内的核内体后可以因电荷反应与负电性的膜融合，逃逸出核内体，免受酶降解失活。因此，从以上可以看出，M2两亲性化合物制备的脂质体具有帮助基因药物穿过细胞外障碍和细胞内障碍的能力。同时，由图9的凝胶电泳阻滞结果来看，在100：1、50:1、20:1三个复合比下制备的复合物电泳条带几乎没有显示，而20:1组的复合物，脂质体被破膜后，观察有明显条带，因此说明M2脂质体对siRNA进行了完全包封，能保护其不受外界环境的破坏。
表6
实施例10、MPZ可电离阳离子脂质体/基因复合物人肺癌H1299-pGL3细胞转染效果
本实施例利用MPZ两亲性化合物制备的脂质体/luciferase-siRNA复合物对人非小细胞肺癌H1299细胞进行细胞转染，由其基因沉默效果，来观察载体脂质对基因药物的转运情况。
1.脂质/基因复合物的制备：
MPZ/基因复合物制备方法如实施例7，以MPZ/DPPC/Chol-(40/40/30mol)摩尔比制备脂质体，按照N/P-20/1包裹荧光素酶luciferase-siRNA，制备脂质/基因复合物；
2.H1299细胞收集与培养：
人非小细胞肺癌H1299-pGL3细胞系由实验室传代获得[Differentialenhancement of a Cutaneou HPV Promoter by△NP63αJun and Mutant p53.[CellCycle4:5,689-696；May2005]，采用含10％小牛血清的RPMI1640培养基于37℃、5％CO2培养箱培养，2～4天更换培养基一次，1:3常规传代培养，取对数期细胞进行实验；
3.复合物与细胞孵育：
细胞在转染实验前24小时按105/Well接种于24孔板，18h后观察，约长到70-80％。转染前用不含血清的培养基洗细胞一次，将样品用适量Opti-MEM培养基稀释，以每孔400μl/well加入24孔板。置培养箱中转染2.5～4小时后，换成含血清培养基继续培养36-48小时后，荧光素酶检测仪(Luminometer)检测(RLU)值，测量报告基因的表达，BCA蛋白含量测定计算细胞板每孔蛋白含量，同时用空白PBS组，裸siRNA组作为对照，考察载体转染基因药物的能力；
1)荧光素酶活力检测：
Luciferase报告基因的转染结果的检测步骤按照Luciferase Assay System的操作说明测定，使用荧光素酶检测仪(Luminometer)检测相对发光值；
ⅰ.将5X CCLR(细胞裂解液)稀释成1X，取分装的荧光素酶底物(Luciferase AssaySubstance)待其恢复室温使用；
ⅱ.将转染后的细胞去除培养基后用PBS润洗3次，润洗后将孔中的PBS吸干，然后每孔添加200μl的1X细胞裂解液于37℃30min；
ⅲ.充分裂解后将混合物移入离心管中，用13000rpm的转速离心3min，用上清液作为检测样品；
ⅳ.每个检测样品取10μl与10μl的荧光素酶底物在检测管中充分混合(用移液枪吹打10次)后放入荧光素酶检测仪(Luminometer)中测定Luciferase的发光值(RLU)。
2)BCA蛋白含量测定法：
每孔细胞蛋白浓度的检测步骤按照BCA Protein Assay Kit的操作说明测定，使用酶标仪检测光密度(OD)值；
ⅰ.绘制标准曲线；
ⅱ.配置BCA工作试剂(WR)，在96孔板中每孔加入200μl的WR，然后像孔中加入10μl样品或者上述离心后的上清检测样品；
ⅲ.加入样品后，将96孔板至于37℃恒温恒湿箱中放置30min使其充分反应，再用酶标仪在562nm处测量光密度(OD)值；
ⅳ.根据标准样品的光密度值绘制标准曲线，然后根据标准曲线拟合得到回归方程计算检测样品中的蛋白质含量。
效果验证：
(1)MPZ/luciferase-siRNA复合物粒径分布及均一度结果如表7所示；
(2)MPZ/luciferase-siRNA复合物转染H1299-pGL3细胞，基因沉默结果如图10所示；
(3)MPZ/luciferase-siRNA复合物转染H1299-pGL3细胞，BCA蛋白结果如图11所示；
由结果中可以看出，经MPZ两亲性化合物制备的脂质体包裹siRNA进入了细胞，并特异性沉默了目的基因，与PBS空白对照及裸siRNA组相比较，大大提高了基因沉默的效率。而细胞蛋白BCA实验结果显示，与空白对照PBS与siRNA组相比，MPZ脂质体包裹siRNA制剂蛋白BCA水平相近，并未造成细胞毒性。
表7
处方 复合物粒径 复合物PDI siRNA浓度
MPZ/luciferase-siRNA 176.8±2.0 0.123±0.102 100μg/ml
实施例11、M1脂质体/基因复合物人肺癌H1299-pGL3细胞转染效果
本实施例利用M1脂质制备的脂质体/luciferase-siRNA复合物对人非小细胞肺癌H1299细胞进行细胞转染，由其基因沉默效果，来观察载体脂质对基因药物的转运情况。
1.脂质/基因复合物的制备：
M1/基因复合物制备方法如实施例8，以M1/DPPC/Chol-(40/20/40mol)摩尔比制备脂质体，按照N/P-20/1包裹荧光素酶luciferase-siRNA，制备脂质/基因复合物；
2.H1299细胞收集与培养方法如实施例10；
3.复合物与细胞孵育及测定方法如实施例10；
效果验证：
(1)M1/luciferase-siRNA复合物粒径分布及均一度结果如表8所示；
(2)M1/luciferase-siRNA复合物转染H1299-pGL3细胞，基因沉默结果如图12所示；
(3)M1/luciferase-siRNA复合物转染H1299-pGL3细胞，BCA蛋白结果如图13所示；
由结果中可以看出，经M1脂质制备的脂质体包裹siRNA进入细胞后，特异性沉默了目的基因，与PBS空白对照及裸siRNA组相比较，大大提高了基因沉默的效率。而细胞蛋白BCA实验结果显示，与空白对照PBS与siRNA组相比，TMEA脂质体包裹siRNA制剂蛋白BCA水平相近，并未造成细胞毒性。
表8
处方 复合物粒径 复合物PDI siRNA浓度
M1脂质/luciferase-siRNA 113.6±6.3 0.141±0.054 100.0μg/ml
实施例12、M2/基因复合物人肺癌H1299-pGL3细胞转染效果
本实施例利用M2两亲性化合物制备的脂质体/luciferase-siRNA复合物对人非小细胞肺癌H1299细胞进行细胞转染，由其基因沉默效果，来观察载体脂质对基因药物的转运情况。
1.脂质/基因复合物的制备：
M2脂质/基因复合物制备方法如实施例9，以M2/DPPC/Chol-(40/30/40 mol)摩尔比制备脂质体，按照N/P-20/1包裹荧光素酶luciferase-siRNA，制备脂质/基因复合物；
2.H1299细胞收集与培养方法如实施例10；
3.复合物与细胞孵育及测定方法如实施例10；
效果验证：
(1)M2脂质/luciferase-siRNA复合物粒径分布及均一度结果如表9所示；
(2)M2脂质/luciferase-siRNA复合物转染H1299-pGL3细胞，基因沉默结果如图14所示；
(3)M2脂质/luciferase-siRNA复合物转染H1299-pGL3细胞，BCA蛋白结果如图15所示；
由结果中可以看出，经M2脂质制备的脂质体包裹siRNA进入细胞后，特异性沉默了目的基因，与PBS空白对照及裸siRNA组相比较，大大提高了基因沉默的效率。而细胞蛋白BCA实验结果显示，与空白对照PBS与siRNA组相比，TMEA脂质体包裹siRNA制剂蛋白BCA水平相近，并未造成细胞毒性。
表9
处方 复合物粒径 复合物PDI siRNA浓度
M2脂质/luciferase-siRNA 154.2±2.0 0.120±0.035 100μg/ml
实施例16、组织切片后共聚焦显微镜观察MPZ/Cy-5-siRNA复合物在肝内分布
本实施例利用MPZ两亲性衍生物制备的脂质体包裹Cy-5-siRNA制备的脂质/siRNA复合物，动物给药后，肝脏组织切片后，共聚焦显微镜下观察MPZ脂质/siRNA复合物分布，从而探知载体脂质对基因药物的转运情况。
1.MPZ脂质/Cy5-siRNA复合物制备：MPZ脂质/Cy5-siRNA复合物制备方法及比例如实施例7；
2.组织切片
(1)取材：取成年健康ICR小鼠20g，尾静脉注射MPZ脂质/Cy5-siRNA复合物200μL，约10μg Cy5-siRNA，4h后，颈椎脱臼，解剖，取出肝脏；
(2)速冻：将取出的肝脏修成小块，置于OCT中包埋，迅速置于液氮中速冻，成块后立即转移至冰冻切片机，准备切片；
(3)切片：将冰冻切片机恒温箱调至-25度，将包埋块沿切片方向修整成长方形或正方形，并将修整后的组织小块放入标本盘中，切片厚度调至20μm,连续切片，直接用预处理后的载玻片粘片，并放入多聚甲醛中固定5min；
(4)漂洗：将固定后的切片转移至装有1xPBS的染色缸中，漂洗3min,漂洗3次；
(5)封闭:将漂洗后的切片用擦镜纸擦干组织周围的水分，用免疫组化笔在组织周围画圈，加入5％的Donkey serum,于湿盒内37摄氏度封闭30min；
(6)一抗孵育：吸收封闭液，立即加入稀释好的一抗，于湿盒内37度封闭12-16h；
(7)二抗孵育：吸掉一抗，加入稀释好的二抗，于湿盒内37度孵育约30min；
(8)DAPI染色：吸掉二抗稀释液，加入DAPI,于湿盒内37摄氏度孵育约30min；
(9)封片：用Vector公司防荧光淬灭封片剂封片，并用指甲油封闭盖玻片四周。
3.荧光共聚焦显微镜(Confocal Microscopy)信号采集
(1)DAPI扫描序列：(Excitation：405nm，Emission：419-460nm)；
(2)Alexa Fluor488扫描序列：(Excitation：500-550nm)；
(3)Dylight549扫描序列：(Excitation：561nm，Emission：559-610nm)；
(4)Cy5-siRNA扫描序列：(Excitation：633nm，Emission：650-750nm)。
效果验证：
表10
处方 复合物粒径 复合物PDI siRNA浓度
MPZ脂质/luciferase-siRNA 176.8±2.0 0.123±0.102 100μg/ml
MPZ脂质/Cy5-siRNA复合物组织切片后共聚焦显微镜观察复合物在肝内分布，如图16所示；蓝色信号为DAPI染色的细胞核，星形绿色信号为kupffer 细胞，红色信号为MPZ脂质/Cy5-siRNA。由图可以看出，在体内给药4小时后，大量MPZ阳离子脂质体包裹的Cy5-siRNA红色信号分布在肝脏细胞内。如果复合物红色信号被巨噬细胞kupffer细胞绿色信号吞噬，会呈黄色。因此从图16可以看出，少数Cy5-siRNA被巨噬细胞吞噬，更多的Cy5-siRNA信号聚集到了肝实质细胞内。说明MPZ脂质载体系统能将Cy5-siRNA体内安全高效递送到肝脏，更可贵的是，将siRNA更多递送到了肝实质细胞中，对于治疗肝脏疾病有非常大的优势。
实施例17、组织切片后共聚焦显微镜观察M1脂质/Cy-5-siRNA复合物在肝内分布
本实施例利用M1阳离子脂质包裹Cy-5-siRNA制备的脂质/siRNA复合物，动物给药后，肝脏组织切片后，共聚焦显微镜下观察TMEA脂质/siRNA复合物分布，从而探知载体脂质对基因药物的转运情况。
1.M1脂质/Cy5-siRNA复合物制备：M1脂质/Cy5-siRNA复合物制备方法及比例如实施例8；
2.组织切片方法如实施例16；
3.共聚焦显微镜Confocal(Leica TS SP8)观察实验方法如实施例16。
效果验证：
M1脂质/Cy5-siRNA复合物组织切片后共聚焦显微镜观察复合物在肝内分布，如图17所示；蓝色信号为DAPI染色的细胞核，星形绿色信号为kupffer 细胞，红色信号为M1脂质/Cy5-siRNA。由图可以看出，在体内给药4小时后，大量M1阳离子脂质体包裹的Cy5-siRNA红色信号分布在肝脏细胞内。如果复合物红色信号被巨噬细胞kupffer 细胞绿色信号吞噬，会呈黄色。因此从图17可以看出，少数Cy5-siRNA被巨噬细胞吞噬，更多的Cy5-siRNA信号聚集到了肝实质细胞内。说明M1脂质载体系统能将Cy5-siRNA体内安全高效递送到肝脏，更可贵的是，将siRNA更多递送到了肝实质细胞中，对于治疗肝脏疾病有非常大的优势。
表11
处方 复合物粒径 复合物PDI siRNA浓度
M1脂质/luciferase-siRNA 113.6±6.3 0.141±0.054 100μg/ml
实施例18、组织切片后共聚焦显微镜观察M2脂质/Cy-5-siRNA复合物在肝内分布
本实施例利用M2两亲性衍生物化合物制备的脂质体包裹Cy-5-siRNA制备的脂质/siRNA复合物，动物给药后，肝脏组织切片后，共聚焦显微镜下观察M2脂质/siRNA复合物分布，从而探知载体脂质对基因药物的转运情况。
1.M2脂质/Cy5-siRNA复合物制备：M2脂质/Cy5-siRNA复合物制备方法及比例如实施例8；
2.组织切片方法如实施例16；
3.共聚焦显微镜Confocal(Leica TS SP8)观察实验方法如实施例16。
效果验证：
M2脂质/Cy5-siRNA复合物组织切片后共聚焦显微镜观察复合物在肝内分布，如图18所示；蓝色信号为DAPI染色的细胞核，星形绿色信号为kupffer 细胞，红色信号为M2脂质/Cy5-siRNA。由图可以看出，在体内给药4小时后，大量M2阳离子脂质体包裹的Cy5-siRNA红色信号分布在肝脏细胞内。如果复合物红色信号被巨噬细胞kupffer 细胞绿色信号吞噬，会呈黄色。因此从图18可以看出，少数Cy5-siRNA被巨噬细胞吞噬，更多的Cy5-siRNA信号聚集到了肝实质细胞内。说明M2脂质载体系统能将Cy5-siRNA体内安全高效递送到肝脏，更可贵的是，将siRNA更多递送到了肝实质细胞中，对于治疗肝脏疾病有非常大的优势。
表12
处方 复合物粒径 复合物PDI siRNA浓度
M2脂质/luciferase-siRNA 113.6±6.3 0.141±0.054 100μg/ml
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (11)

1.一种3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸的两亲性衍生物，其特征在于，其结构式如式(Ⅰ)所示：
其中，n＝2，R1为含12～18个碳原子的长碳链烷烃基，R2为含12～18个碳原子的长碳链烷烃基。
2.如权利要求1所述的两亲性衍生物，其特征在于，所述R1为第九个碳原子位置上为双键或第九、十二个碳原子位置上为双键的长碳链烷烃基。
3.如权利要求1或2所述的两亲性衍生物，其特征在于，所述R2为第九个碳原子位置上为双键或第九、十二个碳原子位置上为双键的长碳链烷烃基。
4.如权利要求1所述的两亲性衍生物，其特征在于，所述R1、R2为相同的基团。
5.如权利要求1所述的两亲性衍生物，其特征在于，其结构式如式(Ⅱ)所示：
6.一种如权利要求1～5中任一项所述的两亲性衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A、在四氢呋喃催化剂、红铝溶液的甲苯溶液存在的条件下，含碳原子12-18的直链脂肪酸在室温下发生还原反应，得含碳原子12-18的直链脂肪醇；所述含碳原子12-18的直链脂肪酸结构式为：其中m＝1-7中任一整数，且第6个碳原子处为单键或双键，第9个碳原子处为单键或双键；
B、在三乙胺、4-二甲氨基吡啶、甲烷磺酸酐催化剂的作用下，含碳原子12-18的直链脂肪醇在0℃下发生磺酸酯化反应，得中间产物3；
C、在二甲基甲酰胺、溴化锂催化剂作用下，中间产物3在45℃下反应，得中间溴化物4；
D、在镁、无水乙醚、甲酸乙酯催化剂作用下，中间溴化物4在40℃下发生格式反应生成中间产物5；
E、在氢氧化钠、四氢呋喃作用下，中间产物5在65℃下发生水解反应生成中间产物6；
F、在N，N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐催化剂作用下，中间产物6在50℃下发生酯化反应生成中间产物8；
G、在二甲基甲酰胺、碘化钠、碳酸钾的催化剂作用下，中间产物8在80℃下与N-甲基哌嗪发生氨基化反应，即得所述两亲性衍生物。
7.一种含有权利要求1所述的两亲性衍生物的脂质体，其特征在于，所述脂质体由所述两亲性衍生物、胆碱、胆固醇组成；所述脂质体中胆碱的重量百分比含量为20％～50％，胆固醇的重量百分比含量为10％～30％。
8.一种如权利要求7所述的脂质体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A、将两亲性衍生物的乙醇溶液、胆碱乙醇溶液、胆固醇乙醇溶液混合，形成脂质乙醇混合液；
B、将所述脂质乙醇混合液加入到pH<5.0的HEPES缓冲液中，搅拌，制得脂质体混悬液；
C、将脂质体混悬液pH<5.0的HEPES缓冲液透析，去除乙醇；即得所述脂质体。
9.一种如权利要求7所述的脂质体在制备基因药物输送载体中的用途，其特征在于，所述脂质体包载DNA、RNA、透明质酸或多肽。
10.一种脂质/基因复合物，其特征在于，所述脂质/基因复合物是由如权利要求7所述的脂质体包载基因生物分子而组成的。
11.一种如权利要求10所述的脂质/基因复合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A、将两亲性衍生物的乙醇溶液、胆碱乙醇溶液、胆固醇乙醇溶液混合，形成脂质乙醇混合液；
B、将所述脂质乙醇混合液加入到pH<5.0的HEPES缓冲液中，搅拌，制得脂质体混悬液；
C、在所述脂质体混悬液中加入基因生物分子的DEPC水溶液，37℃孵育1-2h；
D、将pH<5.0的HEPES缓冲液透析，去除乙醇；继续在PBS溶液透析，调整体系pH至中性，即得所述脂质/基因复合物。
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Assignee: HIGHFIELD BIOPHARMACEUTICAL Corp.

Assignor: SHANGHAI JIAO TONG University

Contract record no.: X2020980005168

Denomination of invention: Amphiphilic derivatives of 3 - (1-tert-butoxycarbonylpiperazine-4-yl) propionic acid and their applications

Granted publication date: 20180703

License type: Exclusive License

Record date: 20200820

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