CN103848751B - 可电离阳离子脂质化合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基因治疗技术领域的可电离阳离子脂质化合物及其用途；本发明还涉及由所述的可电离阳离子脂质化合物制备的脂质体；所述用途为脂质体作为基因药物载体输送系统的用途。本发明的可电离阳离子脂质制备而成的脂质体，与基因药物siRNA复合后，能形成粒径较小，分布均匀的复合物。同时在pH7.0环境下呈电中性，增加了脂质复合物的体内稳定性，减小因过多正电荷引起的细胞毒性。本发明提供的脂质体，可经髓样抑制细胞（MDSCs）特异性结合的配体多肽修饰，可体外转载荧光基因药物进入MDSCs细胞。

Description

可电离阳离子脂质化合物及其用途

技术领域

本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及一种可电离阳离子脂质化合物及其用途。

背景技术

基因治疗（genetherapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。在过去的二十多年间，基因治疗在很多疾病治疗领域将研究从临床前推向了临床，对于由基因异常引起的，医药界至今难以解决的疾病如肿瘤等具有无可替代的优势。常见的基因药物有质粒DNA（plasmidDNA，pDNA）、反义寡核苷酸（antisenseODN）、小干扰RNA（siRNA）和小发卡RNA（shRNA）。在众多基因药物中除了经典的将外源性cDNA导入体内并表达的治疗方法外，基于RNA干扰原理的应用siRNA作为基因药物的思路一经提出便受到了极大地关注。

siRNA（SmallinterferingRNA），又称为小干扰RNA，是长度20到25个核苷酸的双链RNA。它能够特异性的阻断体内特定基因表达，结合到与之序列互补的mRNA上，促使mRNA降解，介导转录水平的基因表达抑制，从而诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，这个过程称为RNA干扰效应（RNAi）。siRNA识别靶序列具有高度的特异性，能特异性沉默靶基因，从根本上阻断疾病的发生。所以将其作为治疗药物，具有广阔的发展前景，对于肿瘤等一系列病症的治疗具有重大意义。

然而，将外源基因引入体内，其会被体内的核酸酶降解，在未进入靶细胞之前，便被降解成小分子核苷酸，从而失去治疗作用。因此，实现基因治疗的关键是高效、安全的基因递送系统。基因载体在运送基因的时候要经历多个复杂的过程：通过血液循环到达靶细胞，细胞摄取，内涵体的逃逸，胞内运动，载体释放基因物质。其主要障碍主要是复杂血液环境的细胞外障碍和溶酶体酶降解的细胞内障碍。因此寻找良好的基因载体，使得靶基因到达靶点发挥效用，是基因载体研究者亟待解决的问题。

目前，在基因输送载体系统方面主要分为两大类：一是病毒载体系统；二是非病毒载体系统。病毒载体是一种天然的载体资源，病毒基因组结构简单，转染效率高，靶细胞特异性强，但其导向性差、携带能力低、免疫原性和潜在致瘤性等缺点限制了其使用。因此多样性、无免疫原性及易于控制生产的非病毒载体系统近年来备受关注，并在很多治疗领域有所应用。常用的非病毒载体系统主要是阳离子脂质（cationiclipids）载体。

阳离子脂质有三个重要的结构区域：带正电荷的亲水极性头；中间负责连接极性和非极性的两端的连接链；疏水脂质链的锚着区。含胺类基团的极性头部起着脂质体与RNA,脂质体/RNA复合物与细胞膜相互结合的作用，影响脂质带电情况，在溶酶体逃逸过程起主要作用。连接链决定了阳离子脂质体的化学和生物稳定性，特别是因此而产生的细胞毒性。疏水锚着区可以为碳链形式或类固醇等多种结构，并且碳链的长度、是否饱和和具体类型将影响脂质行为，其既为脂双层提供足够的流动性,又能促使阳离子脂质体在体内的脂质融合。

阳离子脂质体与带负电的基团通过静电作用形成脂质体/基因复合物。复合物因阳离子脂质体的过剩而带正电：带正电的脂质体/基因复合物由于静电作用吸附于带负电的细胞表面。然后通过与细胞膜融合或细胞的内吞作用进入细胞内。阳离子脂质用于基因治疗的主要特点是在核内体逃逸过程中的电荷影响的膜融合作用。但同时，阳离子脂质/基因复合物过剩的正电以及部分阳离子脂质难降解的特性也导致了细胞毒性。因此较低的转染效率和细胞毒性是限制阳离子脂质应用的主要缺点。

在阳离子载体的结构设计中,常用细胞表面特异表达的受体或蛋白来解决靶向性的影响。通过受体介导通路来促进细胞吸收，是另一个增加基因药物摄取的方式。在类脂分子的疏水尾链部分连接能与这种受体产生特异结合的配体。由这种类脂分子形成的阳离子脂质体/基因复合物会选择性地与受体过度表达的细胞结合,使治疗基因在病变细胞附近富集,提高基因的转染效率。例如：核定位信号的使用。糖皮质激素受体（TheglucocorticoidreceptorGR)是保守的核受体超家族中的一员，属于核转录因子，与配体结合后，受体-配体复合物可以由胞浆转运到细胞核，广泛存在于机体各种组织细胞胞浆中。载体系统与糖皮质激素受体结合可以促进基因药物的胞内摄取，提高基因载体递送系统的转染效率。

目前阳离子脂质作为基因载体因其结构简单、操作简便、生物安全性高等特点成为了目前应用最为广泛的非病毒载体，但其转染的效率低、正电荷所导致的细胞毒性问题仍待解决，因此本发明尝试设计可电离阳离子脂质来解决上述问题，以达到较好的基因治疗效果。

发明内容

针对现有技术存在的上述缺点，本发明提供了一种可电离阳离子脂质化合物及其用途。本发明的可电离阳离子脂质制备而成的脂质体，与基因药物siRNA复合后，能形成粒径较小，分布均匀的复合物。同时在pH7.0环境下呈电中性，增加了脂质复合物的体内稳定性，减小因过多正电荷引起的细胞毒性。本发明提供的脂质体，可经髓样抑制细胞（MDSCs）特异性结合的配体多肽修饰，可体外转载荧光基因药物进入MDSCs细胞。

第一方面，本发明涉及一种以氨基酸为头基的可电离阳离子脂质化合物。

优选地，所述可电离阳离子脂质化合物的结构如式L1所示：

优选地，所述可电离阳离子脂质化合物的结构如式L2所示：

第二方面，本发明涉及一种制备前述可电离阳离子脂质化合物的方法，包括如下步骤：在催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑存在的条件下，经芴甲氧羰酰氯或二碳酸二叔丁酯修饰的赖氨酸，与亚油酸或油醇发生酰胺或酯化反应，即得。

第三方面，本发明涉及一种制备前述可电离阳离子脂质化合物的方法，包括如下步骤：在催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑存在的条件下，芴甲氧羰酰氯或二碳酸二叔丁酯修饰的赖氨酸，与亚油酸或地塞米松发生酰胺或酯化反应，即得。

第四方面，本发明涉及一种由前述可电离阳离子脂质化合物制备的脂质体。

优选地，所述脂质体在pH4.0条件下带正电、pH7.0条件下不带电或带负电。

第五方面，本发明还涉及一种前述脂质体作为基因药物载体输送系统的用途。

优选地，所述基因药物为siRNA、microRNA、DNA或RNA表达载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

（1）本发明基于带较少正电荷同时具有化学性质活泼氨基和羧基的天然氨基酸，通过简单酰胺反应和酯化反应合成了具有不同电离态的可电离阳离子脂质化合物，从而改善优化阳离子脂质递送系统；

（2）本发明的可电离阳离子脂质制备而成的脂质体，与基因药物siRNA复合后，能形成粒径较小，分布均匀的复合物。同时在pH7.0环境下呈电中性，增加了脂质复合物的体内稳定性，减小因过多正电荷引起的细胞毒性，同时，以酰胺键和酯键作为链接键，脂质更易降解，降低了细胞毒性。其可以作为基因药物载体实现安全、有效递送；

（3）本发明的可电离阳离子脂质制备而成的脂质体，可体外有效转载基因药物进入细胞，特异性沉默目的基因；

（4）本发明的可电离阳离子脂质制备而成的脂质体，在溶酶体pH4.0的酸性条件下，阳离子脂质电离带正电，从而可以与溶酶体膜中的磷脂阴离子作用，形成适应非双层结构的离子对，继而破坏细胞膜，实现溶酶体逃逸突破细胞内障碍，因此，可体内有效转载基因药物经过血液循环及细胞内障碍，进入肝脏细胞；

（5）本发明提供的脂质体，可经髓样抑制细胞（MDSCs）特异性结合的配体多肽修饰，可体外转载荧光基因药物进入MDSCs细胞。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为可电离阳离子脂质L1的结构图。

图2为可电离阳离子脂质L1的合成方法示意图。

图3为可电离阳离子脂质L1的核磁分析图谱。

图4为可电离阳离子脂质L1的质谱图

图5为可电离阳离子脂质L2的结构图。

图6为可电离阳离子脂质L2的合成方法示意图

图7为可电离阳离子脂质L2的核磁分析图谱。

图8为可电离阳离子脂质L2的质谱图

图9为L1脂质/luciferase-siRNA复合物的结构示意图。

图10为L1脂质/luciferase-siRNA复合物细胞转染、基因沉默的结果示意图。

图11为L1脂质/luciferase-siRNA复合物细胞转染、BCA蛋白结果示意图。

图12为L2脂质/luciferase-siRNA复合物细胞转染、基因沉默示意图。

图13为L2脂质/luciferase-siRNA复合物细胞转染、BCA蛋白结果示意图。

图14为经MDSCs特异性结合的配体多肽修饰的L1阳离子脂质体/Cy-5-siRNA复合物与MDSCs细胞结合能力示意图。

图15为经MDSCs特异性结合的配体多肽修饰的L2阳离子脂质体/Cy-5-siRNA复合物与MDSCs细胞结合能力示意图。

图16为L1脂质/Cy-5-siRNA复合物在体内给药后的肝脏细胞分布示意图。

图17为L1脂质/Cy-5-siRNA复合物在体内给药后的肝脏细胞分布示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按章制造厂商所建议的条件。

实施例1、可电离阳离子脂质L1

选用赖氨酸、亚油酸、油醇作为原料，按照相关技术由上海茂复化学科技有限公司合成得到L1脂质；均经过HPLC纯化和质谱鉴定，纯度大于95%，分子量与理论值相符；

效果验证：

（1）图1为可电离阳离子脂质L1的结构图；

（2）图2为可电离阳离子脂质L1合成方法示意图；

（3）图3为可电离阳离子脂质L1进行核磁共振图谱结果；

（4）图4为可电离阳离子脂质L1进行质谱图谱分析，所得L1脂质化合物的分子量与理论值相近，为分子量658g/mol。

实施例2、可电离阳离子脂质L2

选用赖氨酸、亚油酸、地塞米松作为原料，按照相关技术由上海茂复化学科技有限公司合成得到L1脂质。均经过HPLC纯化和质谱鉴定，纯度大于95%，分子量与理论值相符。

效果验证：

（1）图5为可电离阳离子脂质L2结构图；

（2）图6为可电离阳离子脂质L2合成方法示意图

（3）图7为可电离阳离子脂质L2进行核磁共振图谱结果；

（4）图8为可电离阳离子脂质L2进行质谱图谱分析，所得L2脂质化合物的分子量与理论值相近，为分子量797g/mol。

实施例3、L1可电离阳离子脂质体

本实施例利用可电离阳离子脂质L1与辅助脂质，按照不同比例制备了可电离阳离子脂质体。

其制备方法包括如下步骤：

1.制备样品溶液

L1乙醇溶液、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)乙醇溶液、胆固醇（Cholesterol，CHOL）乙醇溶液配制：以电子天平称取一定量，加入无水乙醇使之成为10mg/ml,并以之作为贮备液；

HEPES缓冲液（HEPESbuffer）的配制：以电子天平称取HEPES，加入去离子水,用盐酸溶液调pH,使之成为20mMpH4.0，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理，灭菌后，以之作为贮备液；

2.脂质体的制备：

1）取出L1阳离子脂质,胆固醇（CHOL），二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，pal-多肽储备液，室温下平衡半小时；

2)分别按一定摩尔比，量取L1乙醇溶液、DPPC乙醇溶液、CHOL乙醇溶液至5ml离心管混合；

3)取20MmpH4.0HEPESBuffer于5ml离心管中，30℃预热，5-10min；将vortex涡旋仪调至touchII档，在涡旋搅拌下，将脂质乙醇混合液缓慢加入20MmpH4.0HEPESbuffer中，涡旋搅拌1～2min，制备含30%乙醇的脂质体混悬液；

4)使用挤出仪，对脂质体分别过0.2μm、0.1μm、0.08μm聚碳酸酯膜11次，制备粒径小而分布均匀的空白脂质体；

5）激光散射粒度分析仪（PCS）测定纳米粒子粒径分布、电动电势（zeta电位），使用的仪器是英国马尔文公司的ZetaSizer3000H激光粒度仪，使用He-Ne离子激光(λ0=633nm)为入射光，动力学光散射试验在25℃进行，反射角为1.33，角度为90°。连续检测三次的平均值作为得到的数据。

效果验证：

（1）不同原料比例、不同N/P比制备的L1脂质体/基因复合物的表征如表1所示；

（2）L1脂质体/基因复合物的结构如图9所示。

表1

实施例4、L2可电离阳离子脂质体

本实施例利用可电离阳离子脂质L2与辅助脂质，按照不同比例制备了可电离阳离子脂质体。

其制备及表征方法如实施例3脂质体制备方法。

效果验证：

不同原料比例、不同N/P比制备的L2脂质体/基因复合物的表征如下表2所示：

表2

Lipid components	zeta	粒径	PDI
				L2/DPPC/Chol(40/19/27mol)	8.31±0.22	156.8±3.0	0.136±0.025
L2/DPPC/Chol(40/16/30mol)	9.24±0.21	166.7±1.0	0.125±0.011

实施例5、L1可电离阳离子脂质体/基因复合物

本实施例利用L1脂质制备的脂质体，按照不同比例N/P与siRNA制备了脂质/基因复合物，并对其进行表征。

其方法如下：

1.空白脂质体制备：制备方法及处方比例如实施例3脂质体制备方法；

2.脂质/基因复合物制备：

1）配制小干扰RNA（siRNA）溶液：将siRNA用DEPC水溶解，使之成为1mg/ml，并以之作为贮备液；

2）按不同siRNA/脂质总量（N/P）比，取适量siRNA溶液，将制备好的空白脂质体放置在vortex涡旋仪上，缓慢加入siRNA溶液，37℃孵育2h；

3）将制备好的复合物置于20MmpH4.0HEPESbuffer中，4℃下透析4h，除去体系中的乙醇。然后取出，继续在pH7.0PBS溶液中，4℃下透析12h，将体系pH调为7.0，接近体液pH。透析结束收集于离心管中，即为脂质基因复合物，4℃保存备用；

3.脂质、脂质/基因复合物在不同pH环境下的带电情况及粒子均一度表征：

1）取空白脂质体，在pH7.0的PBS缓冲液中，4℃下透析12h，除去乙醇，并将体系pH调为pH7.0；激光散射粒度分析仪（PCS）测定其粒径分布及粒子zeta电位，以考察L1脂质制备的空白脂质体在pH7.0条件下的带电情况及粒径分布；

2）激光散射粒度分析仪（PCS）测定在20MmpH4.0HEPESbuffer中透析除去乙醇的脂质/基因复合物的粒径分布及粒子zeta电位，考察复合物在pH4.0条件下的带电情况及粒径分布。

效果验证：

不同原料比例、不同N/P比制备的L1脂质体/基因复合物的表征如表3所示，由结果可以看出，L1阳离子脂质制备的脂质体包裹基因药物siRNA后，形成了粒径较小且分布均匀的复合纳米粒子。同时，未包裹siRNA的L1阳离子脂质体在近血液环境pH7.0的条件下为负电性，大大减小了阳离子脂质过剩的正电性引起的毒性。而包裹了siRNA的脂质/基因复合物在近核内体pH4.0的条件下带正电，说明其进入细胞内的核内体后可以因电荷反应与负电性的膜融合，逃逸出核内体，免受酶降解失活。因此，从以上两点可以看出，L1阳离子脂质制备的脂质体具有帮助基因药物穿过细胞外障碍和细胞内障碍的能力。

表3

实施例6、L2可电离阳离子脂质体/基因复合物

本实施例利用L2脂质制备的脂质体，按照不同比例N/P与siRNA制备了脂质/基因复合物，并对其进行表征。

其方法如下：

1.空白脂质体制备：制备方法如实施例3脂质体制备方法。

2.脂质/基因复合物制备：制备方法如实施例3脂质/基因复合物制备方法。

3.脂质、脂质/基因复合物在不同pH环境下的带电情况及粒径分布表征：制备及表征方法如实施例3方法。

效果验证：

不同N/P比制备的L2脂质体/基因复合物的表征如表4所示，由结果可以看出，L2阳离子脂质制备的脂质体包裹基因药物siRNA后，形成了粒径较小且分布均匀的复合纳米粒子。同时，未包裹siRNA的L1阳离子脂质体在近血液环境pH7.0的条件下为负电性，大大减小了阳离子脂质过剩的正电性引起的毒性。而包裹了siRNA的脂质/基因复合物在近核内体pH4.0的条件下带正电，说明其进入细胞内的核内体后可以因电荷反应与负电性的膜融合，逃逸出核内体，免受酶降解失活。因此，从以上两点可以看出，L2阳离子脂质制备的脂质体具有帮助基因药物穿过细胞外障碍和细胞内障碍的能力。

表4

实施例7、L1可电离阳离子脂质体/基因复合物细胞转染效果

本实施例利用L1脂质制备的脂质体/luciferase-siRNA复合物对人非小细胞肺癌H1299细胞进行细胞转染，由其基因沉默效果，来观察载体脂质对基因药物的转运情况。

1.脂质/基因复合物的制备：

L1脂质/基因复合物制备方法如实施例5，以L1/DPPC/Chol-(46/14/26mol)摩尔比制备脂质体，按照N/P-10/1包裹荧光素酶luciferase-siRNA，制备脂质/基因复合物；

2.H1299细胞收集与培养：

人非小细胞肺癌H1299-pGL3细胞系由实验室传代获得，采用含10%小牛血清的RPMI1640培养基于37℃、5%CO2培养箱培养，2～4天更换培养基一次，1:3常规传代培养，取对数期细胞进行实验；

3.复合物与细胞孵育：

细胞在转染实验前24小时按1-10×104/well接种于24孔板，18h后观察，约长到70-80%。转染前用不含血清的培养基洗细胞一次，将样品用适量Opti-MEM培养基稀释，以每孔400μl/well加入24孔板。置培养箱中转染2.5～4小时后，换成含血清培养基继续培养36-48小时后，荧光素酶检测仪（Luminometer）检测（RLU）值，测量报告基因的表达，BCA蛋白含量测定计算细胞板每孔蛋白含量，同时用空白PBS组，裸siRNA组作为对照，考察载体转染基因药物的能力；

1）荧光素酶活力检测：

Luciferase报告基因的转染结果的检测步骤按照LuciferaseAssaySystem的操作说明测定，使用荧光素酶检测仪（Luminometer）检测相对发光值；

ⅰ.将5XCCLR（细胞裂解液）稀释成1X，取分装的荧光素酶底物（LuciferaseAssaySubstance）待其恢复室温使用；

ⅱ.将转染后的细胞去除培养基后用PBS润洗3次，润洗后将孔中的PBS吸干，然后每孔添加200μl的1X细胞裂解液于37℃30min；

ⅲ.充分裂解后将混合物移入离心管中，用13000rpm的转速离心3min，用上清液作为检测样品；

ⅳ.每个检测样品取10μl与10μl的荧光素酶底物在检测管中充分混合（用移液枪吹打10次）后放入荧光素酶检测仪（Luminometer）中测定Luciferase的发光值（RLU）。

2）BCA蛋白含量测定法：

每孔细胞蛋白浓度的检测步骤按照BCAProteinAssayKit的操作说明测定，使用酶标仪检测光密度（OD）值；

ⅰ.绘制标准曲线；

ⅱ.配置BCA工作试剂（WR），在96孔板中每孔加入200μl的WR，然后像孔中加入10μl样品或者上述离心后的上清检测样品；

ⅲ.加入样品后，将96孔板至于37℃恒温恒湿箱中放置30min使其充分反应，再用酶标仪在562nm处测量光密度（OD）值；

ⅳ.根据标准样品的光密度值绘制标准曲线，然后根据标准曲线拟合得到回归方程计算检测样品中的蛋白质含量。

效果验证：

（1）L1脂质/luciferase-siRNA复合物粒径分布及均一度结果如表5所示；

（2）L1脂质/luciferase-siRNA复合物转染H1299-pGL3细胞，基因沉默结果如图10所示；

（3）L1脂质/luciferase-siRNA复合物转染H1299-pGL3细胞，BCA蛋白结果如图11所示；

由结果中可以看出，经L1脂质制备的脂质体包裹siRNA进入了细胞，并特异性沉默了目的基因，与PBS空白对照及裸siRNA组相比较，大大提高了基因沉默的效率。而细胞蛋白BCA实验结果显示，与空白对照PBS与siRNA组相比，L1脂质体包裹siRNA制剂蛋白BCA水平相近，并未造成细胞毒性。

表5

处方	复合物粒径	复合物PDI	siRNA浓度
				L1脂质/luciferase-siRNA	168.5±2.2	0.221±0.035	9.9μg/ml

实施例8、L2可电离阳离子脂质体/基因复合物细胞转染效果

本实施例利用L2脂质制备的脂质体/luciferase-siRNA复合物对人非小细胞肺癌H1299细胞进行细胞转染，由其基因沉默效果，来观察载体脂质对基因药物的转运情况。

1.脂质/基因复合物的制备：

L2脂质/基因复合物制备方法如实施例6，以L2/DPPC/Chol-（38/20/39mol)摩尔比制备脂质体，按照N/P-10/1包裹荧光素酶luciferase-siRNA，制备脂质/基因复合物；

2.H1299细胞收集与培养方法如实施例7；

3.复合物与细胞孵育及测定方法如实施例8；

效果验证：

（1）L2脂质/luciferase-siRNA复合物粒径分布及均一度结果如表6所示；

（2）L2脂质/luciferase-siRNA复合物转染H1299-pGL3细胞，基因沉默结果如图12所示；

（3）L2脂质/luciferase-siRNA复合物转染H1299-pGL3细胞，BCA蛋白结果如图13所示；

由结果中可以看出，经L2脂质制备的脂质体包裹siRNA进入细胞后，特异性沉默了目的基因，与PBS空白对照及裸siRNA组相比较，大大提高了基因沉默的效率。

而细胞蛋白BCA实验结果显示，与空白对照PBS与siRNA组相比，L2脂质体包裹siRNA制剂蛋白BCA水平相近，并未造成细胞毒性。

表6

处方	复合物粒径	复合物PDI	siRNA浓度
				L2脂质/luciferase-siRNA	156.1±2.0	0.120±0.035	10.0μg/ml

实施例9、MDSCs靶向多肽修饰的L1脂质体包裹Cy-5-siRNA，复合物对细胞结合能力考察

1.本实施例涉及两种Cy-5-siRNA阳离子脂质体，siRNA阳离子脂质体为MDSCs靶向多肽修饰siRNA阳离子脂质体，其制备方法包括如实施例3中L1脂质体制备方法，按L1:DPPC:CHOL:pal-多肽摩尔比为50:40:10:7，pal-多肽为7%比例制备；

2.不同比例多肽脂质的siRNA阳离子脂质体与细胞结合能力考察

1)分离MDSCs、Monocyte细胞，计数，1640调整细胞浓度至2×10⁶个/ml,24孔板，每孔200μl细胞悬液；

2)避光条件下，各种待测细胞中加入不同脂质体50μl(siRNA每孔0.5μg，终浓度2μg/ml)，37℃下避光静置孵育4.5小时；

3)孵育结束后，弃去细胞培养液，加入PBS+2%FBS缓冲液400μl/孔,300g,10min,离心洗涤3次彻底清洗；

4)利用流式细胞分析仪，在FL-4的激发光通道下计数10000个细胞，分析细胞荧光强度分布及平均值。

效果验证：

（1）MDSCs靶向多肽修饰siRNA脂质体的表征如表7所示；

（2）不同比例多肽脂质的siRNA阳离子脂质体与细胞结合能力结果如图14所示：由图8可知：由荧光结果显示，经多肽修饰的L1脂质体携带Cy-5-siRNA转载进入了MDSCs细胞，且其Cy-5-siRNA荧光强度高于无多肽修饰的L1脂质体组以及空白对照PBS组。并且在对照细胞Monocyte中两者无明显差异。说明F7多肽与L1脂质形成的脂质体可以转载siRNA，进入MDSCs细胞。

表7

	复合物粒径（nm）	PDI	siRNA浓度
				L1脂质/CY5复合物	159.7±3.67	0.311±0.037	9.9μg/ml
L1-多肽脂质/CY5复合物	175.2±0.99	0.104±0.016	9.7μg/ml

实施例10、MDSCs靶向多肽修饰的L2脂质体包裹Cy-5-siRNA，复合物对细胞结合能力考察

1.L2脂质/Cy-5-siRNA复合物制备方法按实施例9制备方法。比例为L2:DPPC:CHOL:pal-多肽摩尔比为50:40:10:7，pal-多肽为7%比例制备；

2.不同比例多肽脂质的siRNA阳离子脂质体与细胞结合能力考察如实施例9。

效果验证：

（1）MDSCs靶向多肽修饰siRNA脂质体的表征如下表8所示；

（2）不同比例多肽脂质的siRNA阳离子脂质体与细胞结合能力结果如图15所示，由图15可知：由荧光强度结果显示，经多肽修饰的L2脂质体转载Cy-5-siRNA进入了MDSCs细胞，且其Cy-5-siRNA荧光强度高于无多肽修饰的L2组及空白对照PBS组。说明F7多肽与L2脂质形成的脂质体可以转载siRNA，进入MDSCs细胞。

表8

	复合物粒径（nm）	PDI	siRNA浓度
				L2脂质/CY5复合物	156.1±2.0	0.120±0.035	10.0μg/ml
L2-多肽脂质/CY5复合物	163.2±0.91	0.124±0.014	10.0μg/ml

实施例11、组织切片后共聚焦显微镜观察L1脂质/Cy-5-siRNA复合物在肝内分布

本实施例利用L1阳离子脂质包裹Cy-5-siRNA制备的脂质/siRNA复合物，动物给药后，肝脏组织切片后，共聚焦显微镜下观察L1脂质/siRNA复合物分布，从而探知载体脂质对基因药物的转运情况。

1.L1脂质/Cy-5siRNA复合物制备：L1脂质/Cy-5siRNA复合物制备方法及比例如实施例7；

2.组织切片

（1）取材：取成年健康ICR小鼠20g，尾静脉注射L1脂质/Cy-5siRNA复合物200μL，约10μgCy-5siRNA，4h后，颈椎脱臼，解剖，取出肝脏；

（2）速冻：将取出的肝脏修成小块，置于OCT中包埋，迅速置于液氮中速冻，成块后立即转移至冰冻切片机，准备切片；

（3）切片：将冰冻切片机恒温箱调至-25度，将包埋块沿切片方向修整成长方形或正方形，并将修整后的组织小块放入标本盘中，切片厚度调至20μm,连续切片，直接用预处理后的载玻片粘片，并放入多聚甲醛中固定5min；

（4）漂洗：将固定后的切片转移至装有1xPBS的染色缸中，漂洗3min,漂洗3次；

（5）封闭;将漂洗后的切片用擦镜纸擦干组织周围的水分，用免疫组化笔在组织周围画圈，加入5%的Donkeyserum,于湿盒内37摄氏度封闭30min；

（6）一抗孵育：吸收封闭液，立即加入稀释好的一抗，于湿盒内37度封闭约30min；

（7）二抗孵育：吸掉一抗，加入稀释好的二抗，于湿盒内37度孵育约30min；

（8）DAPI染色：吸掉二抗稀释液，加入DAPI,于湿盒内37摄氏度孵育约30min；

3.共聚焦显微镜Confocal（LeicaTSSP8)观察实验结果

采用序列扫描分别对DAPI(Excitation:405nm;Emission:419-460)、AlexaFluor488(Excitation:500-550)、Dylight549(Excitation:561nm;Emission:559-610）等标记物，进行荧光信号采集。

效果验证：

L1脂质/Cy-5siRNA复合物组织切片后共聚焦显微镜观察复合物在肝内分布，如图16所示；由图可以看出，蓝色信号为DAPI染色的细胞核，绿色信号为kuffer细胞，红色信号为L1脂质/Cy-5siRNA。可见，在体内给药4小时后，大量L1阳离子脂质体包裹的Cy-5siRNA成功进入了肝脏细胞，因此，将其作为基因药物的载体系统，具有非常大的优势。

实施例12、组织切片后共聚焦显微镜观察L2脂质/Cy-5-siRNA复合物在肝内分布

本实施例利用L2阳离子脂质包裹Cy-5-siRNA制备的脂质/siRNA复合物，动物给药后，肝脏组织切片后，共聚焦显微镜下观察L2脂质/siRNA复合物分布，从而探知载体脂质对基因药物的转运情况。

1.L2脂质/Cy-5siRNA复合物制备：L2脂质/Cy-5siRNA复合物制备方法及比例如实施例8。

2.组织切片方法如实施例10，

3.共聚焦显微镜Confocal（LeicaTSSP8)观察实验方法如实施例10

效果验证：L2脂质/Cy-5siRNA复合物组织切片后共聚焦显微镜观察复合物在肝内分布，如图17所示，由图可以看出，蓝色信号为DAPI染色的细胞核，绿色信号为细胞膜，红色信号为L1脂质/Cy-5siRNA。可见，在体内给药4小时后，大量L2阳离子脂质体包裹的Cy-5siRNA成功进入了肝脏细胞，因此，将其作为基因药物的载体系统，具有非常大的优势。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (6)

1.一种以氨基酸为头基的可电离阳离子脂质化合物，其特征在于，其结构式如式L2所示：

2.一种制备如权利要求1所述可电离阳离子脂质化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：在催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑存在的条件下，芴甲氧羰酰氯或二碳酸二叔丁酯修饰的赖氨酸，与亚油酸或地塞米松发生酰胺或酯化反应，即得。

3.一种由权利要求1所述的可电离阳离子脂质化合物制备的脂质体。

4.如权利要求3所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体在pH4.0条件下带正电、pH7.0条件下不带电或带负电。

5.一种如权利要求3所述的脂质体作为基因药物载体输送系统的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述基因药物为siRNA、microRNA、DNA或RNA表达载体。