CN106946854B - 炔丙胺修饰的嘧啶硫脲类化合物及其用途 - Google Patents

炔丙胺修饰的嘧啶硫脲类化合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN106946854B
CN106946854B CN201710150528.0A CN201710150528A CN106946854B CN 106946854 B CN106946854 B CN 106946854B CN 201710150528 A CN201710150528 A CN 201710150528A CN 106946854 B CN106946854 B CN 106946854B
Authority
CN
China
Prior art keywords
base
pyrimidine
ethyl
propyl
thiourea
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710150528.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106946854A (zh
Inventor
毛斐
徐以香
李晓康
刘文文
李剑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
East China University of Science and Technology
Original Assignee
East China University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by East China University of Science and Technology filed Critical East China University of Science and Technology
Priority to CN201710150528.0A priority Critical patent/CN106946854B/zh
Publication of CN106946854A publication Critical patent/CN106946854A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106946854B publication Critical patent/CN106946854B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一种由炔丙胺修饰的嘧啶硫脲类化合物及其用途。本发明公开的结构新颖的、由炔丙胺修饰的嘧啶硫脲类化合物具有胆碱酯酶抑制活性、单胺氧化酶活性、金属离子螯合性质、抑制金属离子诱导的自由基产生、抑制金属离子诱导Aβ聚集、低细胞毒性及体外实验具有良好的血脑透过率，且其制备工艺简洁和制备成本低，有望被开发为一类多功能治疗、改善和/或预防阿尔茨海默病症的药物。

Description

炔丙胺修饰的嘧啶硫脲类化合物及其用途
技术领域
本发明涉及一种嘧啶硫脲类化合物及其用途，具体地说，涉及一种由炔丙胺修饰的嘧啶硫脲类化合物及其可作为具有多靶点多功能的抗阿尔茨海默病药物。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)又名早老性痴呆症，是一种以老年斑(senile Plaque,Sp)、神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)形成及海马神经元丢失为主要病理特征的神经退行性疾病。主要临床表现为记忆能力减退及认知功能障碍等，并伴随有一系列精神病症状。AD病因复杂，发生发展过程中涉及各种复杂的调控网络和调控因子的变化，单一靶点的药物很难从根本上解决问题。多靶点疗法针对疾病发病机制中涉及的多个靶点来设计小分子化合物，对于AD这种多病因疾病，通过多个靶点的同时作用对该疾病治疗可能会达到更为理想的效果。
在AD众多发病机制中，胆碱能损伤假说得到大多数学者普遍认同，目前临床上用于治疗AD的药物也多为胆碱酯酶抑制剂。目前FDA批准的抗AD药物有五个，分别是多奈哌齐(Donepezil)、利斯的明(Rivastigmine)、加兰他敏(Galantamine)、他克林(Tacrine)、美金刚(Memantine)，其中前四个都是乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)抑制剂，美金刚是N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NMDAR)拮抗剂，他克林上市不久后由于肝毒性等副作用而被撤回。此外，石杉碱甲(Huperzine A)也是一种高效可逆的竞争性AChE抑制剂，是国内较为成功的治疗AD的药物。但这些药物作用靶点单一，只能控制或改善认知功能症状，并不能从根本上终止疾病进程。因此，对AD治疗药物的研究十分必要，研究开发新颖的AD治疗药物有着重要的医学和社会学意义。鉴于针对AD新靶点新机制的药物研发相继失败，AChE仍是如今最为有效的治疗靶点。因此，研究开发以乙酰胆碱酯酶抑制活性为主，兼具其他靶点的抗AD活性的化合物成为有治疗意义和价值的研究新热点。
单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)催化内源性和外源性单胺类物质的代谢，氧化脱氨产生过氧化氢，在人体中被认为是老化的标志，该酶活性的不断升高会引起整个机体机能、尤其是脑功能的逐步退化、衰老。MAO-A抑制剂主要影响与抑郁症和精神紊乱病相关的神经传递，用于治疗抑郁症和焦虑症；MAO-B抑制剂则主要影响脑内的黑质-纹状体系统，促进多巴胺(DA)等递质的分泌，可单独或组合用于治疗老年痴呆症(Riederer,Curr.Med.Chem.2004,11,2033-2043)。此外，在神经组织，尤其是在神经胶质细胞中MAO-B的表达水平随机体的老化而急剧升高，导致多巴胺代谢水平的增加，从而产生过多的过氧化氢，引起氧化应激反应而导致神经元死亡(Gaspar,J.Med.Chem.2011,54,5165-73)。MAO-B抑制剂不仅可以促进DA的释放，提高脑内的神经递质水平，改善AD患者的记忆认知功能，还可以减少氧化应激反应给神经细胞带来的氧化损伤及神经毒性作用，因此，MAO-B作为治疗AD的一个重要靶点已受到人们的广泛关注。
大量数据证明脑内的生物金属离子如Cu2+，Fe2+，Zn2+可以促进氧化应激(ROS)的发生以及Aβ的聚集，而且研究还发现，AD患者后期脑中都发现有这些金属离子的过度富集，具有氧化还原作用的金属离子，如铁离子和铜离子不仅会导致ROS的产生，而且会将这种氧化作用的危害传播扩散(Lee,Chem.Soc.Rev.2014,43,6672-6682.)。研究表明,Aβ并不是自发地聚集,而是与脑中的过量金属(如Cu2+，Fe2+，Zn2+)发生了一种年龄依赖性的作用，它使Aβ沉淀为富含金属的斑块。体外实验表明,金属离子能促进Aβ聚集体和淀粉样斑的形成，而金属螯合剂能使AD脑的淀粉样斑块组织溶解，同时减轻APP转基因鼠的大脑Aβ沉淀负荷。基于这些研究，合成具有金属离子鳌合作用的化合物有望成为一种新的治疗AD的策略。
发明内容
本发明的发明人经研究发现：一种结构新颖的、由炔丙胺修饰的嘧啶硫脲类化合物具有胆碱酯酶抑制活性、单胺氧化酶活性、金属离子螯合性质、抑制金属离子诱导的自由基产生、抑制金属离子诱导Aβ聚集、低细胞毒性及体外实验具有良好的血脑透过率，且其制备工艺简洁及制备成本低，有望被开发为一类多功能的治疗、改善和/或预防阿尔茨海默病症的药物。
本发明一个目的在于，提供一种结构新颖的、由炔丙胺修饰的嘧啶硫脲类化合物。
本发明所述的嘧啶硫脲类化合物为式Ⅰ所示化合物、或其在药学上可接受的盐：
式Ⅰ中，R为氢(H)，C1～C4烃基，C2～C4酰基，或由氰基(CN)或苯基取代的C1～C4烃基；n为1～3的整数。
本发明另一个目的在于，揭示上述嘧啶硫脲类化合物的一种用途，即式Ⅰ所示化合物、或其在药学上可接受的盐在制备抑制乙酰胆碱酯酶、抑制单胺氧化酶A(B)、抑制金属诱导的Aβ聚集和抑制金属离子诱导的自由基产生活性的抑制剂及金属离子(如铜离子)螯合剂中的应用，或，
式Ⅰ所示化合物、或其在药学上可接受的盐在制备治疗、改善和/或预防阿尔茨海默病症的具有多靶点功能的药物中的应用。
本发明还有一个目的在于，提供一种制备式Ⅰ所示化合物的方法。所述方法包括如下步骤：
(1)以取代咪唑(m为2或3，下同)为起始原料，由所述的取代咪唑与4-氨基-6-氯嘧啶反应，制备中间体(式ⅡA或ⅡB所示化合物)的步骤；
(2)由式ⅡA或ⅡB所示化合物与硫代异氰酸乙酯(CH3CH2NCS)反应，制备中间体(式ⅢA或ⅢB所示化合物)的步骤；
(3)由式ⅢB所示化合物与三溴化磷反应，制备中间体(式IV所示化合物)的步骤；
(4)由式ⅢA或IV所示化合物与炔丙胺或者氮甲基炔丙胺反应，得到部分目标化合物(式ⅠA或ⅠB所示化合物)的步骤；和，
(5)由式ⅠA所示化合物与卤代烃或酰氯反应，得到另一部分目标化合物(式ⅠC所示化合物)的步骤。
其中，R1为C2～C4烃基，C2～C4酰基，或由CN或苯基取代的C1～C4烃基；m为2或3；n为1～3的整数。
附图说明
图1.为化合物ⅠA-1和化合物ⅠB-1与金属离子混合物的紫外吸收光谱；
图2为Cu(II)-抗坏血酸及Cu(II)-抗坏血酸-化合物IA-1，IB-1，IB-2和IB-3氧化还原体系的荧光值随时间的变化曲线；
图3.为化合物IB-1抑制Cu2+诱导Aβ聚集测试的TEM图；
其中，(1)为新鲜Aβ1-42，(2)为Aβ1-42+Cu2+，(3)为Aβ1-42自身聚集，(4)为Aβ1-42+Cu2++化合物IB-1，(5)为Aβ1-42+Cu2++CQ。
图4.为dot blotting法测试化合物IB-1抑制Cu2+诱导Aβ聚集的结果图；
其中，1b代表被测化合物IB-1。
图5.为化合物IB-1对胎鼠原代皮层神经元的细胞毒性测试结果图；
其中，1b代表被测化合物IB-1。
图6.为化合物IB-1抑制Cu2+诱导的Aβ聚集所致细胞毒性测试结果图；
其中，1b代表被测化合物IB-1。
具体实施方式
在本发明一个优选的技术方案中，R为H，C1～C4烷基，乙酰基，丙炔基(曲线标记处为取代位，下同)或由CN或苯基取代的C1～C4烷基；
在进一步优选的技术方案中，R为H，甲基，乙基，正丙基，正丁基，乙酰基，或苄基。
适宜的本发明所述嘧啶硫脲类化合物(式Ⅰ所示化合物)的药用盐为：由式Ⅰ所示化合物与酸成盐。例如，与无机酸或有机酸的单或二酸所成的盐，所成的盐可以是盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐、三氟乙酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、马来酸盐、枸橼酸盐、对甲苯磺酸盐或甲磺酸盐等。这些盐可通过公知的成盐方法由式I的化合物与相应的酸反应制得。
本发明所述制备式Ⅰ所示化合物的方法，具体包括如下步骤：
(1)将4-氨基-6-氯嘧啶和碳酸铯或碳酸钾置于反应器中，加人N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)作溶剂，再加入取代咪唑升温至100℃-140℃，反应过夜。加入适量水，并用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，然后过滤，减压蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，便得到中间体(式ⅡA或ⅡB所示化合物)；
(2)将式ⅡA或ⅡB所示化合物和DMF置于反应器中，加入氢化钠，室温搅拌至少5分钟后，再加入硫代异氰酸乙酯(CH3CH2NCS)，在此状态保持至少半小时，向反应器中加适量水(猝灭反应)，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，得到中间体(式ⅢA或ⅢB所示化合物)；
(3)将式ⅢB所示化合物和二氯甲烷(溶剂)置于反应中，在室温条件下，滴加三溴化磷，并在室温状态保持至少十二小时，蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，得到中间体(式IV所示化合物)；
(4)将式ⅢA所示化合物与甲醇和二氯甲烷的混合物(甲醇∶二氯甲烷＝1∶1，v/v)置于反应其中，依次向该反应器中加入炔丙胺或者氮甲基炔丙胺氰基硼氢化钠和醋酸，在室温状态保持至少十二小时，再向该反应器中加入适量水(猝灭反应)，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，得到部分目标化合物(式ⅠA或ⅠB所示化合物)；或，
将式IV所示化合物和炔丙胺或氮甲基炔丙胺置于反应其中，向该反应器中加入碳酸钾，在室温状态保持至少十二小时，浓缩，残留物用硅胶柱层析纯化，得到部分目标化合物(式ⅠA或ⅠB所示化合物)；和，
(5)将式ⅠA所示化合物和乙腈(溶剂)置于反应器中，依次向该反应器中加入相应的卤代烃(R1X，R1为C2～C4烃基、或由CN或苯基取代的C1～C4烃基，X为卤素(F、Cl、Br或I))，三乙胺和催化量的碘化钾，在回流状态保持至少十二小时，蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，得到另一部分目标化合物(式ⅠC所示化合物)；或，
将式ⅠA所示化合物和二氯甲烷(溶剂)置于反应器中，向该反应器中加入酰氯(R2为C1～C3烷基)，在室温状态保持至少十二小时，蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，得到另一部分目标化合物(化合物ⅠC)。
下面通过实施例对本发明做进一步阐述，其目的仅在于更好理解本发明的内容。因此，所举之例不限制本发明的保护范围。
实施例1
1-(6-氨基密啶-4-基)-1H-咪唑-4-甲醛(式ⅡA所示化合物)的制备：
将0.96g(10mmol)1H-咪唑-4-甲醛溶于20ml的DMF中，依次加入1.30g(10mmol)的4-氨基-6-氯嘧啶，2.07g(15mmol)的碳酸钾，升温至100℃，搅拌反应12h。加入适量水，并用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，然后过滤，减压蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为甲醇∶二氯甲烷＝1∶30，得白色固体0.87g(式ⅡA所示化合物)，产率为46％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.83(s,1H),8.70(s,1H),8.64(s,1H),8.37(s,1H),7.35(s,2H),6.72(s,1H).
实施例2
2-(1-(6-氨基密啶-4-基)-1H-咪唑-4-基)乙-1-醇(式ⅡB-1所示化合物)的制备：
将1.12g(10mmol)的2-(1H-咪唑-4-基)乙-1-醇溶于20ml的DMF中，依次加入1.30g的(10mmol)的4-氨基-6-氯嘧啶，3.91g(12mmol)的碳酸铯，升温至140℃，搅拌反应12h。加入适量水，并用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，然后过滤，减压蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为甲醇∶二氯甲烷＝1∶30，得白色固体1.19g(式ⅡB-1所示化合物)，产率为58％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.33(s,1H),8.29(s,1H),7.54(s,1H),7.16(s,2H),6.50(s,1H),4.74–4.59(m,1H),3.70–3.60(m,2H),2.66(t,J＝6.9Hz,2H).
实施例3
3-(1-(6-氨基密啶-4-基)-1H-咪唑-4-基)丙-1-醇(式ⅡB-2所示化合物)的制备：
将1.26g(10mmol)的3-(1H-咪唑-4-基)丙-1-醇溶于20ml的DMF中，依次加入1.30g(10mmol)的4-氨基-6-氯嘧啶，3.91g(12mmol)的碳酸铯，升温至140℃，搅拌反应12h。加入适量水，并用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，然后过滤，减压蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为甲醇∶二氯甲烷＝1∶30，得白色固体0.90g(式ⅡB-2所示化合物)，产率为41％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.33(d,J＝1.1Hz,1H),8.29(s,1H),7.50(s,1H),7.13(s,1H),6.50(d,J＝0.7Hz,1H),4.47(t,J＝5.2Hz,1H),3.44(dd,J＝11.7,6.3Hz,2H),2.59–2.51(m,2H),1.81–1.69(m,2H).
实施例4
1-乙基-3-(6-(4-甲酰基-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(式ⅢA所示化合物)的制备：
将378mg(2mmol)的1-(6-氨基密啶-4-基)-1H-咪唑-4-甲醛(式ⅡA所示化合物)溶于10ml的DMF中，加入96mg(2.4mmol)氢化钠，室温搅拌5min，然后加入174mg(2mmol)硫代异氰酸乙酯，室温搅拌0.5h。加适量水猝灭反应，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，然后过滤，减压蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为甲醇∶二氯甲烷＝1∶40，得白色固体331mg(式ⅢA所示化合物)，产率为60％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.13(t,J＝5.1Hz,1H),11.10(s,1H),9.88(s,1H),8.83(s,1H),8.61(s,2H),7.42(s,1H),3.72–3.57(m,2H),1.23(t,J＝7.2Hz,3H).
实施例5
1-乙基-3-(6-(4-(2-羟乙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(式ⅢB-1所示化合物)的制备
除2-(1-(6-氨基密啶-4-基)-1H-咪唑-4-基)乙-1-醇(式ⅡB-1所示化合物)替换1-(6-氨基密啶-4-基)-1H-咪唑-4-甲醛(式ⅡA所示化合物)外，其它步骤同实施例4，得白色固体239mg(式ⅢB-1所示化合物)，产率41％。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.69(d,J＝0.9Hz,1H),8.52(d,J＝1.2Hz,1H),7.64(s,1H),6.98(d,J＝0.9Hz,1H),3.84(t,J＝6.7Hz,2H),3.74(q,J＝7.3Hz,2H),2.82(t,J＝6.7Hz,2H),1.31(t,J＝5.6Hz,3H).HRMS(EI):m/z calcd C12H16N6OS(M+)292.1106,found292.1116.
实施例6
1-乙基-3-(6-(4-(2-羟丙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(式ⅢB-2所示化合物)的制备
除3-(1-(6-氨基密啶-4-基)-1H-咪唑-4-基)丙-1-醇(式ⅡB-2所示化合物)替换1-(6-氨基密啶-4-基)-1H-咪唑-4-甲醛(式ⅡA所示化合物)外，其它步骤同实施例4，得白色固体214mg，产率35％(式ⅢB-2所示化合物)。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.19(t,J＝5.0Hz,1H),10.92(s,1H),8.74(s,1H),8.35(s,1H),7.42(s,1H),7.25(s,1H),4.48(t,J＝5.2Hz,1H),3.70–3.59(m,2H),3.45(dd,J＝11.7,6.3Hz,2H),2.56(t,J＝7.5Hz,2H),1.81–1.71(m,2H),1.22(t,J＝7.2Hz,3H).
实施例7
1-(6-(4-(2-溴乙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(式IV-1所示化合物)的制备：
将584mg(2mmol)的1-乙基-3-(6-(4-(2-羟乙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(式ⅢB-1所示化合物)溶于30ml的二氯甲烷中，滴加541mg(2mmol)的PBr3，室温搅拌过夜。减压蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为甲醇：二氯甲烷体系，得白色固体199mg(式IV-1所示化合物)，产率为28％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.19(t,J＝5.6Hz,1H),10.98(s,1H),8.75(s,1H),8.40(s,1H),7.61(s,1H),7.27(s,1H),3.76(t,J＝6.9Hz,2H),3.64(dt,J＝14.1,7.1Hz,2H),3.11(t,J＝6.9Hz,2H),1.22(t,J＝5.8Hz,3H).
实施例8
1-(6-(4-(2-溴丙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(式IV-2所示化合物)的制备：
除以式ⅢB-2所示化合物替换式ⅢB-1所示化合物外，其它步骤与实施例7相同，得221mg白色固体(标题化合物)，产率为30％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.27(s,1H),11.03(t,J＝5.4Hz,1H),9.88(s,1H),8.88(s,1H),8.00(d,J＝1.3Hz,1H),7.46(s,1H),4.36(t,J＝7.3Hz,2H),3.69–3.58(m,2H),3.02(t,J＝7.0Hz,2H),2.63–2.54(m,2H),1.21(t,J＝7.2Hz,3H).
实施例9
1-乙基-3-(6-(4-((丙-2-炔-1-基氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目标化合物IA-1)的制备：
将1-乙基-3-(6-(4-甲酰基-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(式ⅢA所示化合物)溶于20ml的甲醇和二氯甲烷的混合物(甲醇∶二氯甲烷＝1∶1)中，依次加入41mg(0.75mmol)的炔丙胺和45mg(0.75mmol)的醋酸，室温搅拌10分钟，再加入63mg(1mmol)的氰基硼氢化钠，室温搅拌过夜。减压蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为甲醇：二氯甲烷体系，得84mg白色固体(标题化合物)，产率为53％。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.71(d,J＝0.9Hz,1H),8.55(d,J＝1.2Hz,1H),7.76(s,1H),7.02(d,J＝1.0Hz,1H),3.86(s,2H),3.74(q,J＝7.2Hz,2H),3.46(d,J＝2.5Hz,2H),2.67(t,J＝2.5Hz,1H),1.31(t,J＝7.3Hz,3H).HRMS(EI):m/z calcd C14H17N7S(M+)315.1266,found315.1269.
实施例10
1-乙基-3-(6-(4-(2-(丙-2-炔-1-基氨基)乙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目标化合物IA-2)的制备：
将178mg(0.5mmol)的1-(6-(4-(2-溴乙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(式IV-1所示化合物)溶于1ml的炔丙胺，加入172mg(1.25mmol)的碳酸钾，室温搅拌过夜。减压蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为甲醇：二氯甲烷体系，得115mg黄色固体(标题化合物)，Mp 159-160℃，产率为70％。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.70(d,J＝0.9Hz,1H),8.52(d,J＝1.3Hz,1H),7.63(s,1H),6.98(d,J＝0.9Hz,1H),3.74(q,J＝7.2Hz,2H),3.44(d,J＝2.5Hz,2H),3.00(t,J＝7.2Hz,2H),2.81(t,J＝7.2Hz,2H),2.62(t,J＝2.5Hz,1H),1.31(t,J＝7.3Hz,3H).HRMS(EI):m/z calcd C15H19N7S(M+)329.1423,found 329.1424.
实施例11
1-乙基-3-(6-(4-(3-(丙-2-炔-1-基氨基)丙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目标化合物IA-3)的制备
除以1-(6-(4-(2-溴丙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(式IV-2所示化合物)替换式IV-1所示化合物外，其它步骤同实施例10，得黄色固体120mg，Mp122-124℃，产率为65％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.19(t,J＝5.3Hz,1H),10.92(s,1H),8.74(s,1H),8.35(d,J＝1.1Hz,1H),7.44(s,1H),7.24(s,1H),3.68–3.60(m,2H),3.30(d,J＝2.3Hz,2H),3.10(t,J＝2.3Hz,1H),2.56–2.52(m,2H),2.38(t,J＝7.2Hz,2H),2.19(s,3H),1.80–1.67(m,2H),1.22(t,J＝7.2Hz,3H).HRMS(EI):m/z calcd C17H23N7S(M+)357.1736,found357.1739.
实施例12
1-乙基-3-(6-(4-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目标化合物IB-1)的制备
除氮甲基炔丙胺替换实施例9中炔丙胺外，其它具体实施步骤同实施例9，得49mg白色固体(标题化合物)，Mp 183–184℃，产率为30％。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.71(d,J＝1.0Hz,1H),8.54(d,J＝1.3Hz,1H),7.78(s,1H),7.02(d,J＝1.0Hz,1H),3.74(q,J＝7.3Hz,2H),3.65(s,2H),3.39(d,J＝2.4Hz,2H),2.71(t,J＝2.4Hz,1H),2.38(s,3H),1.31(t,J＝7.3Hz,3H).HRMS(EI):m/z calcd C15H19N7S(M+)329.1423,found 329.1425.
实施例13
1-乙基-3-(6-(4-(2-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)乙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目标化合物IB-2)的制备：
除氮甲基炔丙胺替换实施例10中炔丙胺外，其它具体实施步骤同实施例10，得007mg黄色固体(标题化合物)，Mp 162-164℃，产率为68％。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.70(d,J＝0.9Hz,1H),8.51(d,J＝1.3Hz,1H),7.65(s,1H),6.98(d,J＝0.9Hz,1H),3.74(q,J＝7.3Hz,2H),3.44(d,J＝2.4Hz,2H),2.87–2.77(m,4H),2.69(t,J＝2.4Hz,1H),2.40(s,3H),1.35–1.31(m,3H).HRMS(ESI):m/z calcdC16H21N7S[M+H]+344.1613,found 344.1657.
实施例14
1-乙基-3-(6-(4-(3-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)丙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目标化合物IB-3)的制备：
除以1-(6-(4-(2-溴丙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(式IV-2所示化合物)替换式IV-1所示化合物及氮甲基炔丙胺替换炔丙胺外，其它具体实施步骤同实施例10，得127mg黄色固体(标题化合物)，Mp 122-124℃，产率为71％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.19(t,J＝5.3Hz,1H),10.92(s,1H),8.74(s,1H),8.35(d,J＝1.1Hz,1H),7.44(s,1H),7.24(s,1H),3.68–3.60(m,2H),3.30(d,J＝2.3Hz,2H),3.10(t,J＝2.3Hz,1H),2.56–2.52(m,2H),2.38(t,J＝7.2Hz,2H),2.19(s,3H),1.80–1.67(m,2H),1.22(t,J＝7.2Hz,3H).HRMS(EI):m/z calcd C17H23N7S(M+)357.1736,found357.1739.
实施例15
1-乙基-3-(6-(4-((乙基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目标化合物IC-1)的制备：
将158mg(0.5mmol)的1-乙基-3-(6-(4-((丙-2-炔-1-基氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目标化合物IA-1)溶于8ml乙腈中，依次加入86mg(0.55mmol)碘乙烷，101mg(1mmol)三乙胺和催化量的碘化钾，反应液回流反应12h，减压蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为甲醇：二氯甲烷体系，得46mg黄色固体(标题化合物)，Mp 163-164℃，产率为27％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.18(s,1H),10.91(s,1H),8.75(s,1H),8.39(s,1H),7.54(s,1H),7.24(d,J＝32.3Hz,1H),3.64(dt,J＝15.4,7.7Hz,2H),3.58(s,2H),3.38(s,2H),3.14(s,1H),2.59–2.52(m,2H),1.22(t,J＝6.3Hz,3H),1.03(t,J＝7.0Hz,3H).HRMS(EI):m/z calcd C16H21N7S(M+)343.1579,found 343.1583.
实施例16
1-乙基-3-(6-(4-((丙-2-炔-1-基(丙基)氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目标化合物IC-2)的制备：
除以1-碘丙烷替换实施例15中碘乙烷外，其它具体实施步骤同实施例15，得54mg白色固体(标题化合物)，Mp 158-159℃，产率为30％。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.71(d,J＝1.0Hz,1H),8.53(d,J＝1.3Hz,1H),7.75(s,1H),7.02(d,J＝1.0Hz,1H),3.74(q,J＝7.3Hz,2H),3.69(s,2H),3.43(d,J＝2.4Hz,2H),2.65(t,J＝2.4Hz,1H),2.56(dd,J＝8.7,6.7Hz,2H),1.56(dq,J＝14.9,7.4Hz,2H),1.31(t,J＝7.3Hz,3H),0.93(t,J＝7.4Hz,3H).HRMS(EI):m/z calcd C17H23N7S(M+)357.1736,found 357.1734.
实施例17
1-乙基-3-(6-(4-((丁基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目标化合物IC-3)的制备：
除以1-碘丁烷替换实施例15中碘乙烷外，其它具体实施步骤同实施例15，得52mg浅黄色固体(标题化合物)，Mp 112-114℃，产率为28％。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.71(d,J＝0.9Hz,1H),8.53(d,J＝1.2Hz,1H),7.76(s,1H),7.03(d,J＝0.9Hz,1H),3.74(dd,J＝14.5,7.2Hz,2H),3.70(s,2H),3.44(d,J＝2.4Hz,2H),2.66(t,J＝2.3Hz,1H),2.63–2.58(m,2H),1.53(dt,J＝15.1,7.5Hz,2H),1.41–1.34(m,2H),1.31(t,J＝7.3Hz,3H),0.94(t,J＝7.3Hz,3H).HRMS(EI):m/z calcd C18H25N7S(M+)371.1892,found371.1895.
实施例18
1-乙基-3-(6-(4-((氰甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目标化合物IC-4)的制备：
除以2-溴乙腈替换实施例15中碘乙烷外，其它具体实施步骤同实施例15，得64mg黄色固体(标题化合物)，Mp 151-152℃，产率为36％。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.72(d,J＝0.9Hz,1H),8.57(d,J＝1.2Hz,1H),7.84(s,1H),7.02(d,J＝0.9Hz,1H),3.82–3.77(m,4H),3.74(dd,J＝14.5,7.3Hz,2H),3.51(d,J＝2.4Hz,2H),2.79(t,J＝2.4Hz,1H),1.31(t,J＝7.3Hz,3H).HRMS(ESI):m/z calcd C16H18N8S[M+H]+355.1409,found 355.1454.
实施例19
N-(1-(6-(3-乙基硫脲)嘧啶-4-基)-1H-咪唑-4-基)甲基-N-(丙-2-炔-1-基)乙酰胺(目标化合物IC-5)的制备：
将158mg(0.5mmol)1-乙基-3-(6-(4-((丙-2-炔-1-基氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目标化合物IA-1)溶于5ml二氯甲烷中，依次加入47mg(0.75mmol)乙酰氯和101mg(1mmol)三乙胺，反应液室温反应12h，减压蒸除溶剂，残留物用硅胶柱层析纯化，洗脱剂为甲醇：二氯甲烷体系，得80mg白色固体，Mp 197-199℃，产率为45％。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.76–8.69(m,1H),8.57(dd,J＝15.0,1.1Hz,1H),7.84(d,J＝33.9Hz,1H),7.03(d,J＝7.2Hz,1H),4.67(d,J＝19.6Hz,2H),4.25(d,J＝2.3Hz,2H),3.75(q,J＝7.2Hz,2H),2.74(dt,J＝59.9,2.5Hz,1H),2.28(d,J＝20.2Hz,3H),1.33(t,J＝7.3Hz,3H).HRMS(ESI):m/z calcd C16H19N7OS[M+H]+358.1405,found 358.1448.
实施例20
1-(6-(4-((苄基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(目标化合物IC-6)的制备
除以苄溴替换实施例15中碘乙烷外，其它具体实施步骤同实施例15，得97mg白色固体(标题化合物)，Mp 146-147℃，产率为48％。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.71(d,J＝0.9Hz,1H),8.55(d,J＝1.3Hz,1H),7.78(s,1H),7.40(d,J＝7.0Hz,2H),7.31(t,J＝7.3Hz,2H),7.25(t,J＝7.2Hz,1H),7.03(d,J＝0.9Hz,1H),3.84–3.62(m,6H),2.71(t,J＝2.3Hz,1H),1.31(t,J＝7.3Hz,3H).HRMS(EI):m/z calcd C21H23N7S(M+)405.1736,found 405.1737.
实施例21
1-(6-(4-((双(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(目标化合物IC-7)的制备：
除以3-溴丙-1-炔替换实施例15中碘乙烷外，其它具体实施步骤同实施例15，得64mg白色固体(标题化合物)，Mp 151-153℃，产率为36％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.19(t,J＝5.3Hz,1H),10.93(s,1H),8.76(s,1H),8.40(d,J＝0.9Hz,1H),7.56(s,1H),7.29(s,1H),3.68–3.61(m,2H),3.59(s,2H),3.40(d,J＝2.1Hz,4H),3.22(t,J＝2.1Hz,2H),1.22(t,J＝7.2Hz,3H).HRMS(EI):m/z calcd C17H19N7S(M+)353.1423,found 353.1402.
实施例22
1-乙基-3-(6-(4-(2-(乙基(丙-2-炔-1-基)氨基)乙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目标化合物IC-8)的制备：
除以1-乙基-3-(6-(4-(2-(丙-2-炔-1-基氨基)乙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目标化合物IA-2)替换实施例15中目标化合物IA-1外，其它具体实施步骤同实施例15，得61mg白色固体(标题化合物)，Mp 154-155℃，产率为33％。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.69(d,J＝0.8Hz,1H),8.51(d,J＝1.2Hz,1H),7.64(s,1H),6.97(d,J＝0.8Hz,1H),3.73(q,J＝7.3Hz,2H),3.54(d,J＝2.3Hz,2H),2.95–2.86(m,2H),2.86–2.79(m,2H),2.70(dd,J＝14.4,7.2Hz,2H),2.66(t,J＝2.3Hz,1H),1.29(t,J＝7.2Hz,3H),1.12(t,J＝7.2Hz,3H).HRMS(EI):m/z calcd C17H23N7S(M+)357.1736,found357.1738.
实施例23
1-(6-(4-(2-((氰甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基)乙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲(化合物IC-9)的制备：
除以1-乙基-3-(6-(4-(2-(丙-2-炔-1-基氨基)乙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲(目标化合物IA-2)替换实施例15中目标化合物IA-1，及以溴乙腈替换实施例15中碘乙烷外，得64mg白色固体(标题化合物)，Mp 159-160℃，产率为35％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.19(t,J＝5.3Hz,1H),10.95(s,1H),8.74(s,1H),8.36(d,J＝1.3Hz,1H),7.52(s,1H),7.25(s,1H),3.84(s,2H),3.68–3.59(m,2H),3.45(d,J＝2.4Hz,2H),3.30(t,J＝2.4Hz,1H),2.83(t,J＝6.9Hz,2H),2.77–2.71(m,2H),1.22(t,J＝7.2Hz,3H).HRMS(EI):m/z calcd C17H20N8S(M+)368.1532,found 368.1515.
实施例24
发明所述的嘧啶硫脲类化合物对乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BuChE)的活性抑制测试及结果。
选取大鼠皮层酶原作为乙酰胆碱酯酶酶原，在最适的酶反应条件和反应体系中，可将本发明所述的嘧啶硫脲类化合物(简称为“底物”)加到反应模板上，通过AChE与底物的反应，用比色法来检测AChE抑制活性。
同样，以大鼠皮层酶原的丁酰胆碱酯酶(BuChE)作为酶原，在最适的酶反应条件和反应体系中，可将底物加到反应模板上，通过BuChE与底物的反应用比色法来检测酶的活性，活性数据如表1(发明所述的嘧啶硫脲类化合物对AChE和BuChE抑制活性数据)所示。
表1.
SI定义为IC50(rBuChE)/IC50(rAChE)。
由表1可知，发明所述的嘧啶硫脲类化合物对乙酰胆碱酯酶(AChE)均具有抑制活性(抑制活性最好的化合物IC50值为228nM)。说明发明所述的嘧啶硫脲类化合物可以被研发为AChE抑制剂类抗AD药物。
本发明所述的嘧啶硫脲类化合物对丁酰胆碱酯酶(BuChE)的抑制活性比较弱(IC50值大于40μM)，说明该类化合物对AChE具有较好的选择抑制活性，可以被研发为选择性AChE抑制剂类抗AD药物。
实施例25
发明所述的嘧啶硫脲类化合物对单胺氧化酶A(B)的抑制活性和体外抗氧化活性测试：
一、发明所述的嘧啶硫脲类化合物对单胺氧化酶A(B)的抑制活性测试：
采用Invtrogen公司的MAO试剂盒测试发明所述的嘧啶硫脲类化合物对人重组单胺氧化酶的抑制活性。具体操作步骤如下：
1、溶液的配制：
(1)1×buffer配置：取5×buffer 5mL，加入去离子水20mL，现配现用。
(2)MAO-A储备液分装(sigma，0.5mL)：将MAO-A在37℃水浴快速解冻，在冰分装为10μL×50管，每管含蛋白50μg，约为4.8U。
(3)MAO-A测试液配置(1.0mL)：将MAO-A储备液10μL在37℃水浴快速解冻，用冷的1×buffer稀释至4.0mL，置于冰上备用。
(4)MAO-B储备液分装(sigma，0.5mL)：将MAO-B在37℃水浴快速解冻，在冰分装为30μL×16管，每管含蛋白150μg。
(5)MAO-B测试液配置：将MAO-A储备液30μL在37℃水浴快速解冻，用冰1×buffer稀释至2mL，置于冰上备用。
(6)100mM MAO-A底物(对羟基苯乙胺，tyramine)储备液配置：将对羟基苯乙胺溶于1.2mL 1×buffer中，分装为200μL×6管。置于-20℃保存。
(7)100mM MAO-B底物(苯乙胺，benzeylamine)储备液配置：将苯乙胺溶于1.2mL1×buffer中，分装为200μL×6管。置于-20℃保存。
(8)0.5mM MAO-A抑制剂(氯吉兰，Clorgyline)储备液配置：将氯吉兰溶于1.0mL去离子水中。置于-20℃保存。
(9)0.5mM MAO-B抑制剂(巴吉林，pargyline)储备液配置：将巴吉林溶于1.0mL去离子水中。置于-20℃保存。
(10)200U/mL HRP储备液配置：将HRP溶于1mL 1×buffer中，分装为100μL×10管。-20℃保存。
(11)20mM Amplex Red reagent(ComponentA)储备液配置：将1mg Amplex Redreagent溶于200μL DMSO中，避光保存备用。
(12)10mM H2O2储备液配置：取3％H2O2溶液11.5μL加入488.5μL 1×buffer稀释，使用时配置到适当浓度。
(13)化合物溶液制备：测试时用1×buffer将10mM DMSO储备液稀释至所需浓度。
2、MAO-A(B)测试步骤
(1)依次在96孔板中加入MAO-A(B)测试液80μL，20μL不同浓度化合物溶液37℃避光孵育15min。对照组用20μL 1×buffer代替化合物溶液。
(2)在暗室中将100mM MAO-A(B)底物(对羟基苯乙胺或苯乙胺)储备液200μL，200U/ml HRP储备液100μL，20mM Amplex Red reagent储备液200μL加入至9.5mL 1×buffer中作为Amplex Red reagent工作溶液。
(3)在暗室中将100μL上述Amplex Red reagent工作溶液分别加入96孔黑板中，混匀，37℃避光孵育15min测荧光值，激发波长：545nM；发射波长590nM。
具体测试结果见表2.(发明所述的嘧啶硫脲类化合物对单胺氧化酶A(B)的抑制活性及抗氧化活性数据)。
二、发明所述的嘧啶硫脲类化合物体外抗氧化活性测试：
采用ORAC-TL法测试发明所述的嘧啶硫脲类化合物的体外抗氧化能力。具体是以水溶性维生E(Trolox)作为标准，被测化合物的ORAC值用化合物的抗氧化能力与Trolox的抗氧化能力的比值表示(Trolox的ORAC值等于1)。具体操作步骤如下：吸取不同浓度的化合物或trolox20μL与FL(0.117μmol/L)120μL置于96孔黑板中，混匀后37℃孵育10min，快速加入AAPH(40.0mM)60μL引发自由基反应，以激发波长485nm，发射波长535nm每隔2min记录一次荧光值，共记录3h，以20μL缓冲液代替化合物作为空白。保护面积按照下式计算：
其中f0是在0min的荧光值，fi是在i min的荧光值.
样品ORAC值以trolox值当量表达，计算公式为：[(AUCSample–AUCblank)/(AUCTrolox–AUCblank)]×[Trolox的浓度/样品的浓度)]。
具体测试结果见表2.(发明所述的嘧啶硫脲类化合物对单胺氧化酶A(B)的抑制活性及抗氧化活性数据)。
表2.
续表2
表2中，SI定义为IC50(MAO-A)/IC50(MAO-B)，n.t.表示未测试，抑制率为：[1-(Fi-Fblank)/(Fcontrol-Fblank))]×100％,其中Fblank为背景吸收，Fcontrol为对照组荧光值，Fi为化合物组荧光值。
由表2.可知，化合物IA-1，IB-1，IB-2和IB-3具有较好的MAO-A(B)抑制活性，其中化合物IA-1和IB-2对MAO-A和MAO-B都具有较好的抑制活性，IB-1和IB-3对MAO-B抑制活性较好，而对MAO-A抑制活性较弱，说明化合物IB-1和IB-3是较好的MAO-B选择性抑制剂。说明本发明的部分化合物可以发展成为AChE/MAO-B双重抑制剂用于阿尔茨海默病的治疗。
此外，在发明所述的嘧啶硫脲类化合物中有一半左右具有较好的抗氧化能力(ORAC值大于1)，其中化合物IC-1抗氧化能力最好(ORAC值为1.383)。因此，部分发明所述的嘧啶硫脲类化合物有望被开发为新一类抗氧化剂。
实施例26
发明所述的嘧啶硫脲类化合物对金属离子螯合作用的测试：
以化合物IA-1和化合物IB-1为例，测试其与金属离子的螯合作用。以紫外吸收分光光度计测量化合物与金属混合后的紫外吸收变化，以考察化合物是否与金属离子有螯合作用。具体操作步骤如下：
1、溶液配制方法
20mM pH为7.4HEPES(150mM NaCl)缓冲溶液配制：称取hepes 2.383g，NaCl4.383g加入超纯水定容至500mL，用少量NaOH溶液调PH为7.4。
金属离子溶液配制：称取一定量的CuSO4、FeSO4和ZnCl2用超纯水配制到浓度为10mM。然后再用20mM HEPES缓冲溶液稀释至400μM。
化合物溶液配制：称取一定量化合物用DMSO配制到10mM。然后再用20mM HEPES缓冲溶液稀释至50μM。
2、操作步骤
取5支2mL离心管，每管加150μL的HEPES缓冲溶液和800μL的50μM的化合物溶液，再分别加入50μL的400μM的CuSO4、FeSO4、FeCl3和ZnCl2溶液和50μL的HEPES缓冲溶液。空白为4μL的DMSO溶液加996μL的HEPES缓冲溶液溶液。混匀后在室温下放置1h，倒入英皿测其在200-500nm的吸收，每个测三次，取平均值。实验结果见图1。
由图1可知，化合物IA-1和化合物IB-1选择性螯合Cu2+，而与Fe2+、Fe3+、Zn2+没有螯合作用(上述实施例中制备的其它化合物也有类似性质，在此不再一一赘述)。所以，发明所述的嘧啶硫脲类化合物是一类选择性Cu2+螯合剂。
实施例27
发明所述的嘧啶硫脲类化合物对金属铜离子(I/II)引起的自由基的抑制作用实验。
以化合物IA-1，化合物IB-1，化合物IB-2和化合物IB-3为例，以已报道的金属离子螯合剂EDTA为阳性对照，具体实验方法如下：
1、溶液的配制：
20mM pH为7.4磷酸缓冲溶液(150mM NaCl)配制：称取KH2PO41.09g，2.383g，NaCl2.34g加入超纯水定容至400mL，用少量NaOH溶液调pH为7.4。
20mM pH为9.0磷酸缓冲溶液(150mM NaCl)配制：称取KH2PO4 1.09g，2.383g，NaCl2.34g加入超纯水定容至400mL，用少量NaOH溶液调pH为9.0。
1mM甲磺酸去铁胺溶液配制：称取65.7mg甲磺酸去铁胺用100.0mL 20mM pH为7.4磷酸缓冲溶液溶解，-20℃保存。测试时用20mM pH为7.4磷酸缓冲溶液稀释至20μM。
5mM香豆素-3-羧酸溶液配制：称取19.0mg香豆素-3-羧酸用20.0mL 20mM pH为9.0磷酸缓冲溶液溶解，再调pH值至7.4，-20℃保存。测试时用20mM pH为7.4磷酸缓冲溶液稀释至500μM。
10mM抗坏血酸溶液配制(现配现用)：称取17.6mg抗坏血酸溶液用10.0mL 20mM pH为7.4磷酸缓冲溶液溶解。然后再用20mM pH为7.4磷酸缓冲溶液稀释至300μM。
金属离子溶液配制：称取一定量的CuSO4用超纯水配制到浓度为10mM。然后再用20mM pH为7.4磷酸缓冲溶液稀释至100μM。
化合物溶液配制：称取一定量化合物用甲醇配制到5mM。然后再用20mM pH为7.4磷酸缓冲溶液稀释至50μM。
2、操作步骤：
在96孔黑板中选取6个孔，分别依次加入60μL 50μM化合物(或60μL 20mM pH为7.4磷酸缓冲溶液)，10μL 100μM CuSO4溶液，10μL 20μM甲磺酸去铁胺溶液，20μL 500μM香豆素-3-羧酸溶液，然后快速加入100μL 300μM抗坏血酸溶液37℃引发自由基反应，以激发波长390nm，发射波长450nm每隔30s记录一次荧光值，共记录40min，以20μL缓冲液代替化合物作为空白。每孔均含甲醇0.1％。实验结果见图2。
由图2可以看出，化合物IA-1，化合物IB-1，化合物IB-2和化合物IB-3具有抑制金属离子诱导的自由基产生的能力(上述实施例中制备的其它化合物也有类似性质，恕不一一赘述)。因此发明所述的嘧啶硫脲类化合物可以发展为一类多功能抗AD药物。
实施例28
发明所述的嘧啶硫脲类化合物抑制Cu2+诱导Aβ聚集的测试。
以化合物IB-1为例，以已报道的金属离子螯合剂CQ为阳性对照，以透射电子显微镜(TEM)的方法和dot blotting方法测试化合物对Cu2+诱导Aβ聚集抑制活性，实验方法如下：
1、溶液的配制：
(1)20μM pH为6.6HEPES(150μM NaCl)缓冲溶液配制：称取hepes 2.38mg，NaCl4.38mg加入超纯水500mL溶解，用少量NaOH溶液调pH至6.6。
(2)75μM Aβ1-42蛋白溶液配制：将0.1mg蛋白溶解于10μL 1％NH4OH溶液中，加256μL20μM pH为6.6HEPES缓冲溶液稀释至75μM，分装10μL每管，置于-80℃保存备用。
2、样品制备
化合物样品：取10μL分装好的Aβ1-42，加入10μL 75μMCu2+，室温放置2min，再加化合物IB-1或CQ(75Μm)10μL。混匀37℃孵育24h。
对照样品1：取10μL分装好的Aβ1-42，加入10μL 75μM Cu2+，室温放置2min，再加20μMpH为6.6HEPES缓冲溶液10μL，混匀37℃孵育24h。
对照样品2：取10μL分装好的Aβ1-42，加入20μM pH 6.6HEPES缓冲溶液20μL，混匀37℃孵育24h。
对照样品3：取10μL分装好的新鲜Aβ1-42，加入20μM pH 6.6HEPES缓冲溶液20μL，混匀37℃孵育0h。
3、透射电子显微镜(TEM)方法测试化合物IB-1抑制Cu2+诱导Aβ聚集：
取10μL样品(化合物样品及对照样品1～3)置于铜网上15min，然后用滤纸吸除多余的液体，置于铜网上的样品再与10μL 2％磷钨酸作用20s，然后再用滤纸吸除多余的液体。用JEM-1400电镜对制备好的观测样品进行观察，选取不同的区域进行拍照。实验结果见图3。
由图3可知，Aβ1-42在有Cu2+存在的情况下，孵育24h后聚集程度很严重(图3-(2))，而当加入化合物IB-1和CQ时，Aβ1-42的聚集程度得到改善(上述实施例中制备的其它化合物也有类似性质，恕不赘述)。因此，发明所述的嘧啶硫脲类化合物具有抑制Cu2+诱导Aβ聚集的能力。
4、dot blotting方法测试化合物IB-1抑制Cu2+诱导Aβ聚集：
化合物IB-1和Aβ的处理方法同电镜实验，样品37℃孵育24h后取5μl滴于0.2μm的NC膜上，室温风干30min后加入5％脱脂奶粉封闭1h后，分别加入A11(1:500)和6E10(1:1000)一抗4℃孵育过夜，TBST洗3次后加入相应二抗室温孵育2h，TBST洗3次，ECL化学发光检测。实验结果见图4.。图4的实验结果与图3电镜实验的结果是一致的，Cu2+可诱导Aβ1-42加速聚集，化合物IB-1和阳性药CQ可显著抑制Cu2+诱导的Aβ聚集。
实施例29
发明所述的嘧啶硫脲类化合物的细胞毒性测试：
采用MTT法检测发明所述的嘧啶硫脲类化合物对神经细胞的毒性。以化合物IB-1为例，多奈哌齐为阳性药。具体操作步骤如下：
将孕17天的孕鼠脱颈椎处死，放入75％酒精中消毒片刻，暴露腹腔后取出胎鼠，解剖显微镜下分离皮层，用眼科剪剪碎，温热的胰酶(含0.4％v/v的DNase I)37℃消化15min。吸取可见的组织团块到DMEM-HG培养液(10％FBS)中终止消化，吹散组织后静置过筛网，稀释至3×105个/ml种96孔板。4h后换成Neurobasal培养液(含2％v/v B27，0.5mM谷氨酰胺，0.1％v/v双抗)，后每隔3天半换液。
原代皮层神经元培养至第9天后，换成新鲜培养液并加入相应浓度待测药物，37℃孵育24h后加入MTT，3h后弃上清液加入100μl的DMSO裂解细胞摇匀，酶标仪490nm波长检测吸光度。实验结果见图5.。
由图5可知，原代皮层神经元经不同浓度化合物IB-1处理24h后展现出较低的细胞毒性，10μM和30μM的化合物对原代皮层神经元均无显著毒性，100μM化合物呈现出显著但较低的细胞毒性(上述实施例中制备的其它化合物也有类似性质，恕不赘述)。因此，发明所述的嘧啶硫脲类化合物表现出低细胞毒性。
此外，由于发明所述的嘧啶硫脲类化合物具有金属离子螯合作用，可以抑制由金属离子诱导的β-淀粉样蛋白(Aβ)的聚集，所以此类化合物可抑制Cu2+诱导的Aβ聚集所致细胞毒性。具体测试实验的步骤如下：
原代皮层神经元培养9天后，加入相应组别Aβ样品，37℃孵育24h进行MTT检测细胞存活率。EGCG和CQ分别为Aβ自发聚集和Cu2+诱导的Aβ聚集的阳性药。实验结果见图6.。
由图6可知，Aβ+Cu2+组较Aβ(alone)组具有更高的细胞毒性，化合物IB-1可显著逆转这一现象(上述实施例中制备的其它化合物也有类似性质，恕不赘述)。因此，发明所述的嘧啶硫脲类化合物对于Cu2+诱导的Aβ聚集所致细胞损伤具有一定的保护作用。
实施例30
发明所述的嘧啶硫脲类化合物透过血脑屏障能力的测定：
采用平行人造膜通透性测定方法(parallel artificial membranepermeability assay,PAMPA)测定化合物透过血脑屏障的能力。该方法通过化合物的透膜常数Pe的值来评价其透过血脑屏障的能力，具体操作步骤如下：
取4μL的2％(PBL)溶液加于MAIPN4550的96孔板的疏水膜上，定量吸取200μL待测样品液(100μg/mL)加入到96孔板中的膜上方作为给药池，膜的另一侧加入300μL缓冲盐(pH为7.4的PBS∶乙醇＝70∶30)为接受池，注意保持接受液与膜的充分接触；室温静止12h后，小心移除给药池，用酶标仪测试接受池内化合物吸光度值(250-500nm)；吸取200μL待测样品液与300μL缓冲盐(pH为7.4的PBS∶乙醇＝70∶30)充分混匀，作为理论平衡溶液，测试其吸光度值(250-500nm)，需要用acceptor板测试；
根据公式计算Pe值：
Vd：给药池体积，Va：接受池体积，A：疏水膜表面积，t：作用时间，[drug]acceptor：接收池中化合物吸光度，[drug]equilibrium：理论上接收池中化合物吸光度。
平行人造膜通透性测定方法透过血脑屏障的临界值划分见表3.。
表3.
测试结果见表4.(化合物的透膜常数(Pe)及其能否通过血脑屏障的预测)。
表4.
由表4.可知，被测样品大部分能够透过血脑屏障或处于不确定状态，具有良好的成药性。
综上，发明所述的嘧啶硫脲类化合物为一类新结构的小分子化合物，其具有胆碱酯酶抑制活性，单胺氧化酶活性，金属离子螯合性质，抑制金属离子诱导的自由基产生，抑制金属离子诱导Aβ聚集，低细胞毒性，及体外实验具有良好的血脑透过率。且其制备工艺简洁，生产成本低，因此有望发展成为一类新结构的多功能抗AD药物。

Claims (9)

1.一种嘧啶硫脲类化合物，其特征在于，所述的嘧啶硫脲类化合物为式Ⅰ所示化合物、或其在药学上可接受的盐：
式Ⅰ中，R为氢，C1～C4烃基，C2～C4酰基，或由氰基或苯基取代的C1～C4烃基；n为1～3的整数。
2.如权利要求1所述的嘧啶硫脲类化合物，其特征在于，其中R为氢，C1～C4烷基，乙酰基，或由氰基或苯基取代的C1～C4烷基。
3.如权利要求2所述的嘧啶硫脲类化合物，其特征在于，其中R为氢，甲基，乙基，正丙基，正丁基，乙酰基，或苄基。
4.如权利要求3所述的嘧啶硫脲类化合物，其特征在于，所述的嘧啶硫脲类化合物为：
1-乙基-3-(6-(4-((丙-2-炔-1-基氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲，1-乙基-3-(6-(4-(2-(丙-2-炔-1-基氨基)乙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲，1-乙基-3-(6-(4-(3-(丙-2-炔-1-基氨基)丙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲，1-乙基-3-(6-(4-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲，1-乙基-3-(6-(4-(2-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)乙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲，1-乙基-3-(6-(4-(3-(甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)丙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲，1-乙基-3-(6-(4-((乙基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲，1-乙基-3-(6-(4-((丙-2-炔-1-基(丙基)氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲，1-乙基-3-(6-(4-((丁基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲，1-乙基-3-(6-(4-((氰甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲，N-(1-(6-(3-乙基硫脲)嘧啶-4-基)-1H-咪唑-4-基)甲基-N-(丙-2-炔-1-基)乙酰胺，1-(6-(4-((苄基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲，1-(6-(4-((双(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲，1-乙基-3-(6-(4-(2-(乙基(丙-2-炔-1-基)氨基)乙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)硫脲，或1-(6-(4-(2-((氰甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基)乙基)-1H-咪唑-1-基)嘧啶-4-基)-3-乙基硫脲。
5.如权利要求1～4中任意一项所述的嘧啶硫脲类化合物在制备乙酰胆碱酯酶或单胺氧化酶A或单胺氧化酶B的抑制剂中的应用。
6.如权利要求1～4中任意一项所述的嘧啶硫脲类化合物在制备抑制金属诱导的Aβ聚集的抑制剂，或抑制金属离子诱导的自由基产生活性的抑制剂中的应用。
7.如权利要求1～4中任意一项所述的嘧啶硫脲类化合物在制备金属离子螯合剂中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其中所述的金属离子为铜离子。
9.如权利要求1～4中任意一项所述的嘧啶硫脲类化合物在制备治疗、改善和/或预防阿尔茨海默病症的具有多靶点功能的药物中的应用。
CN201710150528.0A 2017-03-14 2017-03-14 炔丙胺修饰的嘧啶硫脲类化合物及其用途 Active CN106946854B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710150528.0A CN106946854B (zh) 2017-03-14 2017-03-14 炔丙胺修饰的嘧啶硫脲类化合物及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710150528.0A CN106946854B (zh) 2017-03-14 2017-03-14 炔丙胺修饰的嘧啶硫脲类化合物及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106946854A CN106946854A (zh) 2017-07-14
CN106946854B true CN106946854B (zh) 2019-05-21

Family

ID=59467375

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710150528.0A Active CN106946854B (zh) 2017-03-14 2017-03-14 炔丙胺修饰的嘧啶硫脲类化合物及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106946854B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113956182B (zh) * 2021-10-11 2023-11-17 杭州师范大学 Hdac/mao-b双重抑制剂及其制备和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development and evaluation of multifunctional agents for potential treatment of Alzheimer’s disease: Application to a pyrimidine-2,4-diamine template;Tarek Mohamed et al.;《Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters》;20120526;第22卷;第4707-4712页
Development of Multifunctional Pyrimidinylthiourea Derivatives as Potential Anti-Alzheimer Agents;Xiaokang Li et al.;《J. Med. Chem.》;20160823;第59卷;第8326-8344页
Synthesis and screening of triazolopyrimidine scaffold as multi-functional agents for Alzheimer’s disease therapies;Jitendra Kumar et al.;《European Journal of Medicinal Chemistry》;20160426;第119卷;第260-277页

Also Published As

Publication number Publication date
CN106946854A (zh) 2017-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
He et al. Coumarin-dithiocarbamate hybrids as novel multitarget AChE and MAO-B inhibitors against Alzheimer’s disease: Design, synthesis and biological evaluation
Xue et al. Ratiometric fluorescent sensor based on inhibition of resonance for detection of cadmium in aqueous solution and living cells
Knez et al. Multi-target-directed ligands for treating Alzheimer's disease: Butyrylcholinesterase inhibitors displaying antioxidant and neuroprotective activities
Chkirate et al. Novel Co (II) and Cu (II) coordination complexes constructed from pyrazole-acetamide: Effect of hydrogen bonding on the self assembly process and antioxidant activity
Sang et al. Design, synthesis, in-silico and biological evaluation of novel chalcone-O-carbamate derivatives as multifunctional agents for the treatment of Alzheimer's disease
CN105481706B (zh) 一类2‑羟基查尔酮类化合物、其制备方法和用途
Pisani et al. Design, synthesis, and biological evaluation of coumarin derivatives tethered to an edrophonium‐like fragment as highly potent and selective dual binding site acetylcholinesterase inhibitors
Chen et al. Chemically induced degradation of CK2 by proteolysis targeting chimeras based on a ubiquitin–proteasome pathway
EP3143002B1 (en) Compounds with neural protective effect, and preparation and use thereof
CN106632181B (zh) 噢哢曼尼希碱类化合物、其制备方法和用途
CN104367575B (zh) 一种Bouchardatine和Bouchardatine衍生物及其制备方法和应用
JP6407444B2 (ja) トリフルオロアセトヒドラジド類化合物及びその調製方法並びに製薬における応用
Kang et al. Activatable red emitting fluorescent probe for rapid and sensitive detection of intracellular peroxynitrite
Cheng et al. (−)-Meptazinol–melatonin hybrids as novel dual inhibitors of cholinesterases and amyloid-β aggregation with high antioxidant potency for Alzheimer’s therapy
CN101535285A (zh) 治疗或预防认知障碍的新苯并呋喃型衍生物，包含它们的组合物及其用途
CN106946854B (zh) 炔丙胺修饰的嘧啶硫脲类化合物及其用途
Zhong et al. Design, synthesis and biological evaluations of diverse Michael acceptor-based phenazine hybrid molecules as TrxR1 inhibitors
Liang et al. Discovery of 4-(N-dithiobenzyl piperazine)-1, 8-naphthalimide as a potent multi-target antitumor agent with good efficacy, limited toxicity, and low resistance
CN111592530B (zh) 含醛肟的他克林衍生物类选择性丁酰胆碱酯酶抑制剂及其制备方法和应用
CN109232498A (zh) 一种香豆素类衍生物及其应用
Lin et al. Conjugation of tacrine with genipin derivative not only enhances effects on AChE but also leads to autophagy against Alzheimer’s disease
CN107325062A (zh) 一种检测过氧化氢活性的荧光探针及制备和应用
Yang et al. Novel coumarin derivatives as multifunctional anti-AD agents: Design, synthesis, X-ray crystal structure and biological evaluation
CN110857310B (zh) 一种具有光活性的多联吡啶钌配合物及其应用
CN109232703A (zh) 含16-(1′-芳香基-1′,2′,3′-三氮唑)亚甲基-雄甾-17-酮衍生物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant