KR102009562B1 - 암 세포를 표적화하기 위한 소포체 선택적 형광 프로브 화합물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암 세포를 표적화하기 위한 소포체 선택적 형광 프로브 화합물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 소포체 선택적 형광 프로브 화합물은 PKC-매개 조절 하에서 SMVT 단백질을 통해 세포막 내로 자유롭게 침투하고 ER에서 특히 국부화되는 특징을 가지는바, 여러 ER 스트레스 모델에서 ER 동태에 대한 효율적인 모니터링을 제공할 수 있으며 나아가 형광 바이오 탐침자 및 치료제 개발에 큰 효용성을 갖는다.
본 발명에 따른 소포체 선택적 형광 프로브 화합물은 PKC-매개 조절 하에서 SMVT 단백질을 통해 세포막 내로 자유롭게 침투하고 ER에서 특히 국부화되는 특징을 가지는바, 여러 ER 스트레스 모델에서 ER 동태에 대한 효율적인 모니터링을 제공할 수 있으며 나아가 형광 바이오 탐침자 및 치료제 개발에 큰 효용성을 갖는다.
Description
본 발명은 암 세포를 표적화하기 위한 소포체 선택적 형광 프로브 화합물에 관한 것이다.
2015년 정밀 치료제 계획의 개시 이래로, 암은 개개의 환자를 위한 맞춤형 치료방법을 찾음으로써 현재의 건강 프로그램을 대변혁시키기 위한 단기 목적을 갖고 있다(비특허문헌 1). 암 정밀 치료제 계획에 뒤이은 중요한 목적은 의학적 치료 제공자들이 암 종류에 관계없이, 질병 예방을 위해 적절한 개개 개체로부터 관련 있는 마커의 신뢰할 수 있는 검사로부터 얻어진 집합적 결과에 따라 암 양상 및 사망률을 감소시키는 것이다(비특허문헌 2). 하지만, 종양들의 유전적 이질성, 역학적 약제 내성, 암 종류 분류 및 이와 관련된 모든 시스템적 독성 효과로 인한 부작용, 병리학적 및 생리학적 합병증과 같은 다양한 원인에 의한 장벽이 존재한다.
바이오틴 (비타민 H)은 카르복실라아제 활성을 위한 중요한 보조 인자로서, 지방산 합성, 분지된 아미노산 이화작용 및 글루코오스 신합성에 관여하며(비특허문헌 3), 세포 표면 상의 과발현된 나트륨 의존 멀티비타민 수송 (SMVT)을 통해, 암 세포 (난소암, 직장암 등)를 포함한 빠르게 증식하는 세포 내로 우선적으로 전달되고, 세포 활성은 단백질 키나아제 C (PKC) 활성화에 의해 추가로 조절된다(비특허문헌 4). 바이오틴-컨쥬게이션은 다양한 암 선택적 전구물질, 약물 전달을 위한 폴리머 담체, 및 암 이미지화 및/또는 약물 전달로 구성된 치료진단 시스템(비특허문헌 5)을 발전시키기 위한 유력한 선택 중 하나로 주목받고 있다. 이의 적합성은 그들의 간단한 구조, 합성 유도체화 방법(비특허문헌 6)의 풍부한 정보, 및 관련된 생물학적 특성(비특허문헌 7)에 의해 추가로 뒷받침된다.
최근, 바이오틴은 다양한 단백질 상호작용(비특허문헌 8) 및 치료진단 바이오틴-컨쥬게이트(비특허문헌 9)를 확인하기 위한 단백질 라벨링 도구로서 광범위하게 사용되고 있다. 치료진단 바이오틴-컨쥬게이트에서, 바이오틴 모티프는 자가-희생 링커를 통해 친유성 약물(비특허문헌 10)부터 높은 극성의 펩타이드(비특허문헌 11)와 같이 다양한 약물 분자에 연결되어 있다. 일반적으로, 친수성 분자의 세포 유입은 대응되는 막 분자, 예컨대, 원형질 막 상의 그와 대응되는 수용기에 의한 극성 호르몬에 의해 보조될 수 있지만, 소수성 분자, 예컨대, 스테로이드 호르몬은 막(비특허문헌 12)을 통한 무작위 확산에 의해 유입된다. 이와 관련하여, SMVT 표적화를 위한 바이오틴 모이어티를 삽입시킴에도 불구하고, 바이오틴-컨쥬게이트의 소수성이 세포 유입에 대한 그들의 선택성에 대해 불리한 역할을 하는지 여부는 현재까지 연구된 바 없고, 또한, 치료진단 바이오틴-컨쥬게이트의 유입을 위한 생물학적 경로는 여전히 밝혀지지 않고 있는 상태이다.
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Madani, F.; Lindberg, S.; Langel, U.; Futaki, S.; Graslund, A. J. Biophys. 2011, 2011, Article ID 414729, 10 page.
본 발명에서는 암세포의 소포체를 선택적으로 감지할 수 있는 바이오틴-컨쥬게이션된 형광 프로브 화합물을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,
하기 [화학식 1]로 표시되는 암 세포를 표적화하기 위한 소포체 선택적 형광 프로브 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
상기 [화학식 1]에서, R은 (CH2)11CH3, (CH2)5CH3, (CH2)2O(CH2)2OH중에서 선택되는 어느 하나이다.
본 발명에 따른 소포체 선택적 형광 프로브 화합물은 PKC-매개 조절 하에서 SMVT 단백질을 통해 세포막 내로 자유롭게 침투하고 ER에서 특히 국부화되는 특징을 가지는바, 여러 ER 스트레스 모델에서 ER 동태에 대한 효율적인 모니터링을 제공할 수 있으며 나아가 형광 바이오 탐침자 및 치료제 개발에 큰 효용성을 갖는다.
도 1은 프로브 화합물 2 및 5가 처리된 HeLa 세포의 공초점 현미경 이미지로서, (a)의 세포의 형광 이미지는 가변 시간에 따라 측정하였고, (b)의 세포 이미지는 10분 동안 프로브 화합물의 가변 농도에 따라 각각 배양하여 얻었다. 37 ℃에서 high 글루코오스 무혈청 DMEM 배지에서 프로브(각각 2 μM)와 함께 세포를 배양하였다. 프로브 화합물은 458 nm에서 여기되었고, 이미지 획득을 위해 밴드패스 (bandpath) 필터 (505-550 nm)가 사용되었다. (c)의 그래프는 패널 (a)의 이미지에서 세포 당 형광 강도 (a.u.)를 나타낸다. (d)의 그래프는 패널 (b)의 이미지에서 세포 당 형광 강도 (a.u.)를 나타낸다. 이 이미지들은 Image J 소프트웨어를 이용하여 얻어졌다. 데이터는 평균 ± SD (n=5)로 나타내었다.
도 2는 logPoct 값에 따른 프로브 화합물 1 내지 6의 친유성을 도시한 것이다.
도 3은 HeLa 세포에서 프로브 화합물 2 (a) 및 5 (b)의 공존 공초점 현미경 이미지이다. 37 ℃에서 하이 글루코오스 무혈청 DMEM 배지에서 세포 염색이 수행되었다. 프로브 화합물의 농도는 2 μM 이었고, 트래커의 농도는 각각의 ER, 리소좀, 미토콘드리아 트래커에 대해 0.3, 0.05 및 0.05 μM 이었다. 탐침자 및 트래커에 대한 배양 시간은 10분이었다. 여기 파장은458 nm 및 543 nm였고, 이미지는 탐침자 및 트래커 각각에 대해 밴드패스 필터 505-530 nm 및 560-615 nm를 사용하여 얻어졌다.
도 4의 (a)는 비타민 바이오틴, 판토텐산, 아스코르브산 및 엽산의 존재하에서 HeLa 세포에서 프로브 화합물 5의 흡수(uptake)에 따른 효과를 나타낸다. 세포는 37 ℃에서 하이 글루코오스 무혈청의 DMEM 배지에서 비타민의 존재하에 2 μM의 프로브 화합물과 함께 배양되었다. 여기 파장은 458 nm였고, 밴드패스 필터 (505-550 nm)가 사용되었다. (b)의 그래프는 패널 (a)의 이미지에서 세포 당 형광 강도 (F.I.)를 나타낸다. 이미지들은 Image J 소프트웨어를 사용하여 얻어졌다. 데이터는 평균 ± SD (n =5)로 나타내었다.
도 5는 나트륨 이온, 염화 이온 및 아밀로라이드의 존재에 따른 HeLa 세포에 의한 프로브 화합물 2 및 5의 이온-의존성 흡수를 나타낸다(a). (c)는 HeLa 세포에 의한 프로브 화합물 5의 나트륨 이온 농도-의존성 흡수를 나타낸다. 37 ℃에서 하이 글루코오스 무혈청 DMEM 배지 하 다양한 양의 나트륨 이온의 존재하에서 2 μM의 프로브 화합물과 함께 세포가 배양되었다. 여기 파장은 458 nm였고, 밴드패스 필터 (505-550 nm)가 사용되었다. (b, c) 그래프는 패널 (a)의 이미지에서 세포 당 형광 강도 (F.I.)를 나타낸다. 이미지는 Image J 소프트웨어를 사용하여 얻어졌다. 데이터는 평균 ± SD (n =5)로 나타내었다.
도 6은 (a) 와베인, 아지드화 나트륨 및 2,4-DNP와 같은 다양한 에너지 억제제들이 HeLa 세포에서 프로브 화합물 5의 흡수에 미치는 효과를 나타낸다. 1시간 동안 억제제와 함께 세포를 예비 배양한 후, 세포는 37 ℃에서 하이 글루코오스 무혈청 DMEM 배지하에서 10분 동안 2 μM의 프로브 화합물과 함께 추가로 배양되었다. 여기 파장은 458 nm였고, 밴드패스 필터 (505-550 nm)가 사용되었다. (b) 그래프는 패널 (a)의 이미지에서 세포 당 형광 강도 (F.I.)를 나타낸다. 이미지들은 Image J 소프트웨어를 사용하여 얻어졌다. 데이터는 평균 ± SD (n =5)로 나타내었다.
도 7은 제니스테인, 포스콜린, PMA 및 KN-62와 같은 다양한 신호 전달 경로 조절인자들이 HeLa 세포에서 프로브 화합물 5의 흡수에 미치는 효과를 나타낸다. 1시간 동안 조절인자와 함께 세포를 예비 배양한 후, 세포는 37 ℃에서 하이 글루코오스 무혈청 DMEM 배지하에서 10분 동안 프로브 화합물과 함께 추가로 배양되었다.여기 파장은 458 nm였고, 밴드패스 필터 (505-550 nm)가 사용되었다. (b) 그래프는 패널 (a)의 이미지에서 세포 당 형광 강도 (F.I.)를 나타낸다. 이미지들은 Image J 소프트웨어를 사용하여 얻어졌다. 데이터는 평균 ± SD (n =5)로 나타내었다.
도 8은 프로브 화합물 1-6의 흡광(a, b, c) 및 방출(d, e, f) 스펙트럼을 나타낸다. 프로브 화합물들(10 μM)의 UV/VIS 흡광 스펙트럼은 각각 Toluene(a), Acetonitrile(b), PBS buffer(c) 용매를 사용하여 측정하였다. 프로브 화합물들(2 μM)의 형광 스펙트럼은 각각 Toluene(d), Acetonitrile(e), PBS buffer(f) 용매를 사용하여 측정하였다.(Slit widths: ex 3 em 3)
도 9는 (a) 프로브 화합물 1 (top), 프로브 화합물 2 (middle), 프로브 화합물 3 (bottom) (b) 프로브 화합물 4 (top), 프로브 화합물 5 (middle) and 프로브 화합물 6(bottom)으로 처리된 HeLa 세포의 공초점 현미경 이미지이다. 세포는 37 ℃에서 하이 글루코오스 무혈청 DMEM 배지하에서 2 μM 의 프로브 화합물과 함께 배양되었으며, 시간에 따라 이미지를 측정하였다. 여기 파장은 458 nm였고, 밴드패스 필터 (505-550 nm)가 사용되었다.
도 2는 logPoct 값에 따른 프로브 화합물 1 내지 6의 친유성을 도시한 것이다.
도 3은 HeLa 세포에서 프로브 화합물 2 (a) 및 5 (b)의 공존 공초점 현미경 이미지이다. 37 ℃에서 하이 글루코오스 무혈청 DMEM 배지에서 세포 염색이 수행되었다. 프로브 화합물의 농도는 2 μM 이었고, 트래커의 농도는 각각의 ER, 리소좀, 미토콘드리아 트래커에 대해 0.3, 0.05 및 0.05 μM 이었다. 탐침자 및 트래커에 대한 배양 시간은 10분이었다. 여기 파장은458 nm 및 543 nm였고, 이미지는 탐침자 및 트래커 각각에 대해 밴드패스 필터 505-530 nm 및 560-615 nm를 사용하여 얻어졌다.
도 4의 (a)는 비타민 바이오틴, 판토텐산, 아스코르브산 및 엽산의 존재하에서 HeLa 세포에서 프로브 화합물 5의 흡수(uptake)에 따른 효과를 나타낸다. 세포는 37 ℃에서 하이 글루코오스 무혈청의 DMEM 배지에서 비타민의 존재하에 2 μM의 프로브 화합물과 함께 배양되었다. 여기 파장은 458 nm였고, 밴드패스 필터 (505-550 nm)가 사용되었다. (b)의 그래프는 패널 (a)의 이미지에서 세포 당 형광 강도 (F.I.)를 나타낸다. 이미지들은 Image J 소프트웨어를 사용하여 얻어졌다. 데이터는 평균 ± SD (n =5)로 나타내었다.
도 5는 나트륨 이온, 염화 이온 및 아밀로라이드의 존재에 따른 HeLa 세포에 의한 프로브 화합물 2 및 5의 이온-의존성 흡수를 나타낸다(a). (c)는 HeLa 세포에 의한 프로브 화합물 5의 나트륨 이온 농도-의존성 흡수를 나타낸다. 37 ℃에서 하이 글루코오스 무혈청 DMEM 배지 하 다양한 양의 나트륨 이온의 존재하에서 2 μM의 프로브 화합물과 함께 세포가 배양되었다. 여기 파장은 458 nm였고, 밴드패스 필터 (505-550 nm)가 사용되었다. (b, c) 그래프는 패널 (a)의 이미지에서 세포 당 형광 강도 (F.I.)를 나타낸다. 이미지는 Image J 소프트웨어를 사용하여 얻어졌다. 데이터는 평균 ± SD (n =5)로 나타내었다.
도 6은 (a) 와베인, 아지드화 나트륨 및 2,4-DNP와 같은 다양한 에너지 억제제들이 HeLa 세포에서 프로브 화합물 5의 흡수에 미치는 효과를 나타낸다. 1시간 동안 억제제와 함께 세포를 예비 배양한 후, 세포는 37 ℃에서 하이 글루코오스 무혈청 DMEM 배지하에서 10분 동안 2 μM의 프로브 화합물과 함께 추가로 배양되었다. 여기 파장은 458 nm였고, 밴드패스 필터 (505-550 nm)가 사용되었다. (b) 그래프는 패널 (a)의 이미지에서 세포 당 형광 강도 (F.I.)를 나타낸다. 이미지들은 Image J 소프트웨어를 사용하여 얻어졌다. 데이터는 평균 ± SD (n =5)로 나타내었다.
도 7은 제니스테인, 포스콜린, PMA 및 KN-62와 같은 다양한 신호 전달 경로 조절인자들이 HeLa 세포에서 프로브 화합물 5의 흡수에 미치는 효과를 나타낸다. 1시간 동안 조절인자와 함께 세포를 예비 배양한 후, 세포는 37 ℃에서 하이 글루코오스 무혈청 DMEM 배지하에서 10분 동안 프로브 화합물과 함께 추가로 배양되었다.여기 파장은 458 nm였고, 밴드패스 필터 (505-550 nm)가 사용되었다. (b) 그래프는 패널 (a)의 이미지에서 세포 당 형광 강도 (F.I.)를 나타낸다. 이미지들은 Image J 소프트웨어를 사용하여 얻어졌다. 데이터는 평균 ± SD (n =5)로 나타내었다.
도 8은 프로브 화합물 1-6의 흡광(a, b, c) 및 방출(d, e, f) 스펙트럼을 나타낸다. 프로브 화합물들(10 μM)의 UV/VIS 흡광 스펙트럼은 각각 Toluene(a), Acetonitrile(b), PBS buffer(c) 용매를 사용하여 측정하였다. 프로브 화합물들(2 μM)의 형광 스펙트럼은 각각 Toluene(d), Acetonitrile(e), PBS buffer(f) 용매를 사용하여 측정하였다.(Slit widths: ex 3 em 3)
도 9는 (a) 프로브 화합물 1 (top), 프로브 화합물 2 (middle), 프로브 화합물 3 (bottom) (b) 프로브 화합물 4 (top), 프로브 화합물 5 (middle) and 프로브 화합물 6(bottom)으로 처리된 HeLa 세포의 공초점 현미경 이미지이다. 세포는 37 ℃에서 하이 글루코오스 무혈청 DMEM 배지하에서 2 μM 의 프로브 화합물과 함께 배양되었으며, 시간에 따라 이미지를 측정하였다. 여기 파장은 458 nm였고, 밴드패스 필터 (505-550 nm)가 사용되었다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 암세포의 소포체를 선택적으로 감지할 수 있는 바이오틴-컨쥬게이션된 형광 프로브 화합물을 제공하고자 한다.
따라서, 본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 암 세포를 표적화하기 위한 소포체 선택적 형광 프로브 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
상기 [화학식 1]에서, R은 (CH2)11CH3, (CH2)5CH3, (CH2)2O(CH2)2OH중에서 선택되는 어느 하나이다.
본 발명에서는 형광 탐침자의 종합적인 친수성을 조절하기 위해 도데실, 헥실, 디에틸렌 글리콜을 갖는, 상기 [화학식 1]로 표시되는 바이오틴-컨쥬게이션된 형광 프로브 화합물(하기 [화학적 구조]에서는 화합물 4, 5, 6으로 표시) 및 대응되는 비-바이오틴 유사체 (화합물 1-3)를 설계(하기 [화학적 구조] 참조)하여 실험을 진행하였다.
[화학적 구조]
본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 소포체 선택적 형광 프로브 화합물은 PKC-매개 조절 하에서 SMVT 단백질을 통해 세포막 내로 자유롭게 침투하고 ER에서 특히 국부화되는 특징을 가지는바, 여러 ER 스트레스 모델에서 ER 동태에 대한 효율적인 모니터링을 제공할 수 있으며 나아가 형광 바이오 탐침자 및 치료제 개발에 큰 효용성을 갖는다.
또한, 본 발명에 따른 상기 [화학식 1]로 표시되는 화합물의 구체적인 제조방법은 하기 합성경로(화합물 4, 5, 6으로 표시)에 표시된 바와 같으며, 구체적인 내용은 하기 실시예에서 설명하기로 한다.
[합성 경로]
이하에서는 바람직한 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실험 방법 및
합성예
재료 및 방법
본 발명에서 사용된 용매 및 모든 시약들은 Aldrich, TCI Korea, Samchung, Alfa aesar에서 구입하였으며, 추가의 정제 없이 사용하였다. 컬럼 크로마토그래피를 위해 고정상으로서 실리카 겔 60(70 ~230 메시)을 사용하였으며, 분석용 박막 크로마토그래피는 60 실리카 겔 (0.25 mm 두께의 미리 코팅된 시트)을 사용하여 수행하였다. 질량 스펙트럼은 LC/MS-2020 시리즈(Shimadzu) 기기를 이용하여 수행하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 Varian 300 및 400 MHz 분광계로 측정하였다.
UV/
Vis
및 형광체 분광법.
모든 형광 및 uv/Vis 흡광 스펙트럼은 각각 RF-5301PC 및 S-3100 분광 광도계 상에 기록되었다. 프로브 화합물의 모액 (1 mM) 이 DMSO 중에 준비되었고, 1 % DMSO를 가진 pbs 완충액 중에 프로브 화합물 2 μM의 용액이 준비되었다. 모든 실험에서, 여기 파장은 440 nm였고, 여기 및 배출 슬릿 폭은 둘다 3 nm였다.
옥탄올
-물 분배 계수 (
logP
oct
)의 측정
DMSO 중의 20 mM 프로브 화합물 용액의 작은 표본 (20 μL) 을 5 mL 1-옥탄올을 함유하는 유리병에 첨가하였다. 이 용액에, 5 mL의 MOPS 완충액 (30 mM MOPS, 10 mM EGTA, 100 mM KCl, pH 7.2)를 첨가하였다. 그 다음에, 생성된 혼합물을 교반시켰고 어둠 속에 10분 동안 놓아두었다. 각각의 층에서 프로브 화합물의 농도를 표 1에 나타난 바와 같이, 그들의 몰 흡광 계수와 함께 UV-Vis 흡광에 의해 측정하였다. logPoct 값은 logPoct = log [프로브]oct - log [프로브]MOPS를 사용하여 계산하였는데, 여기서 [프로브]oct 및 [프로브]MOPS는 각각 1-옥탄올 및 MOPS 중의 프로브의 농도이다.
세포 배양 및
공초점
현미경 이미지화
인간 경부 암 세포주(HeLa)를 37 ℃, 95% 습도 및 5% CO2 하에서 10% FBS (WelGene), 페니실린 (100 유닛/mL), 및 스트렙토마이신 (100 μg/mL)으로 보충된 둘베코수정이글배지 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium; DMEM)에서 배양하였다. 세포는 아래 부분이 커버글래스인 접시 (SPL Lifesciences Co., Ltd.) 상에서 37 ℃, 5% (v/v) CO2 를 함유하는 습한 대기 하에서 24시간 동안 배양되어 여물었고, 공초점 시험을 수행하였다. 프로브 화합물 처리된 세포는 인산 완충된 식염수 (PBS, Gibco)로 한번 세척한 후 공초점 현미경 (Zeiss LSM 510, Zeiss, Oberko, Germany)을 사용하여 세포 이미지를 수득하였다.
무-나트륨 또는 무-염화물 매질(Sodium- or chloride-free media)
무-나트륨 이온 매질의 제조를 위해, 매질 중의 제2 인산나트륨 (sodium phosphate dibasic)뿐만 아니라 염화나트륨을 각각 등몰량의 염화칼륨 및 제이인산 칼륨으로 교체하였다. 무-염화물 매질을 위해, 매질 중의 염화나트륨 및 염화칼륨을 각각 등몰량의 제1인산 나트륨 (sodium phosphate monobasic) 및 제1 인산 칼륨으로 교체하였다.
합성
화합물 7의 합성
종래 보고된 문헌상 절차에 따라 화합물 7을 수득하였다(C. Yu, X. Li, F. Zeng, F. Zheng, S. Wu, Chem . Commun ., 2013, 49, 403-405.).
화합물 8의 합성
화합물 7(5.5 g, 17.47 mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(4.07 g, 26.21 mmol), 4-디메틸아미노피리딘(2.46 g, 20.1 mmol) 및 바이오틴 (4.9 g, 20.1 mmol)을 디메틸포름아미드(30 mL)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반 하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고, 에틸 아세테이트로 추가로 희석시키고 물로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산나트륨상에서 건조 및 진공에서 추가로 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토 그래피 (헥산/에틸아세테이트, 3:7, v/v)로 정제하여 6.75g (70.7 %)의 화합물 8을 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.69 (d, J = 7.36 Hz, 1H); 8.60 (d, J = 8.48 Hz, 1H); 8.44 (d, J = 7.88 Hz, 1H); 8.07 (d, J = 7.84 Hz, 1H); 7.87 (t, J = 8.44 Hz, 1H); 5.47 (s, 1H), 4.85 (s, 1H), 4.5 (m, 5H); 4.28 (m, 1H); 3.09 (m, 1H); 2.88 (m, 1H); 2.71 (d, J = 12.88 Hz, 1H); 2.25 (m, 2H); 1.67 (m, 4H); 1.38 (m, 2H). 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): 173.48, 163.73, 163.69, 163.35, 133.50, 132.43, 132.13, 131.81, 130.52, 130.03, 129.02, 123.28, 122.49, 61.58, 61.44, 59.80, 55.96, 40.77, 39.52, 33.88, 28.57, 28.55, 24.96 ppm. ESI-MS m/z (M + Na+):
화합물 1의 합성
2-메톡시에탄올(10 ml) 중 화합물 7(500 mg, 0.92 mmol)의 용액에 도데실아민(1 ml, 4.58 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류하에 밤새 교반 하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고, 에틸 아세테이트로 추가로 희석시키고, 유기층을 물로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산나트륨상에서 건조시키고 진공 농축시켰다. 잔류물 혼합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토 그래피 (헥산 / 에틸아세테이트, 5:5, v/v)를 사용하여 정제하여 240 mg (40.3 %)의 화합물 1을 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.60 (d, J = 7.32 Hz, 1H); 8.52 (d, J = 8.48 Hz, 1H); 8.36 (d, J = 7.88 Hz, 1H); 8.01 (d, J = 7.88 Hz, 1H); 7.84 (t, J = 7.64 Hz, 1H); 4.48 (m, 5H); 4.28 (m, 1H); 3.09 (m, 1H); 2.87 (m, 1H); 2.72 (d, J = 12.88 Hz, 1H); 2.27 (m, 2H); 1.62 (m, 8H); 1.39 (m, 18H), 0.87 (m, 3H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 173.89, 164.23, 163.89, 152.10, 133.65, 132.36, 131.54, 131.30, 130.74, 128.99, 128.29, 122.69, 121.82, 62.03, 61.92, 61.67, 60.23, 60.22, 55.63, 40.53, 39.35, 33.81, 31.98, 29.76, 29.75, 29.74, 29.73, 29.71, 29.70, 29.69, 29.42, 28.42, 28.23, 24.60, 22.76, 14.17 ppm. ESI-MS m/z (M + H+): calcd 651.36, found 651.3
화합물 2의 합성
2-메톡시에탄올(10 ml) 중 화합물 7(500 mg, 0.92 mmol)의 용액에 헥실아민(0.6 ml, 4.58 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 완료 후, 혼합물을 진공에서 증발시키고 에틸 아세테이트로 희석시키고 물로 추가로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산나트륨상에서 건조시키고 진공 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토 그래피 (헥산 / 에틸아세테이트, 5:5, v/v)를 사용하여 정제하여 화합물 2 (98mg, 18.6 %)를 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.52 (d, J = 7.36 Hz, 1H); 8.39 (d, J = 8.52 Hz, 1H); 8.27 (d, J = 8.4 Hz, 1H); 7.58 (t, J = 8.28 Hz, 1H); 6.68 (d, J = 8.6 Hz, 1H); 4.47 (m, 5H); 4.22 (m, 1H); 3.37 (m, 2H); 3.07 (m, 1H); 2.87 (m, 1H); 2.70 (m, 1H), 2.26 (m, 1H); 1.79 (m, 2H); 1.57 (m, 4H), 1.48 (m, 4H), 1.37 (m, 4H), 0.92 (m, 3H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 173.99, 165.23, 164.49, 150.67, 135.14, 131.49, 130.14, 127.41, 124.60, 122.34, 120.38, 108.71, 104.28, 61.94, 61.85, 60.19, 55.57, 43.71, 40.57, 38.84, 33.96, 31.68, 28.73, 28.36, 28.18, 27.00, 24.65, 24.64, 22.72, 14.10 ppm. ESIMS m/z (M - 2H+): calcd 564.24, found 564.4
화합물 3의 합성
2-메톡시에탄올(10 ml) 중 화합물 7(500 mg, 0.92 mmol)의 용액에 2-(2-아미노에톡시)에탄올(0.4 ml, 4.58 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류하에 밤새 교반 하였다. 반응이 종결된 후, 혼합물을 진공하에 농축시키고 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기층을 물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨상에서 건조시키고 진공 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토 그래피 (DCM 중 5 % MeOH)를 사용하여 정제하여 화합물 3 (86mg, 16.5 %)을 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.45 (d, J = 7.32 Hz, 1H); 8.32 (d, J = 8.36 Hz, 2H); 7.54 (t, J = 8.32 Hz, 1H); 6.61 (d, J = 8.64 Hz, 1H); 4.42 (m, 5H); 4.17 (m, 1H); 3.87 (m, 2H), 3.78 (m, 2H), 3.66 (m, 2H), 3.55 (m, 2H), 3.37 (m, 2H); 3.02 (m, 1H); 2.85 (m, 1H); 2.69 (m, 1H), 2.26 (m, 1H); 1.54 (m, 4H), 1.29 (m, 2H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 173.91, 165.15, 164.43, 150.65, 134.94, 131.48, 129.99, 127.99, 124.68, 122.17, 120.64, 109.22, 104.23, 72.56, 68.73, 61.92, 61.42, 60.18, 55.50, 43.45, 40.60, 38.82, 34.03, 29.82, 28.34, 28.19, 24.70 ppm. ESI-MS m/z (M - 3H+): calcd 567.19, found 567.4
화합물 4의 합성
2-메톡시에탄올(10 ml) 중 화합물 8(500 mg, 1.56 mmol)의 용액에 도데실아민(1.79 ml, 7.8 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류하에 밤새 교반 하였다. 반응 완료 후, 혼합물을 진공하에 농축시키고, 에틸 아세테이트로 희석시키고, 유기층을 물로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산나트륨상에서 건조시키고 진공 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토 그래피 (헥산/에틸아세테이트, 7:3, v/v)에 의해 정제하여 98 mg (14.8 %)의 화합물 4를 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.44 (d, J = 7.36 Hz, 1H); 8.33 (d, J = 8.52 Hz, 1H); 8.12 (d, J = 8.4 Hz, 1H); 7.51 (t, J = 8.32 Hz, 1H); 6.60 (d, J = 8.6 Hz, 1H); 4.38 (t, J = 5.44 Hz, 2H); 3.94 (t, J = 5.52 Hz, 2H); 3.35 (t, J = 7.32 Hz, 2H); 1.76 (m, 2H); 1.49 (m, 2H); 1.26 (m, 16H); 0.87 (m, 3H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 165.70, 165.28, 150.42, 135.13, 131.54, 129.94, 126.91, 124.63, 122.44, 120.19, 120.18, 108.95, 104.36, 61.70, 43.76, 42.61, 32.07, 29.81, 29.79, 29.76, 29.74, 29.55, 29.51, 28.91, 27.36, 22.85, 14.26 ppm. ESI-MS m/z (M + H+): calcd 425.28, found 425.3
화합물 5의 합성
2-메톡시에탄올(10 ml) 중 화합물 8(500 mg, 1.56 mmol)의 용액에 헥실아민(1.0 ml, 7.8 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류하에 밤새 교반 하였다. 반응이 종결된 후, 혼합물을 진공하에 농축시키고 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기층을 물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨상에서 건조시키고 진공 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토 그래피 (헥산/에틸 아세테이트, 7:3, v/v)로 정제하여 108 mg (20.3 %)의 화합물 5를 수득 하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.54 (d, J = 7.32 Hz, 1H); 8.40 (d, J = 8.56 Hz, 1H); 8.30 (d, J = 8.36 Hz, 1H); 7.60 (t, J = 8.24 Hz, 1H); 6.70 (d, J = 8.6 Hz, 1H); 4.37 (t, J = 5.88 Hz, 2H); 3.89 (t, J = 5.84 Hz, 2H); 3.40 (t, J = 7.48 Hz, 2H); 1.78 (m, 2H); 1.47 (m, 2H); 1.36 (m, 4H); 0.88 (m, 3H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 165.77, 165.23, 150.88, 135.28, 131.58, 130.16, 127.51, 124.58, 122.33, 120.38, 108.54, 104.31, 60.82, 49.67, 49.46, 49.24, 49.03, 48.82, 48.60, 48.39, 43.67, 42.30, 31.64, 28.68, 26.95, 22.68, 14.02 ppm. ESI-MS m/z (M + H+): calcd 341.19, found 341.2
화합물 6의 합성
2-메톡시에탄올(10 ml) 중 화합물 8(500 mg, 1.56 mmol)의 용액에 2-(2-아미노에톡시)에탄올(0.8 ml, 7.8 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류하에 밤새 교반 하였다. 반응 완료 후, 혼합물을 진공하에 농축시키고, 에틸 아세테이트로 희석시키고, 유기층을 물로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨상에서 건조시키고 진공 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토 그래피 (헥산/에틸 아세테이트, 3:7, v/v)로 정제하여 화합물 6 (81mg, 15.1 %)을 수득하였다.
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.55 (d, J = 7.32 Hz, 1H); 8.47 (d, J = 8.48 Hz, 1H); 8.41 (d, J = 9.72 Hz, 1H); 7.63 (t, J = 8.32 Hz, 1H); 6.73 (d, J = 8.68 Hz, 1H); 4.37 (t, J = 6 Hz, 2H); 3.88 (t, J = 5.48 Hz, 4H); 3.88 (m, 2H), 3.78 (m, 2H), 3.67 (m, 2H), 3.62 (m, 2H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 165.87, 165.33, 151.17, 135.29, 131.74, 130.26, 128.34, 124.79, 122.35, 120.85, 109.11, 104.42, 72.55, 68.85, 61.34, 60.67, 43.50, 42.34 ppm. ESI-MS m/z (M + H+): calcd 345.15, found 345.2
결과 및 논의
합성
본 발명에서는 상기 합성예에서 설명한 바와 같이 비교적 간단한 방법을 통해 프로브 화합물 4-6을 합성하였다. 구체적으로 DMF 중에서 화합물 7과 바이오틴의 EDCI 커플링을 통해 화합물 8 (70.7% 수율)을 생성하였다. 그 다음, 화합물 8을 도데실아민, 헥실아민 및 2-(2-아미노에톡시)에탄올과 반응시켜 각각 화합물 4 (40.3% 수율), 5 (18.6% 수율) 및 6 (16.5% 수율)을 수득하였다 ([합성 경로] 참조).
분광학적 특성
완충 용액에서 프로브 화합물의 분광학적 특성은 UV/Vis 흡수 및 형광 분광법을 사용하여 수행하였다. 프로브 화합물들은 430 nm (톨루엔 중), 433 nm (아세토니트릴 중), 및 440 nm (PBS 중)에서 (도 8) 각각 ~75 nm의 밴드 폭을 가지고, 넓은 흡광 밴드를 나타내었다. 톨루엔과 아세토니트릴 중 프로브 화합물과 대응되는 형광 배출 밴드는 PBS (545 nm)와 비교하여 강화된 강도 (각각 505 nm 및 524 nm)로 약간 청색-이동되었다. 이를 통해 프로브 화합물에서의 내부 전하-전송 (ICT) 여기 상태 현상이 용매 극성에 따라 추가로 안정화/불안정화될 수 있는, 실질적인 여기-상태 쌍극자 모멘트를 제공한다는 것을 확인하였다. PBS 중 프로브 화합물의 상대적으로 낮은 형광 배출 강도는 그들의 수소 결합 공여체 (HBD) 또는 수소 결합 수용체 (HBA) 능력으로 인한 것으로 추측된다.
바이오틴
-
컨쥬게이트
프로브
화합물의 세포 흡수 거동 및 공존 시험
바이오틴-컨쥬게이트의 세포 흡수 거동을 시험하기 위해, 본 발명자들은 HeLa 세포에서 형광 공초점 현미경 시험을 수행하여, 각각의 컨쥬게이트 (화합물 1-6)의 시간에 따른 형광 이미지를 수득하였다. 도 9(a)에 나타나는 바와 같이, 도데실 기를 가진 프로브 화합물 1이 비-바이오틴 탐침자 (화합물 1-3) 중에 가장 강한 형광 강도를 나타내었다. 또한, 이러한 강도는 60분 후에도 계속 증가할 것이라 예상된다. 이러한 결과는 분자의 친수성이 높을수록 무작위 확산의 방식으로 세포막 내로 침투하기 용이하다는 사실에 기초한 것이다. 반대로, 도 9(b)에 입증된 바와 같이, 바이오틴-컨쥬게이트와 관련해서는, 가장 중요한 강도가 헥실 모이어티 (화합물 5)를 가진 것에서 발견되었고, 보다 소수성인 도데실을 가진 것과 친수성인 하이드록시에틸옥시에틸 모이어티는 어떠한 비교할만한 강도도 나타내지 못하였다. 이러한 결과를 통해 바이오틴-컨쥬게이트가 비-바이오틴 대응물의 경로에서 다른 경로를 통해 세포로 들어감을 알 수 있다. 또한, 바이오틴-컨쥬게이트 (화합물 4-6)의 상세한 세포 흡수 메커니즘을 조사하기 위해, 화합물 2 및 5의 시간 경과 및 다양한 농도에 따른 형광 이미지를 측정하였다. 이를 통해 본 발명자들은 형광 강도 강화가 수송을 통한 세포 흡수에 대하여 시간 및 농도 둘 모두에 의존적인 거동을 보임(도 1)을 확인하였다. 또한, 화합물 2가 동일한 알킬 사슬에 화합물 5가 삽입된 것보다 6배 높은 형광 강도를 나타내었다. 프로브 화합물의 친수성 평가를 위해, 본 발명자들은 n-옥탄올 및 MOPS 완충액에서 용해도 (표 1 및 도 2)에 따른 프로브 화합물의 분배-계수 (logPoct)를 측정하였다. 프로브 화합물에 대한 logPoct 값은 각각 1.30, 1.25, 1.14, 1.29, 1.03, 및 0.807이다. 이러한 결과들은 바이오틴기 그 자체가 컨쥬게이트의 선택적인 흡수(유입)를 강화할 수 있을지라도, 바이오틴-컨쥬게이트의 종합적인 친수성이 그들의 우선적인 선택적 유입을 위해 logPoct 값이 대략 1.0인, 특정한 범위 내에서 유지되어야 함을 제시한다.
다음으로, 화합물 2 및 5의 세포내 위치를 확인하기 위해, 상업적으로 입수가능한 세포기관 선택적 마커, ER-RFP, Lyso tracker red 및 Mito tracker red를 사용하여 일련의 공존 시험을 수행하였다. 도 3에 나타나는 바와 같이, 화합물 5의 그린-채널 형광 강도는 ER (피어슨 상관 계수 (PCC)가 0.9729임)의 레드-채널 형광과 우수한 중첩을 나타낸 반면, 다른 트래커들과의 중첩은 상대적으로 좋지 않았다 (Lyso; 0.4617 및 Mito; 0.5576). 이에 반해, 비-바이오틴 컨쥬게이트인 화합물 2는 미토콘드리아뿐만 아니라 ER과도 국부화되었다 (각각의 PCC = 0.9373 및 0.7809).
SMVT
및 신호전달 경로를 통한
바이오틴
-
컨쥬게이션된
프로브
화합물의 세포 흡수(유입)
도 1에서 가포화 화합물 5의 유입 과정이 바이오틴 및 판토텐산 등 널리 알려진 SMVT에 대한 기질의 존재 하, 그리고 비교를 위해 엽산 및 아스코르브산의 존재 하 (도 4)에서 시험되었다. 바이오틴 및 판토텐산은 농도 의존 방식으로 화합물 5의 유입에 현저한 억제 효과를 유발한 반면, 아스코르브산 및 엽산은 그러한 효과를 나타내지 않았다. 유사하게, 일련의 유사한 시험들이 화합물 2의 유입에 대해 수행되었는데, 이는 이러한 연구에서 모든 비타민들이 그의 유입에 임의의 억제 효과를 나타내지 못함을 보여준다. 이러한 결과들은 화합물 5가 SMVT를 통해 선택적으로 세포로 들어가는 반면, 화합물 2는 SMVT와 독립적으로 세포로 들어감을 의미하고, 이는 도 1의 결과로부터 가정된 이러한 탐침자에 대한 차등 유입 공정을 확인해준다.
다음으로, 화합물 5의 유입에 대한 나트륨 이온-의존성을 입증하기 위해, 매질 중 나트륨 이온 및 나트륨 펌프의 선택적 억제제의 존재와 관련하여 이의 세포 유입 거동을 조사하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 나트륨 A의 소모는 화합물 5의 유입에 엄청난 감소를 유발하였다. 이러한 결과는 실제로 원형질 막에 대한 나트륨 기울기가 바이오틴-컨쥬게이트 유입의 구동력이며, 이는 아밀로라이드, 나트륨 이온 수송 억제제에 의한 유입 억제에 의해 추가로 확인될 수 있다 (도 5a). 0-100 mM 범위에서 나트륨 이온의 증가에 따라 이의 세포 유입의 점진적 증가가 관찰되었다 (도 5c). 대응되는 비-바이오틴 탐침자 (화합물 2)에 대한 유사한 시험은 무-나트륨 완충액 또는 아밀로라이드와 함께 이의 유입 거동에 유의미한 변화를 나타내지 않았다 (도 5).
나트륨-의존성 영양분 유입이 2차 펌프의 전형적인 특징임을 고려하면, 바이오틴-컨쥬게이트 유입은 도 6에서 시험된 것처럼, 세포 ATP 수준에 의존해야 한다. 실제로, 각각이 Na+/K+-ATP아제 억제제, 산화적 인산화 억제제 및 미토콘드리아 언커플러 (uncoupler)이고, 모든 화학 물질이 세포 ATP 수준을 감소시키는, 와베인 (oaubain), 아지드화 나트륨 또는 2,4-디나이트로페놀의 존재에 의해 유입이 명확하게 억제된다. 도 4와 도 5의 결과를 조합하면, 도 6의 결과는 프로브 화합물 5와 같은 바이오틴-컨쥬게이트의 세포 유입이 SMVT, 세포내 ATP 가수분해에 의해 구동력이 조절되는 2차 펌프를 통해서 이루어짐을 나타낸다.
세포 내로의 바이오틴 유입에 대한 SMVT 활성의 생리학적 조절이 바이오틴-컨쥬게이트에 대해 작용하는지 여부를 확인하기 위해, 세포 내로의 프로브 화합물 5의 유입이 다양한 신호 경로에 대한 조절인자의 존재하에서 조사되었는데; 제니스테인, 포스콜린, PMA 및 KN-62가 단백질 티로신 키나아제 (PTK), 단백질 키나아제 C (PKC)뿐만 아니라 단백질 키나아제 A (PLA) 및 칼슘-칼모듈린 경로를 각각 조절하기 위해 사용되었다. 도 7에 나타나는 바와 같이, 프로브 화합물 5로부터의 형광 강도는 PMA에 의해 강력하게 억제된 반면, 다른 것들은 어떠한 조절 효과도 나타내지 않았는데, 이는 바이오틴-컨쥬게이트 유입이 바이오틴의 유입과 유사하게 단백질 키나아제 C 활성에 의해 선택적으로 조절됨을 가리킨다. 이러한 결과는 바이오틴-컨쥬게이트가 암 표적화 이미지 및 약물 전달에 대해 우수한 후보임을 설명한다. 하지만, 화합물 2의 유입은 이러한 조절인자들의 존재에 의해 변화되지 않았다.
결론적으로, 본 발명자들은 바이오틴계 암 표적화 이미지화 물질의 세포 유입 공정에 대한 수용성의 중요한 역할을 탐구하기 위한 분석에 기초하여 바이오틴계 암 표적화 이미지화 물질을 발전시켰다. 프로브 화합물 5는 PKC-매개 조절 하에서 SMVT 단백질을 통해 세포막 내로 자유롭게 침투하고 ER에서 특히 국부화되며, 이에 따라 본 발명은 우수한 암 표적화된 이미지화 및 치료법을 발전시키는데 바이오틴 결합의 빈번한 활용을 위한 화학적 및 생물학적 가이드라인을 제공할 수 있다.
Claims (1)
- 하기 [화학식 1]로 표시되는 암 세포를 표적화하기 위한 소포체 선택적 형광 프로브 화합물:
[화학식 1]
상기 암 세포는 HeLa 세포이고,
상기 [화학식 1]의 R은 (CH2)5CH3이다.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170095821A KR102009562B1 (ko) | 2017-07-28 | 2017-07-28 | 암 세포를 표적화하기 위한 소포체 선택적 형광 프로브 화합물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170095821A KR102009562B1 (ko) | 2017-07-28 | 2017-07-28 | 암 세포를 표적화하기 위한 소포체 선택적 형광 프로브 화합물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20190012591A KR20190012591A (ko) | 2019-02-11 |
| KR102009562B1 true KR102009562B1 (ko) | 2019-08-09 |
Family
ID=65369844
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170095821A KR102009562B1 (ko) | 2017-07-28 | 2017-07-28 | 암 세포를 표적화하기 위한 소포체 선택적 형광 프로브 화합물 |
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Citations (1)
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2017
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Non-Patent Citations (3)
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|---|
| Chem Commun., (2016.08.17.), Vol. 52, pp 11247-11250. |
| J. Mater. Chem. B., (2016), Vol. 5, pp 988-995. |
| Methods Appl Fluoresc., (2017.04.), Vol. 5, pp 1-7. |
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