KR20140135483A - 넓은 범위의 pH 측정이 가능한 비율계량적 pH 프로브 - Google Patents

넓은 범위의 pH 측정이 가능한 비율계량적 pH 프로브 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체 내에서 넓은 pH 범위에 걸친 검출이 가능하면서 세포내 pH의 정확한 양적 측정이 가능한 pH 센서 및 이것의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 형광 pH 프로브는 플루오레세인 잔기 및 디에틸트리아민 스페이서를 포함하는 로다민 골격 구조의 화학식 1로 표시된다.
<화학식 1>
Figure pat00012

Description

넓은 범위의 pH 측정이 가능한 비율계량적 pH 프로브{WIDE pH RANGE RESPONSIBLE RATIOMETRIC pH PROBE}
본 발명은 생체 내에서 넓은 pH 범위에 걸쳐 세포내 pH의 정확한 양적 측정이 가능한 pH 센서 및 이것의 제조방법에 관한 것이다.
세포내 pH 항상성은 세포 증식, 세포괴사, 약물 저항, 식균작용 및 엔도시토시스와 같은 생명 활동 현상에서 중요한 역할을 한다. 세포 내 소기관은 다양한 pH 값을 갖는데, 리소좀 및 엔도좀은 약산성이고, 활성화된 미토콘드리아 및 시토졸은 약염기성이다. 비정상 세포에서의 pH는 부적절한 세포 기능과 관련된 것으로 알려져 있으며 암, 알츠하이머와 같은 다양한 질병에서도 pH가 관련이 있다. 최근에 미토콘드리아의 자식 소모성(autophagic) 제거 작용인 미토파지(mitophagy)는 미토콘드리아 내 광범위한 pH 변화(4-8)와 연결되어 있어 직접적인 병원성 상태와 관련이 깊은 것으로 보고되었다. 고배율 현미경을 이용한 세포내 pH의 변화에 대한 연구는 생리적 및 병리적 과정을 더 깊이 이해하는데 필수적인 정보를 제공한다.
지금까지 세포내 pH를 측정하기 위하여, 비율계량(ratiometric) 형광 프로브가 연구되어 왔다. 통상 프로브는 단일의 이온화 기능기를 보유하고, 이것의 발광 스펙트럼은 pH 변화에 따라 양성자의 부가 및 방출에 따라 블루 또는 레드로 이동한다. 따라서, 형광 방출의 환경적 민감도에 따라 pH가 모호해질 수 있으며, 2개의 발광 밴드의 비율계량적 자기-검정(self-calibration)에 의하여 세포내 pH의 정확한 양적 측정이 가능하다. 그러나, 이러한 전형적 프로브는 비율계량적 변화에 있어서 세포내 pH의 측정시 2개의 방출 밴드 간 파장 차이가 너무 작고 pH 범위가 좁다는 문제점이 있었다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 방출 성능과 적용 pH 범위에 있어서 상이한 다수의 형광 그룹을 갖는 소형 분자의 설계가 요구되고 있다.
이에, 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자, 생체 내에서 넓은 pH 범위에 걸친 검출이 가능하면서 세포내 pH의 정확한 양적 측정이 가능한 pH 센서 및 이것의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 카멜레온 형광 pH 프로브는 플루오레세인 잔기 및 디에틸트리아민 스페이서를 포함하는 로다민 골격 구조의 화학식 1로 표시된다.
<화학식 1>
Figure pat00001
본 발명의 또다른 구체예는 화학식 1로 표시되는 카멜레온 형광 pH 프로브의 제조방법에 관한 것이다. 하기 반응식 1에서와 같이 로다민 유도체(화학식 2)로부터 화학식 1을 제조할 수 있다.
[반응식 1]
Figure pat00002

구체적으로, 본 발명의 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법은 화학식 2의 화합물을 N,N-디메틸포름아미드(DMF), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디미드(EDCI), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)의 존재 하에서 화학식 3의 화합물과 반응시킴으로써 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계를 포함한다.
<화학식 2>
Figure pat00003
<화학식 3>
Figure pat00004
본 발명에 따른 비율계량적 pH 센서는 생체 내에서 넓은 pH 범위에 걸친 검출이 가능하면서 세포내 pH의 정확한 양적 측정이 가능하여, 병원성 세포에서의 pH 변화를 모니터하는 진단 툴로 이용될 수 있다.
도 1(a)는 다양한 pH에서 본 발명에 따른 프로브가 나타내는 형광 스펙트럼 변화를 관찰한 그래프이다. 도 1(b)는 F512/F580 vs pH의 그래프이다. 여기서 F512 및 F580은 각각 512 nm 및 580 nm의 형광 강도를 나타낸다. 도 1(c)는 pH4와 pH10 사이에서 본 발명에 따른 프로브의 가역성 형광 변화를 보여주는 그래프이다.
도2는 본 발명에 따른 프로브로 처리된 HeLa 세포의 공초점 현미경 이미지이다.
도3은 본 발명에 따른 프로브와 Lyso Tracker Blue DND-22(LTB)를 투여한 HeLa 세포에서의 위치 확인(colocalization) 실험 결과를 보여주는 이미지이다.
도4는 HeLa 세포에서 본 발명에 따른 프로브의 공초점 현미경 이미지이다.
도5는 HeLa 세포에서 본 발명에 따른 프로브의 세포내 pH 보정 커브 그래프(a) 및 본 발명에 따른 프로브가 투여된 HeLa 세포의 공초점 현미경 이미지(b)이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하고자 한다.
본 발명의 프로브는 플루오레세인 잔기 및 디에틸트리아민 스페이서를 포함하는 로다민 골격 구조의 화학식 1로 표시된다.
<화학식 1>
Figure pat00005
본 발명의 프로브는 염기-중성 pH에서는 녹색을, 산성 pH에서는 적색을 각각 나타낸다. 본 발명의 프로브는 넓은 pH에 따라 식별가능한 비율계량적 형광 변화를 나타낸다. 이에 따라, 본 발명의 프로브는 병원성 세포에서의 pH 변화를 모니터하는 진단 툴로 이용될 수 있다.
생리 조건하에서의 생체적합성과 높은 민감도로 인하여 플루오레세인과 로다민 형광단은 세포내 pH 측정을 위하여 광범위하게 이용되어 왔다. 플루오레세인은 염기 또는 중성 pH에서 시클로락탐 고리를 열어서 강한 녹색 형광을 내고(여기/방출, 495/412 nm), 산성 pH에서 시클로락탐 고리를 닫아서 방출이 확연히 감소된다. 반대로, 로다민은 산성 pH에서 시클로락탐의 고리를 열어서 강한 적색 형광을 나타내지만, 염기성 또는 중성 pH에서는 시클로락탐 고리를 형성하여 비형광성이 된다. 이러한 현상에 의하여, 플루오레세인과 로다민이 결합된 본 발명에 따른 프로브는 단일 분자로서 pH 변화에 따라 반대의 형광 방출을 나타내므로, 광범위한 세포내 pH를 측정하는데 있어서 비율계량적 형광 프로브로서 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
한편, 본 발명의 한 구체예로서, 화학식 1로 표시되는 프로브의 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 방법은 하기 화학식 2(로다민)를 갖는 화합물 및 하기 화학식 3(플루오로세인)을 갖는 화합물을 반응시킴으로써 하기 화학식 1을 갖는 화합물을 제조하는 단계를 포함한다:
<화학식 2>
Figure pat00006

<화학식 3>
Figure pat00007
상기 반응은 DMF 중 EDCl 및 DMAP이 존재하에서 수행된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
시약 준비
모든 반응들은 질소 분위기 하에서 수행되었다. 아미노산, 금속 이온, 티올 및 기타 화학물질과 같은 모든 시약은 Aldrich에서 구입하였다. 세포소기관 추적용 염색약 및 LysoSensorTM Yellow/Blue DND-160은 Molecular Probes(미국, 인비트로젠)에서 구입하였다. 모든 용매는 HPLC 시약 등급이고, 삼중-탈이온수가 분석 실험에서 사용되었다. 실리카 겔 60(머크, 0.063-0.2 mm)가 컬럼 크로마토그래피에 사용되었다. 분석 박층 크로마토그래피는 Merck 60 F254 실리카겔(전코칭된 시트, 0.25 mm 두께)을 사용하여 수행되었다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 Varian 300 및 400 MHz 분광기에서 CDCl3에서 수집되었다(메사추세츠, 캠브리지, Cambridge Isotope Laboratories).
본 발명의 프로브의 저장 원액(stock solution)은 DMSO에서 제조되었다. 생물학적으로 적절한 분석물질, 예를 들면, GSH, Cys, Hcy, Na(I), K(I), Zn(II), Mg(II), Mn(II), Fe(III), Cu(II) 및 Ca(II)은 삼중-탈이온수로 제조되었다. 다양한 pH 완충용액은 50 mM의 칼륨 히드로젠 프탈레이트(pH2.6-5 완충용액), 나트륨 테트라보레이트(pH 9-10 완충용액), 및 나트륨 바이카보네이트(pH 완충용액)를 사용하여 제조되었다. pH는 0.1 M의 NaOH 또는 0.1 M의 HCl 용액을 첨부하여 조정하였다.
장치 준비
흡수 스펙트럼은 S-3100(Scinco) 분광광도계에서 측정하였고, 형광 스펙트럼은 제논 램프가 장착된 RF-5301 PC 분광형광계(Shimadzu)를 사용하여 측정하였다. 흡수 및 발광 측정을 위한 샘플은 석영 큐벳에 수용되었다(3mL 부피). 여기는 480 nm에서 이루어지고, 여기 및 방출 슬릿은 3 및 5 nm 폭을 갖는다.
본 발명에 따른 화학식 1의 프로브 합성
무수 DMF 중 플루오레세인(0.4g, 1.1mmol), EDCI(0.3 g, 1.9 mmol) 및 DMAP(0.3g, 2.6 mmol)의 혼합물을 실온에서 30분간 질소 분위기하에서 교반하였다. 화학식 2의 화합물(0.7g, 1.3 mmol)을 상기 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 용매의 제거 후, 조생성물을 용리제로 CH2Cl2/MeOH(v/v, 20:1)을 사용하여 실리카겔로 정제하여, 본 발명에 따른 화학식 1의 프로브를 오렌지색 고체로 수득하였다(0.3g, 27%).
HRESI-MS m/z (M+H+) calc 842.39121, obs 842.39016. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.83 (d, 2 H, J = 5.5 Hz); 7.457.35 (m, 4 H); 7.077.02 (m, 1 H); 6.996.93 (m, 1 H); 6.58 (s, 2 H); 6.40 (s, 6 H); 6.32 (d, 2 H, J = 2.5); 6.276.20 (m, 2 H); 3.313.20 (m, 8 H); 3.193.10 (m, 4 H); 2.292.21 (br d, 4 H); 1.09 (t, 12 H, J = 8.3 Hz). 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): 169.3, 169.0, 158.9, 153.8, 153.6, 153.4, 152.8, 149.1, 133.0, 130.7, 128.8, 128.5, 128.3,124.0, 123.2, 113.2, 109.2, 108.6, 104.8, 103.5, 98.1, 65.9, 65.3, 47.6, 44.5, 39.4, 29.9, 12.7 ppm.
세포 배양 및 사진 촬영
HeLa(인간 자궁경부암) 및 HepG2(인간 간암) 세포주를 10% FBS(WelGene), 페니실린(100 unit/mL), 및 스트렙토마이신(100 ug/ml)으로 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)에서 배양하였다. 사진 촬영 이틀 전에, 세포들을 계대배양하고, 유리 바닥 그릇(MatTek) 상에 플레이트하였다. 모든 세포들은 37℃의 5/95(v/v) 비율의 CO2/공기의 습기 분위기로 유지하였다. 표지를 하기 위하여, 성장 배지를 제거하고, FBS가 없는 DMEM으로 교환하였다. 세포들은 30분동안 5% CO2하에서 37℃의 10 uM로 처리하고 항온배양하였다. 세포들은 포스페이트 완충된 식염수(PBS, Gibco)로 3번 세척한 후, 레이카(Leica TCS SP3 모델)의 공초점 현미경을 이용하여 사진 촬영하였다.
세포내 pH 측정
세포를 니게리신 10.0 uM의 존재하에서 고농도 K+ 완충용액(30 mM NaCl, 120 mM KCl, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgSO4, 1mM NaH2PO4, 5 mM 글루코스, 20 mM HEPES, 및 20 mM NaOAc)으로 다양한 pH 값(4-8)에서 항온처리하였다. 30분 후, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 프로브 및 LysoSensor TM Yellow/Blue DND-160을 분리하여 각 웰에 투여하고, 37℃에서 항온처리하였다. 그리고, 형광 사진을 촬영하였다. pH 검정 곡선은 공초점 현미경(Leica)에 의하여 만들어졌다.
분석 결과
다양한 pH 에서 형광 스펙트럼 측정
pH가 증가하면 512 nm(F512)에서의 플루오레세인의 형광 강도가 증가하는 한편, 로다민은 580 nm(F580)에서 감소한다. 오렌지에서 녹색으로 형광색의 변화는 pH가 증가하면 쉽게 관찰되었다. 도 1b에서 보는 바와 같이, 형광 강도(F512/F580)의 상대적 비율은 pH 3.2-10.0에서 120 배(0.08에서 9.59) 증가하였다. (F512/F580) 비율의 그래프는 거의 직선에 가깝다는 점이 매우 흥미로운 특성이며, 이는 생물학 연구 등에서 생리적 pH 범위를 대부분 측정할 수 있음을 의미한다. 도 1c에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 프로브는 pH 4 및 pH 10 사이에서 가역성을 나타내어, pH 변화에 대한 예측가능한 평형 상태를 보여준다.
공초점 현미경 하에서 세포 내 pH 값의 측정
도 2는 공초점 현미경 하에서 세포내 pH 값을 측정한 결과를 보여준다. 염색된 이미지는 다수의 점과 같은 형상이 비-시토졸성 세포소기관일 것으로 추정된다. 본 발명의 프로브로 표지된 HeLa 세포의 스펙트럼 분석은 500-550 nm에서의 플루오레세인(녹색, 도 2a 및 도 2e)과 555-650 nm(적색, 도 2b 및 도 2e)의 로다민에 상응하여 식별가능한 방출 스펙트럼을 각각 보여주었다. 515 nm와 585 nm의 방출 최대값은 in vitro에서 측정된 본 발명의 프로브와 거의 일치한다. 도 2c의 오버레이 이미지에서 보는 바와 같이, 녹색 형광 이미지는 적색 형광 이미지와 명확하게 불일치한다. 이는 녹색 및 적색 형광 이미지가 HeLa 세포 내 세포소기관의 염기 및 산성 pH에 상응한다는 것을 시사한다.
세포소기관 -특이적 형광 염색을 이용한 위치 확인
세포소기관-특이적 형광 염색약(Lyso Tracker Blue and Mito Tracker Deep Red)을 사용하여 녹색 및 적색 형광의 세포내 위치를 확인하였다. 도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 프로브의 적색 이미지는 Lyso Tracker의 이미지와 주로 겹치고, 이는 리소좀의 산성 pH(3.5~6)가 로다민의 고리 열림을 활성화한다는 것을 의미한다. 그러나, Tracker는 녹색 이미지와 겹치지 않으며, 이는 본 발명의 화학식 1로 표시되는 프로브의 플루오레세인의 고리-열린 형태가 중성-염기성 세포소기관에서의 상태임을 의미하고 있다.
이와 같이, 도 2 및 도 3의 결과로부터 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 프로브는 세포내 pH의 넓은 범위를 측정할 수 있는 효과적인 진단 시약일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 프로브는 비율계량적 형광 변화를 나타내므로, 세포내 pH의 정량적 측정 용도로 사용할 수 있다.
세포내 pH 의 정량적 측정
H+/K+ 이온통로구, 니게리신이 HeLa 세포의 세포내 측정 실험에 사용되었다. 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 세포내 플루오레세인 단위의 형광 방출은 pH에 따라 증가하고, 로다민의 형광 방출은 감소한다. 그러나, 공초점 현미경에서 방출 필터의 넓은 범위로 인하여 측정이 가능하다.
도 5a에 나타난 그래프에서 볼 수 있듯이, pH 범위 4 내지 8에서 검정 곡선(calibration curve)이 직선임을 알 수 있으며, 이는 녹색과 적색 이미지의 비율로 본 발명의 프로브가 pH에 의존적인 시그날을 계측할 수 있음을 증명한다.
H2O2, NAC(N-아세틸 시스테인, GSH 전구체)와 같은 산화환원 물질이 세포소기관 산성도에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 도 5a의 보정 커브에 기초하여 HeLa 세포의 평균 pH 값을 측정하였고, 그 결과는 도 5b에서 확인할 수 있다. 비처리된 세포, H2O2 처리된 세포 및 NAC 처리된 세포의 pH 값은 5.7±0.2, 6.6±0.4, 4.9±0.1을 각각 나타내었다(도 5a). 이 결과를 통하여 H2O2 가 세포소기관, 예컨대 HeLa 세포의 리소좀을 염기성화하고, NAC는 산성화를 일으킨다는 것을 알 수 있다. 도 5의 결과는 세포내 산화-환원 균형은 리조좀의 산성도를 조절할 수 있음을 보여주었다.

Claims (4)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 생체내 pH 측정용 형광 프로브.
    <화학식 1>
    Figure pat00008

  2. 제1항에 있어서, 상기 형광 프로브는 염기 또는 중성 pH에서 녹색을 나타내고, 산성 pH에서는 적색을 나타내는 것을 특징으로 하는 생체내 pH 측정용 형광 프로브.
  3. 하기 화학식 2의 화합물을 하기 화학식 3의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 화학식 1로 표시되는 생체내 pH 측정용 형광 프로브를 제조하는 방법.
    <화학식 1>
    Figure pat00009


    <화학식 2>
    Figure pat00010


    <화학식 3>
    Figure pat00011

  4. 제3항에 있어서, 상기 반응은 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 중 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디미드(EDCl) 및 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP)의 존재 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 화학식 1로 표시되는 생체내 pH 측정용 형광 프로브를 제조하는 방법.

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