CN114259573B - 一种含有胆碱酯酶重活化剂的脑靶向脂质体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有胆碱酯酶重活化剂的脑靶向脂质体及其制备方法和用途，具体涉及胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂，该胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂是具有长循环功能的植物凝集素/核酸适配体双靶向脂质体，可实现中枢靶向递送胆碱酯酶重活化剂，可用于有机磷中毒时的急救，尤其能够缓解中枢中毒症状。

Description

一种含有胆碱酯酶重活化剂的脑靶向脂质体及其制备方法和 用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种含有胆碱酯酶重活化剂的脑靶向脂质体及其制备方法和用途。

背景技术

目前，胆碱酯酶重活化剂是针对有机磷中毒的特效解毒药，主要用于中、重度有机磷中毒的解救，能够从根本上恢复乙酰胆碱酯酶的活性，从而维持胆碱能神经系统功能的正常。但是，胆碱酯酶重活化剂多属于季铵盐，亲水性强，难以透过血脑屏障，无法逆转中枢中乙酰胆碱酯酶的活性，因而对抗致命的中枢中毒症状效果很差。

因此，使胆碱酯酶重活化剂穿透血脑屏障进入中枢，是解救中枢性有机磷中毒的核心问题。

发明内容

本发明是为了解决胆碱酯酶重活化剂难以穿透血脑屏障进入中枢的问题。本发明的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂是具有长循环功能的植物凝集素/核酸适配体双靶向脂质体，可实现中枢靶向递送胆碱酯酶重活化剂，可用于有机磷中毒时的急救，尤其能够缓解中枢中毒症状。

为此，在本发明的第一方面，本发明提供了一种胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂，其包含：

脂质体；

胆碱酯酶重活化剂，所述胆碱酯酶重活化剂包载于所述脂质体内部；

植物凝集素；

核酸适配体；

其中，所述植物凝集素和所述核酸适配体以共价键结合在所述脂质体表面。

在一些实施方案中，所述植物凝集素选自蓖麻毒素B链、相思子毒素B链或其组合。

在一些实施方案中，所述植物凝集素为蓖麻毒素B链。

在一些实施方案中，所述核酸适配体为TfRA15T(5’-Cholesterol-TTT TTT TTTTTT TTT GC GTG GTAC CAC GC-3’-dT)。

在一些实施方案中，所述脂质体的膜材选自蛋黄卵磷脂E80、DOPS、DSPE-mPEG2000、胆固醇或其任意组合。

在一些实施方案中，所述脂质体的膜材为蛋黄卵磷脂E80、DOPS、DSPE-mPEG2000和胆固醇的混合物。

在一些实施方案中，所述胆固醇的重量份为15-25(如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，优选20)，所述DOPS的重量份为5-15(如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，优选10)，所述DSPE-mPEG2000的重量份为2-6(如2、3、4、5或6，优选4)，所述蛋黄卵磷脂E80的重量份为58-66(如58、59、60、61、62、63、64、65或66，优选60)。

在一些实施方案中，所述核酸适配体与所述植物凝集素的摩尔比为1:(0.125-1)，例如1:0.125、1:0.25、1:0.5、1:0.75或1:1。

在一些实施方案中，所述核酸适配体与所述脂质体的膜材的质量比为(0.4-0.5):9.4，例如0.4:9.4、0.41:9.4、0.42:9.4、0.43:9.4、0.44:9.4、0.45:9.4、0.46:9.4、0.47:9.4、0.48:9.4、0.49:9.4或0.5:9.4，优选为0.42:9.4。

在一些实施方案中，所述胆碱酯酶重活化剂选自双复磷、氯解磷定、酰胺磷定HI-6、TMB-4、MMB-4或其任意组合。

在一些实施方案中，所述胆碱酯酶重活化剂与所述脂质体的膜材的质量比为1:(9-10)，例如1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10，优选为1:9.4。

在一些实施方案中，所述胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂的粒径在130～160nm之间，例如130-135nm、135-140nm、140-145nm、145-150nm、150-155nm或155-160nm。

在一些实施方案中，所述胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂的zeta电位在-53～-29mV之间，例如-53～-50mV、-50～-45mV、-45～-40mV、-40～-35mV、-35～-30mV或-30～-29mV。

在一些实施方案中，所述胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂是通过以下第二方面所述的制备方法制备获得的。在一些实施方案中，所述胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂是通过以下第二方面中任意技术方案制备获得的。

在本发明的第二方面，本发明提供了制备前述的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂的方法，其包括：

1)将胆碱酯酶重活化剂包载于脂质体内部；

2)用植物凝集素和核酸适配体对步骤1)获得的脂质体进行修饰，获得所述胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂。

在一些实施方案中，所述方法的具体步骤为：

i)将植物凝集素与还原剂进行反应，获得还原后的植物凝集素；

ii)将DSPE-PEG2K-MAL与步骤ii)获得的还原后的植物凝集素进行反应，获得被DSPE-PEG2K修饰的还原后的植物凝集素；

iii)将脂质混合物的二氯甲烷溶液进行蒸发干燥(例如旋转蒸发干燥)，获得干燥混合物；

iv)将步骤iii)获得的干燥混合物与胆碱酯酶重活化剂的PBS溶液、步骤ii)获得的被DSPE-PEG2K修饰的还原后的植物凝集素以及核酸适配体进行混合反应，获得所述胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂。

在一些实施方案中，所述植物凝集素选自蓖麻毒素B链、相思子毒素B链或其组合。

在一些实施方案中，所述植物凝集素为蓖麻毒素B链。

在一些实施方案中，所述还原剂为TCEP。

在一些实施方案中，步骤i)中，所述植物凝集素与所述还原剂的质量比为0.8:(0.02-0.03)，例如0.8:0.021、0.8:0.022、0.8:0.023、0.8:0.024、0.8:0.025、0.8:0.026、0.8:0.027、0.8:0.028、0.8:0.029或0.8:0.03，优选为0.8:0.023。

在一些实施方案中，步骤i)中，所述反应是在避光的条件下进行的，优选地，进行时间为30min-60min，例如30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min，优选45min。

在一些实施方案中，步骤ii)中所述DSPE-PEG2K-MAL与步骤i)中所述植物凝集素的质量比为(68-69):0.8，例如68:0.8、68.1:0.8、68.2:0.8、68.3:0.8、68.4:0.8、68.5:0.8、68.6:0.8、68.7:0.8、68.8:0.8、68.9:0.8或69:0.8，优选为68.46:0.8。

在一些实施方案中，步骤ii)中，所述反应是在避光的条件下进行的，优选地，进行时间为20-30h，例如20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h或30h，优选24h。

在一些实施方案中，所述脂质混合物的二氯甲烷溶液中，所述脂质混合物的浓度为1.8-1.9mg/mL，例如1.8mg/mL、1.81mg/mL、1.82mg/mL、1.83mg/mL、1.84mg/mL、1.85mg/mL、1.86mg/mL、1.87mg/mL、1.88mg/mL、1.89mg/mL或1.9mg/mL，优选为1.88mg/mL。

在一些实施方案中，所述脂质混合物选自蛋黄卵磷脂E80、DOPS、DSPE-mPEG2000、胆固醇或其任意组合。

在一些实施方案中，所述脂质混合物为蛋黄卵磷脂E80、DOPS、DSPE-mPEG2000和胆固醇的混合物。

在一些实施方案中，所述脂质混合物中，所述胆固醇的重量份为15-25(如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，优选20)，所述DOPS的重量份为5-15(如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，优选10)，所述DSPE-mPEG2000的重量份为2-6(如2、3、4、5或6，优选4)，所述蛋黄卵磷脂E80的重量份为58-66(如58、59、60、61、62、63、64、65或66，优选60)。

在一些实施方案中，所述核酸适配体与所述植物凝集素的摩尔比为1:(0.125-1)，例如1:0.125、1:0.25、1:0.5、1:0.75或1:1。

在一些实施方案中，所述核酸适配体与所述脂质混合物的质量比为(0.4-0.5):9.4，例如0.4:9.4、0.41:9.4、0.42:9.4、0.43:9.4、0.44:9.4、0.45:9.4、0.46:9.4、0.47:9.4、0.48:9.4、0.49:9.4或0.5:9.4，优选为0.42:9.4。

在一些实施方案中，步骤iv)中，所述混合反应的转速为400-600RPM，例如400RPM、420RPM、440RPM、460RPM、480RPM、500RPM、520RPM、540RPM、560RPM、580RPM或600RPM，优选500RPM。

在一些实施方案中，步骤iv)中，所述混合反应的时间为3-5h，例如3小时、3.5小时、4小时、4.5小时或5小时，优选4小时。

在一些实施方案中，所述核酸适配体为TfRA15T(5’-Cholesterol-TTT TTT TTTTTT TTT GC GTG GTAC CAC GC-3’-dT)。

在一些实施方案中，所述胆碱酯酶重活化剂选自双复磷、氯解磷定、酰胺磷定HI-6、TMB-4、MMB-4或其任意组合。

在一些实施方案中，所述胆碱酯酶重活化剂与所述脂质混合物的质量比为1:(9-10)，例如1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10，优选为1:9.4。

在一些实施方案中，步骤i)-步骤iv)是在常温的条件下进行的。

在本发明的第三方面，本发明提供了由前述的制备方法制备得到的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂。

在本发明的第四方面，本发明提供了前述的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂或前述的方法制备的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂在制备用于治疗有机磷中毒的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述有机磷中毒为全身或中枢性有机磷中毒、优选为中枢性有机磷中毒。

在一些实施方案中，所述有机磷中毒为全身或中枢性有机磷急性中毒、优选为中枢性有机磷急性中毒。

在一些实施方案中，所述有机磷中毒为有机磷急性中毒。

在一些实施方案中，所述有机磷中毒为中、重度有机磷中毒。

在本发明的第五方面，本发明提供了前述的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂或前述的方法制备的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂，其用于治疗有机磷中毒。

在一些实施方案中，所述有机磷中毒为全身或中枢性有机磷中毒、优选为中枢性有机磷中毒。

在一些实施方案中，所述有机磷中毒为全身或中枢性有机磷急性中毒、优选为中枢性有机磷急性中毒。

在一些实施方案中，所述有机磷中毒为有机磷急性中毒。

在一些实施方案中，所述有机磷中毒为中、重度有机磷中毒。

在本发明的第六方面，本发明提供了治疗有机磷中毒的方法，其包括给予受试者治疗有效量的前述的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂或前述的方法制备的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂。

在一些实施方案中，所述有机磷中毒为全身或中枢性有机磷中毒、优选为中枢性有机磷中毒。

在一些实施方案中，所述有机磷中毒为全身或中枢性有机磷急性中毒、优选为中枢性有机磷急性中毒。

在一些实施方案中，所述有机磷中毒为有机磷急性中毒。

在一些实施方案中，所述有机磷中毒为中、重度有机磷中毒。

本发明中，“受试者”指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物指哺乳动物。所述哺乳动物包括牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物，例如是人，猫，狗或猪。哺乳动物包括，但不限于，牲畜(诸如牛)、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物指人。

本发明中，术语“治疗有效量”是指在合理的医学判断范围内，足以治疗或预防患者疾病但足够低地避免严重副作用(在合理的利益/风险比)的量。化合物的治疗有效量将根据所选择的具体化合物(例如考虑化合物的效力、有效性和半衰期)、所选择的给药途径、所治疗的疾病、所治疗的疾病的严重性、所治疗的患者的年龄、大小、体重和身体疾病、所治疗的患者的医疗史、治疗持续时间、并行疗法的性质、所需的治疗效果等因素发生变化，但仍可以由本领域技术人员常规确定。

有益效果

本发明的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂是具有长循环功能的植物凝集素/核酸适配体双靶向脂质体，可实现中枢靶向递送胆碱酯酶重活化剂，可用于有机磷中毒时的急救，尤其能够缓解中枢中毒症状。

附图说明

图1：细胞摄取实验后，不同脂质体的FITC荧光强度。

图2：药代动力学实验中，给药不同脂质体后大鼠血液中PAM的浓度。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

本发明目的之一在于提供一种含有胆碱酯酶重活化剂的脑靶向脂质体递送系统的制备方法，该方法可以制备获得具有长循环功能的植物凝集素/核酸适配体双靶向脂质体，该双靶向脂质体可实现中枢靶向递送胆碱酯酶重活化剂，可用于有机磷中毒时的急救，尤其能够缓解中枢中毒症状。

具体地，本发明提供了一种含有胆碱酯酶重活化剂的脑靶向脂质体递送系统的制备方法。

在一些实施方案中，包载肟类胆碱酯酶重活化剂的具有长循环功能的植物凝集素/核酸适配体双靶向脂质体可用于治疗全身及中枢性有机磷急性中毒。

在一些实施方案中，所述方法包括：包载肟类胆碱酯酶重活化剂，用植物凝集素/核酸适配体修饰脂质体，制备成脑靶向脂质体。

在一些实施方案中，所用的膜材是蛋黄卵磷脂E80、DOPS、DSPE-mPEG2000及胆固醇四种；所述的肟类胆碱酯酶重活化剂包括双复磷、氯解磷定(PAM)、酰胺磷定HI-6、TMB-4、MMB-4；所述的植物凝集素包括蓖麻毒素B链或相思子毒素B链；核酸适配体为TfRA15T(5’-Cholesterol-TTT TTT TTT TTT TTT GC GTG GTAC CAC GC-3’-dT)。

在一些实施方案中，按质量比制备，胆固醇占比为20，DOPS占比为10，DSPE-mPEG2000占比为4，蛋黄卵磷脂E80占比为58～66，植物凝集素占比为1～6，蛋黄卵磷脂和蓖麻毒素B链/核酸适配体总占比为66，植物凝集素/核酸适配体摩尔比为(0.125～1):1。

在一些实施方案中，胆碱酯酶重活化剂占脑靶向脂质体的1/11(质量比)。

在一些实施方案中，植物凝集素可以由蓖麻毒素B链替换成相思子毒素B链，可以达到类似的效果，蓖麻毒素B链(RTB)和相思子毒素B链都是植物凝集素，且蓖麻毒素B链和相思子毒素B链作用原理相似。

在一些实施方案中，包载的胆碱酯酶重活化剂，可以由氯解磷定替换成双复磷、酰胺磷定HI-6、TMB-4、MMB-4，他们都是属于胆碱酯酶重活化剂，水溶性药物。

在另一些实施方案中，本发明提供了一种含有胆碱酯酶重活化剂的脑靶向脂质体的制备方法，其包括：

向DSPE-PEG2K-MAL中加入PBS，加入含TCEP的RTB溶液，制得RTB-DSPE-PEG2K；

向蛋黄卵磷脂E80：胆固醇：DOPS：DSPE-mPEG2K质量比为58:20:10:4中加入二氯甲烷，旋蒸干燥后，加入PAM溶液溶解，再加入RTB-DSPE-PEG2K和核酸适配体，振荡反应，即得脂质体。对所得脂质体进行粒径电位表征。脂质体的粒径在130～160nm之间，zeta电位在-53～-29mV之间。

在另一些实施方案中，本发明提供了一种含有胆碱酯酶重活化剂的脑靶向脂质体的制备方法，其包括：

向DSPE-PEG2K-MAL中加入PBS，加入含TCEP的RTB溶液，制得RTB-DSPE-PEG2K；

胆固醇占比为20，DOPS占比为10，DSPE-mPEG2K占比为4，蛋黄卵磷脂E80占比60-65，RTB占比为1～6，蛋黄卵磷脂E80和RTB总占比为66；

向蛋黄卵磷脂E80：胆固醇：DOPS：DSPE-mPEG2K中加入二氯甲烷，旋蒸干燥后，加入FITC溶液溶解，再加入RTB-DSPE-PEG2K，振荡反应，即得RTB占比不同的脂质体。

复苏bEnd.3细胞，传代，接种至六孔板(至少1×10⁶个细胞/孔)中，孵育1～2天，分别给载FITC的脂质体孵育2h，将细胞从六孔板上移至离心管中，采用流式细胞仪进行测定FITC荧光强度。

在另一些实施方案中，本发明提供了一种含有胆碱酯酶重活化剂的脑靶向脂质体的制备方法，其包括：

向DSPE-PEG2K-MAL中加入PBS，加入含TCEP的RTB溶液，制得RTB-DSPE-PEG2K；

胆固醇占比为20，DOPS占比为10，DSPE-mPEG2K占比为4，蛋黄卵磷脂E80占比58-62，RTB占比为4，RTB/核酸适配体摩尔比为1、1:2、1:4、1:8；

向蛋黄卵磷脂E80：胆固醇：DOPS：DSPE-mPEG2K中加入二氯甲烷，旋蒸干燥后，加入FITC溶液溶解，再加入RTB-DSPE-PEG2K和核酸适配体，振荡反应，即得不同摩尔比RTB/核酸适配体的脂质体；

复苏bEnd.3细胞，传代，接种至六孔板(至少1×10⁶个细胞/孔)中，孵育1～2天，分别给载FITC的脂质体孵育2h，将细胞从六孔板上移至离心管中，采用流式细胞仪进行测定FITC荧光强度。

在另一些实施方案中，本发明提供了一种含有胆碱酯酶重活化剂的脑靶向脂质体的制备方法，其包括：

①向质量比为66:20:10:4的蛋黄卵磷脂E80、胆固醇、DOPS、DSPE-PEG2K-MAL中加入二氯甲烷，旋蒸干燥后，加入PAM溶液溶解，振荡反应，即得脂质体LP。

②向质量比为66:20:10:4的蛋黄卵磷脂E80、胆固醇、DOPS、DSPE-mPEG2K中加入二氯甲烷，旋蒸干燥后，加入PAM溶液溶解，振荡反应，即得脂质体LLP。

将制得的两种脂质体以相同的给药剂量给药大鼠，在预设时间点取血，经过一定处理后高效液相色谱法测定不同时间点的血浆样品中PAM浓度。

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。

其中，以下实验所涉及的部分实验材料、设备来源：

氯解磷定：购买自美国Sigma公司；

蛋黄卵磷脂E80：购买自德国Lipoid公司；

二油酸酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)：购买自美国Avanti公司；

胆固醇：购买自德国Lipoid公司；

DSPE-mPEG2000：购买自西安瑞禧生物科技有限公司；

核酸适配体TfRA15T：购买自北京擎科生物技术有限公司；

异硫氰酸荧光素(FITC)：购买自国药集团化学试剂有限公司；

LF-1型脂质体挤压器：购买自加拿大AVESTIN公司；

BT125D型十万分之一天平：购买自德国Sartorius公司；

BS323S型千分之一电子分析天平：购买自德国Sartorius公司；

MS3型数显振荡混匀器：购买自德国IKA公司；

RE-52AA型旋转蒸发仪：购买自上海亚荣生化仪器厂；

FACSAris型流式细胞仪：购买自美国BD公司；

DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱：购买自上海一恒科技有限公司

实施例1：脂质体的制备

(1)RTB-DSPE-PEG2K的制备：

常温下，用PBS稀释TCEP(阿法埃莎(中国)化学有限公司)，振荡混匀，得到10mMTCEP溶液。向0.8mL RTB水溶液(Vector公司，每毫升含RTB 1mg)中加入8μL10mM TCEP溶液，避光震荡反应45min。向68.46mg DSPE-PEG2K-MAL(西安瑞禧生物科技有限公司)中加入1.2mL PBS缓冲液(美国Gibco公司)，振荡混匀，加入上述反应完的含TCEP的RTB溶液，避光振荡反应24h，制得RTB-DSPE-PEG2K。

(2)脂质体的制备

常温下，向质量比为60:20:10:4蛋黄卵磷脂E80、胆固醇、DOPS、DSPE-mPEG2K的混合物(其中，DSPE-mPEG2K的质量为0.4mg)中加入二氯甲烷(5mL)溶解，旋蒸干燥后，加入0.5mL 2mg/mLPAM溶液(PBS为溶剂)溶解，再加入前述制备得到的0.4mg RTB-DSPE-PEG2K和0.42mg核酸适配体TfRA15T(RTB-DSPE-PEG2K和核酸适配体的摩尔比为1:4)，500RPM振摇反应4h，即得脂质体RALP-PAM。

对比例1：

常温下，向质量比为66:20:10:4的蛋黄卵磷脂E80、胆固醇、DOPS、DSPE-mPEG2K的混合物(其中，DSPE-mPEG2K的质量为0.4mg)中加入二氯甲烷(5mL)溶解，旋蒸干燥后，加入0.5mL 2mg/mL氯解磷定(PAM)溶液(PBS为溶剂)溶解，500RPM振摇反应4h，即得脂质体LP-PAM。

对比例2：

常温下，向质量比为62:20:10:4的蛋黄卵磷脂E80、胆固醇、DOPS、DSPE-mPEG2K的混合物(其中，DSPE-mPEG2K的质量为0.4mg)中加入二氯甲烷(5mL)溶解，旋蒸干燥后，加入0.5mL 2mg/mL PAM溶液(PBS为溶剂)溶解，再加入实施例1制备得到的0.4mg RTB-DSPE-PEG2K，500RPM振摇反应4h，即得脂质体RLP-PAM。

对比例3：

常温下，向质量比为64:20:10:4蛋黄卵磷脂E80、胆固醇、DOPS、DSPE-mPEG2K的混合物(其中，DSPE-mPEG2K的质量为0.4mg)中加入二氯甲烷(5mL)溶解，旋蒸干燥后，加入0.5mL 2mg/mL PAM溶液(PBS为溶剂)溶解，再加入0.42mg核酸适配体TfRA15T，500RPM振摇反应4h，即得脂质体ALP-PAM。

测试例1：细胞摄取实验

用FITC等量替代上述实施例1以及对比例1-3中的PAM，其余步骤不变，制备得到包载FITC的上述四种脂质体。

复苏bEnd.3细胞，传代，接种至六孔板(至少1×10⁶个细胞/孔)中，孵育1～2天，之后分别与等量的前述制备的四种载FITC的脂质体(LP、RLP、ALP、RALP，四种载FITC的脂质体的浓度均为1mg/mL)孵育2h，之后将细胞从六孔板上移至离心管中，采用流式细胞仪进行测定FITC荧光强度。

结果：实验结果如图1所示。从图1可以看出，具有长循环功能的植物凝集素/核酸适配体共修饰的实施例1制备的脑靶向脂质体的细胞摄取能力明显更好。

测试例2：药代动力学实验：

麻醉雄性Wistar大鼠(200±20g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司)，分别将PAM、前述实施例1制备的RALP-PAM、前述对比例1制备的LP-PAM、前述对比例2制备的RLP-PAM、前述对比例3制备的ALP-PAM给药五只大鼠(给药方法为静脉给药，给药剂量均为8.3kg/g)，在给药后预设时间点(0.08、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6h)分别取血，离心后取50μL上清液，加入双复磷内标液，混合均匀，再加入400μL蛋白沉淀剂(乙腈与水体积比为1:1)，涡旋1min，离心5min，取上清液进样，采用高效液相色谱仪分析，检测其中PAM的浓度。

结果：实验结果如图2所示。从图2中可以看出，具有长循环功能的植物凝集素/核酸适配体共修饰的实施例1制备的脑靶向脂质体能够明显提高PAM在血液中的浓度。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (24)

1.一种胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂，其包含：

脂质体，所述脂质体的膜材为蛋黄卵磷脂E80、DOPS、DSPE-mPEG2000和胆固醇的混合物，所述胆固醇的重量份为15-25，所述DOPS的重量份为5-15，所述DSPE-mPEG2000的重量份为2-6，所述蛋黄卵磷脂E80的重量份为58-66；

胆碱酯酶重活化剂，所述胆碱酯酶重活化剂包载于所述脂质体内部；

被DSPE-PEG2K-MAL修饰的还原后的植物凝集素，所述植物凝集素为蓖麻毒素B链；和

核酸适配体，所述核酸适配体为5’-Cholesterol-TTT TTT TTT TTT TTT GC GTG GTACCAC GC-3’-dT；

其中，所述被DSPE-PEG2K-MAL修饰的还原后的植物凝集素和所述核酸适配体以共价键结合在所述脂质体表面；

所述核酸适配体与所述被DSPE-PEG2K-MAL修饰的还原后的植物凝集素的摩尔比为1:(0.125-1)，所述核酸适配体与所述脂质体的膜材的质量比为(0.4-0.5):9.4；

所述被DSPE-PEG2K-MAL修饰的还原后的植物凝集素是通过如下方式制备获得的：

i)将植物凝集素与还原剂进行反应，获得还原后的植物凝集素，所述还原剂为TCEP，

ii)将DSPE-PEG2K-MAL与步骤i)获得的还原后的植物凝集素进行反应，获得被DSPE-PEG2K-MAL修饰的还原后的植物凝集素，

其中，步骤i)中，所述植物凝集素与所述还原剂的质量比为0.8:(0.02-0.03)，步骤ii)中所述DSPE-PEG2K-MAL与步骤i)中所述植物凝集素的质量比为(68-69):0.8。

2.根据权利要求1所述的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂，其中，所述胆固醇的重量份为20。

3.根据权利要求1所述的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂，其中，所述DOPS的重量份为10。

4.根据权利要求1所述的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂，其中，所述DSPE-mPEG2000的重量份为4。

5.根据权利要求1所述的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂，其中，所述蛋黄卵磷脂E80的重量份为60。

6.根据权利要求1所述的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂，其中，所述核酸适配体与所述脂质体的膜材的质量比为0.42:9.4。

7.根据权利要求1所述的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂，其中，所述胆碱酯酶重活化剂选自双复磷、氯解磷定、酰胺磷定HI-6、TMB-4、MMB-4或其任意组合。

8.根据权利要求1所述的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂，其中，所述胆碱酯酶重活化剂与所述脂质体的膜材的质量比为1:(9-10)。

9.根据权利要求1所述的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂，其中，所述胆碱酯酶重活化剂与所述脂质体的膜材的质量比为1:9.4。

10.制备权利要求1所述的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂的方法，其中，所述方法的具体步骤为：

i)将植物凝集素与还原剂进行反应，获得还原后的植物凝集素，所述植物凝集素为蓖麻毒素B链，所述还原剂为TCEP，所述植物凝集素与所述还原剂的质量比为0.8:(0.02-0.03)；

ii)将DSPE-PEG2K-MAL与步骤i)获得的还原后的植物凝集素进行反应，获得被DSPE-PEG2K-MAL修饰的还原后的植物凝集素，所述DSPE-PEG2K-MAL与步骤i)中所述植物凝集素的质量比为(68-69):0.8；

iii)将脂质混合物的二氯甲烷溶液进行蒸发干燥，获得干燥混合物，所述脂质混合物为蛋黄卵磷脂E80、DOPS、DSPE-mPEG2000和胆固醇的混合物，所述脂质混合物中，所述胆固醇的重量份为15-25，所述DOPS的重量份为5-15，所述DSPE-mPEG2000的重量份为2-6，所述蛋黄卵磷脂E80的重量份为58-66；

iv)将步骤iii)获得的干燥混合物与胆碱酯酶重活化剂的PBS溶液、步骤ii)获得的被DSPE-PEG2K-MAL修饰的还原后的植物凝集素以及核酸适配体进行混合反应，获得所述胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂，

其中，所述核酸适配体为5’-Cholesterol-TTT TTT TTT TTT TTT GC GTG GTAC CACGC-3’-dT，所述核酸适配体与所述被DSPE-PEG2K-MAL修饰的还原后的植物凝集素的摩尔比为1:(0.125-1)，所述核酸适配体与所述脂质混合物的质量比为(0.4-0.5):9.4。

11.根据权利要求10所述的方法，其具有选自以下(1)-(17)中的一项或多项技术特征：

(1)步骤i)中，所述植物凝集素与所述还原剂的质量比为0.8:0.023；

(2)步骤i)中，所述反应是在避光的条件下进行的；

(3)步骤i)中，所述反应的进行时间为30min-60min；

(4)步骤ii)中所述DSPE-PEG2K-MAL与步骤i)中所述植物凝集素的质量比为68.46:0.8；

(5)步骤ii)中，所述反应是在避光的条件下进行的；

(6)步骤ii)中，所述反应的进行时间为20-30h；

(7)所述脂质混合物的二氯甲烷溶液中，所述脂质混合物的浓度为1.8-1.9mg/mL；

(8)所述脂质混合物中，所述胆固醇的重量份为20；

(9)所述脂质混合物中，所述DOPS的重量份为10；

(10)所述脂质混合物中，所述DSPE-mPEG2000的重量份为4；

(11)所述脂质混合物中，所述蛋黄卵磷脂E80的重量份为60；

(12)所述核酸适配体与所述脂质混合物的质量比为0.42:9.4；

(13)步骤iv)中，所述混合反应的转速为400-600RPM；

(14)步骤iv)中，所述混合反应的时间为3-5h；

(15)所述胆碱酯酶重活化剂选自双复磷、氯解磷定、酰胺磷定HI-6、TMB-4、MMB-4或其任意组合；

(16)所述胆碱酯酶重活化剂与所述脂质混合物的质量比为1:(9-10)；

(17)步骤i)-步骤iv)是在常温的条件下进行的。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，步骤i)中，所述反应的进行时间为45min。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，步骤ii)中，所述反应的进行时间为24h。

14.根据权利要求11所述的方法，其中，所述脂质混合物的二氯甲烷溶液中，所述脂质混合物的浓度为1.88mg/mL。

15.根据权利要求11所述的方法，其中，步骤iv)中，所述混合反应的转速为500RPM。

16.根据权利要求11所述的方法，其中，步骤iv)中，所述混合反应的时间为4小时。

17.根据权利要求11所述的方法，其中，所述胆碱酯酶重活化剂与所述脂质混合物的质量比为1:9.4。

18.权利要求1-9中任一项所述的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂或权利要求10-17中任一项所述的方法制备的胆碱酯酶重活化剂脂质体制剂在制备用于治疗有机磷中毒的药物中的用途。

19.根据权利要求18所述的用途，其中，所述有机磷中毒为全身或中枢性有机磷中毒。

20.根据权利要求18所述的用途，其中，所述有机磷中毒为中枢性有机磷中毒。

21.根据权利要求18所述的用途，其中，所述有机磷中毒为全身或中枢性有机磷急性中毒。

22.根据权利要求18所述的用途，其中，所述有机磷中毒为中枢性有机磷急性中毒。

23.根据权利要求18所述的用途，其中，所述有机磷中毒为有机磷急性中毒。

24.根据权利要求18所述的用途，其中，所述有机磷中毒为中、重度有机磷中毒。

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