CN107693800A - 基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物及其制备方法和应用，该复合物由碳量子点与蓖麻毒素A链复合形成碳量子点‑蓖麻毒素A链复合物，然后经脂质体包封，再在脂质体上修饰核仁素核酸适配体制得，制得的复合物更容易进入细胞，经由高尔基体路径作用于核糖体，具有更强的细胞毒性，并可以有效的保护A链不被溶酶体酶解，还利用核仁素核酸适配体的特异性作用，可以靶向作用肿瘤细胞，降低对正常细胞的毒副作用，对肿瘤细胞的靶向治疗具有重要意义。

Description

基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物，还涉及该复合物的制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是导致全世界人口死亡的第二大原因，每年有数以百万的人因为肿瘤死亡。为了应对肿瘤危机，很多植物毒素被研究者们开发成无毒副作用或毒副作用极小的新型抗癌试剂。蓖麻毒素(Ricin)作为一种从蓖麻籽中提取的天然植物蛋白毒素，在作为抗癌试剂发挥其诱导肿瘤细胞凋亡方面具有很大的应用潜力。蓖麻毒素由发挥毒性作用的A链(RTA)和发挥凝集作用的B链(RTB)组成。RTA通过攻击核糖体上特定的腺嘌呤碱基而抑制蛋白质的合成，然而单独的RTA却无法顺利跨膜，只能借助RTB的凝集作用才能进入细胞发挥作用。完整的Ricin进入细胞后，经核内体被进一步转运，然而大部分的蓖麻毒素经胞吐作用排除胞外或被酶解，只有少部分进入高尔基体，并被进一步转运至内质网。在内质网上，与RTB分离的RTA才能进一步与核糖体作用，抑制蛋白质的合成从而导致细胞凋亡。但是RTB不具有特异性，可引起正常细胞的损伤，从而造成很大的副作用。此外RTB的存在还会空间阻碍RTA的催化活性位点，因此RTA的释放是其发挥作用的关键因素。
为了克服RTB带来的毒副作用，不少研究者试图用肿瘤抑制性抗体或在细胞膜上有过表达受体的激素或生长因子代替RTB与RTA结合为免疫毒素。这类免疫毒素虽然表现出对肿瘤细胞更高的选择性，但是效率却并未得到显著提高。主要原因是，这类免疫毒素进入胞内后，在溶酶体被大量酶解，降低了RTA进入胞质发挥作用的数量。因此，要让RTA充分发挥它的抗肿瘤效应，必须解决其对肿瘤细胞的选择性低及进入细胞后转运至作用位置少这两个问题。研究表明，经由高尔基体路径发挥作用的免疫毒素效率更高。因此，制备具有高尔基体靶向性的RTA复合物对蓖麻毒素靶向抗肿瘤具有重要意义。
发明内容
鉴于此，为解决上述技术问题，本发明第一目的利用一种生物相容性很好的并具有高尔基体靶向性的碳量子点(CQDs)与RTA组成碳量子点-蓖麻毒素A链复合物(CQDs-RTA)。再用修饰有核仁素核酸适配体(NCL aptamer)的脂质体将该复合物进行包封，组成具有肿瘤细胞靶向性的核仁素核酸适配体/脂质体/碳量子点-蓖麻毒素A链复合物(NCL/Lip/C-R)。当与不同细胞进行孵育时，由于核酸适配体对在肿瘤细胞表面过表达的核仁素的特异性识别作用，脂质体选择性地进入肿瘤细胞而对正常细胞影响不大。进入肿瘤细胞后，从脂质体释放的CQDs-RTA复合物又因为CQDs良好的高尔基体靶向性质，使该复合物可以很快的被转运至高尔基体，减少了溶酶体酶解的影响，使更多的A链被进一步转运至内质网和胞质与核糖体作用，提高了蓖麻毒素A链的靶向抗肿瘤作用。本发明第二目的提供基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物的制备方法；本发明第三目的提供基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物，所述复合物由碳量子点与蓖麻毒素A链复合形成碳量子点-蓖麻毒素A链复合物，然后经脂质体包封，再在脂质体上修饰核仁素核酸适配体制得。
2、所述基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物的制备方法，包括如下步骤：
1)制备碳量子点-蓖麻毒素A链复合物：将碳量子点和蓖麻毒素A链在PBS溶液中混合，充分反应，得碳量子点-蓖麻毒素A链复合物，保存备用；
2)将大豆卵磷脂，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇溶解在氯仿中，成膜，充分去除有机溶剂获得脂质层，然后用乙醇溶解脂质层，所得溶液注入由HEPES缓冲液配制的碳量子点-蓖麻毒素A链复合物，磁力搅拌，超声，透析，过滤制得脂质体包封的碳量子点-蓖麻毒素A链复合物；
3)将步骤2)所得脂质体包封的碳量子点-蓖麻毒素A链复合物与核仁素核酸适配体在HEPES缓冲液中混合，反应过夜，超滤，去除未结合的核仁素核酸适配体，得基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物。
优选的，步骤1)中，所述反应的条件为25℃条件下反应至少3h。
优选的，步骤2)中，所述大豆卵磷脂，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的摩尔比为70：28：2。
优选的，步骤2)中，充分去除有机溶剂的方法为N2吹拂3min，并在25℃真空干燥箱中干燥30min。
优选的，步骤2)中，所述成膜的条件为37℃真空旋蒸30min；所述搅拌为25℃磁力搅拌3h；所述超声为150W探头超声6min；所述透析为4℃透析12h，所述过滤为过0.22μm滤膜。
更优选的，步骤2)为：将大豆卵磷脂，胆固醇，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇按摩尔比为70：28：2溶解在氯仿中，氯仿按大豆卵磷脂浓度为10mg/ml加入，37℃真空旋蒸30min成膜，N2吹拂3min，并在25℃真空干燥箱中干燥30min，得脂质层；然后加入乙醇溶解脂质层，所得溶液注入含0.72mg/mL碳量子点-10nM蓖麻毒素A链复合物的HEPES缓冲液中，25℃磁力搅拌3h，150W探头超声6min，300kD透析袋4℃透析12h，过0.22μm滤膜，制得脂质体包封的碳量子点-蓖麻毒素A链复合物。
优选的，步骤3)中，所述反应为在四维混匀仪上18～25℃反应过夜；所述超滤为过100K超滤膜。
3、所述基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物在制备靶向抗肿瘤的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物，通过利用核酸适配体对在肿瘤细胞表面过表达的核仁素的特异性识别作用，脂质体选择性地进入肿瘤细胞，进入肿瘤细胞后，从脂质体释放的CQDs-RTA复合物中CQDs具有良好的高尔基体靶向性质，使该复合物可以很快的被转运至高尔基体，减少了溶酶体酶解的影响，使更多的A链被进一步转运至内质网和胞质与核糖体作用，提高了蓖麻毒素A链的靶向抗肿瘤作用。相对于同量单独的蓖麻毒素A链，碳量子点-A链复合物更容易进入细胞；且碳量子点-A链复合物可以有效的保护A链不被溶酶体酶解；由于更多的蓖麻毒素经由高尔基体路径到达核糖体，表现出更强的细胞毒性；因此该复合物对肿瘤细胞具有靶向性，而对正常细胞毒副作用小，对肿瘤细胞的治疗具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为CQDs-RTA复合物琼脂糖凝胶电泳检测结果(条带1为单独的CQDs(1.8mg/mL)，条带2为CQDs-RTA复合物(1.8mg/mL CDs-25nM RTA))。
图2为Lip/C-R复合物扫描电子显微镜(SEM)结果。
图3为模拟细胞内CQDs-RTA复合物抗酶解的细胞毒性实验结果。其中，1为对照组；2中加入0.001mg/mL蛋白酶；3中加入10nM RTA；4中加入与0.001mg/mL蛋白酶预孵育1h后的10nM RTA；5中加入36μg/mL CQDs-0.5nM RTA；6中加入与0.001mg/mL蛋白酶预孵育1h后的36μg/mL CQDs-0.5nM RTA。
图4为相同浓度的RTA和CQDs-RTA复合物与人喉癌上皮细胞(HEp-2cells)进行孵育后，对RTA的免疫荧光成像照片，标尺表示20μm。
图5为CQDs-RTA复合物与HEp-2cells孵育12h后与细胞器的荧光共定位照片。其中a-f为CQDs与高尔基体的共定位情况，g-l为CQDs与内质网的共定位情况，标尺表示20μm。a,g分别为高尔基体染料和内质网染料对高尔基体和内质网的染色照片；b,h为CQDs的荧光照片；c,i为RTA的免疫荧光照片；d,j为细胞器和CQDs合并后荧光照片；e,k为细胞器和RTA合并后荧光照片；f,l为CQDs和RTA合并后荧光照片。
图6为同浓度的CQDs,RTA和CQDs-RTA复合物与HEp-2cells孵育48h后的6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)活细胞荧光成像照片，标尺表示50μm。其中a-g为CFSE活细胞荧光照片，b-h为CFSE活细胞荧光照片与明场合并后的照片。
图7为NCL/Lip/C-R复合物与人脐静脉内皮细胞(HUVEC cells)和HEp-2cells孵育后的毒性结果。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例中蓖麻毒素A链购买于Sigma Aldrish(USA,L9514)；高尔基体靶向性CQDs参照文献以柠檬酸和L-半胱氨酸为碳源通过热解法进行合成；CFSE和CCK-8试剂从日本株式会社同仁化学研究所购买；一抗(兔抗蓖麻毒素A链的多克隆抗体)从Abcam(USA)购买；二抗(Alexa Fluor 488–标记的山羊抗兔IgG)从Proteintech(USA)购买；Lyso-tracker red,Golgi-tracker red,ER-tracker red和4’,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)从碧云天生物技术研究所购买；细胞毒性通过多功能酶标仪(Bio-Tek,USA)进行测定；细胞的荧光照片通过共聚焦荧光显微镜(Olympus IX-81)进行采集。荧光照片通过Image-Pro Plus 6.0(IPP)进行分析处理。实验所用水均为从微孔水净化系统获得的超纯水(18.2MΩ)。
实施例1、高尔基体靶向性CQDs-RTA复合物的获得
取200μL浓度为1.8mg/mL碳量子点(CQDs)、5μL浓度为1μM RTA和100μL 10×PBSbuffer(pH 7.4)混合在1mL水溶液中，摇床中25℃条件下反应3h，于4℃保存待用，即制得0.36mg/mL CQDs-5nM RTA复合物(同理制得其他高浓度复合物)。为验证CQDs-RTA复合物的成功合成，利用质量分数2％的琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果如图1所示。从图中可以观察到，CQDs-RTA复合物的条带相对于单独的CQDs来说，存在着明显的滞后，表明CQDs-RTA复合物已成功合成。
实施例2、脂质体/碳量子点-A链复合物(Lip/C-R)的构建
将大豆卵磷脂：胆固醇：DSPE-mPEG 2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)按摩尔比为70：28：2(10mg，2.04mg，1.05mg)溶解在1mL氯仿中，37℃真空旋蒸30min成膜，N2吹拂3min，并在25℃真空干燥箱中干燥30min，充分去除有机溶剂，之后加入450μL乙醇溶解脂质层并取所得溶液注入到含有0.72mg/mL CQDs-10nM RTA复合物的HEPES缓冲液(pH 7.4，包含25mM HEPES，150mM NaCl,5mM KCl，1mM MgCl2和1mM CaCl2)中，25℃磁力搅拌3h，150W探头超声6min，300kD透析袋4℃透析12h，过0.22μm滤膜，即得Lip/C-R复合物。通过扫描电子显微镜(SEM)表征，结果如图2所示。结果显示，观察到明显的囊状脂质体结构，表明脂质体/碳量子点-A链复合物制备成功。
实施例3、核仁素核酸适配体/脂质体碳量子点-A链复合物(Apt/Lip/C-R)的构建
取0.6mL上述所得Lip/C-R复合物，与25μL 10μM NCL aptamer，0.1ml 10×HEPESbuffer(pH 7.4)混合在1mL水溶液中，四维混匀仪上室温条件下反应过夜，过100k超滤膜(8000rpm/10min)除去未结合核酸适配体，4℃条件下保存，即得Apt/Lip/C-R复合物。
实施例4、体外模拟碳量子点抗酶解试验
将密度为1×105个/mL的HEp-2cells接种到96孔细胞培养板中(1×104个/孔)，在37℃和5％CO2的条件下培养24h，吸出培养基，用PBS缓冲液清洗3遍，再按10μL样品，90μL2％培养基向各孔加入待测样品，于培养箱再次孵育24h后，用PBS缓冲液清洗3遍，再用CCK-8试剂显色并测定其吸光度，并进一步计算其细胞毒性，结果如图3所示。结果显示，单独的蛋白酶基本无毒性，10nM RTA可以产生很大的毒性，而当RTA与蛋白酶进行孵育后，细胞毒性急剧降低，说明RTA已经被蛋白酶酶解。同样的，加入CQDs-RTA复合物的可以观察到较大的细胞毒性，而与蛋白酶进行预孵育后，其细胞毒性基本无变化，说明CQDs的存在对RTA具有很好的保护作用，可以有效的防止其被溶酶体酶解。
实施例5、CQDs，RTA和CQDs-RTA复合物进入细胞后的示踪及共定位表征
本发明利用CQDs本身的蓝色荧光(激发350nm，发射420nm)，抗体的免疫荧光以及细胞器染料分别对CQDs，RTA和各细胞器进行成像，具体方法是将CQDs，RTA和CQDs-RTA复合物与HEp-2cells孵育适当时间后，用PBS清洗3次，再加入各细胞器染料，按要求操作后，即用荧光共聚焦显微镜对CQDs和各细胞器进行成像，得到CQDs在胞内的分布照片及细胞器的照片。对于RTA的免疫荧光染色，则需要再对细胞进行固定、通透、2％BSA封闭非特异性吸附位点操作，PBS清洗后，加入一抗孵育1.5h，PBS清洗3遍后，再加入二抗孵育0.5h，PBS清洗后，即对RTA进行免疫荧光成像，获得RTA的免疫荧光照片，结果如图4和图5所示。
其中，图4为相同浓度的RTA和CQDs-RTA复合物与人喉癌上皮细胞(HEp-2cells)进行孵育后，对RTA的免疫荧光成像照片，标尺表示20μm。其中，细胞核用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行染色，如图中第二列；RTA先与一抗(兔抗蓖麻毒素A链的多克隆抗体)结合，再与绿色二抗(Alexa Fluor 488–标记的山羊抗兔IgG)进行孵育，如图中第三列。从图中可以看到，单独的RTA与HEp-2cells进行孵育后，基本观察不到胞内的RTA绿色免疫荧光信号，而与此对比的是，加入CQDs-RTA复合物的细胞却可以观察到明显的RTA免疫荧光信号，由此证明，复合物相比于相同浓度单独的RTA，更容易进入穿透细胞膜进入细胞。
图5为CQDs-RTA复合物与HEp-2cells孵育12h后与细胞器的荧光共定位照片。从图中可以看出，CQDs-RTA复合物与HEp-2cells孵育12h后，CQDs与高尔基体具有很好的共定位特性，同时RTA与内质网也有很好的共定位特性，而CQDs与RTA只在高尔基体附近存在一定的共定位，说明孵育12h后，CQDs主要聚集在高尔基体上，表现出其特有的高尔基体靶向性特点，而RTA则逐渐与CQDs分离，并进一步转运至内质网中，继续发挥其毒性作用。
实施例6、HUVEC对活细胞进行染色
本实验中，为直观地观察CQDs-RTA复合物对细胞的致死作用，我们利用CFSE对活细胞进行染色。即，将密度为1×105个/mL的HEp-2细胞接种在细胞培养皿中，在37℃和5％CO2的条件下孵育24h之后，分别加入0.5nM RTA、36μg/mL CDs和36μg/mL CDs-0.5nM RTA，在37℃和5％CO2的条件下培养48h后，用PBS溶液清洗3遍，再加入20mM CFSE溶液于37℃孵育25min，即用荧光共聚焦显微镜对活细胞进行成像，结果如图6所示。从上图结果可以看出，单独的CQDs和RTA与HEp-2cells进行孵育后，细胞基本不存在凋亡现象；而CQDs-RTA复合物与HEp-2cells孵育48h后只残存少量的活细胞，直观地反映出CQDs-RTA复合物相比于单独的RTA有很大的毒性提高。
实施例7、NCL/Lip/C-R复合物的靶向抗肿瘤实验
本实验中，为验证合成的NCL/Lip/C-R复合物的靶向抗肿瘤特性，分别利用其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC cells)和HEp-2cells的毒性实验加以证明。即，分别将密度为1×105个/mL的HUVEC cells和HEp-2cells接种到96孔细胞培养板中(1×104个/孔)，在37℃和5％CO2的条件下培养24h后，吸出培养基，用PBS缓冲液清洗3遍，再按10μL NCL/Lip/C-R复合物，90μL 2％培养基向各孔加入样品，于培养箱再次孵育24h后，用PBS缓冲液清洗3遍，再用CCK-8试剂显色并测定其吸光度，并进一步计算其细胞毒性。结果如图7所示，结果显示，该复合物可以特异性地对肿瘤细胞产生较大的毒性，而对正常细胞的影响较小。由此可以证明该复合物对靶向抗肿瘤具有很好的应用潜力。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物，其特征在于：所述复合物由碳量子点与蓖麻毒素A链复合形成碳量子点-蓖麻毒素A链复合物，然后经脂质体包封，再在脂质体上修饰核仁素核酸适配体制得。
2.权利要求1所述基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备碳量子点-蓖麻毒素A链复合物：将碳量子点和蓖麻毒素A链在PBS溶液中混合，充分反应，得碳量子点-蓖麻毒素A链复合物，保存备用；
2)将大豆卵磷脂，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇溶解在氯仿中，成膜，充分去除有机溶剂获得脂质层，然后用乙醇溶解脂质层，所得溶液注入由HEPES缓冲液配制的碳量子点-蓖麻毒素A链复合物，磁力搅拌，超声，透析，过滤制得脂质体包封的碳量子点-蓖麻毒素A链复合物；
3)将步骤2)所得脂质体包封的碳量子点-蓖麻毒素A链复合物与核仁素核酸适配体在HEPES缓冲液中混合，反应过夜，超滤，去除未结合的核仁素核酸适配体，得基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物。
3.根据权利要求2所述基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述反应的条件为25℃条件下反应至少3h。
4.根据权利要求2所述基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述大豆卵磷脂，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的摩尔比为70：28：2。
5.根据权利要求2所述基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物的制备方法，其特征在于：步骤2)中，充分去除有机溶剂的方法为N2吹拂3min，并在25℃真空干燥箱中干燥30min。
6.根据权利要求2所述基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述成膜的条件为37℃真空旋蒸30min；所述搅拌为25℃磁力搅拌3h；所述超声为150W探头超声6min；所述透析为4℃透析12h，所述过滤为过0.22μm滤膜。
7.根据权利要求2所述基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物的制备方法，其特征在于：步骤2)为：将大豆卵磷脂，胆固醇，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇按摩尔比为70：28：2溶解在氯仿中，氯仿按大豆卵磷脂浓度为10mg/ml加入，37℃真空旋蒸30min成膜，N2吹拂3min，并在25℃真空干燥箱中干燥30min，得脂质层；然后加入乙醇溶解脂质层，所得溶液注入含0.72mg/mL碳量子点-10nM蓖麻毒素A链复合物的HEPES缓冲液中，25℃磁力搅拌3h，150W探头超声6min，300kD透析袋4℃透析12h，过0.22μm滤膜，制得脂质体包封的碳量子点-蓖麻毒素A链复合物。
8.根据权利要求2所述的基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所述反应为在四维混匀仪上18～25℃反应过夜；所述超滤为过100K超滤膜。
9.权利要求1所述基于蓖麻毒素的靶向抗肿瘤复合物在制备靶向抗肿瘤的药物中的应用。
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