KR20150128103A - 엽산을 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체 및 그를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 엽산이 세포내 분해 가능한 연결을 통해 광증감제 또는 근적외선 형광염료와 결합된 광역학 진단 또는 치료용 결합체 및 이를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 엽산은 엽산 수용체를 과발현 하는 세포에 대한 표적 리간드로서의 기능뿐만 아니라, 형광염료 및 광증감제의 광학 특성을 소광시키는 작용을 하고 있다. 0.5nm ~ 10nm 길이의 분해 가능한 연결자를 통하여 엽산과 형광염료 또는 광증감제의 결합체를 형성하는 경우에는, 엽산의 소광작용에 의하여 형광염료 및 광증감제로부터 형광신호와 반응성 산소가 발생하지 않는다. 결합체가 엽산 수용체를 과발현 하는 세포내로 특이적으로 섭취되고 세포내 효소, 환원제, 또는 낮은 pH 환경에 의해서 결합체의 연결자가 분해되고 엽산과 형광염료 또는 광증감제의 거리가 멀어진 후에는, 엽산이 더 이상 소광제로서 작용하지 못하므로 이 때 부터는 강한 형광신호를 발생할 수 있고 광역학 치료 효과도 나타난다.
본 발명에 따른 엽산을 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 조직 투과성이 높고, 정상 세포에서는 안전한 반면 표적 세포 (예컨대 암세포)에서만 높은 치료 효과를 보이며, 엽산의 소광 기능을 통해 배경 대비 신호율이 높은 좋은 진단 영상을 얻을 수 있다.

Description

엽산을 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체 및 그를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 조성물{Photosensitizer containing folate, and a composition for photodynamic diagnosis and therapy comprising the same}
본 발명은 엽산이 세포내 분해 가능한 연결을 통하여 광증감제 또는 근적외선 형광염료와 결합된 광역학 진단 또는 치료용 결합체 및 그를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
광역학 치료법(photodynamic therapy: PDT)은 광민감성 물질(photosensitizer, 이하 광증감제라 칭함)을 이용하여 수술 없이 암 등의 난치병을 치료하거나 여드름 등의 병을 치료하는 기술이다. 이러한 PDT는 20세기 초부터 활발한 연구가 진행되어 현재에 이르러는 암의 진단과 치료, 자가 골수 이식, 항생제, AIDS 치료, 피부이식 수술이나 관절염 등의 치료에 면역성을 높이기 위해 사용되고 있어 그 응용 범위는 점차 확대되고 있다.
특히, 암의 치료에 사용되는 PDT는 빛에 예민한 반응을 보이는 물질인 광증감제를 체내에 투여하면 외부에서 빛을 조사하였을 경우, 체내의 풍부한 산소와 외부 빛에 의한 화학반응으로 일항 산소(singlet oxygen) 또는 자유 라디칼(free radical)이 생성되고, 이런 일항 산소 또는 자유 라디칼이 각종 병변 부위나 암세포의 세포사멸을 유도하여 파괴하는 원리를 이용한 치료법이다.
현재 PDT 요법에 사용되고 있는 광증감제로는 포르피린(porphyrin) 유도체, 클로린(chlorin), 박테리오클로린(bacteriochlorin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid) 유도체 등이 알려져 있으며, 광증감제로서 사이클릭 테트라피롤 유도체는 암세포에 선택적으로 축적될 뿐만 아니라 화합물의 특징상 형광이나 인광을 나타내므로 종양의 조기진단 시약으로도 활용될 수 있는 특징이 있다. 또한, 사이클릭 테트라피롤 내부에 금속이 결합되어 있는 메탈로포르피린(metalloporphyrin)의 경우에는 결합된 금속의 종류에 따라 여러 가지 특성을 나타내기 때문에 메탈로포르피린을 MRI(magnetic resonance imaging)시의 조영제(contrasting agent)로 이용하여 암세포와 같은 종양세포의 조기 진단에 응용되기도 하며, 가장 널리 알려진 광증감제인 5-아미노레불린산 유도체는 사용 방법이 단순하고 분자량이 작아 비교적 피부 침투가 용이하며, 부작용이 적어 안전하다는 장점이 있다.
그러나, 이러한 종래에 사용되던 광역학 진단 또는 치료용 광증감제의 경우, 암세포의 축적률과 표적률이 낮으며 형광간섭을 일으키지 못하기 때문에 빛을 조사하게 되면 체내에서 일반세포, 즉 정상세포에도 세포독성을 나타내므로 치료 효과가 낮고 여러 가지 부작용을 유발하는 문제점이 있었다. 즉, 종래에 광역학 치료에 사용되는 광증감제는 소수성(hydrophobic)을 띠고 있어서, 정맥주사된 후에 암조직 외에도 피부를 포함한 정상조직에도 비특이적 축적이 된다. 이것은 종양-대비-배경 잡신호 비율을 나쁘게 하여 종양부위의 영상 진단을 어렵게 할 뿐 아니라, 광역학 치료시 주변의 중요한 정상조직에도 손상을 줄 수 있는 위험성이 있다. 뿐만아니라, 광역학 치료를 받은 환자가 햇빛 등의 밝은 빛에 노출이 되면 피부에 축적이 되어있던 광증감제로부터 다시 반응성 산소가 생성이 되면서 피부 광민감성 (skin photosensitivity) 부작용을 일으키게 된다. 이러한 이유로 광역학 치료 후에 환자는 피부등의 정상조직에 축적된 광증감제가 없어질 때까지 어두운 실내에 최소 6주 동안 머무르도록 권고받고 있고, 이것은 환자에게 불편을 야기시킨다. 광증감제의 친수성을 증가시킴으로써 피부 광민감성 문제를 해결하고자 하는 시도가 있으나, 이 경우에는 정맥투여된 광증감제의 많은 양이 소변을 통하여 배출되기 때문에, 치료에 충분한 양의 광증감제가 종양조직에 축적되기 위해서는 훨씬 높은 용량의 광증감제를 투여해 주여야 된다.
이러한 문제점을 해결하고 종양선택성을 높이기 위한 수단으로서, 엽산수용체를 과발현하는 세포를 표적 할 수 있는 엽산-광증감제 결합체가 개발되었으나, 이러한 결합체들은 빛을 쪼여 주는 동안은 항상 형광 신호를 발생하는 항시 활성형 타입이기 때문에, 결합체가 혈류를 순환하는 동안에도 형광신호를 발생함으로써 종양-대비-배경 신호 비율이 낮고 좋은 대조도의 영상을 얻기가 힘들다. 기존의 엽산-광증감제 및 엽산-형광염료 결합체를 이용하여 높은 대조도의 영상을 얻기 위해서는 종양내 염료의 축적양은 최대가 되면서도 혈액 및 정상조직에 존재하는 형광염료의 농도는 최소가 되는 시간에 영상을 얻어야 한다. 그러나, 환자에 따라서 약동학적 특성이 다르므로, 최적 영상을 위한 시간을 알기가 힘들다는 문제가 있고, 특히, 항체-광증감제 또는 항체-형광염료 결합체의 경우에는 혈액내 체류시간이 길어서 장시간 동안 배경 잡신호(background noise signal)의 높게 나오므로, 좋은 대조도의 영상을 얻기 위하여서는 항체가 혈류에서 제거되기 까지 몇일 동안을 기다린 후에 영상을 얻어야 되는 제한점을 가지고 있다. 또한, 엽산-광증감제 결합체 경우, 항시 정상조직과 암조직 모두에서 형광신호를 발생하여 영상 진단에 제한이 있을 뿐 아니라, 정상조직과 암조직 모두에서 반응성 산소를 발생하기 때문에, 종양 선택적 광역학 치료 효과를 얻는데 한계가 있다.
결국 이러한 정상조직에 대한 비특이적 축적은 최소화하면서 종양내 분자 신호의 농도는 최대가 되게 하기 위해서는 활성 가능한 저분자 또는 나노 프루브 형태가 유리하다. 고분자 또는 나노입자 형태의 프루브의 경우에는 저분자 프루브에 비하여 낮은 용량에서도 높은 종양 축적율을 얻을 수 있다는 장점이 있으나, 항시 활성화 결합체의 경우에는 배경 잡신호 비율이 오랜 시간동안 유지된다는 문제가 있다.
1. 한국공개특허 1,116,570 2. 한국공개특허 1,141,410 3. 한국공개특허 1,344,303 4. 미국공개특허 2011-0075899 5. 미국공개특허 2005-0261170
본 발명은 종래 형광염료 및 광증감제가 일반적인 세포 투과성에 의존하여 암세포의 축적률과 표적률이 낮고, 자가 형광에 의한 종양-대-배경 신호비가 저하되고, 개체간 서로 다른 약동학적 특성에 영향을 받아 체류 시간이 현저하게 달라지고, 형광활성 영상에 잡음이 생기는 점 등을 해결하고자 한다. 이를 위하여 평상시에는 신호를 내지 못하다가 표적 세포(예컨대 암세포)에 반응할 때만 선택적으로 강한 형광 신호를 생성해 내는 엽산-형광염료 및 엽산-광증감 결합체를 개발하여, 시간의 제한 없이 높은 종양-대-배경 신호비로 병소의 영상 검출이 가능하고, 조직 투과성을 높이고 자가 형광의 문제점을 해결하고자 한다.
또한, 본 발명의 분해 가능한 엽산-광증감제 결합체의 경우는, 표적으로 하는 세포외에 존재할 때에는 반응성 산소를 생성해내지 못하다가, 표적으로 하는 세포내로 섭취되어 들어간 경우에만 반응성 산소 생성이 활성화되고 표적세포 특이적 광역학 치료 효과를 얻을 수 있게 함으로써, 정상조직에 대한 비특이적인 손상을 억제하고자 한다.
상기 상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 엽산이 세포내 분해 가능한 연결을 통하여 광증감제 또는 근적외선 형광염료와 결합되고, 상기 엽산과 광증감제간 결합 또는 상기 엽산과 형광염료간의 결합의 길이가 10nm 이내인 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제공한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 세포내 분해 가능한 연결은 세포내 효소에 의해 분해되는 연결, 세포내 환원제에 의하여 분해되는 연결, 및 세포내 pH 4 내지 5.5 환경에서 분해되는 연결 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 세포내 효소는 카텝신(cathepsin) 및 에스터라아제(esterases) 중에서 선택된 어느 하나 또는 복합인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 카텝신(cathepsin)은 카텝신(cathepsin) B, 카텝신(cathepsin) L 및 카텝신(cathepsin) S 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 세포내 효소에 의해 분해되는 연결은 카텝신 B(cathepsin B)에 의해 분해되는 다이-아르기닌(di-arginine) 결합인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 세포내 효소에 의해 분해되는 연결은 에스터라아제에 의해서 분해되는 에스터(ester, -COO-) 결합 또는 씨오에스터(thioester, -COS-) 결합인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 세포내 환원제는 글루타티온, 설프히드릴 및 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADPH) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 세포내 환원제에 의하여 분해되는 연결은 이황화(di-sulfide) 결합인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 세포내 pH 4 내지 5.5 환경에서 분해되는 연결은 히드라존(hydrazone) 결합인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 광증감제는 유리염기 또는 금속 착물 형태의 헤마토포피린(hematoporphyrins), 포피센(porphycenes), 페오포바이드(pheophorbides), 퍼퓨린(purpurins), 클로린(chlorins), 프로토포피린(protoporphyrins), 프탈로시아닌(phthalocyanines)으로 이루어진 군에서 선택된 포피린계 화합물; 또는 하이페리신(hypericin), 로다민(rhodamine), 로즈벵갈(rose Bengal), 프소랄렌(psoralen), 페노씨아지늄(phenothiazinium) 계열 염료 및 메로시아닌(merocyanine)으로 이루어진 군에서 선택된 비포르피린계 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 단독 또는 복합적으로 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 근적외선 형광염료는 시아닌(Cyanine) 계열 염료 (Cy5, Cy5.5, Cy7, indocyanine green, IR820), 아토(Atto) 계열 염료(ATTO633, ATTO647, ATTO647N, ATTO655, ATTO665, ATTO680, ATTO700, ATTO725, ATTO740, ATTO MB2, ATTO Oxa12), 알렉사(Alexa) 계열 염료 (Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750), HiLyte 계열 염료 (HiLyte FluorTM 647, HiLyte FluorTM 680, HiLyte FluorTM 750) 플라마(Flama) 염료, F648, NIR730, F749, NIR797 및 BODIPY로 이루어진 군에서 선택되는 것을 단독 또는 복합적으로 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 화학식 1로 표시되는 것(엽산-다이 아르기닌 결합-ATTO 염료)을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 화학식 2로 표시되는 것(엽산-다이 아르기닌 결합-Ce4)을 특징으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 화학식 3으로 표시되는 것(엽산-이황화 결합-ATTO 염료)을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 상술한 광역학 진단 또는 치료용 결합체 중 어느 하나를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 엽산-광증감제 결합체 또는 엽산-형광염료 결합체가 분해가능한 연결을 통하여 10nm 이내의 거리를 유지하고 있는 경우에는, 형광염료 및 광증감제의 형광신호와 반응성 산소 생성능력이 소광(quenching)됨으로써, 정상조직에서 또는 혈액을 순환하는 동안에는 형광 신호를 발생하지 않을 뿐 아니라, 반응성 산소를 생성하지도 않는다. 본 발명의 결합체가 엽산수용체를 과발현 하는 세포에 선택적으로 섭취된 후에 세포내에서 연결자가 분해되는 경우에는 엽산의 소광작용이 사라지면서 강한 형광신호 발생과 반응성 산소 생성이 활발히 일어난다. 따라서, 본 발명에 따른 엽산을 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 조직 투과성이 높고, 정상 세포에서는 안전한 반면 표적 세포 (예컨대 암세포)에서만 높은 치료 효과를 보이며, 배경 대비 표적 신호율이 높은 좋은 진단 영상을 얻을 수 있다.
나아가 결합체에 사용되는 결합의 유형에 따라 엽산 수용체를 과발현 하는 세포는 물론, 효소 과발현 질병을 동시에 진단할 수 있으며, 대량 생산이 용이하다는 장점을 갖는다.
도 1a는 분해 가능한 연결자를 포함한 엽산-형광염료 및 엽산-광증감제 결합체의 구조 및 특성을 개략적으로 보여주는 모식도이다.
도 1b는 분해 가능한 연결자를 포함한 엽산-형광염료 결합체가 표적 세포에서만 강한 형광신호를 발생함으로써 높은 종양세포 진단 효능을 나타내는 모식도이다.
도 1c는 분해 가능한 연결자를 포함한 엽산-광증감제 결합체가 표적세포에서만 강한 형광신호 및 광역학 치료 효능을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 대한 UV/Vis 스펙트럼에 대한 실험 결과이다. A) ATTO655 염료 (농도 2.89 μM, 최대 흡광도 662nm), B) 실시예 1 결합체 (농도 1.92 μM, 최대 흡광도 665nm).
도 3은 본 발명의 실시예 1에 각기 다른 종류의 카텝신 효소 또는 카텝신 B 효소 억제제 (E64)를 같이 처리한 경우의 형광 증가 경향을 보여주는 결과이다. A) Ex. 610nm에서 얻은 형광스펙트럼 결과, B) 680nm에서의 형광 세기를 나타낸 그래프(Ex . 610nm)
도 4는 본 발명의 실시예 1을 인산완충식염수(PBS), 20% 인간혈청알부민 함유 PBS, 100% 우태아혈청(Fetal bovine serum, FBS)에 녹였을 때의 형광 스펙트럼 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1과 자유염료 (ATTO655)를 SKOV3 세포주에 각각 처리하고, 염료의 세척(washing)과정 없이 시간대별로 공초점 레이저 현미경(CLSM)으로 찍은 사진이다(Ex. 633nm, Em. 646~753nm). 한편 2시간 후, 세포를 세척(washing)한 후 다시 촬영함(오른쪽 사진).
도 6은 본 발명의 실시예 1을 엽산 수용체를 발현하지 않는 인간 폐암 세포주 A549 및 엽산 수용체를 과발현하는 인간 난소암 세포주 SKOV3에 각각 2시간 동안 처리한 후, 공초점 레이저 현미경(CLSM)을 찍은 사진이다(Ex. 633nm, Em. 646~753nm). 대조를 위하여 자유 엽산(Free FA, 1mM)을 혼합 배양한 결과를 3번째 칼럼에, 세포투과성 카텝신 B 억제제(E64d, 20μM)를 혼합 배양한 결과를 4번째 칼럼에 도시함.
도 7a는 본 발명의 실시예 1을 종양 쥐에게 정맥 투여하고, 3시간 후에 근적외선 형광영상을 촬영한 사진이다(Ex . 660nm, Em . 690~730nm). 대조를 위하여 인산완충식염수(PBS) 투여군, 자유염료 투여군의 사진을 도시함. 화살표는 종양 부위를 나타냄. 도 7b는 촬영된 형광영상으로부터 종양-대-배경 잡신호 비율을 구한 그래프이다.
도 8은, A) 본 발명의 실시예 2의 UV/vis 흡수스펙트럼. B) 실시예 2에 카텝신 B 효소를 처리하기 전후와 억제제인 E64를 처리했을 때의 형광 스펙트럼(Ex . 400nm). C) 665nm에서의 형광 세기(Ex . 400nm). D) 실시예 2에 카텝신 B 효소를 처리하기 전후와 억제제(E64)를 처리했을 때의 일항 산소 생성 거동을 나타낸 그래프이다.
도 9는, A) 실시예 2에 카텝신 B,S,L 효소를 처리하기 전후의 형광 스펙트럼(Ex . 400nm). B) 665nm에서의 형광 세기 비교(Ex . 400nm). C) 실시예 2에 카텝신 B,S,L 효소를 처리하기 전후의 일항 산소 생성 여부. D) 상대적인 일항 산소의 생성능력 비교를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예 2를 혈청이 존재하는 배지에 녹인 후에 시간대별로 형광변화를 측정한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실시예 2와 자유염료 Ce4를 KB 세포에 처리한 후, 세척(washing)과정 없이 시간대별로 근적외선 형광영상을 찍은 사진이다(Ex . 640±5nm, Em. 690±5nm).
도 12는 본 발명의 실시예 2와 자유염료 Ce4를 자유 엽산(1mM) 또는 카텝신 억제제(E64d, 100μM)와 함께 KB 세포에 처리한 공초점 레이저 현미경 사진이다.
도 13은 본 발명의 실시예 2를 LysoTracker와 함께 KB 세포에 처리한 공초점 레이저 현미경 사진이다.
도 14는 A) 실시예 2를 어둠 속에서 배양했을 때의 KB 세포에 대한 독성. B) KB 세포에 실시예 2를 2μM, 5μM의 농도로 4시간동안 처리하고, 670nm 레이저를 조사한 후의 세포 독성을 나타낸 그래프이다. 비교를 위하여 실시예 2를 자유엽산 (1 mM) 또는 카텝신 억제제 (E64d, 100μM)를 함께 처리하고 레이저를 조사했을 때의 세포 독성을 검사하였다.
도 15는, 본 발명의 실시예 2를 KB종양을 이식시킨 쥐에게 정맥 투여하고, 각 시간대별로 근적외선 형광영상(Ex . 660±0nm, Em . 710±0nm)을 촬영한 사진이다. 대조를 위하여 인산완충식염수(PBS) 투여군, 자유염료 투여군의 사진을 도시함. 화살표는 종양 부위를 나타냄.
도 16은 본 발명의 인산완충식염수, 자유염료, 및 실시예 2를 KB종양을 이식시킨 쥐에게 정맥 투여하고, 24 시간 후에 종양부위에 670nm 레이저를 조사하여 얻은 광역학 치료 결과 그래프이다.
도 17은 A) 본 발명에 따른 실시예 3의 UV/Vis spectrum. B) 본 발명에 따른 실시예 3을 PBS 수용액, 환원제인 dithiothreitol (DTT)이 PBS에 2μM 농도로 있는 경우, 환원제인 DTT가 PBS에 5mM 농도로 있는 경우의 각각의 시간에 따른 형광 변화를 680nm에서 관찰한 그래프 (Ex . 610nm). C) 본 발명에 따른 실시예 3을 PBS 수용액, 환원제인 DTT가 PBS에 2μM 농도로 있는 경우, 환원제인 DTT가 PBS에 5mM 농도로 있는 경우의 파장에 따른 형광 변화관찰 그래프(Ex . 610nm).
도 18은 본 발명의 실시예 3을, 엽산 수용체를 발현하지 않는 유방암 세포(MDA-MB-231) 및 엽산 수용체가 과발현된 세포 (SKOV3)에 각각 2시간 동안 처리한 후, 공초점 레이저 현미경(CLSM)을 찍은 사진이다(Ex . 633nm, Em . 646~753nm). 대조를 위하여 자유 엽산(Free FA, 1mM)을 혼합 배양한 결과를 3번째 칼럼에 나타내었다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 엽산이 세포내 분해 가능한 연결을 통하여 광증감제 또는 근적외선 형광염료와 결합된 광역학 진단 또는 치료용 결합체 및 이를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 조성물을 제공한다. 이하 첨부된 도면을 이용하여 본 발명의 구성을 더욱 상세하게 살펴보도록 한다.
본 발명은 엽산이 세포내 분해 가능한 연결을 통하여 광증감제 또는 근적외선 형광염료와 결합된 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 특징으로 한다.
상기 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
본 발명에서 엽산의 첫 번째 기능은, 표적으로 하는 암세포 및 염증세포의 표면에 과발현된 엽산 수용체와 특이적으로 결합함으로써, 엽산 결합체가 표적으로 하는 세포내로만 섭취될 수 있도록 하는 표적 리간드로 작용한다.
이와 더불어 상기 엽산의 두 번째 기능은 결합된 근적외선 형광염료 또는 광증감제에 대한 소광(quenching)제로 작용함으로써 결합체로부터 형광신호를 발생시키지 못하게 할뿐 아니라 치료용 반응성 산소도 발생시키지 못하도록 억제시킨다. 엽산 결합체의 연결자가 표적으로 하는 세포내에서 분해된 후에, 엽산과 형광염료 또는 광증감제가 멀어질 경우에는, 엽산의 소광작용이 없어지게 되므로 이때부터는 강한 형광신호를 발생하여 진단을 가능하게 하고, 반응성 산소의 생성도 활발하게 일어남으로써 광역학 치료를 가능하게 한다.
본 발명의 작용에 대한 모식도는 도 1에 도시하였다. 도 1a는 분해 가능한 연결자를 포함한 엽산-형광염료 및 엽산-광증감제 결합체의 구조 및 특성을 개략적으로 보여주는 모식도이다. 엽산과 형광염료 또는 광증감제를 연결하는 연결자의 길이는 10nm 이내이며, 엽산은 형광염료 및 광증감제에 대한 소광자(quencher)로서 작용한다. 연결자가 분해되어 엽산과 형광염료 또는 광증감제와의 거리가 10nm 이상으로 멀어지게 되는 경우에는, 강한 형광신호를 발생하고 반응성 산소생성도 활성화 된다. 세포내 효소, 환원제, 및 리소좀에서의 낮은 pH에 의해서 연결자가 분해된다.
도 1b 및 도 1c는 본 발명의 효능을 나타내고 있다. 도 1b에 따르면 엽산의 소광(quenching)작용에 의해서 형광신호를 발생하지 않던 형광염료는, 엽산 수용체 과발현 세포내로 섭취되고 연결자가 분해된 후부터 강한 형광신호를 발생한다. 도 1c에 따르면, 엽산의 소광(quenching)작용에 의해서 형광신호와 반응성 산소를 모두 발생하지 않던 광증감제는, 엽산 수용체 과발현 세포내로 섭취되고 연결자가 분해된 후부터 강한 형광신호와 반응성 산소를 생성해 내기 시작한다.
상기 세포내 분해 가능한 연결이란 세포내 환경, 예컨대 효소, 신호인자, 환원제, pH 등에 의하여 분해될 수 있는 것을 의미하며, 보다 구체적으로는 리소좀 내에서 분해되는 것일 수 있다. 따라서, 상기 세포내 분해 가능한 연결은 세포내 효소에 의해 분해되는 연결, 세포내 환원제에 의하여 분해되는 연결 및 세포내 pH 4 내지 5.5 환경에서 분해되는 연결 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체에 포함된 세포내 분해 가능한 연결을 분해 가능한 효소는 카텝신(cathepsin) 및 에스터라아제(esterases) 중에서 선택된 어느 하나 또는 복합일 수 있으며, 상기 카텝신은 카텝신 B, 카텝신 L 및 카텝신 S 중에서 선택된 어느 하나 이상의 효소일 수 있다. 예를 들어, 리소좀 내에 존재하는 카텝신 B(cathepsin B)에 의해 분해되는 다이-아르기닌(di-arginine) 결합이거나, 에스터라아제에 의해서 분해되는 에스터(ester, -COO-) 결합 또는 씨오에스터(thioester, -COS-) 결합일 수 있다.
본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체에 포함된 세포내 분해 가능한 연결을 분해 가능한 세포내 환원제는 글루타티온, 설프히드릴 및 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADPH) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 예를 들어, 리소좀 내 글루타티온에 의하여 분해될 수 있는 이황화(di-sulfide) 결합일 수 있다. 글루타티온의 경우, 혈액을 포함한 세포외의 영역에서는 약 2μM 농도로 있으며, 세포내에서는 10mM의 높은 농도로 존재하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체에 포함된 세포내 분해 가능한 연결은 pH 4 ~ 5.5 환경에서 분해되는 히드라존(hydrazone) 결합일 수 있다. 혈액과 세포외 영역에서의 산성도는 pH 7.4 이며, 암세포 내 리소좀(lysosome)에서는 pH 4 ~ 5.5 인 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체에서, 엽산에 의한 형광염료 및 광증감제의 소광(quenching) 효과를 극대화하기 위하여 엽산과 광증감제간 결합 또는 엽산과 형광염료간의 결합의 길이는 10nm 이내인 것을 특징으로 한다. 보다 바람직하게는 3차원 입체상에서의 거리는 3nm 이내일 수 있다. 상기 세포내 분해 가능한 연결자가 표적으로 하는 세포내에서 절단되어 엽산과 형광염료 또는 엽산과 광증감제의 거리가 10nm보다 더 멀어진 경우에는, 엽산에 의한 소광효과가 사라지면서 형광염료 및 광증감제로부터 강한 형광신호가 발생되고 광역학 치료 효과를 나타낼 수 있게 된다.
본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합에 사용되는 광증감제는 당해 분야에서 통상의 기술자가 적용할 수 있는 광증감제가 적용될 수 있다. 예를 들어, 포르피린류(porphyrins), 클로린류(chlorins), 페오포바이드류(pheophorbides), 박테리오클로린류(bacteriochlorins), 포피센류(porphycenes), 프탈로시아닌(phthalocyanines)으로 이루어진 군에서 선택된 포피린계 화합물; 또는 하이페리신(hypericin), 로다민(rhodamine), 로즈벵갈(rose bengal), 프소랄렌(psoralen), 페노씨아지늄(phenothiazinum) 계열 염료 및 메로시아닌(merocyanine)으로 이루어진 군에서 선택된 비포피린계 화합물로 이루어진 군 중에서 사용될 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 보다 구체적으로는 유리염기 또는 금속 착물 형태의 헤마토포피린(hematoporphyrins), 포피센(porphycenes), 페오포바이드(pheophorbides), 퍼퓨린(purpurins), 클로린(chlorins), 프로토포피린(protoporphyrins), 프탈로시아닌(phthalocyanines)으로 이루어진 군에서 선택된 포피린계 화합물; 또는 하이페리신(hypericin), 로다민(rhodamine), 로즈벵갈(rose Bengal), 프소랄렌(psoralen), 페노씨아지늄(phenothiazinium) 계열 염료 및 메로시아닌(merocyanine)으로 이루어진 군에서 선택된 비포르피린계 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 단독 또는 복합적으로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체에 사용되는 근적외선 형광염료는 당해 분야에서 통상의 기술자가 적용할 수 있는 근적외선 형광염료가 적용될 수 있다. 예를 들어, 시아닌(Cyanine) 계열 염료, 아토(Atto) 계열 염료, 알렉사(Alexa) 계열 염료, HiLyte 계열 염료, 플라마(Flama) 계열 염료, NIR 계열 염료, F648, NIR730, F749, NIR797 및 BODIPY 등이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 보다 구체적으로는 시아닌(Cyanine) 계열 염료 (Cy5, Cy5.5, Cy7, indocyanine green, IR820), 아토(Atto) 계열 염료(ATTO633, ATTO647, ATTO647N, ATTO655, ATTO665, ATTO680, ATTO700, ATTO725, ATTO740, ATTO MB2, ATTO Oxa12), 알렉사(Alexa) 계열 염료 (Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750), HiLyte 계열 염료 (HiLyte FluorTM 647, HiLyte FluorTM 680, HiLyte FluorTM 750) 플라마(Flama) 염료, F648, NIR730, F749, NIR797 및 BODIPY로 이루어진 군에서 선택되는 것을 단독 또는 복합적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 일례에 따르면, 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 [엽산-다이 아르기닌 결합-ATTO 염료] 구조를 가질 수 있다.
Figure pat00001
본 발명의 일례에 따르면, 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 화학식 2로 표시되는 [엽산-다이 아르기닌 결합-Ce4]의 구조를 가질 수 있다.
Figure pat00002
본 발명의 일 태양에 따르면, 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 하기 화학식 3으로 표시되는 [엽산-이황화 결합-ATTO 염료]의 구조를 가질 수 있다.
Figure pat00003
따라서 본 발명의 결합체는 암세포에 선택적으로 표적 및 침투되면 암세포내의 효소작용, 환원제 작용, 및 낮은 pH에서 연결자 결합이 절단(분해)되어 형광간섭이 풀림으로써 형광을 띄는 특징이 있다.
본 발명은 본 발명의 결합체가 암 조직에 선택적으로 축적될 경우, 암세포의 효소작용 등에 의해 형광간섭이 풀리고, 레이저 조사에 의해 암세포에서만 광증감제가 형광발색을 나타낼 수 있기 때문에 이러한 형광 유무를 통해 암을 진단할 수 있다. 또한, 억제되어 있던 반응성 산소 생성이 다시 활성화되면서 표적세포 특이적 광역학 치료 효과를 얻을 수 있게 된다.
본 발명은 상기 상술한 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 광역학 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 병의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
상기에서 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 광역학 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 결합체 또는 상기 결합체를 포함하는 조성물을 이용하여 질병을 치료 또는 진단할 경우, 사용할 수 있는 광원으로는 이에 제한되지는 않으나, 초음파 조사 방출기, 광 방출 다이오드, 레이저 다이오드, 염료 레이저, 할로겐화 금속 램프, 플래쉬 램프, 기계적으로 필터링된 형광 광원, 기계적으로 필터링된 백열, 및 필라멘트 광원으로 이루어진 군 중에서 선택된 생체 외 광조사를 위한 광원; 및 광역학 치료용 레이저 파이버 등의 생체 내 광조사를 위한 광원으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 상기 광증감제는 600nm 내지 700nm 범위의 근적외선 광선에서 활성을 나타낼 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
( 실시예 1)
1.1. 엽산- 다이아르기닌 -형광염료 ATTO655 결합체 제작
ASP48S(Peptron Inc, 미국)를 이용한 Fmoc 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통하여 펩타이드를 제조하였으며, 제조 과정은 다음과 같다.
NH2-Lys(Dde)-2-chloro-Trityl 레진(Anaspec, 미국)에 보호기가 결합된 아미노산[Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OH)-OtBu] 8당량 및 2-(1H-벤조트리아졸(Benzotriazol)-1-yl)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플로로포스페이트[2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, HBTU] 8당량/ N-하이드록시벤조트리아졸(Hydroxybenzotriazole, HOBt) 8당량/ 4-메틸모르폴린(Methylmorpholine, NMM) 16당량을 디메틸포름아마이드(Dimethylformaminde, DMF)에 녹인 용액을 결합제로 하여 혼합한 후 2시간 동안 실온에서 반응한 후, DMF, 메탄올 및 DMF로 세척하였다.
아미노산에 붙은 보호기 Fmoc을 분리해내기 위하여, 상기 반응액에 20% 피페리딘(piperidine)을 함유하는 DMF를 가하여 5분 동안 2회 반응시킨 후, DMF, 메탄올 및 DMF로 세척하였다. 상술한 과정을 반복하여 펩타이드 기본골격에 레진이 결합된 [NH2-감마-E(OtBu)-R(Pbf)-R(Pbf)-K(Dde)-2-클로로-트리틸 레진] 구조체를 합성하였다.
상기 레진-펩타이드 기본골격 결합체에 프테로산(pteroic acid) 4당량 및 HBTU 4당량 / HOBt 4당량 / NMM 8당량을 다이메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹인 용액을 첨가하였다. 상기 혼합액을 12시간 동안 반응시키고 석션한 후, DMF, 메탄올 및 DMF로 세척하였다.
이후 하이드라진(hydrazine)을 2%로 희석한 DMF 용액을 처리하여 라이신(Lys)의 C-말단에 존재하는 보호기 Dde를 제거하였다. 이후 ATTO655(ATTO-TEC 게엠베하, 독일) 및 HBTU/HOBt/NMM를 녹인 DMF 용액을 첨가하여 12시간 동안 반응시키고 석션한 후, DMF, 메탄올 및 DMF로 세척하였다.
이후 트리플로로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)/1,2-에탄싸이올(1,2-ethanedithiol, EDT)/싸이오아니졸(Thioanisole)/트리이소프로필실란(triisopropylsilane, TIS)/물을 90/2.5/2.5/2.5/2.5로 희석한 액을 처리하여 상기에서 생성된 펩타이드(엽산-다이아르기닌-ATTO655 결합체)를 레진으로부터 분리하였다.
그 후 반응액에 10배의 차가운 디에틸 에테르(diethyl ether)를 가하여 펩타이드를 침전시키고, 10분간 3000rpm으로 원심 분리한다. 여액을 버리고 2회 반복한다. 상기에서 수득한 결합체는 Vydac Everest C18 컬럼(250mm×22mm, 10㎛)을 사용한 역상 HPLC를 수행하여 정제한다. TFA 0.1%를 함유하는 10 내지 75%(v/v) 아세토나이트릴 용액을 이용하는 물-아세토나이트릴 선형 그래디언트를 사용해 용출하였다.
상기에 따라 제조된 결합체(실시예 1)의 화학구조는 하기 화학식 1과 같다. 즉, 엽산과 ATTO655 염료가 다이-아르기닌 구조를 통해 결합되어 있다.
(화학식 1)
Figure pat00004

1.2. 엽산- 다이아르기닌 -형광염료 ATTO655 결합체의 특성
1) 분자량 및 형광방출
분자량은 LC/MSD(Agilent Hewlett Packard 1100 시리즈, 미국)를 사용하여 측정하였으며, 흡광도는 UV/Vis 스펙트로미터(DU370, 미국)를 사용하여 측정하였다. 최고 흡광 피크는 662 및 665nm 에서 측정되었다.
상기 UV/Vis 스펙트럼에 대한 실험 결과는 도 2에 도시하였다. 상기 도 2에 따르면 상기 수득한 정제된 본 발명의 결합체, 즉 실시예 1의 분자량은 1,391 g/mol 이었고, 각각 665nm, 680nm에서 최대 흡수와 최대 발광을 나타냈다(도 2 참조).
2) 효소 활성에 의한 형광 신호의 증가
상기에서 수득한 결합체(실시예 1) 4nmol을 소디움 아세테이트 완충액(20 mM sodium acetate buffer, 1mM EDTA, pH 5.0) 194㎕에 희석한 후, 효소 처리 시료에는 카텝신 B(cathepsin B, Calbiochem, 미국) 97pmol를 소디움 아세테이트 완충액 6㎕에 희석하여 혼합하고, 완충액 처리군에는 동량의 소디움 아세테이트 완충액을 혼합하였다. 상기 혼합액(200㎕)을 4시간 동안 37℃에서 배양하였다.
한편 다른 카텝신 효소에 의한 활성도 비교 평가하기 위하여 카텝신 L, 카텝신 S도 동일한 조건과 방법으로 실험을 수행하였다.
카텝신 B 억제제 처리군을 위해서, 카텝신 B 97pmol(소디움 아세테이트 완충액 6㎕에 희석)를 억제제 E64(Sigma Aldrich, 미국) 0.1mM(20㎕)를 포함하는 20mM 소디움 아세테이트 완충액(pH 5.0)에 혼합하여 실온에서 30분간 배양하였다. 이후 본 발명의 결합체(실시예 1) 4nmol을 소디움 아세테이트 완충액 174㎕에 희석한 후, 이에 상기에서 E64를 전처리 배양한 카텝신 B를 혼합한 후 4시간 동안 37℃에서 배양하였다.
모든 시료의 형광 스펙트럼을 측정하기에 앞서, 상기 시료 50㎕를 인산완충식염수(Phosphate buffered saline, PBS, 6.7mM, pH 7.4, 154 mM NaCl) 950㎕에 희석하였다. 상기 희석된 시료들을 다기능 마이크로플레이트 판독기(Safire 2, Tecan사, 스위스)에 넣어 형광 스펙트럼(λEx. 610nm, λEm. 620～850nm) 결과를 얻었다(도 3 참조).
도 3에 따르면, 실시예 1와 카텝신 B를 같이 처리한 군(처리2)이 결합체만을 처리한 군(처리1)보다 형광세기가 3배 높게 나타났다. 카텝신 억제제 E64를 전처리한 군(처리3)의 경우, 본 발명에 따른 결합체(실시예 1)의 카텝신 B 처리에 따른 흡광도 회복을 완벽하게 저해하였다. 또한 다른 카텝신 효소를 처리한 경우(처리 4 및 5)에는 형광 세기가 전혀 증가하지 않아, 본 발명에 따른 실시예 1이 카텝신 B 특이적이라는 것을 확인하였다.
3) 혈청내 안정성
본 발명의 결합체(실시예 1)을 PBS, 인간 혈청 알부민(GenDEPOT, 미국) 20%(v/v)을 함유하는 PBS, 우태아 혈청(Fetal bovein serum, FBS, Life Technologire, 미국) 100%에 각각 혼합하여 배양하여 혈청내 안정성을 평가하였다. 용액내 상기 결합체의 최종 농도는 1μM로 조정하였다. 상기 용액을 실온에서 4시간 동안 반응시킨 후, 다기능 마이크로플레이트 판독기(Safire 2, Tecan사, 스위스)에 넣어 형광 스펙트럼(λEx. 610nm, λEm. 620～850nm) 결과를 얻었다(도 4 참조).
도 4에 따르면, 혈청 단백질들은 실시예 1의 형광에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
4) 세포 배양
엽산 수용체를 과발현하는 인간 난소암 세포주 SKOV3과 엽산 수용체를 발현하지 않는 인간 폐암 세포주 A549, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231은 모두 American Type Culture Collection(ATCC, 미국)으로부터 수득하였다.
상기 SKOV3 세포, A549 세포 및 MDA-MB-231 세포를 우태아혈청 10% 및 페니실린/스트렙토마이신(Life Technologies) 1%를 포함하는 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지에서 37℃, 5% 이산화탄소 및 표준 습도 조건하에서 배양하였다.
5) 형광소광 및 형광회복
표적 세포 밖에서는 형광신호가 약한 본 발명의 결합체(실시예 1)가 표적세포 안에 섭취된 후에는 강한 형광을 발생하는 것을 측정하기 위하여, 엽산 발현 SKOV3 세포에 상기 실시예 1 및 자유 염료(ATTO655)를 가한 후 세척하지 않고 형광 사진을 찍었다. 구체적인 방법은 다음과 같다.
4-well Lab-Tek 챔버(Nalge Nunc International, 미국)에 각 well 마다 SKOV3 세포 1×105개씩 넣어 세포가 잘 흡착하도록 24시간 동안 배양한 후, 실시예 1 및 자유 염료(ATTO655)를 혼합하여 희석하였다. 이후 기존 배지를 실시예 1 및 자유 염료(ATTO655)를 포함하는 신선한 배지 300㎕로 교체하였다.
이후 세포를 세척하지 않고, 공초점 레이저 현미경(confocal laser scanning microscope, CLSM, ZEISS LSM 510 META, 독일)을 사용하여 15분, 1시간, 2시간 각각의 근적외광 형광 이미지(λEx. 633nm, λEm. 646～753nm)를 얻었다.
이후 세포를 3회 세척하여 세포외 염료를 제거한 후 근적외광 형광 이미지를 다시 찍어서, 혹시 실험하는 동안 자유 염료가 세포 안으로 이동하였는지를 확인하였다.
6) 결합체의 특이적 세포 섭취 및 그에 따른 형광활성
SKOV3 세포 및 A549 세포를 4-well Lab-Tek 챔버에 각 well 마다 SKOV3 세포 1×105개씩 넣어 세포가 잘 흡착하도록 24시간 동안 배양한 후, 실시예 1 및 자유 엽산, E64d(세포 투과성 E64)를 혼합하여 희석하였다. 이후 기존 배지를 실시예 1 (1μM)을 포함하는 신선한 배지 300㎕로 교체한 후, 상기 세포들을 2시간 동안 배양하였다.
자유 엽산 경쟁 실험에서는, SKOV3 세포를 자유 엽산 1mM이 존재하는 배지에서 30분 동안 배양한 후, 실시예 1을 1μM 첨가하여 2시간 동안 추가 배양하였다.
효소 억제 실험에서는, SKOV3 세포를 E64d(세포 투과성 E64) 20μM 이 존재하는 배지에서 30분 동안 배양한 후, 실시예 1을 1μM 첨가하여 2시간 동안 추가 배양하였다.
최종적으로, 배양배지로 세포를 2회 세척한 후, 공초점 레이저 현미경(CLSM. ZEISS LSM 510 META, 독일)를 사용하여 근적외광 형광 이미지(λEx. 633nm, λEm. 646～753nm)를 얻었다. MDA-MB-231 세포주에 대해서도 상기와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
본 발명의 실시예 1 및 자유 염료(ATTO655)를 SKOV3 세포에 각각 처리한 후 세척하지 않고 근적외광 형광 이미지를 촬영함으로써 세포 밖 소광현상 및 세포내 형광활성화를 보여주는 사진을 도 5에 도시하였다. 본 발명의 실시예 1을 처리한 경우, 세포 밖에서는 형광신호가 매우 약하게 나왔으나 세포 안에서는 강한 형광 신호가 발생된 반면, ATTO655 염료만을 처리한 경우에는 세포 밖에서 강한 형광신호가 지속적으로 관찰되었고 세포내에서는 형광이 발생되지 않았다. 세포 밖과 세포내의 형광 강도를 정량적으로 분석하기 위하여, 형광사진들의 하얀 선 부위에서의 형광강도를 분석하였을 때, 그래프에서 볼 수 있는 것처럼 결합체 1을 처리한 경우에는 세포 밖에서는 형광이 없는 반면, ATTO655 염료를 처리한 경우에는 세포 밖에서 강한 형광이 발생하고 있음을 정량적으로 비교할 수 있다. 특히 본 발명의 실시예 1을 처리한 경우에는 배양시간이 경과할수록 세포내 형광세기가 더욱 증가하였으며, 표적세포 안에서 형광 발생이 활성화되었음을 알 수 있다. 2시간 처리한 후, 세척하여 새로운 배지를 첨가한 후 다시 한 번 공초점 레이저 현미경으로 영상을 획득하였을 때, 자유 염료를 처리한 세포에서는 염료의 세포내 섭취가 없었으므로 형광 신호가 사라진 반면에, 실시예 1을 매개로 한 세포내 섭취가 있는 실시예 1 처리 세포에서는 여전히 강한 형광 신호가 관찰되었다.
본 발명의 결합체 1이 엽산 수용체를 과발현하는 세포에 특이적으로 섭취가 되며, 세포내 존재하는 카텝신 B에 의하여 형광이 활성화됨을 보여주는 결과를 도 6에 도시하였다. 엽산 수용체를 발현하지 않는 A549 세포에 본 발명의 실시예 1을 처리한 경우, 형광이 측정되지 않았으나, 엽산 수용체를 발현하는 SKOV3 세포에 처리한 경우에는 세포 내에서 강한 형광을 발생하였다. 세포 표면에 존재하는 엽산 수용체와 결합체 1의 결합을 방해하기 위하여 과량의 자유엽산을 동시에 처리해 준 경우에도 세포내 형광발생이 급감하였으며, 이러한 결과로부터 결합체 1의 세포내 섭취가 엽산 수용체 특이적으로 일어났음을 알 수 있다. 카텝신 B 억제제 (E64)를 함께 처리해 준 경우에는 형광이 측정되지 않았으며, 이것은 세포내 형광회복이 카텝신 B의 작용에 의한 것임을 보여주는 결과이다.
7) 생체 형광영상 실험
암컷 무흉선 누드 쥐(Balb-c/nude, 5주령)에 SKOV3 세포 1×107개를 50㎕ RPMI 배지에 희석하여 피하주사한 후, 주기적으로 종양 세포 크기를 측정하여, 종양 크기가 60mm3에 도달한 것을 실험대상으로 선정하였다.
염료 및 실시예 1 투여군에게는 염료 및 실시예 1 각각을 체중 20g당 15nmol씩 정맥주사하였고, 대조군에게는 인산완충식염수를 개체당 100㎕ 정맥주사하였다. 주사 3시간 후에 IVIS Lumina XR(Xenogen Corporation-Caliper, 미국)를 사용하여 근적외광 형광 영상(λEx. 660nm, λEm. 690～730nm)을 얻었다.
상기 동물실험 결과는 도 7에 도시하였다. 실험 결과, 본 발명의 실시예 1을 투여한 쥐에서 근적외광의 종양 대 배경 비율이 7.76±0.88 정도의 비율로 강한 형광 신호가 검출되었다. 자유염료의 대부분이 투여 30분 이내에 소변으로 배출되었으며, 종양 부위에 염료의 축적은 없었다. 그 결과, 자유염료 투여군과 PBS 투여군에서의 투여 3시간 후 종양 부위 대비 배경의 형광세기에서 차이가 나타나지 않았다. 이는 실시예 1의 결합체가 엽산 수용체를 표적으로 하여 종양 세포내에서 축적이 되고, 또한 세포내에서 형광이 활성화 된다는 것을 의미한다.
( 실시예 2)
2.1. 엽산- 다이아르기닌 - 광증감제 Ce4 결합체 제작
ASP48S(Peptron Inc, 미국)를 이용한 Fmoc 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통하여 펩타이드를 제조하였으며, 제조 과정은 상술한 실시예 1의 제조방법에서 형광염료 ATTO655 대신 광증감제 Ce4(Frontier Scientific Inc., 미국)를 사용한 것을 제외하고는 동일하다.
상기에 따라 제조된 결합체(실시예 2)의 화학구조는 하기 화학식 2과 같다. 즉, 엽산과 Ce4염료가 다이-아르기닌 구조를 통해 결합되어 있다.
(화학식 2)
Figure pat00005

2.2. 엽산- 다이아르기닌 - Ce4 결합체의 특성
1) 분자량 및 흡광 스펙트럼
분자량은 LC/MSD(Agilent Hewlett Packard 1100 시리즈, 미국)를 사용하여 측정하였으며, 흡광도는 UV/Vis 스펙트로미터(DU370, 미국)를 사용하여 측정하였다.
평가 결과, 상기 수득한 정제된 본 발명의 결합체, 즉 실시예 2의 분자량은 1,416g/mol 이었고, 흡광 스펙트럼상 각각 285, 403, 505, 660nm에서 최대 흡수피크를 나타냈다(도 8a 참조).
2) 효소 활성 작용에 의한 형광 및 반응성 산소 발생 회복 분석
효소활성에 반응하여 상기에서 수득한 결합체(실시예 2)의 형광회복을 상기 실시예l에서 수행한 방법과 동일한 방법으로, 실시예 1 대신 실시예 2를 사용하여 수행하였다. 한편 희석하여 준비한 시료를 다기능 마이크로플레이트 판독기(Safire 2, Tecan사, 스위스)에 넣어 형광 스펙트럼(λEx. 400nm, λEm. 620～850nm) 결과를 얻었다.
일항 산소 생성(singlet oxygen generation, SOG)은 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 상기에서 수득한 결합체(실시예 2) 4nmol을 소디움 아세테이트 완충액(20mM sodium acetate buffer, 1mM EDTA, pH 5.0) 194㎕에 희석한 후, 효소 처리 시료에는 카텝신 B(cathepsin B, Calbiochem, 미국) 97pmol를 소디움 아세테이트 완충액 6㎕에 희석하여 혼합하고, 완충액 처리군에는 동량의 소디움 아세테이트 완충액을 혼합하였다. 상기 혼합액(200㎕)을 4시간 동안 37℃에서 배양하였다.
한편 다른 카텝신 효소에 의한 활성도 비교 평가하기 위하여 카텝신 L, 카텝신 S도 동일한 조건과 방법으로 실험을 수행하였다.
카텝신 B 억제제 처리군을 위해서, 카텝신 B 97pmol(소디움 아세테이트 완충액 6㎕에 희석)를 억제제 E64(Sigma Aldrich, 미국) 0.1mM(20㎕)를 포함하는 20mM 소디움 아세테이트 완충액(pH 5.0)에 혼합하여 실온에서 30분간 배양하였다. 이후 본 발명의 결합체(실시예 2) 4nmol을 소디움 아세테이트 완충액 174㎕에 희석한 후, 이에 상기에서 E64를 전처리 배양한 카텝신 B를 혼합한 후 4시간 동안 37℃에서 배양하였다.
이후 시료 50㎕에 농축된 Singlet Oxygen Sensor Green(SOSG)를 함유하는 산소 포화 PBS를 혼합한 후, 최종 SOSG의 농도를 1μM로 조정하였다. 상기 시료에 광조사(광 조사량 50mW/cm2) 동안 SOSG의 형광도 변화를 670nm-연속 파장 레이저 장치를 사용하여 주기적으로 측정하였다.
도 8b 및 8c에 따르면, 실시예 2의 결합체만 존재할 때는 형광이 나오지 않다가(OFF 상태) 카텝신 B 효소와 만나면 연결기로 사용된 기질이 잘려서 광증감제 고유의 형광을 나타내는 것(ON 상태)을 확인하였다. 형광발현 상태(ON)의 형광세기는 무려 6배로 매우 증가하였다. 또한, OFF 상태에서는 일항 산소의 생성이 억제되다가 카텝신 B 효소와 만나면 ON 상태가 되어 일항 산소가 OFF 상태에 비해 6.67배로 급격히 증가하였고, 카텝신 B 효소 억제제를 처리한 경우에는 형광 세기와 일항 산소의 생성이 모두 억제된다는 결과를 보였다 (도 8b 및 8d 참조). 이를 종합하면 형광과 일항 산소의 생성은 카텝신 B 효소의 특이적 작용에 따른 것을 알 수 있다.
도 9에 따르면, 카텝신 S와 L 효소를 이용해서 위와 동일한 실험을 진행한 결과 본 발명의 실시예 2는 카텝신 B 효소에 특이적으로 형광 및 반응성 산소인 일항 산소가 증가된다는 것을 추가로 확인하였다.
3) 혈청내 안정성
본 발명의 실시예 2를 PBS, 우태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS, Gibco, 미국) 10%에 각각 혼합하여 배양하여 혈청내 안정성을 평가하였다. 용액내 상기 결합체의 최종 농도는 1μM로 조정하였다. 상기 용액을 실온에서 4시간 동안 반응시킨 후, 다기능 마이크로플레이트 판독기(Safire 2, Tecan사, 스위스)에 넣어 형광 스펙트럼(λEx. 400nm) 형광 스펙트럼 결과를 얻었다(도 10 참조).
도 10에 따르면, 혈청단백질은 실시예 2의 형광에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
4) 세포 배양
엽산 수용체를 발현하는 인간 표피암 KB 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, 미국)으로부터 수득하였다.
상기 KB세포를 우태아혈청 10% 및 페니실린/스트렙토마이신 1%를 포함하는 엽산 결핍 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지(Gibco)에서 37℃, 5% 이산화탄소 조건하에서 배양하였다.
5) 형광소광 및 형광회복
12-well 플레이트에 각 well 마다 KB세포 5×105개씩 넣어 세포가 잘 흡착하도록 24시간 동안 배양한 후, 실시예 2 및 자유 염료(Ce4)를 혼합하여 농도가 2μM이 되도록 희석하였다. 이후 기존 배지를 실시예 2 및 자유 염료(Ce4)를 포함하는 신선한 배지 1㎖로 교체하였다.
이후 세포를 세척하지 않고, Live Cell Imaging System(Axio Observer Z1, Carl Zeiss사, 독일)을 사용하여 2시간 동안 15분 간격으로 각각의 근적외광 형광 영상(λEx. 640±15nm, λEm. 690±25nm)을 얻었다.
도 11에 따르면, 실시예 2를 처리한 경우에는 세포내 및 세포외 영역에서 형광신호를 발생하지 않다가, 시간이 지남에 따라서 암세포 안에서만 강한 형광이 발생이 됨으로써 암세포의 존재 위치를 형광영상으로부터 매우 용이하게 확인할 수 있었다. 자유염료(Ce4)를 처리한 경우에는, 항상 형광신호가 활성화되어 있는 이유로 세포외 영역에서 지속적으로 강한 형광신호를 발생하여 배경 잡신호가 높았기 때문에, 형광영상으로부터는 암세포의 위치를 확인할 수 없었다. 이 결과는, 실시예 2의 형광이 표적으로 하는 암세포 안에서만 활성화되는 특성을 이용하면, 표적으로 하는 암세포를 선택적으로 영상으로 진단하는데 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.
6) 결합체의 세포내 흡입 및 그에 따른 형광활성
KB세포를 우태아혈청 10% 및 페니실린/스트렙토마이신 1%를 포함하는 엽산 결핍 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지(Gibco)에서 37℃, 5% 이산화탄소 조건하에서 유지하였다.
이후 8-well Lab-Tek 챔버에 각 well 마다 세포 1×105개씩 넣어 세포가 잘 흡착하도록 24시간 동안 배양한 후, 실시예 2 및 자유 염료(Ce4)를 혼합한 후, 농도가 2μM이 되도록 희석하였다. 이후 기존 배지를 실시예 2 및 자유 염료(Ce4)를 포함하는 신선한 배지 200㎕로 교체한 후, 상기 세포들을 4시간 동안 배양하였다.
자유 엽산 경쟁 실험에서는, KB세포를 실시예 2 또는 자유 염료를 처리한 후 자유 엽산 1mM이 존재하는 배지에서 4시간 동안 배양하였다.
효소 억제 실험에서는, KB세포를 E64d(세포 투과성 카텝신 억제재) 100μM 이 존재하는 배지에서 30분 동안 배양한 후, 실시예 2 또는 자유 염료(Ce4)을 첨가하여 4시간 동안 추가 배양하였다.
최종적으로, 배양배지로 세포를 3회 세척한 후, 공초점 레이저 현미경(CLSM, Confocal ZEISS LSM 510 META, 독일)를 사용하여 근적외광 형광 영상(λEm. 405nm, λEm. 625～754nm)을 얻었다.
본 발명의 실시예 2의 세포내 위치를 파악하기 위한 실험을 수행하였다. 8-well Lab-Tek 챔버에 각 well 마다 세포 1×105개씩 넣어 세포가 잘 흡착하도록 24시간 동안 배양한 후, 실시예 2를 2μM 첨가한 후 4시간 배양한 후, 3회 세척하였다. 이후 기존 배지를 LysoTracker Blue DND-22 염료 100nM을 포함하는 신선한 배지로 교체한 후, 상기 세포들을 45분 동안 배양하였다. 상기 시료에 대해 CLSM을 사용하여 실시예 2(λEx. 405nm, λEm. 625～754nm) 및 LysoTracker(λEx. 405nm, λEm. 411～497nm)에서 형광 이미지를 수득하였다.
도 12에 따르면, 실시예 2만 KB 세포에 처리해준 경우에는 세포 안으로 인입되어서 강한 형광 신호를 나타내었고, 자유 엽산을 경쟁제로 함께 처리해 준 경우에는 형광 신호가 거의 나타나지 않는 것으로 보아 세포 내부로 거의 들어가지 않았다는 것으로 나타났다. 이 결과는, 실시예 2가 KB세포 표면의 자유엽산 수용체와의 특이적 상호작용을 함으로써 세포내로 섭취되었음을 뒷받침 한다.
또한 실시예 2와 카텝신 B 효소의 억제제인 E64d를 함께 처리해 준 경우에도 동일하게 형광 신호가 거의 나타나지 않는 것을 확인하였다. 이를 통해 세포 내부에서 실시예 2의 형광발현은 세포내 존재하는 카텝신 B 효소의 작용에 의한 것임을 확인하였다.
반면에 같은 양의 자유 염료(Ce4)를 처리했을 때는 경쟁제나 효소 억제제의 여부에 상관없이 비특이적으로 소량만 세포 안으로 들어가는 것으로 나타나, 실시예 2는 엽산 수용체를 매개로 효과적으로 세포에 인입될 수 있으며 카텝신 B 효소에 의해 활성/비활성 상태를 야기할 수 있다는 것을 확인하였다.
도 13에 따르면, 세포 내의 lysosome을 특이적으로 염색하는 lysotracker와 실시예 2를 함께 4시간 동안 배양했을 때, 공동으로 염색되는 부위가 존재함을 확인하였고, 형광 사진을 겹쳐서 보았을 때도 그 위치가 정확히 겹치는 것으로 보아, 실시예 2는 세포 내부에서 lysosome 안에 위치하며 그 안에서 활성화 되는 것을 확인하였다.
7) 세포 독성 및 광역학 치료 효능 실험
빛이 없는 어두운 상태에서 본 발명의 실시예 2를 0-10μM 농도로 KB에 첨가하여 세포 독성을 평가하였다. 그 결과 도 14a에 나타난 것처럼, 해당 농도 범위에서 빛이 없다면 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
KB 세포를 1x104개/well만큼 96-well plate에 넣고, 세포가 잘 부착되도록 24시간 동안 배양하였다. 실시예 2를 각각 2μM, 5μM 농도로 준비하여 세포에 처리한 후 4시간 동안 배양하였다. 그 후 세포에 인입되지 않은 실시예 2를 제거해 준 후에 670nm 레이저를 이용하여 조사 선량밀도 50mW/cm2로 6분 40초 동안 조사해 주었다. 그 후 안정화를 위해 overnight 동안 인큐베이터에서 배양한 후, CCK-8 assay로 세포 독성 여부를 판단하였다.
그 결과 도 14b에 따르면, 실시예 2를 단독으로 5μM 처리해 준 경우 62%의 세포가 사멸한 것을 확인하였고 자유엽산과 카텝신 B 억제제(E64)를 처리한 경우에는 독성이 미미한 것을 확인하였다. 이로부터, 실시예 2가 자유엽산 수용체를 매개로 하여 암세포 안으로 섭취가 되고, 카텝신 B 효소의 작용이 있을 때에만 선택적으로 암 치료효과를 유도할 수 있음을 알 수 있다.
8) 생체 근적외선 형광영상 실험
암컷 무흉선 누드 쥐(Balb-c/nude, 5주령)에 KB 세포 5×106개를 50㎕ RPMI 배지에 희석하여 피하주사한 후, 주기적으로 종양 세포 크기를 측정하여, 종양 크기가 50mm3에 도달한 것을 실험대상으로 선정하였다.
염료 및 실시예 2 투여군에게는 투여 0일째, 체중 kg당 염료(Ce4) 1mg 당량에 해당하는 시료 용액을 정맥 주사하였고, 대조군에게는 인산완충식염수를 개체 당 100㎕ 정맥 주사하였다. 약물은 실시예 2 및 자유염료를 인산완충식염수(pH 7.4, 154mM NaCl)에 희석하여 준비하였다. 주사 30분, 3시간, 5시간, 24시간 후에 각각 IVIS Lumina XR(Xenogen Corporation-Caliper, 미국)를 사용하여 근적외광 형광 이미지(λEx. 660±10nm, λEm. 710±20nm)를 얻었다.
도 15에 따르면, 강한 형광 신호가 실시예 2 투여군에서 관찰되어, 본 발명의 결합체가 종양 조직에 축적되어 형광 발현한 것을 확인하였다. 상기 종양 조직에서의 높은 형광 발현은 투여 24시간 후에도 지속됨으로써 종양의 위치를 용이하게 식별할 수 있었다. 반면에, 자유 염료를 투여 받은 군은 비록 투여 30분만이 경과한 경우라도 종양 조직 및 그 주변에서 형광 발현을 보이지 않았으며, 오히려 소장에서의 형광 발현이 나타났다. 이는 소수성인 자유염료가 간을 통해 신속히 혈액순환을 빠져나갔음을 의미한다.
광조사 후의 항암 치료 효과를 측정하였다. 대조군으로 상기 쥐 5마리에게 정맥으로 개체 당 인산완충식염수(100㎕)를 주사하고, 염료 투여군으로 자유염료 Ce4 용액(체중 kg당 1mg Ce4 당량)을 정맥 주사하고, 실시예 2 투여군은 실시예 2 용액(체중 kg당 1mg Ce4 당량)을 정맥 주사하였다. 그 후 광역학 항암 치료를 위하여 쥐의 모든 종양 부위를 670-nm 연속 파장 레이저 장치로 조사하였다(100mW/cm2, 30J/cm2). 이후 종양 부피를 측정하였으며, 대조군에서의 종양 부피가 800mm3을 초과하는 경우에는 실험을 중단하였다.
도 16에 따르면, 실시예 2 투여군에서는 8일째 되었을 때, 종양의 부피가 대조군에 비해 53%만큼 감소한 것을 확인하였고, 자유 염료를 투여한 군에 대해서는 대조군에 비해 83%의 부피를 나타냈다. 모든 군에서 눈에 띄는 체중의 감소는 나타나지 않았다.
( 실시예 3)
3.1. 엽산- 이황화 -형광염료 ATTO655 결합체 제작
ASP48S(Peptron Inc, 미국)를 이용한 Fmoc 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통하여 펩타이드를 제조하였으며, 제조 과정은 다음과 같다.
Cysteamine-chloro-Trityl 레진(Anaspec, 미국)에 보호기가 결합된 아미노산[Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Glu(OH)-OtBu] 8당량 및 2-(1H-벤조트리아졸(Benzotriazol)-1-yl)-1,1,3,3-테트라메틸우로니움 헥사플로로포스페이트[2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, HBTU] 8당량/ N-하이드록시벤조트리아졸(Hydroxybenzotriazole, HOBt) 8당량/ 4-메틸모르폴린(Methylmorpholine, NMM) 16당량을 디메틸포름아마이드(Dimethylformaminde, DMF)에 녹인 용액을 결합제로 하여 혼합한 후 2시간 동안 실온에서 반응하여 DMF, 메탄올 및 DMF로 세척하였다.
아미노산에 붙은 보호기 Fmoc을 분리해내기 위하여, 상기 반응액에 20% 피페리딘(piperidine)을 함유하는 DMF를 가하여 5분 동안 2회 반응시킨 후, DMF, 메탄올 및 DMF로 세척하였다. 상술한 과정을 반복하여 펩타이드 기본골격에 레진이 결합된 [NH2-감마-E(OtBu)-E(OtBu)-E(OtBu)-Cysteamide-2-클로로-트리틸 레진] 구조체를 합성하였다.
상기 레진-펩타이드 기본골격 결합체에 프테로산(pteroic acid) 4당량 및 HBTU 4당량 / HOBt 4당량 / NMM 8당량을 다이메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 녹인 용액을 첨가하였다. 상기 혼합액을 12시간 동안 반응시키고 석션한 후, DMF, 메탄올 및 DMF로 세척하였다.
이후 하이드라진(hydrazine)을 2%로 희석한 DMF 용액을 처리하여 라이신(Lys)의 C-말단에 존재하는 보호기 Dde를 제거하였다. 이후 ATTO655(ATTO-TEC 게엠베하, 독일) 및 HBTU/HOBt/NMM를 녹인 DMF 용액을 첨가하여 12시간 동안 반응시키고 석션한 후, DMF, 메탄올 및 DMF로 세척하였다.
이후 트리플로로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)/1,2-에탄싸이올(1,2-ethanedithiol, EDT)/싸이오아니졸(Thioanisole)/트리이소프로필실란(triisopropylsilane, TIS)/물을 90/2.5/2.5/2.5/2.5로 희석한 액을 처리하여 상기에서 생성된 펩타이드(엽산-다이아르기닌-ATTO655 결합체)를 레진으로부터 분리하였다.
상기 수득액에 10배의 차가운 디에틸 에테르(diethyl ether)를 가하여 펩타이드를 침전시키고, 10분간 3000rpm으로 원심 분리한다. 여액을 버리고 2회 반복한다.
상기에서 수득한 결합체는 Vydac Everest C18 컬럼(250mm×22mm, 10㎛)을 사용한 역상 HPLC를 수행하여 정제한다. TFA 0.1%를 함유하는 10 내지 75%(v/v) 아세토나이트릴 용액을 이용하는 물-아세토나이트릴 선형 그래디언트를 사용해 용출하였다.
상기에서 수득한 결합체와 2,2‘-dithiodipyridine 5당량을 아세트산에 녹인 후 상온에서 12시간 동안 반응한다. 그 후 반응액에 10배의 차가운 디에틸 에테르(diethyl ether)를 가하여 펩타이드를 침전시키고, 10분간 3000rpm으로 원심 분리한다. 여액을 버리고 2회 반복한다. 상기에서 수득한 결합체는 Vydac Everest C18 컬럼(250mm×22mm, 10㎛)을 사용한 역상 HPLC를 수행하여 정제한다.
이렇게 수득한 activated folate-EE-cysteamide와 cysteine 2당량을 아세트산에 녹인 후, 상온에서 12시간 동안 반응한다. 그 후 반응액에 10배의 차가운 디에틸 에테르(diethyl ether)를 가하여 펩타이드를 침전시키고, 10분간 3000rpm으로 원심 분리한다. 여액을 버리고 2회 반복한다. 상기에서 수득한 결합체는 Vydac Everest C18 컬럼(250mm×22mm, 10㎛)을 사용한 역상 HPLC를 수행하여 정제한다. TFA 0.1%를 함유하는 10 내지 75%(v/v) 아세토나이트릴 용액을 이용하는 물-아세토나이트릴 선형 그래디언트를 사용해 용출하였다.
위에서 얻은 folate-EE-cysteamide-Cys와 ATTO655-NHS를 DMF에 녹인 후, N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA)를 첨가하고, 빛을 차단한 상태에서 상온에서 12시간 동안 반응한다. 그 후 반응액에 10배의 차가운 디에틸 에테르(diethyl ether)를 가하여 펩타이드를 침전시키고, 10분간 3000rpm으로 원심 분리한다. 여액을 버리고 2회 반복한다. 상기에서 수득한 결합체는 Vydac Everest C18 컬럼(250mm×22mm, 10㎛)을 사용한 역상 HPLC를 수행하여 정제한다. TFA 0.1%를 함유하는 10 내지 75%(v/v) 아세토나이트릴 용액을 이용하는 물-아세토나이트릴 선형 그래디언트를 사용해 용출하였다.
상기에 따라 제조된 결합체(실시예 3)의 화학구조는 하기 화학식 3과 같다. 즉, 엽산과 ATTO655 염료가 이황화 결합 구조를 통해 결합되어 있다.
(화학식 3)
Figure pat00006

3.2. 엽산- 이황화 -형광염료 ATTO655 결합체의 특성
1) 분자량 및 형광방출
분자량은 LC/MSD(Agilent Hewlett Packard 1100 시리즈, 미국)를 사용하여 측정하였으며, 흡광도는 UV/Vis 스펙트로미터(DU370, 미국)를 사용하여 측정하였다.
평가결과, 상기 수득한 정제된 본 발명의 결합체, 즉 실시예 3의 분자량은 1,387g/mol 이었고, 흡광 스펙트럼에서 각각 665nm, 680nm에서 최대 흡수 피크를 나타냈다(도 17 참조).
2) 형광방출에 대한 환원제 활성
본 발명의 실시예 3의 형광 회복을 측정한 결과를 도 17에 도시하였다. 상기 도 17에 따르면, 세포내 환원제의 농도와 유사한 DTT 5mM 처리에 의해서는 실시예 3의 형광 값이 9배 정도 증가함을 알 수 있었으며, 세포 밖 환경에서의 환원제 농도인 DTT 2μM 농도에서는 실시예 3의 형광이 2시간 동안 변화가 없음을 알 수 있었다.
3) 종양세포 표적 및 형광활성화 특성
본 발명의 실시예 3을 이용하여 표적세포 특이적 형광증가를 측정한 결과를 도 18에 도시하였다. 실험방법은 엽산 수용체 과발현 난소암 세포주인 SKOV3와 엽산 수용체를 거의 발현하지 않는 유방암 세포주인 MDA-MB-231을 각각 배양하고, 실시예 3을 처리하여 종양세포 표적 및 형광활성화 특성을 평가하였다. 실험 결과는 도 18에 도시하였다.
도 18에 따르면, MDA-MB-231 세포주에서는 약한 형광만이 검출되었지만, 엽산 수용체 과발현 세포주인 SKOV3 세포주에서는 강한 형광신호가 관찰 되었다. 또한, SKOV3 세포주에 자유 엽산을 1mM 농도로 같이 처리해 줌으로써, 엽산 수용체 결합을 방해 하였을 때는, 세포내 형광 프루브의 신호가 매우 감소하였다. 이것을 통하여, 형광 프루브가 엽산 수용체를 매개체로 하여 암세포 내로 섭취되었으며, 세포내의 환원제의 작용에 의해서 결합체의 형광이 활성화되었음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 엽산이 세포내 분해 가능한 연결을 통하여 광증감제 또는 근적외선 형광염료와 결합되고, 상기 엽산과 광증감제간 결합 또는 상기 엽산과 형광염료간의 결합의 길이가 10nm 이내인 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포내 분해 가능한 연결은 세포내 효소에 의해 분해되는 연결, 세포내 환원제에 의해 분해되는 연결 및 세포내 pH 4 내지 5.5 환경에서 분해되는 연결 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 세포내 효소는 카텝신(cathepsin) 및 에스터라아제(esterases) 중에서 선택된 어느 하나 또는 복합인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 카텝신(cathepsin)은 카텝신(cathepsin) B, 카텝신(cathepsin) L 및 카텝신(cathepsin) S 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 세포내 효소에 의해 분해되는 연결은 카텝신 B(cathepsin B)에 의해 분해되는 다이-아르기닌(di-arginine) 결합인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 세포내 효소에 의해 분해되는 연결은 에스터라아제(esterases)에 의해 분해되는 에스터(ester, -COO-) 결합 또는 씨오에스터(thioester, -COS-) 결합인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 세포내 환원제는 글루타티온, 설프히드릴 및 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 인산(NADPH) 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 세포내 환원제에 의해 분해되는 연결은 이황화(di-sulfide) 결합인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 세포내 pH 4 내지 5.5 환경에서 분해되는 연결은 히드라존(hydrazone) 결합인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 광증감제는 유리염기 또는 금속 착물 형태의 헤마토포피린(hematoporphyrins), 포피센(porphycenes), 페오포바이드(pheophorbides), 퍼퓨린(purpurins), 클로린(chlorins), 프로토포피린(protoporphyrins), 프탈로시아닌(phthalocyanines)으로 이루어진 군에서 선택된 포피린계 화합물; 또는 하이페리신(hypericin), 로다민(rhodamine), 로즈벵갈(rose Bengal), 프소랄렌(psoralen), 페노씨아지늄(phenothiazinium) 계열 염료 및 메로시아닌(merocyanine)으로 이루어진 군에서 선택된 비포르피린계 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 단독 또는 복합적으로 사용하는 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 근적외선 형광염료는 시아닌(Cyanine) 계열 염료 (Cy5, Cy5.5, Cy7, indocyanine green, IR820), 아토(Atto) 계열 염료(ATTO633, ATTO647, ATTO647N, ATTO655, ATTO665, ATTO680, ATTO700, ATTO725, ATTO740, ATTO MB2, ATTO Oxa12), 알렉사(Alexa) 계열 염료 (Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750), HiLyte 계열 염료 (HiLyte FluorTM 647, HiLyte FluorTM 680, HiLyte FluorTM 750) 플라마(Flama) 염료, F648, NIR730, F749, NIR797 및 BODIPY로 이루어진 군에서 선택되는 것을 단독 또는 복합적으로 사용하는 것을 특징으로 하는 광역학 진단용 결합체.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
    [화학식 1]
    Figure pat00007
  13. 제1항에 있어서,
    상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 하기 화학식 2로 표시되는 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
    [화학식 2]
    Figure pat00008
  14. 제1항에 있어서,
    상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 하기 화학식 3으로 표시되는 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
    [화학식 3]
    Figure pat00009
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 조성물.
KR1020140054923A 2014-05-08 2014-05-08 엽산을 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체 및 그를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 조성물 KR101659855B1 (ko)

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