KR20110101338A - 광역학 진단 또는 치료를 위한 생체 적합성 고분자와 광감작제의 결합체 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 광역학 진단 또는 치료를 위한 생체 적합성 고분자와 광감작제의 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 생체 적합성 고분자와 광감작제가 에스터 본드(ester bond)로 결합하고 있고, 상기 생체 적합성 고분자는 암세포 표적물질과 결합되어 구성된 광역학 진단 또는 치료용 결합체, 이의 제조방법 및 상기 결합체를 유효성분으로 포함하는 광역학적 암 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 암세포만을 특이적으로 표적할 수 있는 암세포 표적물질을 포함하고 있어 암세포에 대한 선택성과 축적성이 우수하고, 근적외선 조사시 암세포를 사멸하는 효과가 우수할 뿐만 아니라 암세포 이외의 세포에 대해서는 근적외선 조사시에도 세포독성을 나타내지 않아 체내 안정성이 우수한 효과가 있으므로 광역학을 이용한 질병의 진단 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 광역학 진단 또는 치료를 위한 생체 적합성 고분자와 광감작제의 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 암세포에 대한 축적률과 표적률이 우수하고 암세포 이외의 세포에 대해서는 안정성이 우수하도록 생체 적합성 고분자에 광감작제와 암세포 표적물질이 결합된 결합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
광역학 치료법(photo dynamic therapy: PDT)은 광민감성 물질(photo-sensitizer)을 이용하여 수술 없이 암 등의 난치병을 치료하거나 여드름 등의 병을 치료하는 기술이다. 이러한 광역학 치료법(PDT)은 20세기 초부터 활발한 연구가 진행되어 현재에 이르러는 암의 진단과 치료, 자가골수이식, 항생제, AIDS 치료, 피부이식 수술이나 관절염 등의 치료에 면역성을 높이기 위해 사용되고 있어 그 응용 범위는 점차 확대되고 있다.
특히, 암의 치료에 사용되는 PDT는 빛에 예민한 반응을 보이는 물질인 광민감성 물질(photosensitizer)을 체내에 투여하면 외부에서 빛을 조사하였을 경우, 체내의 풍부한 산소와 외부 빛에 의한 화학반응으로 단일항산소(singlet oxygen) 또는 자유 라디칼(free radical)이 생성되고, 이런 단일항산소 또는 자유 라디칼이 각종 병변 부위나 암세포의 세포사멸을 유도하여 파괴하는 원리를 이용한 치료법이다.
현재 PDT 요법에 사용되고 있는 광민감성 물질로는 포르피린(porphyrin) 유도체, 크로린(chlorin), 박테리오크로린 (bacteriochlorin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 5-아미노레불린 산(5-aminolevulinic acid) 유도체 등이 알려져 있으며, 광민감성 물질로서 사이클릭 테트라피롤 유도체는 암세포에 선택적으로 축적될 뿐만 아니라 화합물의 특징상 형광이나 인광을 나타내므로 종양의 조기진단 시약으로도 활용될 수는 특징이 있다. 또한, 사이클릭 테트라피롤 내부에 금속이 결합되어 있는 메탈로포르피린(metalloporphyrin)의 경우에는 결합된 금속의 종류에 따라 여러 가지 특성을 나타내기 때문에 메탈로포르피린을 MRI(magnetic resonance imaging) 조영제(contrasting agent)로 하는 진단기술을 이용하여 암세포와 같은 종양세포의 조기 진단에 응용되기도 하며, 가장 널리 알려진 광민감성 물질인 5-아미노레불린산 유도체는 사용 방법이 단순하고 분자량이 작아 비교적 피부 침투가 용이하며, 부작용이 적어 안전하다는 장점이 있다.
또한, 광역학 치료는 정상 세포는 그대로 보존하면서 암세포만 선택적으로 제거할 수 있는 장점이 있고, 대부분 전신 마취의 위험성을 배제할 수 있으며, 간단한 국소 마취 만으로도 수술할 수 있는 등 시술이 용이한 장점도 있다.
한편, 광역학 치료는 빛의 투과 제한으로 부피가 큰 종양에는 사용되고 있지 못하며 특히, 광감작제의 인체 내 대사가 느려 광독성의 부작용이 발견되고 있고, 종양 내의 광감작제의 농도가 낮아 효율적인 치료 효과를 보이지 못한다는 문제점이 있다. 또한, 치료 이외의 장기간 동안 치료 화합물이 체내에 누적되어 있기 때문에 이로 인한 각종 체내의 부작용을 유발하기도 한다. 뿐만 아니라 광역학 치료용으로 사용되고 있는 광민감성 물질들의 경우, 대부분이 친수성 제품으로서 피부 침투가 어렵기 때문에 장기간에 걸쳐 여러 차례 치료해야 하므로 치료를 위해 많은 시간이 소요된다는 문제점이 있다.
따라서 암세포 특이적으로 축적률이 높고, 부작용이 없으며, 치료 효과가 우수한 새로운 광역학 치료제의 개발이 요구되고 있다.
따라서 본 발명의 목적은 광감작제의 종양세포로의 축적을 높임과 동시에 암세포에서만 특이적으로 세포독성을 나타내는 효과가 있는 광역학 치료제로서, 생체 적합성 고분자와 광감작제가 에스터 본드(ester bond)로 결합하고 있고, 상기 생체 적합성 고분자는 암세포 표적물질이 결합되어 구성된 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 유효성분으로 함유하는 광역학적 암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체 적합성 고분자와 광감작제가 에스터 본드(ester bond)로 결합하고 있고, 상기 생체 적합성 고분자는 암세포 표적물질과 결합되어 구성된 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 친수성의 플루란(pullulan) 또는 히알루론산(hyaluronic acid) 유도체일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암세포 표적물질은 엽산, 또는 CD133, CD44, CD34 및 Bcl-2로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 단백질에 대한 단클론 항체일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광감작제는 포피린류(phophyrins), 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins) 및 포피센류(porphycenes)로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광감작제는 근적외선에서 형광을 띄며, 소수성이고, COOH기를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광감작제는 페어포비드 a(pheophorbide a)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 결합체는 혈액순환시 또는 정상조직에서는 세포독성을 나타내지 않고, 암조직 또는 암세포에만 선택적으로 표적, 축적 및 분해되어, 근적외선 파장의 빛을 조사하면 단일항산소 또는 자유라디칼을 생성하여 세포독성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 결합체가 암조직 또는 암세포에서 표적 및 축적되면 생체내 효소에 의해 에스터 본드와 고분자 연결부분이 절단되고 형광간섭이 풀려 형광을 띄는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은,
생체 적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계;
상기 용해된 용액에 암세포 표적물질과 촉매를 첨가하여 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질을 에스터 본드(ester bond)로 결합시키는 단계;
상기 에스터 본드(ester bond)로 결합된 물질에 유기용매에 용해된 광감작제와 촉매를 첨가하여 상기 광감작제를 생체 적합성 고분자에 에스터 본드로 결합시키는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 친수성의 플루란 (pullulan) 또는 히알루론산(hyaluronic acid) 유도체일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광감작제는 포피린류(phophyrins), 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins) 및 포피센류(porphycenes)로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 촉매는 4-하이드록시메칠벤조익에시드(4-hydroxymethylbezoic acid;DMAP) 또는 1,3-디사이클로 헥실카보디미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide ;DCC)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암세포 표적물질은 엽산, 또는 CD133, CD44, CD34 및 Bcl-2으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 단백질에 대한 단클론 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 암세포만을 표적할 수 있는 암세포 표적물질을 포함하고 있어 암세포에 대한 선택성과 축적성이 우수하고, 근적외선 조사시 암세포를 사멸하는 효과가 우수할 뿐만 아니라 암세포 이외의 세포에 대해서는 근적외선 조사시에도 세포독성을 나타내지 않아 체내 안정성이 우수한 효과가 있으므로 광역학을 이용한 질병의 진단 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있는 특징이 있다.
도 1은 본 발명에 따라 제조된 광역학 진단 또는 치료용 결합체(나노미립구)를 1H NMR을 이용하여 화학적 결합을 분석한 것을 나타낸 그래프이다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 플루란-엽산 결합물을 광산란장치 및 전자현미경을 이용하여 크기와 분포 형태를 관찰한 것을 나타낸 것이고, 도 5b는 플루란-엽산 결합물에 광감작제를 첨가하여 제조한 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체(나노미립구)를 광산란장치 및 전자현미경을 이용하여 크기와 분포 형태를 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구에 대해 형광간섭 효과가 나타날때와 나타나지 않을 때의 형광그래프를 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구에 대해 피렌(pyrene)을 이용하여 자가형광 간섭농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구에 대해 레이저 조사에 따른 단일항산소 생성능을 나타낸 그래프로서, ●: 개질화하지 않은 pheo-A의 DMF상에서의 산소생성을 나타낸 것이고, ○: 본 발명에 따른 나노미립구(PFP1)의 DMF상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, ▼: 본 발명에 따른 나노 미립구(PFP2)의 DMF상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, △: 본 발명에 따른 나노 미립구(PFP3)의 DMF상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, ■: 개질화하지 않은 pheo-A의 PBS상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, □: 본 발명에 따른 나노미립구(PFP1)의 PBS상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, ◆: 본 발명에 따른 나노미립구(PFP2)의 PBS상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, ◇: 본 발명에 따른 나노미립구(PFP3)의 PBS상에서의 산소생성능을 나타낸 것이다(참고로, 본 발명의 일실시예에서 나노미립구의 제조과정 중, 광감작제의 양을 0.50mg, 1.25mg 및 2.5mg로 사용하여 제조한 나노미립구를 순차적으로 각각 PFP1, PFP2 및 PFP3으로 명명하였다).
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구 및 대조군으로 사용한 개질화되지 않은 pheo-A를 각각 세포에 흡수시키고, 레이저 조사한 다음, XTT시약을 통하여 세포사멸을 관찰한 것을 비교하여 나타낸 결과로서, ●: 본 발명에 따른 나노미립구(PFP2)를 세포와 배양한 다음, 레이저를 조사하지 않은 경우를 나타낸 것이고, ○: 개질화하지 않은 pheo-A을 세포와 배양한 다음, 레이저를 조사하지 않은 경우를 나타낸 것이며, : 본 발명에 따른 나노미립구(PFP2)를 세포와 배양한 후, 레이저를 조사한 경우를 나타낸 것이고, : 개질화하지 않은 pheo-A를 세포와 함께 배양 후, 레이저를 조사한 경우를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구를 암세포 및 암세포가 없는 배양액에 각각 처리하고 암세포의 효소작용에 의해 분해되어 발색하는 형광의 정도를 이미지로 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명의 나노미립구와 개질화되지 않은 pheo-A를 각각 투여한 누드마우스를 시간에 따라 KODAK 이미지 스테이션을 통하여 생체 내에서 나타나는 형광값을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 나노미립구와 개질화되지 않은 pheo-A를 암세포에 처리한 다음, 시간에 따른 세포내의 위치를 공초점현미경을 통해 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 플루란-엽산 결합물을 광산란장치 및 전자현미경을 이용하여 크기와 분포 형태를 관찰한 것을 나타낸 것이고, 도 5b는 플루란-엽산 결합물에 광감작제를 첨가하여 제조한 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체(나노미립구)를 광산란장치 및 전자현미경을 이용하여 크기와 분포 형태를 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구에 대해 형광간섭 효과가 나타날때와 나타나지 않을 때의 형광그래프를 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구에 대해 피렌(pyrene)을 이용하여 자가형광 간섭농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구에 대해 레이저 조사에 따른 단일항산소 생성능을 나타낸 그래프로서, ●: 개질화하지 않은 pheo-A의 DMF상에서의 산소생성을 나타낸 것이고, ○: 본 발명에 따른 나노미립구(PFP1)의 DMF상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, ▼: 본 발명에 따른 나노 미립구(PFP2)의 DMF상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, △: 본 발명에 따른 나노 미립구(PFP3)의 DMF상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, ■: 개질화하지 않은 pheo-A의 PBS상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, □: 본 발명에 따른 나노미립구(PFP1)의 PBS상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, ◆: 본 발명에 따른 나노미립구(PFP2)의 PBS상에서의 산소생성능을 나타낸 것이고, ◇: 본 발명에 따른 나노미립구(PFP3)의 PBS상에서의 산소생성능을 나타낸 것이다(참고로, 본 발명의 일실시예에서 나노미립구의 제조과정 중, 광감작제의 양을 0.50mg, 1.25mg 및 2.5mg로 사용하여 제조한 나노미립구를 순차적으로 각각 PFP1, PFP2 및 PFP3으로 명명하였다).
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구 및 대조군으로 사용한 개질화되지 않은 pheo-A를 각각 세포에 흡수시키고, 레이저 조사한 다음, XTT시약을 통하여 세포사멸을 관찰한 것을 비교하여 나타낸 결과로서, ●: 본 발명에 따른 나노미립구(PFP2)를 세포와 배양한 다음, 레이저를 조사하지 않은 경우를 나타낸 것이고, ○: 개질화하지 않은 pheo-A을 세포와 배양한 다음, 레이저를 조사하지 않은 경우를 나타낸 것이며, : 본 발명에 따른 나노미립구(PFP2)를 세포와 배양한 후, 레이저를 조사한 경우를 나타낸 것이고, : 개질화하지 않은 pheo-A를 세포와 함께 배양 후, 레이저를 조사한 경우를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 본 발명의 나노미립구를 암세포 및 암세포가 없는 배양액에 각각 처리하고 암세포의 효소작용에 의해 분해되어 발색하는 형광의 정도를 이미지로 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명의 나노미립구와 개질화되지 않은 pheo-A를 각각 투여한 누드마우스를 시간에 따라 KODAK 이미지 스테이션을 통하여 생체 내에서 나타나는 형광값을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 나노미립구와 개질화되지 않은 pheo-A를 암세포에 처리한 다음, 시간에 따른 세포내의 위치를 공초점현미경을 통해 관찰한 것을 나타낸 것이다.
본 발명은 암조직 또는 암세포로의 축적률과 표적률을 높이고 암조직 또는 암세포 이외에서는 형광간섭으로 인한 광독성을 현저히 줄여줄 수 있는 새로운 광역학 치료방법으로서, 생체 적합성 고분자와 광감작제가 에스터 본드(ester bond)로 결합하고 있고, 상기 생체 적합성 고분자는 암세포 표적물질과 결합되어 구성된 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제공함에 그 특징이 있다.
통상적으로 광역학 치료에 있어서, 광감작제를 고분자 물질에 결합시킬 경우, 대부분 아미노기와 카르복실기가 결합하여 형성되는 아마이드 본드(amide bond), 즉, -CO-NH-결합으로 연결되는데, 본 발명에서는 광감작제를 고분자 물질에 결합시킬 경우, 아마이드 본드(amide bond)가 아닌 에스터 본드(ester bond) 결합으로 결합시킨 특징이 있다.
이러한 에스터 본드 결합은 아마이드 결합에 비해 체내에서 분해효율이 높아 적은양의 광감작제만으로도 높은 치료효과를 가질 수 있는 유용함이 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 친수성인 생체 적합성 고분자 유도체와 소수성인 광감작제의 균형을 통해 수계에서 안정하게 나노크기의 자기조립체(self-assembly)인 나노겔 또는 나노미립구의 형태일 수 있다.
이하에서는 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 제조방법을 단계별로 보다 상세히 기술한다.
제1단계: 생체 적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계
본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 제조를 위해 먼저 생체 적합성 고분자를 유기용매에 용해시킨다.
상기 고분자는 생체 내에서 생체적합성 및 생분해성이 우수해야 하며, 생체 내에서 안정성이 우수할 뿐만 아니라 암 조직에 효과적으로 축적되는 특성이 필요하다.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 고분자로는 생체 내에서 생체적합성을 갖는 고분자 또는 고분자 유도체라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 친수성을 띄는 플루란(pullulan) 또는 히알루론산(hyaluronic acid) 유도체를 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 하기 구조식의 플루란을 사용하였는데, 상기 '플루란’ 은 흑효모(Aureobasidium pullulans (DE BARY) ARN.)로부터 생산한 다당류를 분리 정제하여 얻어지는 물질로서 주성분은 중성다당류이다. 플루란은 물에 잘 녹는 반면, 알코올류와 유류에는 녹지 않는 특성이 있고, 다른 검류에 비해 점도는 낮은 편에 속하나, 산, 알칼리, 열 등에 안정하다. 특히, 피막성 외에 강력한 점착력을 가지고 있고, 평균 분자량은 200,000과 100,000의 2종류가 있으며, 점도는 1-2cps이다. 본 발명의 일실시예에서는 분자량이 100,000인 것을 사용하였다.
<플루란의 구조식>
또한, 상기 고분자는 시중에서 판매하고 있는 것을 구입하여 사용하거나, 천연으로부터 당업계에 공지된 방법으로 분리 및 정제하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 고분자 물질에 존재하는 불순물을 제거하고 순도도 높이기 위해 깨끗이 정제하여 사용할 수 있다.
상기 고분자를 유기용매에 용해시키는 과정은 고분자가 유기용매 하에서 충분히 용해될 수 있도록 적당량의 유기용매를 사용하는 것이 바람직하며, 이때 유기용매의 사용량이 너무 적을 경우, 고분자가 서로 엉겨붙는 현상이 일어날 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 상기 유기용매로는 DMSO, 포름아마이드(formamide) 및 DMF 일 수 있으며, 바람직하게는 DMSO일 수 있다.
제2단계: 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질을 에스터 본드로 결합시키는 단계
제1단계에서 생체 적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 과정이 완료되면, 상기 고분자가 용해된 용액에 암세포 표적물질과 촉매를 첨가하여 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질을 에스터 본드로 결합시킨다.
본 발명에서는 광역학 진단 또는 치료용 결합체가 보다 효과적으로 암세포 또는 암조직만을 표적화 할 수 있도록 암세포 표적물질을 사용하였는데, 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 암세포 표적물질로는 이에 제한되지는 않으나, 엽산, 또는 CD133, CD44, CD34 및 Bcl-2으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 단백질에 대한 단클론 항체일 수 있다. 즉, 상기 암세포 표적물질은 정상세포에 비해 암세포에서만 특이적으로 발현되고 있어 암세포만을 표적화하는데 매우 유용하다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 암세포 표적물질로 엽산을 사용하였는데, 이는 암세포 표면에는 엽산을 인지하는 수용체가 많이 분포되어 있어 엽산을 사용할 경우, 정상적인 세포를 제외한 암세포에만 선택적으로 침투하게 됨으로써 암세포만을 표적화할 수 있기 때문이다.
본 발명에서 사용한 상기 엽산은 비타민 B 복합체의 하나로 하기 구조식을 가지며, 자연계에서는 트라이 또는 헵타글루타밀펩티드의 형태로 존재한다.
<엽산의 구조식>
본 발명의 일실시예에서는 상기 엽산을 생체 적합성 고분자와 에스터 본드로 결합시키기 위해 엽산의 -COOH기를 활성화 시키는 촉매를 첨가하여 반응시킬 수 있다.
이때 상기 촉매로는 4-하이드록시메칠벤조익에시드(4-hydroxymethylbezoic acid;DMAP) 또는 1,3-디사이클로 헥실카보디미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide:DCC)를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 암세포 표적물질과 고분자와의 에스터 결합 반응은 유기용매에 상기 암세포 표적물질과 촉매를 용해시키고, 상기 제1단계에서 고분자가 용해된 용액에 한 방울씩 떨어뜨리면서 상온에서 20~28시간 반응시킬 수 있다. 이때, 상기 암세포 표적물질과 촉매를 용해시킬 수 있는 유기용매는 상기 고분자를 용해시킨 유기용매와 동일한 용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 DMSO를 사용할 수 있다.
제3단계:
광감작제를
생체 적합성 고분자와 에스터 본드로 결합시키는 단계
제2단계를 통해 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질이 에스터 본드로 결합된 결합물의 제조과정이 완료되면, 상기 결합물에 광감작제를 첨가하여 암세포 표적물질이 결합된 고분자에 광감작제를 에스터 본드로 결합시킨다.
이때, 상기 결합물에 광감작제를 첨가하기 전에, 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질을 결합시키는 과정에서 사용한 유기용매를 제거하는 단계를 추가할 수 있는데, 유기용매의 제거는 당업계에서 통상적으로 사용하는 여과 또는 투석의 방법 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 투석막을 이용하여 유기용매를 제거할 수 있다.
또한, 투석막을 통해 유기용매를 제거할 경우에는, 투석막이 열에 약한 특성이 있으므로 투석 과정 시 주변의 온도가 너무 높지 않도록 상온을 유지할 수 있도록 고려해야 한다.
또한, 투석 과정을 거친 반응 용액은 동결 건조하는 단계를 추가할 수 있는데, 동결 건조를 통해 생체 적합성 고분자에 엽산이 결합된 물질을 용이하게 회수할 수 있다. 상기 동결건조는 당업계에 공지된 방법이라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 액체 질소를 사용하여 동결건조시킬 수 있는데, 액체 질소 상에서 10분 동안 반응 용액을 완전히 얼려준 다음, 진공 건조기를 이용하여 수분을 완전히 승화시켜 고분자에 엽산이 결합된 물질을 회수할 수 있다.
이후, 동결건조를 통해 얻어진 물질은 광감작제 및 촉매와 함께 유기용매 상에서 생체 적합성 고분자와 광감작제가 에스터 본드에 의해 결합시킬 수 있다.
즉, 유기용매 하에서 에스터 본드로 결합된 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질의 결합물에 광감작제와 촉매를 첨가하여 상기 생체 적합성 고분자와 광감작제를 에스터 본드로 결합시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 광감작제는 근적외선에서 형광을 띄며, 소수성이고, COOH기를 갖는 것을 사용할 수 있으며, 그 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 포피린류(phophyrins), 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins) 및 포피센류(porphycenes)로 이루어진 군 중에서 선택된 것을 사용할 수 있고, 본 발명의 일실시예에서는 하기 구조식으로 표시되는 페어포비드 a(pheophorbide a)를 사용하였다.
<페어포비드 a 구조식>
본 발명의 일실시예에서 사용한 상기 페어포비드 a는 클로로필(Chlorophyll)로부터 추출한 것으로서, 기존의 광감작제에 비해 ROS 발생 효율이 높으며 근적외선 파장대를 흡수하여 형광을 띈다. 또한, 가시광선 영역에서 반응성이 좋기 때문에 실험 과정에서 빛에 영향을 받지 않도록 유의하여야 한다.
상기 촉매는 광감작제의 -COOH기를 활성화시키는 작용이 있으며, 광감작제와 함께 유기용매에 용해시켜 사용할 수 있으며, 상기 촉매로는 4-하이드록시메칠벤조익에시드(4-hydroxymethylbezoic acid;DMAP) 또는 1,3-디사이클로 헥실카보디미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide ;DCC)를 사용할 수 있다.
또한, 생체 적합성 고분자에 광감작제를 에스터 본드로 결합시키는 반응은 분자량이 상대적으로 큰 고분자와 분자량이 상대적으로 작은 촉매 및 광감작제를 반응시키는 것이기 때문에, 바람직하게는 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질이 결합된 결합물에 유기용매에 용해된 광감작제와 촉매의 혼합용액을 한 방울씩 떨어뜨려 주면서 반응시켜 상기 고분자와 광감작제 사이의 에스터 결합이 충분히 형성될 수 있도록 한다. 또한, 상기 반응은 합성이 잘 될 수 있도록 45~50시간 정도 수분이 없고 빛이 없는 환경에서 잘 섞어주면서 반응시킬 수 있다.
이상, 기술된 방법의 반응과정을 통해 생체 적합성 고분자에 광감작제와 암세포 표적물질이 각각 에스터 본드 결합에 의해 결합되어 구성된 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제조할 수 있다.
나아가 상기에서 고분자와 광감작제 사이의 에스터 결합에 의해 형성된 본 발명의 결합체는 앞서 기술한 바와 같이 여과 또는 투석을 통해 유기용매를 제거하고, 동결건조시킨 형태로 수득할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 생체 적합성 고분자로 플루란을 사용하고, 광감작제로 페어포비드 a(pheophorbide a)를 사용하여 제조된 결합체의 합성반응을 종합하여 나타내면 하기 반응식과 같다.
그러므로 본 발명은,
생체 적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계;
상기 용해된 용액에 암세포 표적물질과 촉매를 첨가하여 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질을 에스터 본드(ester bond)로 결합시키는 단계; 및
상기 에스터 본드(ester bond)로 결합된 물질에 유기용매에 용해된 광감작제와 촉매를 첨가하여 상기 광감작제를 생체 적합성 고분자에 에스터 본드로 결합시키는 단계를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
또한, 상기 기술된 방법에 의해 제조된 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 수계에서 안정하게 나노입자, 즉, 나노겔 또는 나노미립구의 형태일 수 있으며, 평균 입자 크기는 100~200nm 일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 결합체 제조과정에서 소수성의 광감작제를 농도를 달리하여 결합체를 제조한 다음, 각 결합체의 크기 및 형태를 동적광산랑 기기 및 전자현미경을 사용하여 측정한 결과, 광감작제를 많이 사용할 수도록 소수성이 증가하여 서로 응집력이 강해져 결합체(나노 미립구)의 크기가 감소하는 것으로 나타났다(도 2a 및 2b 참조).
한편, 종래에 사용되던 광역학 진단 또는 치료용 광감작제의 경우, 암세포의 축적률과 표적률이 낮으며 형광간섭을 일으키지 못하기 때문에 빛을 조사하게 되면 체내에서 일반세포, 즉 정상세포에도 세포독성을 나타내므로 치료 효과가 낮고 여러 가지 부작용을 유발하는 문제점이 있었다.
그러나 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 혈액순환시 또는 정상조직에서는 근적외선 조사시에도 세포독성을 나타내지 않는 반면, 암조직 또는 암세포에만 선택적으로 표적, 축적 및 분해되어, 근적외선 파장의 빛을 조사하면 단일항산소 또는 자유라디칼을 생성하여 세포독성을 나타내어 암조직의 세포사멸을 유도함으로써 광역학 치료의 효능을 최대화 할 수 있는 특징이 있다.
특히, 암조직 또는 암세포로의 선택적인 표적을 위해 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 엽산을 포함하고 있으며, 암세포 표면에는 엽산수용체가 다량 발현되어 있어 정상세포가 아닌 암세포에만 효과적으로 표적 및 침투될 수 있다.
일반적으로 광역학 치료에서 소수성 광감작제만을 사용하는 경우, 이를 정맥주사하게 되면 혈액 내에서 단백질과 결합하고 이는 세포 표면에 위치하는 수용체를 통해서 세포 내부로 이동되는 것으로 알려져 있는데, 이러한 경우에는 광감작제의 세포선택 특이성이 단순히 광감작제의 소수성 특성에 의해서만 규정되며 또한 조직 또는 세포에서의 잔류 시간도 경우에 따라 많은 차이를 보이는 것으로 알려져 있다. 또한, 이는 광역학 치료의 효과를 감소시키며 치료 후 재발 확률을 증가시키는 요인으로 지목되어 왔다. 또한, 이러한 문제점을 극복할 수 있는 방법으로는 특정한 부위에 선택적으로 작용하는지의 여부를 단순히 다양한 종류의 광감작제를 사용한 시행착오를 거치면서 선별하는 방법에만 의존하고 있는 것이 현실이다.
그러나 본 발명에서는 광감작제를 효과적으로 조직 특이적으로 전달하기 위해 암세포 표적물질을 광감작제와 함께 사용하였다.
또한, 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체는 레이저 조사시 세포독성을 유발시킬 수 있는 단일항산소 또는 자유라디칼 생성능을 가지고 있는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에서 제조한 결합체, 즉 나노미립구는 양성대조군으로 사용한 pheo-A와 단일항산소의 생성정도가 유사한 것으로 나타났다(도 5 참조).
따라서 본 발명자들은 기존의 사용되던 결합 방법이 아닌 에스터 본드 결합으로 합성된 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체도 암조직을 사멸할 수 있는 암치료 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 다른 일실시예에 따르면, 암세포로 축적되지 않은 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체가 세포에 독성을 나타내는지를 확인하는 실험을 수행하였는데, 즉, 체내와 유사한 조건인 수계 상에서는 상기 결합체가 나노 미립구의 형태를 구성하여 형광간섭을 일으키기 때문에 근적외선 파장의 빛을 조사하여도 전혀 반응이 없는 것으로 나타났다(도 3 참조). 반면, 암세포로 축적된 경우에는 세포독성을 나타내어 암세포의 세포사멸이 증가하는 것으로 나타났다(도 6 참조).
따라서 본 발명자들은 이러한 결과를 통해 본 발명의 결합체는 암세포로 축적되지 못할 경우, 빛을 조사하여도 반응성을 나타내지 않으므로 세포독성을 나타내지 않기 때문에 체내에서 안정하며, 암세포 축적된 경우에만 세포독성을 나타내어 치료 효과를 나타낸다는 사실을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 결합체는 암세포에 선택적으로 표적 및 침투되면 암세포의 효소작용, 즉, 생체내 효소인 에스터레이즈(esterase)와 같은 효소에 의해 에스터 결합이 절단(분해)되어 형광간섭이 풀림으로써 형광을 띄는 특징이 있다(도 7 참조).
따라서 본 발명은 본 발명의 결합체가 암조직에 선택적으로 축적될 경우, 암세포의 효소작용에 의해 형광간섭이 풀리고, 레이저 조사에 의해 암세포에서만 광감작제가 형광발색을 나타낼 수 있기 때문에 이러한 형광 유무를 통해 암을 진단할 수 있다.
나아가 본 발명은 본 발명에 따른 상기 결합체를 유효성분으로 함유하는 광역학적 암 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 '치료'란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
본 발명에 따른 상기 광역학 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 암의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 광역학 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 결합체 또는 상기 결합체를 포함하는 조성물을 이용하여 질병을 치료 또는 진단할 경우, 사용할 수 있는 광원으로는 이에 제한되지는 않으나, 초음파 조사 방출기, 광방출 다이오드, 레이저 다이오드, 염료 레이저, 할로겐화 금속 램프, 플래쉬 램프, 기계적으로 필터링된 형광 광원, 기계적으로 필터링된 백열, 및 필라멘트 광원으로 이루어진 군 중에서 선택된 생체외 광조사를 위한 광원; 및 광역학 치료용 레이저 파이버 등의 생체내 광조사를 위한 광원으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 상기 광감작제는 600nm 내지 700nm 범위의 근적외선 광선에서 활성을 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 상기 결합체는 친수성의 고분자와 소수성의 광감작제를 포함하고 있어 상기 결합체가 나노미립구의 형태로 존재할 수 있는데, 상기 나노미립구는 치료학적 활성을 나타내는 약물 또는 생물제제를 추가로 더 포함할 수 있으며, 바람직하게는 항암제를 포함할 수 있다. 이때 상기 약물 또는 생물제제는 나노미립구 내부에 봉입된 형태로 포함될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<
실시예
1>
광역학
진단 또는 치료용
나노미립구의
제조
<1-1>
에스터 결합에 의한
플루란
-엽산 결합물의 제조
생체적합성 고분자 물질인 정제된 플루란(1g)을 10ml의 수분을 제거한 DMSO 용매에 용해시켰고, 암세포 표적물질로 사용하기 위한 엽산 50mg을 4-하이드록시메칠벤조익에시드(4-hydroxymethylbezoic acid;DMAP) 및 1,3-디사이클로 헥실카보디미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide ;DCC)와 함께 DMSO 용매 5ml에 용해시켰다. 이후, 플루란이 용해된 DMSO 용액 10ml에 엽산이 용해된 DMSO 용액 5ml을 한 방울씩 떨어뜨려 혼합시켰다. 그런 뒤, 총 15ml의 혼합용액을 빛이 닿지 않는 조건에서 24시간 동안 잘 섞어주면서 에스터 결합 반응시켰고, 반응이 끝난 용액을 투석막을 이용하여 투석한 후, 동결건조하여 회수하였다.
<1-2>
플루란
-엽산 결합체와
광감작제를
에스터 결합으로 결합
상기 실시예 <1-1>에서 동결건조하여 회수된 플루란-엽산 결합물 45mg을 5ml의 수분을 제거한 DMSO 용매에 용해시켰다. 또한, 광감작제로서 페어포비드 a(pheophorbide a)를 각각 0.50mg, 1.25mg 및 2.50mg의 양으로 4-하이드록시메칠벤조익에시드(4-hydroxymethylbezoic acid;DMAP) 및 1,3-디사이클로 헥실카보디미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide ;DCC)와 함께 DMSO 2ml에 충분히 녹여 -COOH기를 활성화시켰다. 이후, 플루란-엽산 결합물이 용해된 DMSO 5ml에 광감작제인 페어포비드 a가 각 농도별로 용해된 용액 2ml을 한 방울씩 각각 떨어뜨린 후, 잘 섞어주면서 48시간 동안 충분히 에스터 결합 반응시켰고, 반응이 끝난 용액은 상기 실시예 <1-1>의 방법과 동일한 과정을 통해 회수하여 냉동보관 함으로써 본 발명에 따른 광역학 치료 또는 진단용 결합체인 나노미립구를 제조하였다. 이후, 제조된 상기 나노미립구를 1H-NMR 분석을 통해 화학적 결합을 분석하였으며, 화학적 결합상태 및 1H-NMR 분석 결과를 도 1에 나타내었다.
<
실험예
1>
나노미립구의
특성 분석
상기 실시예 <1-1> 및<1-2>에서 제조한 플루란-엽산 결합물과 각 농도별 페어포비드 a가 에스터 결합으로 연결되어 형성된 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체인 나노미립구 샘플 3개를 각각 1mg/ml의 농도로 녹인 후, 동적광산란(Dynamic light scattering, DLS) 장치를 사용하여 각각의 크기를 측정하였고, 전자현미경(Field emission-scanning electromicroscopy, FE-SEM)을 이용하여 형태를 확인하였다. 이때 정확한 사이즈의 측정을 위해 0.1M의 NaCl로 희석하여 사이즈를 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
측정 결과, 동적광산랑장치 및 전자현미경을 이용하여 에스터 결합에 의해 제조된 본 발명의 플루란-엽산 결합물의 크기 및 형태는 도 2a에 나타낸 바와 같이, 직경이 500~1000nm인 것으로 나타난 반면, 플루란-엽산 결합물에 페어포비드 a가 에스터 결합으로 결합되어 형성된 나노미립구의 크기 및 형태는 도 2b에 나타낸 바와 같이 약 100~200nm인 것으로 나타났다. 이러한 측정 결과를 통해 본 발명자들은 소수성인 광감작제를 첨가할 경우, 소수성이 증가하여 서로 응집력이 강해서 본 발명에 따른 결합체, 즉 나노미립구의 크기가 감소한다는 사실을 알 수 있었고, 사용하는 광감작제의 양이 증가할수록 소수성이 더욱 증가하여 나노미립구의 크기는 더욱 감소한다는 사실을 알 수 있었다.
<
실험예
2>
형광간섭의 유무 확인
상기 실시예 1에서 수득한 나노미립구 중 광감작제를 2.50mg의 양으로 첨가하여 제조한 나노미립구 1mg을 각각 DMSO 및 PBS에 용해시켰다. 이후, 형광 스펙트로포토미터(Spectrofluorephotometer)기기를 670nm의 파장으로 고정시키고, 600~900nm의 파장 범위에서 측정을 수행하였다. 이때 본 발명에서 제조된 나노미립구의 경우, 유기용매 상에서는 미립구가 형성되지 않아 형광간섭이 일어나지 않는다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 유기용매인 DMSO에 용해시킨 경우, 미립구가 형성되지 않아 형광간섭이 일어나지 않으나, PBS에 용해시킨 경우에는 나노미립구가 형성되어 형광간섭을 일으키기 때문에 근적외선 파장대에서도 전혀 반응하지 않는 다는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 유기용매에 용해시킨 경우, 600~700nm 파장 범위에서 형광을 띄는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 광역학 치료에서 암세포로 축적이 되지 않은 나노미립구의 경우, 세포독성을 띄지 않기 때문에 체내에서 안정하게 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
<
실험예
3>
CQC
(
Critical
self
-
quenching
concentration
)의 측정
CQC는 본 발명에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체가 나노미립구의 형태를 이루려면 어느 정도의 농도가 필요한지를 형광간섭의 성질을 이용하여 계산할 수 있는 실험방법이다. 일반적으로 CQC는 나노미립구내에 피렌(Pyrene)이라는 형광물질을 봉입하여 그 형광물질의 형광이 급격히 사라지는 점을 이용하여 농도를 확인하는데, 본 발명에서는 본 발명의 나노미립구가 형광간섭이 일어나는 특징이 있으므로 피렌(Pyrene)이 나노미립구내에 봉입되어 있어 형광을 띄지 못하다가 미립구가 풀리면서 급격히 형광을 띄는 반대의 성질을 이용하였다. 즉, 이를 위해 상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 나노미립구가 제조된 용액에 증류수를 이용하여 상기 용액을 희석하였고, 여기에 피렌 수용액을 첨가하여 잘 섞어 주었다. 이때, 피렌은 물에 거의 녹지 않기 때문에 피렌 수용액 제조시 아세톤에 피렌을 잘 녹여 미량을 취해 과량의 증류수에 분산시키는 방법을 이용하였다. 이후, 희석된 나노미립구와 피렌수용액이 섞인 용액을 취해서 형광 스펙트로포토미터(Spectrofluorephotometer)기기를 이용하여 형광 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 나노미립구의 농도를 0.005mg/ml에서 1mg/ml까지 달리 희석하여 피렌(Pyrene)의 형광 정도를 측정하였더니, 나노미립구의 농도가 높아질수록 형광의 세기는 감소하는 것으로 나타났고, 이러한 값을 통해 나노미립구를 형성할 수 있는 최소 농도를 나타내는 그래프를 얻을 수 있었고, 상기 그래피를 통해 0.21mg/ml 정도에서 나노미립구를 형성하는 것을 확인할 수 있었다.
<
실험예
4>
나노미립구의
단일항산소
생성능
평가
상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 광역학 진단 또는 치료용 결합체, 즉, 나노미립구(일명 ‘PFP 나노미립구’라고 함)를 광역학 진단 또는 치료용 광감작제로 사용하기 위하여, 레이저 조사에 따른 PFP 나노미립구의 단일항산소 생성능을 광감작제로 사용되고 있는 pheo-A와 비교하여 분석하였다. 즉, 각기 다른 농도의 광감작제를 첨가하여 제조된 PFP 나노미립구들과 개질화하지 않은 pheo-A를 유기용매인 DMF와 PBS 2ml에 각각 녹인 후, 단일항산소를 검출할 수 있는 소량의 9,10-디메틸안트라센(9,10-dimethylanthracene)을 첨가하여 최종 20㎍/ml의 농도가 되도록 하였다. 이후, pheo-A가 단일항산소를 생성할 수 있는 것으로 알려진 670nm 파장의 레이저를 사용하여 40초 간격으로 레이저를 조사한 후, 형광 스펙트로포토미터(Spectrofluorephotometer)를 이용하여 Ex 360nm, Em 380~550nm에서 형광을 측정하였다.
그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 본 발명의 PFP 나노미립구는 광감작제로 사용되고 있는 pheo-A(개질화하지 않은)와 거의 동일한 단일항산소를 생성할 수 있다는 사실을 알 수 있었고, 본 발명의 나노미립구가 단일항산소를 생성할 수 있다는 효과를 확인함에 따라 본 발명자들은 본 발명의 나노미립구가 표적 세포(암세포)내에서 단일항산소의 생성을 통해 암세포를 사멸시킬 수 있음을 알 수 있었다.
<
실험예
5>
본 발명에 따른
나노미립구의
세포 독성 평가
상기 실시예 1에서 제조한 본 발명에 따른 나노미립구에 대해 세포독성 시험을 수행하였다. 세포 독성 시험을 위해 사용한 세포주는 암세포주이 HeLa 세포이고, 10%의 FBS와 1%의 페니실린이 포함되어 있는 RPMI1640 배양액에서 5% CO2 및 37℃의 온도조건에서 배양하였다. 세포 독성 실험은 우선 배양된 HeLa 세포를 96 well 플레이트에 1×104 세포수로 분주하여 24시간 동안 배양시킨 후, 이튿날 본 발명에 따른 나노미립구(1.25mg의 광감작제가 첨가된 나노미립구)를 농도별로 희석하여 100㎕씩 각 웰에 첨가하였다. 이후, 나노미립구가 세포에 작용할 수 있도록 12시간 더 배양기에서 배양시켜 준 다음, 근적외선 파장대의 빛(670nm)에서 1.2 J/cm2 의 양으로 조사하였다. 이후 다시 배양기에서 하루 동안 배양시켰다. 배양이 완료되면 세포에 XTT 시약(CCK-8,Dojindo)을 희석하여 100㎕씩 첨가하고 1시간 동안 다시 배양시켜 주었고, 이후 배양액의 광학밀도를 ELIZA 분석기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존률을 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제조한 나노미립구 및 개질화하지 않은 pheo-A을 세포에 각각 첨가하여 배양한 후, 근적외선을 조사하지 않은 경우에는 세포사멸이 일어나지 않은 반면, 근적외선을 조사한 경우에는 세포사멸이 발생하여 세포 생존률이 감소하는 것으로 나타났다.
<
실험예
6>
암세포의 효소작용에 의한 형광간섭의
풀림측정
상기 실험예 5와 같이 1x104의 세포수로 분주한 HeLa 세포를 96 웰 플레이트에서 배양한 후, 상기 세포들에 본 발명의 나노미립구를 각 농도별로 처리한 다음, KODAK 이미지 스테이션 기기를 이용하여 형광현상을 관찰하였다. 이때, 대조군으로는 HeLa 세포가 없는 배양액에 본 발명의 나노미립구를 처리한 것을 사용하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, HeLa 세포가 없는 일반 배양액의 웰에서는 형광간섭이 풀리지 않았지만 HeLa 세포가 분주되어있는 배양액의 웰에서는 배양시간이 경과할수록 형광간섭이 풀려 형광을 띄는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 본 발명의 나노미립구에 에스터레이즈(esterase)를 처리하여 에스터 결합을 가수분해 한 경우, 에스터레이즈의 처리 농도 및 배양 시간에 비례하여 형광간섭이 풀리는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 본 발명에서 제조한 나노미립구의 경우, 암세포에 표적 및 축적되면 암세포의 효소작용에 의해 형광간섭이 풀리고, 이후 근적외선 파장의 빛을 조사하면 광감작제에 의해 암세포를 사멸시키는 과정을 통해 암을 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
<
실험예
7>
본 발명에 따른
나노미립구의
동물 내에서의 작용 확인
상기 실시예 1에서 수득한 본 발명의 나노미립구와 개질되지 않은 광감작제(pheo-A)가 실제 동물 내에서 어떠한 작용을 하는지 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, Balb/c 누드마우스(6주령)를 사용하여 등부분에 각각 본 발명의 나노미립구와 개질되지 않은 광감작제를 피하주사 하였고, 이때 주사제의 농도는 광감작제의 농도에 맞춰 각각 2㎍/ml씩 사용하였다. 주사 후, KODAK 이미지 스테이션으로 시간에 따른 형광간섭 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 개질화되지 않은 pheo-A의 경우, 완벽하게 형광간섭을 일으키지 못해 형광을 나타내는 반면, 본 발명에 따른 나노미립구는 완벽한 형광간섭을 일으켜 초기에는 형광을 나타내지 않다가 시간이 지남에 따라 생체 내에서 분해되어 형광세기가 변화되는 것으로 나타났으며, 특히 한곳에서 3주 동안이나 머무르면서 서서히 분해가 이루어짐을 확인할 수 있었다.
<
실험예
8>
본 발명에 따른
나노미립구의
세포내에서의
위치 확인
나아가 본 발명자들은 압세포 표적물질로 엽산을 이용한 본 발명의 나노미립구의 경우, 암세포의 표적화, 즉 암세포 내에서의 축적 위치 및 축적율을 관찰하기 위해, 상기 실시예 1에서 1.25㎍/ml의 pheo-A를 사용하여 제조된 나노미립구 및 대조군으로 개질화 되지않은 pheo-A를 각각 분주된 HeLa 세포(1 x 105 세포수)에 처리한 후, 시간에 따른 세포내 위치를 공초점현미경을 통해 관찰하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 나노미립구 및 개질화 되지않은 pheo-A는 세포내에서 각각 다른 부위에 위치하는 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 암세포의 경우, 세포 표면에 엽산수용체가 과발현되어 있기 때문에 엽산수용체를 통해 세포내로 흡수되는 반면, 통상의 광감작제의 경우에는 수용체가 아닌 다른 기작을 통해 세포내로 흡수된다는 사실을 알 수 있어으며, 나아가 본 발명의 나노미립구를 사용하였을 경우, 개질화 되지않은 pheo-A을 사용한 것에 비해 암세포내로 더 많이 축적된다는 사실을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (13)
- 생체 적합성 고분자와 광감작제가 에스터 본드(ester bond)로 결합하고 있고, 상기 생체 적합성 고분자는 암세포 표적물질과 결합되어 구성된 광역학 진단 또는 치료용 결합체.
- 제1항에 있어서,
상기 생체 적합성 고분자는 친수성의 플루란(pullulan) 또는 히알루론산(hyaluronic acid) 유도체인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체. - 제1항에 있어서,
상기 암세포 표적물질은 엽산, 또는 CD133, CD44, CD34 및 Bcl-2으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 단백질에 대한 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체. - 제1항에 있어서,
상기 광감작제는 포피린류(phophyrins), 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins) 및 포피센류(porphycenes)로 이루어진 군 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체. - 제4항에 있어서,
상기 광감작제는 근적외선에서 형광을 띄며, 소수성이고, COOH기를 갖는 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체. - 제5항에 있어서,
상기 광감작제는 페어포비드 a(pheophorbide a)인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체. - 제1항에 있어서,
상기 결합체는 혈액순환시 또는 정상조직에서는 세포독성을 나타내지 않고, 암조직 또는 암세포에만 선택적으로 표적, 축적 및 분해되어, 근적외선 파장의 빛을 조사하면 단일항산소 또는 자유라디칼을 생성하여 세포독성을 나타내는 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체. - 제7항에 있어서,
상기 결합체가 암조직 또는 암세포에서 표적 및 축적되면 생체내 효소에 의해 에스터 본드와 고분자 연결부분이 절단되고 형광간섭이 풀려 형광을 띄는 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체. - 생체 적합성 고분자를 유기용매에 용해시키는 단계;
상기 용해된 용액에 암세포 표적물질과 촉매를 첨가하여 생체 적합성 고분자와 암세포 표적물질을 에스터 본드(ester bond)로 결합시키는 단계;
상기 에스터 본드(ester bond)로 결합된 물질에 유기용매에 용해된 광감작제와 촉매를 첨가하여 상기 광감작제를 생체 적합성 고분자에 에스터 본드로 결합시키는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제조하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 생체 적합성 고분자는 친수성의 플루란(pullulan) 또는 히알루론산(hyaluronic acid) 유도체인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제조하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 광감작제는 포피린류(phophyrins), 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins) 및 포피센류(porphycenes)로 이루어진 군 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제조하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 촉매는 4-하이드록시메칠벤조익에시드(4-hydroxymethylbezoic acid;DMAP) 또는 1,3-디사이클로 헥실카보디미드(1,3-dicyclohexyl carbodiimide;DCC)인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제조하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 암세포 표적물질은 엽산, 또는 CD133, CD44, CD34 및 Bcl-2로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 단백질에 대한 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체를 제조하는 방법.
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| KR1020100020279A KR101188979B1 (ko) | 2010-03-08 | 2010-03-08 | 광역학 진단 또는 치료를 위한 생체 적합성 고분자와 광감작제의 결합체 및 이의 제조방법 |
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