KR102238174B1 - 후코이단 기반의 쎄라그노시스 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 후코이단 기반의 쎄라그노시스 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 본 발명은 형광염료 또는 광감각제와 후코이단의 결합체를 이용함으로써 암 또는 혈관질환 병소를 형광영상 진단할 수 있을 뿐 아니라 치료 효과도 동시에 얻을 수 있는 쎄라그노시스 조성물의 제조 및 그 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 형광염료 또는 광감각제가 공유결합으로 후코이단에 연결된 결합체는 종양 조직 및 안과 혈관질환의 형광영상 진단에 유용할 뿐 아니라, 암세포 및 관상동맥 평활근 세포에 대한 치료 효과 및 안과 질환에서의 신생혈관 생성 억제 효과를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 결합체에서 광역학 치료를 추가로 시행할 시에는, 부작용은 낮으면서도 암 및 혈관질환은 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

후코이단 기반의 쎄라그노시스 조성물 {Fucoidan-based Theragnostic Composition}
본 발명은 후코이단 기반의 쎄라그노시스 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 본 발명은 형광염료 또는 광감각제와 후코이단의 공유결합된 결합체를 이용함으로써 암 또는 혈관질환 병소를 형광영상 진단할 수 있을 뿐 아니라 치료 효과도 동시에 얻을 수 있는 쎄라그노시스 조성물의 제조 및 그 용도에 관한 것이다.
진단과 치료는 질병의 임상 적용에서 두가지 주요 범주이며, 최근에 치료제에 영상기능을 활용한 진단(diagnosis)과 치료(therapy)를 동시에 수행하는 기술인 쎄라그노시스(theragnosis) 개념이 도입되었다.
광역학 치료법(photodynamic therapy: PDT)에 사용되고 있는 광감각제(photosensitizer)는 특정 파장의 빛을 흡수하여 형광신호를 발생하는 특성이 있어서 이를 이용하여 질병 병소의 형광영상 진단에 사용하거나, 빛을 쪼여준 부위에서만 발생하는 반응성 산소종인 일항 산소(singlet oxygen) 또는 자유 라디칼(free radical)을 이용하여 표적으로 하는 세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있으면서도 항암제등에서 보이는 부작용은 최소화 할 수 있는 장점이 있다. 광역학 치료법은 20세기 초부터 활발한 연구가 진행되어 현재에 이르러는 암의 진단과 치료, 안과 질환 치료, 동맥경화 등의 혈관질환의 치료, 여드름 및 치과질환 치료에 사용되고 있고, 자가 골수 이식, 항생제, AIDS 치료, 피부이식 수술이나 관절염 등의 치료에 대한 면역성을 높이기 위해 사용되고 있어 그 응용 범위는 점차 확대되고 있다. 최근 들어서는, 광역학 치료를 면역치료와 접목시킴으로써, 빛을 쪼여주지 않은 곳에 존재하는 전이된 암(metastatic cancer)까지도 치료 할 수 있는 가능성이 열리고 있다. 기술의 발달로 최근에는 광감각제를 음파역동 치료(sonodynamic therapy)를 위한 치료제로 사용함으로써, 기존의 광역학 치료로 치료하기가 어려웠던 인체 내 깊숙이 위치한 종양의 치료도 가능해 지고 있다. 또한, 근적외선 형광염료를 이용하여 각종 질환 병소의 선택적 형광영상 진단 기술이 개발되고 있고 임상에 적용되고 있는데, 광감각제도 특정 파장의 빛을 쪼여주었을 때에 강한 형광신호를 발생하므로 이러한 특성을 이용하여 암 등의 질환 병소의 형광영상 진단에 적용하려는 노력도 활발하게 이루어지고 있다.
종래에 사용되던 광역학 진단 또는 치료용 광감각제의 경우, 소수성(hydrophobic)을 띠고 있어서, 정맥 주사를 통하여 환자에 투여된 후에는 암조직 외에도 피부를 포함한 정상조직에 비특이적 축적이 일어난다. 이것은 표적-대비-배경 잡신호 (target-to-background) 비율을 저하시켜서 종양부위의 영상 진단을 어렵게 할 뿐 아니라, 광역학 치료 시 주변의 중요한 정상조직에도 손상을 줄 수 있는 위험성이 있다. 뿐만 아니라, 광역학 치료를 받은 환자가 햇빛 등의 밝은 빛에 노출이 되면 피부에 축적이 되어있던 광감각제로부터 반응성 산소 생성이 활성화 되면서 피부 광민감성 (skin photosensitivity) 부작용을 일으키게 된다. 이러한 이유로 광역학 치료 후에 환자는 피부 등의 정상조직에 축적된 광감각제가 없어질 때까지 어두운 실내에 최소 6주 동안 머무르도록 권고 받고 있고, 이것은 환자에게 불편을 초래하고 있다. 광감각제의 친수성을 증가시킴으로써 피부 광민감성 문제를 해결하고자 하는 시도가 있으나, 이 경우에는 정맥 투여된 광감각제의 많은 양이 소변을 통하여 빠르게 배출되기 때문에, 치료에 충분한 양의 광감각제가 종양조직에 축적되기 위해서는 높은 용량의 광감각제를 투여해 주여야 하는 단점이 있다.
광감각제를 키토산(chitosan), 글라이콜 키토산(glycol chitosan), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리-L-라이신, 카스복시 메틸 덱스트란 (carboxymethyl dextran)과 같은 친수성 고분자에 공유결합을 통하여 결합시키는 경우에는, 광감각제를 수용액 상에서 안정적으로 분산시킬 수 있으면서도 종양에 대한 축적 효율은 높이는 효과를 얻을 수 있다. 그러나, 이러한 친수성 고분자-광감각제와 결합체는 광감각제의 친수성 향상에는 도움을 주지만, 암세포 또는 기타 질병과 관련된 세포에 대한 특이적 표적 성능(target specificity)은 없기 때문에, 표적 세포에 대한 특이성을 갖기 위해서는 엽산(folic acid)이나 항체(antibody) 또는 압타머(aptamer)와 같은 표적 리간드를 고분자에 추가로 결합(conjugation) 시켜 주어야만 했다. 이 경우, 제조를 위한 과정(step)과 비용이 증가하고 결합체의 대량 생산이 어려워진다. 뿐만 아니라, 친수성 고분자와 광감각제 결합체에서 70% 이상의 질량을 친수성 고분자가 차지하고 있음에도, 치료 효과는 광감각제에 의해서만 얻을 수 있고, 친수성 고분자 자체는 암세포 등에 대한 치료 효과가 없기 때문에, 질량 대비 얻을 수 있는 치료 효과가 낮을 뿐 아니라, 고분자-광감각제 결합체가 전달된 부위에 빛이 닿지 못하는 경우에는 광역학 치료 효과를 얻지 못한다는 커다란 단점이 있다.
또한, 특정 세포를 표적할 수 있는 리간드가 결합(conjugation)되어 있는 형광염료와 친수성 고분자의 결합체(즉, 리간드-형광염료-친수성 고분자 결합체)를 이용하여 암 등의 병소를 영상진단 하고자 하는 시도들이 있는데, 이러한 경우에는 표적 부위에 대한 영상 진단 기능만 얻을 수 있을 뿐 치료 효과를 얻기 위해서는 고분자에 약물을 추가로 결합(conjugation) 또는 탑재(loading)하여야 하는 복잡한 과정을 필요로 한다.
대한민국공개특허 제10-2017-0048202호 대한민국공개특허 제10-2008-0095182호
상기 문제점을 극복하기 위해 본 발명자들은, 후코이단을 이용하여 광감각제 또는 형광염료와 공유 결합된 결합체(conjugate)를 제조함으로써, 상기 결합체가 형광 영상 및 광역학 치료를 동시에 달성할 수 있도록 해줄 뿐만 아니라, 후코이단의 치료 효과 및 표적 특이성 효과까지 함께 얻을 수 있도록 하여, 이전에 기대할 수 없었던 향상된 치료효과를 얻을 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 후코이단과 형광 염료 또는 후코이단과 광감각제가 공유결합을 통해 결합되어있는 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 결합체를 이용하여 암 및 혈관관련 질환 , 예컨대, 동맥경화반 또는 노인성 황반변성 및 녹내장 등의 안과질환에 대하여, 부위의 실시간 형광영상 진단 뿐 아니라, 이러한 질환에 대한 치료 효과를 가질 수 있는 형광영상 진단용 조성물 및 광역학 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
상기한 바와 같은 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 후코이단과 광감각제 또는 형광염료가 공유결합으로 연결된 결합체, 및 이를 포함하는 형광 영상 진단용 조성물 또는 광역학 치료용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
일 관점에서, 본 발명은 광감각제 또는 형광염료가 후코이단과 공유결합된 결합체에 관한 것이다. 여기서, 결합체는 컨쥬게이트, 접합체와 동일한 의미를 포함한다.
일 관점에서, 본 발명은 후코이단 및 형광염료가 공유결합으로 연결된 형광염료-후코이단 결합체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 후코이단의 카르복시기와 형광염료의 아민기를 커플링제를 이용하여 공유결합시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 형광염료는 시아닌(cyanine), 로다민(rhodamine), 쿠마린(cumarine), 에보블루(EvoBlue), 옥사진(oxazine), 보디피(BODIPY), 카보피로닌, 나프탈렌, 비페닐, 안트라센류, 페난트렌, 피렌, 카바졸 또는 상기 염료를 기본골격으로 하는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광염료인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광염료는 플루오레세인 (Fluorescein), CR110 : 카복시로다민 110 : 로다민 그린(상표명), TAMRA : 카복시테트라메틸로다민 : TMR, 카복시로다민 6G : CR6G, BODIPY FL(상표명) : 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 493/503(상표명) : 4,4-디플루오로-1,3,5,7-테트라메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-8-프로피온산, BODIPY R6G(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3-부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 558/568(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 564/570(상표명) : 4,4-디플루오로-5-스티릴-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 576/589(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(2-피롤릴)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 581/591(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3-부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, EvoBlue10(상표명), EvoBlue30(상표명), MR121, ATTO 655(상표명), ATTO 680(상표명), ATTO 700(상표명), ATTO MB2(상표명), Alexa Fluor 350(상표명), Alexa Fluor 405(상표명), Alexa Fluor 430(상표명), Alexa Fluor 488(상표명), Alexa Fluor 532(상표명), Alexa Fluor 546(상표명), Alexa Fluor 555(상표명), Alexa Fluor 568(상표명), Alexa Fluor 594(상표명), Alexa Fluor 633(상표명), Alexa Fluor 680(상표명), Alexa Fluor 700(상표명), Alexa Fluor 750(상표명), Alexa Fluor 790(상표명), Flamma 496(상표명), Flamma 507(상표명), Flamma 530(상표명), Flamma 552(상표명), Flamma 560(상표명), Flamma 575(상표명), Flamma 581(상표명), Flamma 648(상표명), Flamma 675(상표명), Flamma 749(상표명), Flamma 774(상표명), Flamma 775(상표명), Rhodamine Red-X(상표명), Texas Red-X(상표명), 5(6)-TAMRA-X(상표명), 5TAMRA(상표명), Cy5TM, Cy5.5TM, Cy7TM 또는 Licor NIRTM,IRDye38TM,IRDye78TM, IRDye80TM, LaJolla BlueTM, Licor NIRTM, Indocyanine green (ICG) 및 ZW800-1C으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 후코이단 대 형광염료의 결합비율은 1:2 내지 1:4가 바람직하며, 이보다 더 많은 형광염료를 결합시키는 경우에는 표적으로 하는 세포내에서 분해가 될 수 있는 연결자를 통하여 후코이단과 형광염료를 결합시키는 것이 바람직하다.
상기 본 발명에 따른 형광염료-후코이단 결합체는, 이에 제한되는 것은 아니나, 후코이단을 완충용액에 용해시키는 단계(제1단계); 상기 제1단계 용해물에 커플링제를 첨가하고 교반하는 단계(제2단계); 상기 제2단계의 반응혼합물을 분리한 후 근적외선 형광염료를 첨가하고 교반하는 단계(제3단계); 및 상기 제3단계의 반응혼합물을 증류수에서 투석한 후, 동결 건조하여 근적외선 형광염료가 공유 결합된 형광염료-후코이단 결합체를 수득하는 단계(제4단계)를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 형광염료-후코이단 결합체는 결합체 형성 후에도 P-selectin과 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor)에 대한 높은 결합력(binding specificity)를 얻을 수 있기 때문에, 암세포, 동맥경화반 및 안과 질환에서의 신생혈관 형성 부위, 및 혈소판 풍부 혈전의 형광영상 진단이 가능하다.
따라서, 본 발명은 상기 형광염료-후코이단 결합체를 포함하는 형광 영상 진단용 조성물에 관한 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 후코이단 및 광감각제가 공유결합으로 연결된 광감각제-후코이단 결합체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 후코이단의 카르복시기에 이황화결합(disulfur) 또는 이셀레늄화결합(diselenium)을 포함하는 연결자를 이용하여 광감각제와 후코이단이 결합되어 있는 것이다.
이러한 광감각제로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 헤마토포피린(hematoporphyrins), 포피센(porphycenes), 페오포바이드(pheophorbides), 퍼퓨린(purpurins), 클로린(chlorins), 프로토포피린(protoporphyrins), 프탈로시아닌(phthalocyanines)으로 이루어진 군에서 선택된 포피린계 화합물; 및 하이페리신(hypericin), 로다민(rhodamine), 아토(ATTO), 로즈벵갈(rose Bengal), 프소랄렌(psoralen), 페노씨아지늄(phenothiazinium) 계열 염료 및 메로시아닌(merocyanine)으로 이루어진 군에서 선택된 비포르피린계 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 본 발명에 따른 광감각제-후코이단 결합체는, 이에 제한되는 것은 아니나, 후코이단을 완충용액에 용해시키는 단계(제1단계); 상기 제1단계 용해물에 커플링제를 첨가하고 교반하는 단계(제2단계); 상기 제2단계 반응혼합물에 이황화(disulfur) 또는 이셀레늄화(diselenium) 결합을 포함하고 있는 연결자(링커)를 첨가하고 교반하는 단계(제3단계); 상기 제3단계의 반응혼합물을 증류수에서 투석한 후, 동결 건조하여 아민기를 갖는 후코이단 유도체를 수득하는 단계(제4단계); 및 광감각제를 유기용매에 용해시키고, 여기에 커플링제를 첨가하고 교반하는 단계(제5단계); 상기 아민기를 갖는 후코이단 유도체와 상기 제5단계 반응용액을 혼합하여 반응시키는 단계(제6단계); 상기 제6단계의 반응혼합물을 인산완충액 및 증류수에서 투석한 후, 동결 건조하여 광감각제와 후코이단이 연결자를 통하여 공유 결합된 광감각제-후코이단 결합체를 수득하는 단계(제7단계)를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 광감각제-후코이단 결합체는 후코이단 고분자 자체가 암세포 또는 평활근 세포(smooth muscle cells)에 대하여 직접적인 세포독성을 보이거나, 혈관 상피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)와 후코이단의 결합(binding)에 의한 암 성장 억제 또는 안과 질환에서의 신생혈관 형성억제 효과를 추가로 얻음으로써, 후코이단 자체에 의한 치료효과와 광감각제를 이용한 광역학 치료 효과를 동시에 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 광감각제-후코이단 결합체는 또한, 암세포, 동맥경화반 및 신생혈관의 내피세포 (endothelial cells)에 대한 형광영상 진단 효능을 얻을 수 있을 뿐 아니라, 혈관 재협착을 일으키는 주요 요인인 평활근 세포의 증식을 효과적으로 억제 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 광감각제-후코이단 결합체를 포함하는 형광영상 진단용 조성물 또는 광역학 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 커플링제는 분자 내, 분자간 또는 양자 모두에 존재하는 둘 이상의 작용기 사이의 결합을 촉진시키거나 형성할 수 있는 시약을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 커플링제는 바람직하게는 N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)와 N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt (sulfo-NHS)를 사용할 수 있다.
형광염료-후코이단 및 광감각제-후코이단 결합체를 제조함에 있어서, 커플링제를 이용하여 후코이단의 카르복시기를 아민, 싸이올, 아자이드, 또는 알킨 등의 작용기로 변환 시킨 후에, 형광염료 또는 광감각제와 결합체를 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 후코이단에 알킨 또는 아자이드기가 도입될 경우, 아자이드(azide)와 알킨(alkyne) 간의 반응인 클릭 화학(click chemistry)을 통하여 형광염료 또는 광감각제가 결합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 광역학 진단 또는 치료용 결합에 사용되는 광감각제는 당해 분야에서 통상의 기술자가 적용할 수 있는 광감각제가 적용될 수 있다. 예를 들어, 포르피린류(porphyrins), 클로린류(chlorins), 페오포바이드류(pheophorbides), 박테리오클로린류(bacteriochlorins), 포피센류(porphycenes), 프탈로시아닌(phthalocyanines)으로 이루어진 군에서 선택된 포피린계 화합물; 또는 하이페리신(hypericin), 로다민(rhodamine), 로즈벵갈(rose bengal), 프소랄렌(psoralen), 페노씨아지늄(phenothiazinum) 계열 염료 및 메로시아닌(merocyanine)으로 이루어진 군에서 선택된 비포피린계 화합물로 이루어진 군 중에서 사용될 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 보다 구체적으로는 유리염기 또는 금속 착물 형태의 헤마토포피린(hematoporphyrins), 포피센(porphycenes), 페오포바이드(pheophorbides), 퍼퓨린(purpurins), 클로린(chlorins), 프로토포피린(protoporphyrins), 프탈로시아닌(phthalocyanines)으로 이루어진 군에서 선택된 포피린계 화합물; 또는 하이페리신(hypericin), 로다민(rhodamine), 아토(ATTO), 로즈벵갈(rose Bengal), 프소랄렌(psoralen), 페노씨아지늄(phenothiazinium) 계열 염료 및 메로시아닌(merocyanine)으로 이루어진 군에서 선택된 비포르피린계 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 단독 또는 복합적으로 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 광감각제 또는 형광염료와 후코이단을 공유 결합으로 연결하는 연결자는 길이가 0인(zero-length) 연결자, 즉, 형광염료 또는 광감각제의 아민기와 후코이단의 카르복시기가 연결된 아마이드 결합, 탄소결합, 이황화(disulfur) 또는 이셀레늄화(diselenium) 결합을 포함하고 있을 수 있다. 본 발명에 따른 연결자는 양 말단에 아민기를 가질 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 연결자의 아민기는 후코이단의 카복시기와 공유 결합하여 연결자가 공유 결합된 후코이단 결합체를 형성한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 연결자는 EDC-NHS와 같은 커플링제, 셀레노시스타민(selenocystamine), 디셀레노디프로피오닉엑시드(diselenodipropionic acid), 셀레노시스틴(selenocystine), 시스틴(cystine), 시스타민(cystamine) 및 이의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 광감각제는 하기로 표시되는 클로린(chlorin) 기반 광감각제인 클로린 e6일 수 있다. 상기 클로린 e6의 카르복시기는 상기 연결자가 공유 결합된 후코이단 결합체의 아민기와 공유 결합하여 광감각제-후코이단 결합체를 형성한다.
Figure 112020054770582-pat00001
본 발명에 따르면, 상기 연결자가 공유 결합된 후코이단 결합체는 표적으로 하는 세포 내로 섭취되고, 세포 내부에 과량으로 존재하는 환원제인 글루타치온(glutathione)에 의해서 이황화 또는 이셀레늄화 결합이 끊어지면서, 후코이단에 결합되어 있던 광감각제 또는 형광염료가 표적 세포 내에서 방출(release)될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 광감각제-후코이단 결합체를 함유하는 광역학 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 형광염료 또는 광감각제 후코이단 결합체는 P-selectin 과발현 세포를 특이적으로 표적화하여 치료 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명에 따른 형광염료 또는 광감각제 후코이단 결합체로 진단/치료될 수 있는 질환에는 말단흑자성 흑색종, 광선각하증, 선암종, 선양낭성 암종, 선종, 선육종, 선인상 암종, 아스트로사이틱(astrocytic) 종양, 글루카곤종, 혈관아세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간선종, 간선종증, 간세포암종, 인슐린종, 상피간 신생물, 상피간 편평세포 신생물, 침습성 편평세포 암종, 대세포 암종, 평활근육종, 악성흑점흑색종, 악성흑색종, 악성중피종양, 수모세포종, 수질상피종과 같은 종양 질환, 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 난소암, 자궁경부암과 같은 암 질환을 포함하나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 형광염료 또는 광감각제 후코이단 결합체로 치료될 수 있는 다른 질환에는 겸상 적혈구 질환, 동맥 혈전증, 류마티스성 관절염, 허혈 및 재관류, 동맥경화반, 스텐트 시술 후 발생하는 혈관 재협착, 노인성 황반변성 및 녹내장 등의 안과질환, 여드름 및 치과질환을 포함한다.
본 발명에 따른 형광 영상 진단용 조성물 또는 광역학 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체란 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 광역학 치료용 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 형광 영상 진단용 조성물 또는 광역학 치료용 조성물은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 형광 영상 진단용 조성물 또는 광역학 치료용 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여 하거나 비경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
본 발명에 따른 후코이단-형광염료 결합체 또는 후코이단-광감각제 결합체는 광감각제 또는 형광염료가 물에 잘 녹을 수 있도록 해주고, 형광영상 및 광역학 치료가 효과적으로 이루어 질수 있도록 해줄 뿐 아니라, 후코이단 고분자 자체에 의한 치료 효과 또는 P-selectin 과발현 세포에 대한 표적 특이성(target specificity) 효과를 얻을 수 있다. 본 발명에 따르면 후코이단 고분자 자체가 암세포 또는 평활근 세포(smooth muscle cells)에 대하여 직접적인 세포독성을 보이거나, 혈관 상피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)와 후코이단의 결합(binding)에 의한 암 성장 억제 또는 안과 질환에서의 신생혈관 형성억제 효과를 추가로 얻음으로써, 기존의 광감각제 또는 형광염료와 친수성 고분자에서는 기대할 수 없었던 향상된 치료효과를 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 광감각제-후코이단 결합체는 암세포, 동맥경화반 및 신생혈관의 내피세포(endothelial cells)에 대한 형광영상 진단 효능을 얻을 수 있을 뿐 아니라, 후코이단 자체에 의한 치료효과와 광감각제를 이용한 광역학 치료 효과를 동시에 얻을 수 있다. 혈관 확장을 위하여 스텐트를 장착시킨 부위는 시간이 지나면 평활근 세포(smooth muscle cells)의 증식으로 인하여 혈관 재협착(restenosis)이 발생하게 되는데, 본 발명에 따른 광감각제-후코이단 결합체를 사용하면 혈관 재협착을 일으키는 주요 요인인 평활근 세포의 증식을 효과적으로 억제 할 수 있다.
본 발명에 따른 형광염료-후코이단 결합체는 결합체 형성 후에도 P-selectin과 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor)에 대한 높은 결합력(binding specificity)을 얻을 수 있기 때문에, 암세포, 동맥경화반, 및 안과 질환에서의 신생혈관 형성 부위의 형광영상 진단이 가능할 뿐 아니라, 후코이단에 의한 치료효과도 얻을 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 따른 형광염료-후코이단 결합체는 및 광감각제-후코이단 결합체는 종양 조직 및 안과 혈관질환의 형광영상 진단에 유용할 뿐 아니라, 암세포 및 관상동맥 평활근 세포에 대한 치료 효과 및 안과 질환에서의 신생혈관 생성 억제 효과를 얻을 수 있다. 또한, 광감각제-후코이단 결합체에서 광역학 치료를 추가로 시행할 시에는, 부작용은 낮으면서도 암은 효과적으로 치료할 수 있다.
도 1은 후코이단 기반 형광염료 또는 광감각제 결합체의 개략도이다. 광감각제 또는 형광염료는 연결자(linker)를 통하여 후코이단과 공유결합으로 결합되어 있으며, 연결자는 아마이드 결합, 탄소결합, 이황화 또는 이셀레늄 결합이 포함되어 있는 것일 수도 있다.
도 2는 아민(amine)그룹을 갖고 있는 형광염료와 후코이단의 결합체(conjugate)를 합성하는 모식도. 커플링제(coupling agent)인 EDS와 NHS를 사용하여 형광염료-후코이단 결합체를 제조하였다.
도 3은 제조된 Flamma774-Fucoidan 결합체의 광학 특성을 (A) UV-Vis 흡광 및 (B) 형광 스펙트럼을 통해 확인한 자료이다.
도 4는 (A) 후코이단과 (B) 제조된 Flamma774-Fucodian 결합체를 FT-IR 분석을 통해 확인한 자료이다.
도 5는 (A) 후코이단과 (B) 제조된 Flamma774-Fucoidan 결합체를 1H-NMR 분석을 통해 확인한 자료이다.
도 6은 제조된 ATTO655-Fucoidan 결합체의 광학 특성을 (A) UV-Vis 흡광 및 (B) 형광 스펙트럼을 통해 확인한 자료이다.
도 7은 근적외선 형광염료 ZW800 염료를 후코이단에 결합하여 ZW800-Fucoidan 결합체를 합성하는 방법에 대한 개략도이다.
도 8A는 ZW800-Fucoidan 결합체를 비율에 따라 1:2로 반응한 경우의 광학 특성을 UV-Vis 흡광 및 형광 스펙트럼을 통해 확인한 자료이다.
도 8B는 ZW800-Fucoidan 결합체를 비율에 따라 1:4로 반응한 경우의 광학 특성을 UV-Vis 흡광 및 형광 스펙트럼을 통해 확인한 자료이다.
도 9는 제조된 ZW800-Fucoidan 결합체들 및 후코이단 자체와 혈관 상피성장인자 (VEGF165) 리간드의 결합 친화도를 surface plasmon resonance (SPR) 분석을 통해 확인한 자료이다.
도 10은 제조된 ZW800-Fucoidan 결합체 및 후코이단 자체와 P-selectin 과의 결합 친화도를 surface plasmon resonance (SPR) 분석을 통해 확인한 자료이다.
도 11은 제조된 FSD750-Fucoidan 결합체의 광학 특성을 (A) UV-Vis 흡광 및 (B) 형광 스펙트럼을 통해 확인한 자료이다.
도 12는 광감각제인 chlorin e6 (Ce6)를 이황화결합 (disulfide bond, -S-S-)이 포함된 연결자를 통하여 후코이단과 결합시킨 Ce6-Fucoidan 결합체를 만들고, 이 물질을 자가응집(self assembly)을 통해 나노 미터 크기의 광역학 진단 및 치료용 나노입자가 됨을 보여주는 합성 개략도이다.
도 13A는 제조된 Ce6-Fucoidan (후코이단 분자량 18 kDa) 결합체의 수용액상 크기분포 (hydrodynamic size)를 나타낸 그래프이다.
도 13B는 제조된 Ce6-Fucoidan (18 kDa) 결합체의 용매에 따른 UV-Vis 흡광 스펙트럼이다.
도 13C는 제조된 Ce6-Fucoidan (18 kDa) 결합체의 용매에 따른 형광 스펙트럼이다.
도 14A는 제조된 Ce6-Fucoidan (후코이단 분자량 100 kDa) 결합체의 수용액상 크기분포 (hydrodynamic size)를 나타낸 그래프이다.
도 14B는 제조된 Ce6-Fucoidan (100 kDa) 물질의 형태를 투과전자현미경 (transmission electron microscope)로 분석한 사진이다.
도 15A는 제조된 Ce6-Fucoidan (100 kDa) 결합체의 용매에 따른 UV-Vis 흡광 스펙트럼이다.
도 15B는 제조된 Ce6-Fucoidan (100 kDa)결합체의 용매에 따른 형광 스펙트럼이다.
도 15C는 제조된 Ce6-Fucoidan (100 kDa)에 글루타치온 (glutathione; GSH)을 0 μM, 5 μM, 5 mM 농도로 각각 처리하고 얻은 형광 스펙트럼이다.
도 15D는 제조된 Ce6-Fucoidan (100 kDa)에 글루타치온 (glutathione; GSH)를 0 μM, 5 μM, 5 mM 농도를 4시간 처리하고, 670 nm 빛을 조사하면서 일항산소 생성량을 측정한 자료이다. 일항산소가 발생함에 따라서 일항산소 검출 시약 (singlet-oxygen-detecting reagent, SOSG)의 형광이 증가한다.
도 16은 자유 광감각제 (free Ce6)와 제조된 Ce6-Fucoidan 결합체의 1H-NMR 분석 결과이다.
도 17은 광감각제-후코이단 결합체인 Ce6-Fucoidan과 자유 광감각제 (free Ce6)를 암세포에 동일 농도로 처리한 후에 얻은 공초점 형광 현미경 사진이다. Ce6-Fucoidan 결합체가 암세포내로 훨씬 더 잘 섭취가 될 수 있음을 확인하였다.
도 18A는 Ce6-Fucoidan 결합체와 자유 광감각제의 암세포에 여러 가지 농도로 처리하고 세포 생존율 분석한 결과이다. 빛 조사 없이도 결합체 자체에 의한 치료 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
도 18B는 Ce6-Fucoidan 결합체와 자유 광감각제를 암세포에 처리한 후에 670 nm 레이져를 이용하여 광역학 치료를 시행하였을 때의 세포 생존율을 분석한 결과이다. 빛 조사에 의하여 매우 향상된 암 치료 효과를 얼을 수 있었다.
도 19A는 Ce6-Fucoidan 결합체를 정맥 주사후 5분 및 24시간 후에 얻은 근적외선 형광영상 결과이다. Ce6-Fucoidan 결합체를 투여한 경우에는 암조직의 위치를 형광영상으로부터 진단할 수 있음을 알 수 있다.
도 19B는 종양-대-배경 신호비 값을 정량 분석한 결과이다.
도 19C는 Ce6-Fucoidan 결합체 투여 24시간이후 종양과 주요 장기(major organs)들을 채취하여 형광영상을 촬영한 결과이다. 종양 조직에 Ce6-Fucoidan 결합체가 축적이 되었음을 알 수 있다.
도 19D는 Ce6-Fucoidan 결합체투여 24시간이후, 종양을 절개하여 동결절편을 제작하여 공초점현미경으로 형광 영상을 촬영한 결과이다. Ce6-Fucoidan 결합체를 투여한 종양에서 광감각제의 농도가 높게 존재함을 알 수 있다.
도 20A는 광감각제-후코이단 결합체인 Ce6-Fucoidan 결합체를 이용한 항종양효과를 나타낸 결과이다. Ce6-Fucoidan 결합체를 정맥 투여한 경우에, 빛을 조사하지 않더라도 의미있는 항암 효과를 얻을 수 있음을 알수 있으며, 종양에 빛을 조사시에는 매우 높은 암 치료 효과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
도 20B는 Ce6-Fucoidan 결합체와 광역학치료 병합처리 후 24시간째에 종양조직을 절개하여 절편을 만든 후에, CD31 염색으로종양 조직내 혈관의 분포를 확인하고 TUNEL 염색으로 세포고사 (cell apoptosis) 효과를 확인한 결과이다.
도 21A는 10일째에 각 실험군 마우스의 주요 장기를 절취하고 H&E 염색을 통하여 독성이 있는지를 확인한 결과이다.
도 21B는 각 실험군에 대한 마우스 몸무게 변화를 측정한 결과이다.
도 22A는 Ce6-Fucoidan 결합체와 자유 광감각제를 관상동맥 평활근세포에 여러 농도로 처리하고 세포 생존율을 분석한 결과이다.
도 22B는 Ce6-Fucoidan 결합체와 자유 광감각제를 관상동맥 평활근세포에 여러 농도로 처리하고, 670 nm 레이져를 이용하여 광역학 치료를 시행한 후에 세포 생존율을 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되어지는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
[실시예 1] Flamma774-Fucoidan 결합체의 제조
Bioacts사의 근적외선 형광염료인 Flamma774의 아민기와 후코이단의 카르복시기를 커플링제를 이용하여 공유결합체를 합성하였다. Flamma774-amine은 몰질량 971.15 g/mol, 최대 여기 파장 774 nm, 최대 방출 파장 806 nm를 갖는 형광물질이다. 근적외선 형광 염료 결합체는 생체 조직에 대한 투과성이 높기 때문에 약물전달, 종양연구 등에서 생체 영상화를 위해 사용될 수 있다. 후코이단은 Fucus vesiculosus에서 추출한 분자량 18,000 Da의 씨그마알드리치 제품을 사용하였다.
후코이단에 형광염료를 결합시키기 위하여 다양한 커플링제를 사용할 수 있는데, 여기에서는 N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)와 N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt (sulfo-NHS)를 사용하여 염료를 활성화시켜 후코이단-NHS ester 결합물을 얻고 여기에 Flamma774-amine를 결합하는 과정을 거쳤다. 이의 과정을 좀 더 상세히 설명하면, 후코이단 10 mg을 0.1M 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer에 녹이고 여기에 EDC 19.7 mg, sulfo-NHS 2.17 mg을 첨가하고 약 30분 동안 교반하였다. 그 다음 PD-10 컬럼을 이용하여 분리 후 Flamma774-amine 형광을 1.02 mg 첨가하고 하루 동안 교반하였다. 그 다음 증류수에서 하루 동안 투석(dialysis)하여 미반응물 및 부산물을 제거하고, 동결 건조하여 분말을 수득하여 Flamma774가 공유 결합된 형광염료-후코이단 결합체를 얻었다.
도 3의 광학측정 분석을 통해, 후코이단 한 분자당 약 3.8개의 Flamma774가 결합되었음을 확인하였다.
[실시예 2] ATTO655-Fucoidan 결합체의 제조
형광염료인 ATTO655의 아민기와 후코이단의 카르복시기를 커플링제를 이용하여 공유결합체를 형성하였다. ATTO655-amine은 몰질량 798 g/mol, 최대 여기 파장 663 nm, 최대 방출 파장 680 nm를 갖는 형광물질이다. 후코이단은 Fucus vesiculosus에서 추출한 분자량 18,000 Da의 씨그마알드리치 제품을 사용하였다.
후코이단을 N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)와 N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt (sulfo-NHS)로 활성화시켜 후코이단-NHS ester 결합물을 얻고 여기에 ATTO655-amine를 결합하는 과정을 거쳤다. 이의 과정을 좀 더 상세히 설명하면, 후코이단 10 mg을 0.1M 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer에 녹이고 여기에 EDC 19.7 mg, sulfo-NHS 2.17 mg을 첨가하고 약 30분 동안 교반하였다. 그 다음 PD-10 컬럼을 이용하여 분리 후 ATTO655-amine 형광을 0.399 mg 첨가하고 하루 동안 교반하였다. 그 다음 증류수에 대하여 하루 동안 투석하고, 동결 건조하여 분말을 수득하여 ATTO655가 공유 결합된 형광염료-후코이단 결합체를 얻었다.
도 6의 광학측정 분석을 통해, 후코이단 한 분자당 약 1.3개의 ATTO 염료가 결합되어 있음을 확인하였다.
[실시예 3] ZW800-Fucoidan 결합체의 제조
하버드 대학 최학수 교수 연구팀이 개발한 근적외선 형광염료인 ZW800의 아민기와 후코이단의 카르복시기를 커플링제를 이용하여 공유결합체를 형성하였다. ZW800-amine은 몰질량 887 g/mol, 최대 여기 파장 753 nm, 최대 방출 파장 772 nm를 갖는 근적외선 형광물질이다. 후코이단은 Fucus vesiculosus에서 추출한 분자량 18,000 Da의 씨그마알드리치 제품을 사용하였다.
후코이단을 N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)와 N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt (sulfo-NHS)로 활성화시켜 후코이단-NHS ester 결합물을 얻고 여기에 ZW800-amine를 결합하는 과정을 거쳤다. 후코이단 대 ZW800 형광염료의 반응비율을 1:2와 1:4로 각각 반응시켰다. 이의 과정을 좀 더 상세히 설명하면, 후코이단 20 mg을 0.1M 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer에 녹이고 여기에 EDC 38.34 mg, sulfo-NHS 4.34 mg을 첨가하고 약 30분 동안 교반하였다. 그 다음 PD-10 컬럼을 이용하여 분리 후, 후코이단 대 ZW800 형광염료의 반응비율이 1:2일 경우는 ZW800-amine 형광을 1.97 mg 첨가하고, 후코이단 대 ZW800 형광염료의 반응비율이 1:4일 경우는 ZW800-amine 형광을 3.94 mg 첨가하여 하루 동안 교반하였다. 그 다음 증류수에 대하여 하루 동안 투석하고, 동결 건조하여 분말을 수득함으로써 ZW800이 공유 결합된 형광염료-후코이단 결합체를 얻었다.
도 8의 광학측정 분석을 통해, 후코이단 대 ZW800 형광염료의 반응비율이 1:2인 경우, 후코이단 한 분자당 약 1.84개의 ZW800 형광염료가 결합되어 있음을 확인하였다. 후코이단 대 ZW800 형광염료의 반응비율이 1:4인 경우, 후코이단 한 분자당 약 2.88개의 ZW800 형광염료가 결합되어 있음을 확인하였다.
[실시예 4] ZW800-Fucoidan 결합체와 VEGF165 리간드의 결합 친화도
합성된 ZW800-Fucoidan 결합체와 human VEGF165 리간드와의 결합 친화도 (binding affinity)를 surface plasmon resonance (SPR)을 이용하여 분석하였다. SPR 센서 기술은 단백질과 같은 생체 물질이 센서 표면에 결합될 경우 신호 변화를 일으키는 현상을 이용하는 것으로, SPR 광학적 원리를 이용하여 특정한 표지 (형광, 방사능 외)없이 실시간으로 생체 분자 간의 상호관계 (Kinetics Affinity, Ka, Kd, KD)를 측정하는 분석법이다. SPR 분석 장비로는 Biacore T200 장비와 CM5 chip을 이용하여 분석한 후, Biaevaluation 소프트웨어를 통해 데이터 처리를 하였다.
후코이단 대 ZW800 형광염료의 반응비율이 1:2와 1:4인 ZW800-Fucoidan 결합체(1)과 (2)의 경우와, 아무것도 표지하지 않은 후코이단의 human VEGF165 리간드와 결합 친화도를 SPR assay의 equilibrium dissociation rate constant (KD)값을 통해 분석한 결과를 도 9에 보이고 있다. 1:2로 반응한 ZW800-Fucoidan 결합체의 경우 178.7 nM, 1:4로 반응한 ZW800-Fucoidan 결합체의 경우 72.42 nM, 후코이단의 경우 4.053 nM로 측정되었다. 이러한 결과는 후코이단과 형광염료의 결합체 형성 후에도 VEGF에 대하여 10-9 M단위의 강한 결합을 보여줌을 확인할 수 있다. 따라서, 형광염료-후코이단 결합체는 혈관질환의 형광영상 진단 뿐 아니라, 형광염료-후코이단 결합체가 VEGF와 결합(binding)하는 것을 통하여 안과질환 등에서의 신생혈관 억제 효과도 얻을 수 있다.
[실시예 5] ZW800-Fucoidan 결합체와 P-selectin의 결합 친화도
도 10에서는, 후코이단 대 ZW800 형광염료의 반응비율이 1:2와 1:4인 ZW800-Fucoidan 결합체(1)과 (2)의 경우와, 아무것도 표지하지 않은 후코이단의 P-selectin과 결합 친화도를 SPR assay의 equilibrium dissociation rate constant (KD)값을 통하여 분석한 결과를 보이고 있다. 1:2로 반응한 ZW800-Fucoidan 결합체의 경우 387.8 nM, 1:4로 반응한 ZW800-Fucoidan 결합체의 경우 218.8 nM, 후코이단의 경우 2.981 nM로 측정되었다. 이러한 결과는 후코이단과 형광염료의 결합체 형성 후에도 P-selectin에 대하여10-9 M단위의 강한 결합을 보여줌을 확인할 수 있다. 이러한 결과는, 형광염료-후코이단 결합체를 사용하여 P-selectin이 세포 표면에 과발현 되어있는 전이암세포 또는 동맥경화반등의 혈관성 질환 병소를 영상으로 진단할 수 있음을 말해준다.
[실시예 6] FSD750-Fucoidan 결합체의 제조
Bioacts사의 근적외선 형광물질인 FSD750의 아민기와 후코이단의 카르복시기를 공유결합시켜 공유결합체를 형성할 수 있다. FSD750-amine은 몰질량 1252.42 g/mol, 최대 여기 파장 749 nm, 최대 방출 파장 774 nm를 갖는 형광물질이다. 후코이단은 Fucus vesiculosus에서 추출한 분자량 18,000 Da의 씨그마알드리치 제품을 사용하였다.
후코이단을 N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)와 N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt (sulfo-NHS)로 활성화시켜 후코이단-NHS ester 결합물을 얻고 여기에 FSD750-amine를 결합하는 과정을 거쳤다. 이의 과정을 좀 더 상세히 설명하면, 후코이단 5 mg을 0.1M 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer에 녹이고 여기에 EDC 9.585 mg, sulfo-NHS 1.085 mg을 첨가하고 약 30분 동안 교반하였다. 그 다음 PD-10 컬럼을 이용하여 분리 후 FSD750-amine 형광을 0.695 mg 첨가하고 하루 동안 교반하였다. 그 다음 증류수에 대하여 하루 동안 투석하고, 동결 건조하여 분말을 수득하여 FSD750이 공유 결합된 형광염료-후코이단 결합체를 얻었다.
도 11의 광학측정 분석을 통해, 후코이단 한 분자당 약 1.2개의 FSD750형광염료가 결합되어 있음을 확인하였다.
[실시예 7] 광감각제-후코이단(18 kDa) 결합체의 제조
광감각제인 chlorin e6 (Ce6)와 후코이단의 카르복시기를 연결자를 통하여 공유결합 시킴으로써 광감각제-후코이단 결합체를 합성 하였다. 후코이단은 Fucus vesiculosus에서 추출한 분자량 18,000 Da의 씨그마알드리치 제품을 사용하였다.
먼저 아민기가 도입된 후코이단을 합성하기 위하여, 이황화 결합을 포함하고 있는 연결자인 cystamine dihydrochloride를 후코이단의 카르복시기와 EDC, sulfo-NHS를 이용하여 공유결합 시켰다. 이의 과정을 좀 더 상세히 설명하면, 후코이단 54.36 mg을 10 mM PBS buffer 18 mL에 녹이고 여기에 EDC 23.0 mg (0.5 mL), sulfo-NHS 27.1 mg (0.5 mL)을 첨가하고 약 30분 동안 교반하였다. 그 다음 이황화 결합을 포함하고 있는 연결자인 cystamine dihydrochloride을 27 mg (1 mL)을 첨가하고 하루 동안 교반하였다. 그 다음 증류수에 대하여 하루 동안 투석하고, 동결 건조하여 분말을 수득하여 아민기를 갖는 후코이단 유도체를 얻었다.
Ce6의 카르복시기를 EDC와 sulfo-NHS로 활성화시킨 후, 여기에 아민기가 도입된 후코이단을 결합하는 과정을 거쳤다. Ce6 5 mg을 dimethyl sulfoxide (DMSO) 2.5 mL에 녹이고 여기에 EDC 16.3 mg, sulfo-NHS 19 mg을 첨가하고 한 시간 동안 교반하였다. 그 다음 아민기가 도입된 후코이단 30.15 mg을 DMF:H2O co-solvent (1:1 v/v) 2.5 mL에 녹여서 Ce6 반응용액과 섞어준 뒤 하루 동안 교반하였다. 그 다음 인산완충액 (pH7.4)과 증류수를 이용하여 하루 동안 투석하고, 동결 건조하여 분말을 수득하여 광감각제-후코이단 결합체를 얻었다. 도 13A에 의하면 제조된 광감각제-후코이단 결합체는 수용액 상에서 나노입자를 형성함을 알 수 있으며, 도 13B 및 C에 의하면 제조된 결합체의 형광 특성이 억제되어 있음을 알 수 있다.
[실시예 8] 후코이단(100 kDa)-광감각제 결합체의 제조
광감각제인 chlorin e6 (Ce6)와 후코이단의 카르복시기를 연결자를 통하여 공유결합 시킴으로써 광감각제-후코이단 결합체를 합성 하였다. 결합체 제조에 사용된 후코이단은 Undaria pinnatifida 에서 추출한 분자량 100,000 Da 크기의 후코이단 으로서 해림 바이오사 제품을 사용하였다.
먼저, 아민기가 도입된 후코이단을 합성하기 위해, cystamine dihydrochloride를 후코이단의 카르복시기와 EDC, sulfo-NHS를 이용하여 이황화 결합을 포함하는 연결자를 후코이단에 공유결합 시켰다. 이의 과정을 좀 더 상세히 설명하면, 후코이단 405 mg을 10 mM PBS buffer 18 mL에 녹이고 여기에 EDC 23.0 mg (0.5 mL), sulfo-NHS 27.1 mg (0.5 mL)을 첨가하고 약 30분 동안 교반하였다. 그 다음 cystamine dihydrochloride을 27 mg (1 mL)을 첨가하고 하루 동안 교반하였다. 그 다음 증류수에 대하여 하루 동안 투석하고, 동결 건조하여 분말을 수득하여 아민기를 갖는 후코이단 유도체를 얻었다.
Ce6의 카르복시기를 EDC와 sulfo-NHS로 활성화시킨 후, 여기에 아민기가 도입된 후코이단을 결합하는 과정을 거쳤다. Ce6 20 mg을 DMSO 10 mL에 녹이고 여기에 EDC 65.2 mg, sulfo-NHS 76 mg을 첨가하고 한시간 동안 교반하였다. 그 다음 아민기가 도입된 후코이단 101 mg을 DMF:H2O cosolvent (1:1 v/v) 5 mL에 녹여서 Ce6 반응용액과 섞어준 뒤 하루 동안 교반하였다. 그 다음 인산완충액 (pH7.4)과 증류수를 이용하여 하루 동안 투석하고, 동결 건조하여 분말을 수득하여 광감각제-후코이단 결합체를 얻었다.
도 14A는 상기에서 제조한 광감각제-후코이단 결합체를 입도분석기로 입자의 평균 사이즈를 측정한 결과이며, 259 nm로 분석되었다. 도 14B는 광감각제-후코이단 결합체를 투과 전자현미경으로 분석한 결과이다. 도시된 바와 같이 약 85 nm의 사이즈를 가지는 나노입자가 얻어 졌음을 알 수 있다.
계면활성제의 역할을 하는 NaOH/SDS 혼합용액 및 인산완충용액(phosphate buffered saline (PBS) solution, 0.1 M, pH7.4)에 제조된 광감각제-후코이단 결합체를 녹인 후에 Ce6 결합양을 흡광도를 통하여 분석하였으며, 도 15A와 도 15B는 측정한 UV-vis 흡광 및 형광 스펙트럼이다.
또한 제조된 Ce6-Fucoidan (100 kDa)에 글루타치온 (glutathione; GSH)를 0 μM, 5 μM, 5 mM 농도를 처리함에 따라 이황화결합이 끊어지고 소광(quenching)되었던 유도체의 Ce6 형광 세기가 달라지는 지 알아보기 위해 글루타치온 처리 농도에 따른 형광 세기 변화를 측정하였으며, 도 15C는 이것을 관찰한 형광 스펙트럼이다. 암세포외 또는 혈액내에 존재하는 글루타치온의 농도인 5 μM의 농도로 Ce6-Fucoidan (100 kDa)을 처리한 경우에는 형광의 세기 변화가 없지만, 암세포내 글루타치온의 농도인 5 mM을 처리한 경우 형광의 세기가 약 5배 정도 증가함을 확인하였다.
도 15D는 제조된 Ce6-Fucoidan (100 kDa)에 글루타치온 (glutathione; GSH)를 0 μM, 5 μM, 5 mM 농도를 4시간동안 처리하고, 670 nm 레이져로 빛을 조사하면서 30초 간격으로 일항산소 생성을 분석한 결과이다. 암세포내 글루타치온 농도인 5 mM을 처리한 경우에는 일항산소 생성이 약 2배 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는, 이황화 결합이 포함된 연결자를 사용하는 경우에는 결합체가 표적으로 하는 암세포 내로 섭취되고 암세포 내에 높은 농도로 존재하는 환원제인 글루타치온에 의해서 이황화 결합이 분해되는 경우에는 형광생성 및 광역학 치료 효과가 암세포 특이적으로 다시 회복이 될 수 있음을 가리킨다.
도 16A는 광감각제 Ce6의 1H-NMR 분석 결과이며, 도 16B는 광감각제-후코이단 결합체의 1H-NMR 분석 결과이다. 1H-NMR 분석을 통하여, 후코이단 한 분자당 약 20개의 Ce6가 결합되어 있는 것으로 계산되었다.
[실시예 9] 암세포에 대한 광감각제-후코이단 결합체의 섭취 확인
광감각제-후코이단 결합체와 자유 광감각제 (free Ce6)가 암세포인 HT1080 세포에 섭취되는 정도를 공초점 형광 현미경을 통하여 비교하였다.
1) 세포 배양
인간 섬유육종 세포주 HT1080은 American Type Culture Collection(ATCC, 미국)으로부터 수득하였다. HT1080 세포는 우태아혈청 (FBS) 10% 및 페니실린/스트렙토마이신 1%를 포함하는 MEM (Eagle’s Minimum Essential Media) 배지에서 37℃, 5% 이산화탄소 및 표준 습도 조건하에서 배양하였다.
2) 세포 섭취 확인 실험
HT1080 세포를 LabTek II Chambered Coverglass의 각 웰마다 5×104개씩 넣고, 세포가 잘 부착되도록 24시간 동안 배양하였다. 광감각제-후코이단 결합체인 Ce6-Fucoidan과 자유 광감각제 (free Ce6)를 Ce6기준 2 μ농도로 6시간 동안 암세포에 처리하였다. 그 후, 세포에 섭취되지 않은 약물을 세척을 통해 제거하고, 새로운 세포배양액을 첨가한 후에 공초점 형광 현미경을 통해 세포내로 섭취된 양을 비교 하였다(관찰 조건 = excitation: 633 nm, emission: 650 nm long-pass filter). 도 17에 의하면 Ce6를 처리한 암세포에 비하여 Ce6-Fucoidan을 처리한 암세포에서의 형광세기가 약 18배정도 높은 것으로 분석되었으며, 이것은 광감각제에 비하여 광감각제-후코이단 결합체가 암세포에 매우 효과적으로 섭취될 수 있을 뿐 아니라, 소광(quenching)되어 있던 광학특성이 암세포 내에서 다시 회복된다는 것을 알 수 있다.
[실시예 10] 암세포에 대한 광감각제-후코이단 결합체의 치료성능 분석
도 18A는 광감각제-후코이단 결합체와 자유 광감각제를 암세포에 처리한 농도에 따른 세포 생존율을 측정한 결과이다. 후코이단은 다른 생체적합성 고분자와 달리 후코이단 자체에 의한 항암효과가 있음을 알 수 있다.
도 18B는 HT1080 암세포에 대한 광감각제-후코이단 결합체인 Ce6-Fucoidan의 광역학치료 효과를 도시한 것이다. 광역학 치료를 위해 사용한 파장은 670 nm였고, 빛의 강도는 10 J/cm2였다. HT1080 암세포에 대조군인 Ce6와 본 발명에 의한 Ce6-Fucoidan 결합체를 여러 농도로 6시간 동안 처리한 후, 새로운 MEM 배지로 교환하고 670 nm 레이져를 사용하여 10 J/cm2로 빛을 조사하여 주었다. 추가로 24시간 동안 배양한 뒤 CCK-8 assay 분석킷을 사용하여 세포의 생존율을 분석하였다. 도시한 바와 같이 기존의 Ce6에 비하여 Ce6-Fucoidan 결합체가 HT1080 암세포에 대한 광독성 (phototoxicity)이 훨씬 뛰어난 것을 알 수 있었으며, 세포에서 절반정도를 죽이는 데 필요한 물질의 농도 (IC50)값은 2.73 μM임을 분석하였다.
[실시예 11] 광감각제-후코이단 결합체의 종양 표적 효과
실시예 11에서는 광감각제-후코이단 결합체의 종양 표적 효과를 분석하기 위하여 결합체를 실험동물에 정맥 투여하고 형광영상을 촬영하는 실험을 실시하였다.
HT1080 인간 섬유육종 이식 동물 모델에 각각 인산완충액(음성대조군), 자유 광감각제(free Ce6) 또는 광감각제-후코이단 결합체(Ce6-Fucoidan)를 정맥주사하고 5분 및 24시간째에 IVIS영상기기로 형광영상을 촬영하였다(λex 660/20 nm, λem 710/40 nm). 도 19A의 결과에 의하면, 자유 광감각제(free Ce6)는 생체 내에서 머무르는 시간이 짧고 단기간내에 체외로 배출이 되어 24시간째 체내에 거의 남아있지 않으며 종양조직에서도 형광영상신호가 없음을 확인하였다. 반면에, Ce6-Fucoidan 결합체는 혈류를 통하여 체내에 오래 머무르며 종양조직에 지속적으로 축적되어 24시간째 종양조직에서 뚜렷한 형광영상신호가 나타나는 것을 확인하였다. 도 19B에서는 종양조직의 형광영상 신호값을 정량화하여 종양조직에 축적된 광감각제의 양을 비교함으로서 광감각제-후코이단 결합체가 종양 표적이 가능하고 종양 선택적으로 전달이 될 뿐 아니라, 종양에서 광학특성이 다시회복 됨으로써 향상된 치료효과를 유도할 수 있음을 제시하였다. 도 19C는 마우스를 안락사한 후 종양조직 및 비장, 신장, 간장, 폐 조직을 수득하여 ex vivo 형광영상을 확인한 결과이다. 결과에서 보는 바와 같이, 광감각제-후코이단 결합체는 광감각제를 투여했을 때와 비교하여서 종양을 포함한 체내 각 조직에 좀 더 오랜 시간동안 남아있으며 종양에 전달된 광감각제의 양도 자유 광감각제(free Ce6)에 비해 월등히 증가하였고, 광역학 치료 효과를 높일 수 있는 적합한 표적치료제임을 알 수 있다. 도 19D는 수득한 종양조직을 얼려서 동결절편을 제작한 후 종양조직 내에 광감각제가 침투된 정도를 공초점현미경으로 확인한 결과이다. 대조군(PBS), 자유 광감각제(free Ce6) 처리그룹에서는 종양 조직에서 광감각제에 의한 형광신호가 거의 보이지 않은 반면, 광감각제-후코이단 결합체 처리 그룹에서는 종양 조직에서의 광감각제에 의한 강한 형광 신호가 존재함을 통하여서, 결합체가 종양조직으로 전달 및 종양조직 내에 잘 침투된 것을 확인할 수 있었으며 도 19A, B, C와 일치한 결과를 확인할 수 있었다. 또한, 광감각제-후코이단 결합체를 이용하면 종양에서 회복되는 광학특성을 이용하여 종양의 위치를 형광영상으로부터 검출할 수 있음을 제시하였다.
[실시예 12] 광감각제-후코이단 결합체의 광역학 치료 증진 효과에 대한 동물시험
광감각제-후코이단 결합체를 이용한 광역학 치료 효과를 종양이식 동물 모델에서 평가하였다. HT1080암세포주가 피하에 이종이식된 종양모델에 자유 광감각제(free Ce6) 또는 Ce6-Fucoidan을 정맥주사하고, 종양 부위에 670 nm 레이저를 이용하여 빛 조사 (PDT)를 실시하였다. 항종양효과의 평가는 10일 동안 매일 종양의 크기를 측정하여 각 그룹간의 차이를 분석하였다. 대조군 실험 동물의 경우에는, 광감각제가 없는 인산완충액을 정맥 주입하였다.
1) 종양모델 구축 및 종양성장억제 효과 분석
인간 섬유육종 세포주 HT1080은 American Type Culture Collection(ATCC, 미국)으로부터 수득하였다. HT1080 세포는 우태아혈청 (FBS) 10% 및 페니실린/스트렙토마이신 1%를 포함하는 MEM (Eagle’s Minimum Essential Media) 배지에서 37℃, 5% 이산화탄소 및 표준 습도 조건하에서 배양하였다. HT1080 암세포 5×106개/100 μL만큼 누드마우스(Balb/c nude)의 피하에 주사하고 5~7일 뒤에 피하종양이 생성된 것을 확인하였다. 종양의 크기가 70~80 mm3 정도가 되었을 때, 4개의 그룹(음성대조군, free Ce6 + PDT, Ce6-Fucoidan, 그리고 Ce6-Fucoidan + PDT)으로 나누어 각각의 실험을 진행하였다. 1일째에 free Ce6 또는 Ce6-Fucoidan를 5 mg Ce6 equivalent/kg body weight의 용량으로 마우스의 꼬리정맥을 통하여 전신투여를 진행하였고, 음성대조군은 인산완충액 (PBS)을 정맥 투여하였다. PDT 그룹은, 2일째에 종양부위에 국소적으로 레이저를 조사하여 광역학치료(PDT)를 진행하였고 PDT는 670 nm 파장 레이저로 50 mW/cm2, 20 J/cm2의 조건으로 빛을 조사하였다. 10일째까지 종양의 크기를 측정하여 종양성장 그래프를 작성하였고, 각 그룹간의 종양크기를 비교분석하였다. 도 20A의 결과에서 볼 수 있듯이, Ce6-Fucoidan + PDT 그룹에서의 항종양효과가 가장 우수한 것을 확인할 수 있었으며 ,10일째 Ce6-Fucoidan 또는 Ce6-Fucoidan + PDT 그룹의 종양의 크기는 각각 음성대조군의 76.0%(P < 0.01) 또는 0%(P < 0.001)로 종양성장억제효과를 확인하였다. Free Ce6 + PDT 그룹은 대조군과 비교하여 통계적으로 의미 있는 종양성장억제 효과가 없음을 확인하였다. 특히, 광감각제-후코이단 결합체를 투여한 경우에는 빛을 조사하지 않아도 (Ce6-Fucoidan) 통계적으로 의미 있는 항암 효과를 얻을 수 있었고, 빛을 조사하는 경우에는 (Ce6-Fucoidan + PDT) 매우 우수한 항암 효과를 얻을 수 있었다.
2) 조직염색을 통한 종양조직 내 신생혈관생성 억제 효과 관찰
종양조직 내에서의 신생혈관 분포를 확인하기 위하여, 실험 3일째에 마우스를 안락사 시킨 후에 종양조직을 수득하고, 파라핀 블럭 및 조직슬라이드를 제작하였다. 그리고, 조직 슬라이드를 이용하여 혈관분포를 확인할 수 있는 CD31 염색을 진행하였다. CD31 염색은 anti-CD31 antibody (abcam)를 사용하여 상온에서 2시간 반응시키고 2차 antibody (anti-rabbit IgG-HRP)를 상온에서 1시간 반응시킨 후 diaminobenzidine (DAB) chromogen substrate (DAKO, Carpinteria, CA) 으로 발색하였고 Meyer’s hematoxylin으로 counterstain을 진행하였고 에탄올로 dehydration을 한 후 mounting을 진행했다. 염색이 완료된 조직 슬라이드 샘플은 조직현미경으로 영상을 촬영하였다. 그 결과, 도 20B에서와 같이, 음성대조군, free Ce6 + PDT, 그리고 Ce6-Fucoidan 처리그룹에서 CD31의 발현정도는 비슷하지만, Ce6-Fucoidan + PDT 처리그룹은 기타 세 그룹에서 비해 CD31의 염색이 확연히 감소되었음을 확인할 수 있었다. 이 결과는 실시예 4의 도 9의 결과와 비슷하게 Fucoidan이 VEGF와 결합하여 VEGF의 신호전달체계를 억제함으로써 신생혈관생성을 억제하였거나, 광역학 치료 효과에 의해서 종양내 신생혈관들이 대부분 파괴 되었을 가능성을 제시한다.
3) 조직염색을 통한 종양조직 내 세포고사 유도 변화 관찰
종양조직 내에서의 세포사멸 및 세포고사의 변화를 확인하기 위하여 항종양효과 실험 3일째에 마우스를 안락사하여 종양조직을 수득하였으며, 파라핀 블럭 및 조직 슬라이드를 제작하였다. 조직 슬라이드를 이용하여 terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) 염색을 진행하였다. TUNEL 염색이 완료된 조직 슬라이드 샘플은 조직현미경으로 영상을 촬영하였다. 그 결과, 도 20B에서와 같이, 다른 그룹에 비해, Ce6-Fucoidan + PDT 처리그룹에서 세포고사가 가장 많이 발생하였음을 확인하였다.
[실시예 13] 광감각제-후코이단 결합체의 생체 내 안전성 평가
광감각제-후코이단 결합체의 생체내 안전성을 평가하기 위하여 각 장기별 조직학적변화를 확인하는 실험을 진행하였다. 실시예 12의 종양성장억제효과를 확인하는 실험을 진행함과 동시에 10일째까지 종양의 크기뿐 만아니라 몸무게를 측정하였으며 10일째 마우스를 안락사 시킨 후 마우스의 심장, 폐, 간, 비장과 신장을 수집하여 파라핀 블럭 및 조직슬라이드를 제작하여 H&E 염색을 진행하였다.
도 21A에 의하면, 모든 처리 그룹에서 대조군 그룹과 의미있는 조직학적변화가 발생하지 않음을 알 수 있었다. 또한, 도 21B에 의하면, 광감각제-후코이단 결합체 처리그룹 (Ce6-Fucoidan) 또는 광감각제-후코이단 결합체와 광역학치료 병합처리그룹(Ce6-Fucoidan + PDT)은 대조군 그룹과 비교하였을 때 10일 동안 확연한 몸무게의 감소가 발생하지 않았음 알 수 있다. 이러한 결과를 통하여, 광감각제-후코이단 결합체는 생체 적합하고 안전함을 증명하였다.
[실시예 14] 관상동맥 평활근세포에 대한 광감각제-후코이단 결합체의 치료 성능 분석
동맥경화증(Atheroscelrosis)으로 좁아진 혈관 부위를 넓히기 위하여 스텐트(stent)를 이용하는데, 이 부위에서의 평활근세포 (smooth muscle cell)의 증식에 의하여 혈관 재협착(restenosis)이 문제가 되고 있으며, 따라서 항암제가 탑재된 분해성 스텐드의 개발이 진행 중이다. 따라서, 광감각제-후코이단 결합체가 평활근세포에 대한 치료 효과가 있는지를 세포 실험을 통하여 평가하였다. 도 22A는 광감각제-후코이단 결합체(Ce6-Fucoidan)와 자유 광감각제(free Ce6)를 관상동맥 평활근세포(human primary coronary artery smooth muscle cell, HCASMC))에 여러 농도로 처리하고 세포 생존율을 측정한 결과이다. 광감각제-후코이단 결합체의 농도가 증가함에 따라 세포 생존률이 줄어드는 것을 확인하였으며, 이것은 결합체내 후코이단에 치료 효과로 보인다.
도 22B는 관상동맥 평활근세포 (HCASMC)에 광감각제-후코이단 결합체와 광역학 치료를 동시에 시행하였을 때의 세포 생존율이다. 670 nm 파장의 레이져를 사용하여 빛을 조사하였고, 빛의 파워 밀도는 10 J/cm2였다. HCASMC 세포에 대조군인 Ce6와 본 발명에 의한 광감각제-후코이단 결합체를 농도에 따라 6시간동안 처리한 후, 새로운 배지로 교환하고 670 nm 레이져로 10 J/cm2로 광역학 치료하였다. 처리한 세포를 CO2 배양기에서 추가로 24시간 동안 배양한 뒤 CCK-8 assay 분석방법으로 세포의 생존율을 분석하였다. 도시한 바와 같이 기존의 Ce6에 비교하여 광감각제-후코이단 결합체가 HCASMC 세포에 대한 광독성(phototoxicity)이 훨씬 뛰어난 것을 알 수 있었으며, 세포에서 절반정도를 죽이는 데 필요한 물질의 농도 (IC50)값은 1.05 μM임을 분석하였다.

Claims (5)

  1. 후코이단에 형광염료가 공유결합으로 연결된 결합체로서, 상기 후코이단 대 형광염료의 반응비율은 1:2 내지 1:4인 것을 특징으로 하고, 상기 형광염료는 여기 파장이 663nm 이상인 근적외선 형광염료인 것을 특징으로 하는, 결합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 후코이단의 카르복시기와 형광염료의 아민기를 커플링제를 이용하여 공유결합시키는 것인 결합체.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항 또는 제 2 항의 결합체를 포함하는 형광 영상 진단용 조성물.
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