KR101725613B1

KR101725613B1 - 광역학 진단 또는 치료용 광감작제 및 이를 이용한 광역학 치료방법

Info

Publication number: KR101725613B1
Application number: KR1020150008224A
Authority: KR
Inventors: 이은성; 김솔
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2017-04-26
Also published as: KR20160088748A

Abstract

본 발명은 광역학 진단 또는 치료용 광감작제 및 이를 이용한 광역학 치료방법에 관한 것이다. 기존의 광민감제들이 체내에서 분해되지 않는 특성을 가짐으로써 생체로부터 제거되는데 어려움이 있었고, 이로인해 비특이적 세포독성을 유발시켰던 반면, 본 발명에 따른 광역학치료용 광민감제인 히알루론산과 풀러렌(Fullerene)이 접합된 히알루론산-풀러렌 접합체 및 DNA 단편에 삽입될 수 있는 검출가능한 화합물이 결합된 히알루론산-풀러렌 접합체는 생분해성으로서 생체로부터 용이하게 제거될 수 있다. 이 뿐 아니라 풀러렌에 수용성을 부가하여 난용성을 개선함으로써 높은 광학 특성으로 일항산소 발생을 통한 세포사멸 능력을 나타내고, 혈액 내 입자안정성을 높여 약물 효율성을 증가시켜 치료 효과 또한 극대화 시킬 수 있다.
뿐만 아니라 본 발명의 광역학 치료 방법은 히알루론산-풀러렌 접합체를 이용하여 첫 번째 광역학 치료를 하고, DNA 단편에 삽입될 수 있는 검출가능한 화합물이 결합된 히알루론산-풀러렌 접합체를 이용하여 괴사 종양 조직을 선택적으로 표적화하거나 종양의 괴사 중심부에 두 번째 광역학 치료를 하였을 때 히알루론산-풀러렌 접합체만을 이용하여 광역학 치료를 하였을 때보다 효과적으로 암세포를 죽일 수 있고, 치료기간을 단축할 수 있는 장점이 있다.

Description

광역학 진단 또는 치료용 광감작제 및 이를 이용한 광역학 치료방법{Photosensitizer for photodynamic diagnosis or therapy and photodynamic therapy using the same}

본 발명은 광역학 진단 또는 치료용 광감작제 및 이를 이용한 광역학 치료방법에 관한 것이다.

광역학 치료법(photo dynamic therapy: PDT)은 광감각제(photo-sensitizer)를 이용하여 수술 없이 암 등의 난치병을 치료하는 기술을 일컫는다. 이러한 광역학 치료법(PDT)은 BC 1400년경부터 시도되어 20세기 초부터 활발한 연구가 진행되었고, 현재에 이르러는 암의 진단과 치료, 동맥경화 및 관절염을 포함한 염증성 질환의 치료, 치과 질환 치료, 자가골수이식, 항생제, AIDS 치료, 피부이식 수술이나 피부질환 등의 치료에서 사용되고 있으며 그 응용범위는 점차 확대되고 있다.

광감각제는 특정 파장의 빛에 조사되어 에너지적으로 여기(excitation)될 수 있으며, 이때 형광 신호를 발생하거나, 여기된 에너지를 주변의 기질 또는 산소에 전달하여 반응성 산소종(일항산소, 산소 라디칼, superoxide 및 peroxide 등)을 생성하면서 주변 종양 세포를 자멸(apoptosis) 또는 괴사(necrosis) 시킬 수 있다.

현재 광역학 치료 요법에 사용되고 있는 광민감성 물질로는 포르피린(porphyrin) 유도체, 클로린(chlorin), 박테리오클로린(bacteriochlorin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 5-아미노레불린 산(5-aminolevulinic acid) 유도체 등이 알려져 있으며, 광민감성 사이클릭 테트라피롤 유도체는 암세포에 선택적으로 축적될 뿐만 아니라 화합물의 특성상 형광이나 인광을 나타내므로 종양의 조기진단 시약으로도 활용될 수 있는 특징이 있다.

또한, 암세포 뿐만 아니라 정상세포에도 심각한 독성효과를 나타내는 부작용을 갖는 항암제와는 달리, 광감각제는 빛에 노출되지 않으면 높은 농도에서도 세포 독성을 거의 나타내지 않으므로 빛에 노출되지 않은 정상 세포는 그대로 보존하면서 암세포만 선택적으로 제거할 수 있기 때문에 반복치료가 가능하며, 대부분 전신 마취의 위험성을 배제할 수 있으며, 간단한 국소 마취만으로도 수술할 수 있는 등 시술이 용이한 장점도 있다.

다만, 광감각제를 이용한 광역학 치료법이 기존의 항암치료나 방사선 치료에서 보이는 부작용을 현저히 줄이면서도 암 치료 효과는 극대화할 수 있는 장점이 있으나, 광역학 치료 후 발생하는 피부 광민감성(skin photosensitivity)의 문제가 지적되고 있다. 일례로, 미국 식약청의 허가를 받아서 암치료에 사용되는 광감각제인 Photofirin의 경우, 정상조직에 비특이적으로 축적되어 광역학 치료 후에도 오랜기간 광감각제가 피부와 눈 등에 잔존하므로, 환자가 빛에 노출되는 경우 피부 또는 눈의 정상세포를 죽이는 피부 광민감성 부작용을 보인다. 이러한 피부 광민감성 부작용을 피하기 위하여 환자는 광역학 치료 시술 후 6주 이상 빛이 없는 환경에서 생활해야하는 불편함이 있다. 또한, 광감각제가 종양 조직 주변의 정상조직에도 쌓이는 경우 표적-대비-배경신호 비(target-to-background signal ratio)가 나빠지기 때문에 광감각제를 이용한 종양의 형광 영상 진단에 효율적이지 못하다.

이에, 정상조직에 대한 비특이적 축적을 줄이기 위한 친수성 특성을 갖는 개질된 광감각제가 개발되고 있다. 그러나, 친수성이 증가된 광감각제는 정상세포에 대한 비특이적인 축적이 감소되고 체내에서 보다 빠르게 배출 되어 피부 광민감성 지속 기간이 상당히 단축되는 장점이 있는 반면, 치료에 충분한 양이 종양 조직에 전달되기 위해서는 용량을 높여서 투여해야하는 단점이 있으며, 암 세포 내 침투도 어렵기 때문에 광역학 치료 효능이 낮아진다는 단점이 있다. 따라서, 암 세포에 특이적으로 축적률을 높이고, 부작용이 없으며, 치료 효과가 우수한 새로운 광역학 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

한국공개특허 제2013-0127232호

따라서 본 발명의 목적은 광 조사에 의해 활성산소종을 발생시키는 광역학치료용 광민감제로서, 히알루론산과 풀러렌(Fullerene)이 접합된 히알루론산-풀러렌 접합체 및 DNA 단편에 삽입될 수 있는 화합물이 결합된 광역학치료용 광민감제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (a) 피험체에 히알루론산-풀러렌 접합체를 투여하는 단계; (b) 600 내지 800nm 파장의 광을 조사하는 단계; (c) 피험체에 훽스트(Hoechst) 결합된 히알루론산-풀러렌 접합체를 투여하는 단계; 및 (d) 600 내지 800nm 파장의 광을 조사하는 단계;를 포함하는, 인간을 제외한 동물에 대한 광역학치료방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 광 조사에 의해 활성산소종을 발생시키는 광역학치료용 광민감제로서, 히알루론산과 풀러렌(Fullerene)이 접합된 히알루론산-풀러렌 접합체 및 DNA 단편에 삽입될 수 있는 화합물이 결합된 광역학치료용 광민감제를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 히알루론산-풀러렌 접합체는 풀러렌의 이중결합과 히알루론산의 수산화기가 공유결합되고, 상기 히알루론산의 단위 당 대비 풀러렌 분자의 접합도가 0.01 내지 1일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 DNA 단편에 삽입되어 DNA를 염색할 수 있는 훽스트(Hoechst)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광민감제는 600 내지 800nm 범위 파장의 광을 조사 시 일항산소 또는 자유라디컬을 발생시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 피험체에 히알루론산-풀러렌 접합체를 투여하는 단계; (b) 600 내지 800nm 파장의 광을 조사하는 단계; (c) 피험체에 훽스트(Hoechst)가 결합된 히알루론산-풀러렌 접합체를 투여하는 단계; 및 (d) 600 내지 800nm 파장의 광을 조사하는 단계;를 포함하는, 인간을 제외한 동물에 대한 광역학치료방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광은 0.1 내지 100 mW/cm² 광강도로 1 내지 30분간 조사되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광역학 치료는 CD44 수용체를 발현하는 암의 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 뇌종양(Brain Tumor), 양성성상세포종 (Low- grade astrocytoma), 악성성상세포종 (High-grade astrocytoma), 뇌하수체 선종 (Pituitary adenoma), 뇌수막종 (Meningioma), 뇌림프종 (CNS lymphoma), 핍지교종 (Oligodendroglioma), 두개내인종 (Craniopharyngioma), 상의세포종 (Ependymoma), 뇌간종양 (Brain stem tumor), 두경부 종양(Head & Neck Tumor), 후두암 (Larygeal cancer), 구인두암 (Oropgaryngeal cancer), 비강/부비동암 (Nasal cavity/PNS tumor), 비인두암 (Nasopharyngeal tumor), 침샘암 (Salivary gland tumor), 하인두암 (Hypopharyngeal cancer), 갑상선암 (thyroid cancer), 구강암 (Oral cavity tumor), 흉부종양(Chest Tumor), 소세포성 폐암 (Small cell lung cancer), 비소세포성 폐암 (NSCLC), 흉선암 (Thymoma), 종격동 종양 (Mediastinal tumor), 식도암 (Esophageal cancer), 유방암 (Breast cancer), 남성유방암 (Male breast cancer), 복부종양 (Abdomen-pelvis Tumor), 위암 (Stomach cancer), 간암 (Hepatoma), 담낭암 (Gall bladder cancer), 담도암 (Billiary tract tumor), 췌장암 (pancreatic cancer), 소장암 (Small intestinal tumor), 대장(직장)암 (Large intestinal tumor), 항문암 (Anal cancer), 방광암 (Bladder cancer), 신장암 (Renal cell carcinoma), 전립선암 (Prostatic cancer), 자궁경부암 (Cervix cancer), 자궁내막암 (Endometrial cancer), 난소암 (Ovarian cancer), 자궁육종 (Uterine sarcoma) 및 피부암(Skin Cancer)에서 선택되는 1종이상일 수 있다.

나아가 본 발명은 상기 본 발명의 광역학치료용 광민감제를 유효성분으로 포함하는 CD44 수용체를 발현하는 암에 대한 항암용 조성물을 제공한다.

기존의 광민감제들이 체내에서 분해되지 않는 특성을 가짐으로써 생체로부터 제거되는데 어려움이 있었고, 이로인해 비특이적 세포독성을 유발시켰던 반면, 본 발명에 따른 광역학치료용 광민감제인 히알루론산과 풀러렌(Fullerene)이 접합된 히알루론산-풀러렌 접합체 및 DNA 단편에 삽입될 수 있는 검출가능한 화합물이 결합된 히알루론산-풀러렌 접합체는 생분해성으로서 생체로부터 용이하게 제거될 수 있다. 이 뿐 아니라 풀러렌에 수용성을 부가하여 난용성을 개선함으로써 높은 광학 특성으로 일항산소 발생을 통한 세포사멸 능력을 나타내고, 혈액 내 입자안정성을 높여 약물 효율성을 증가시켜 치료 효과 또한 극대화 시킬 수 있다.

뿐만 아니라 본 발명의 광역학 치료 방법은 히알루론산-풀러렌 접합체를 이용하여 첫 번째 광역학 치료를 하고, DNA 단편에 삽입될 수 있는 검출가능한 화합물이 결합된 히알루론산-풀러렌 접합체를 이용하여 괴사 종양 조직을 선택적으로 표적화하거나 종양의 괴사 중심부에 두 번째 광역학 치료를 하였을 때 히알루론산-풀러렌 접합체만을 이용하여 광역학 치료를 하였을 때보다 효과적으로 암세포를 죽일 수 있고, 치료기간을 단축할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 훽스트 결합된 히알루론산-풀러렌 접합체(Ho-HF)의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 2는 훽스트 결합된 히알루론산-풀러렌 접합체(Ho-HF)와 히알루론산-풀러렌 접합체(HF)의 ¹H NMR 피크를 나타낸 결과이다.
도 3a는 Ho-HF 나노 입자의 입자 분포와 FE-SEM 사진 및 Ho-HF의 자가 응집 후 형태를 나타낸 결과이다.
도 3b는 PBS(pH 7.4-6.0)에서의 Ho-HF의 제타 포텐셜(n=3)을 나타낸 결과이다.
도 4a는 λ_ex=352 nm에서 각 샘플(C₆₀ 농도 0.5 mg/mL)의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸 결과이다.
도 4b는 PBS(pH 7.4)에서 각 샘플(C₆₀ 농도 0.1 mg/mL)의 일항 산소 발생을 측정한 결과이다.
도 5a는 HF 또는 Ho-HF 나노 입자를 이용한 in vitro PDT 치료설계 도식화한 결과이다.
도 5b는 T1, T2, T3, T4 과정(C₆₀ 농도 1 μg/mL)으로 처리한 HCT-116 종양 세포를 CCK-8 assay를 이용하여 광 독성을 평가한 결과이다.
도 6a는 HCT-116 세포에 T1,T2,T3 과정의 형광 사진을 나타낸 결과이다(파란 형광: Hoechst).
도 6b는 24시간 동안 빛없이 HF 또는 Ho-HF 나노 입자를 처리한 HCT-116 종양 세포의 생존율을 나타낸 결과이다.
도 7a는 HCT-116세포에 T1 또는 T2 과정(C₆₀ 농도 1 μg/mL) 치료 전과 후의 CD44 수용체의 밀도를 유세포 분석기를 이용하여 분석한 결과이다.
도 7b는 T1 또는 T2 과정(C₆₀ 농도 1 μg/mL)의 치료 후에 HCT-116 종양 세포의 핵산 농도를 측정한 결과이다.
도 8은 각 stage에 HF 또는 Ho-HF 나노 입자를 이용한 in vivo PDT 치료 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 control(PBS 주사), T1, T2 과정으로 치료하고 1일 경과 후 HCT-116 종양을 심은 누드 쥐로부터 in vivo 종양 조직을 적출하여 얇게 잘라 TCC 염색 후의 결과를 나타낸 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 명세서에서, 용어‘광역학치료(photodynamic therapy)’는 피부에 빛에 반응하는 광민감제(광감작제)를 바른 뒤 특정 파장의 빛을 쏘이면 질병세포에만 선택적으로 빛이 축적되어 치료적 효과를 나타내는 치료요법을 의미한다. 광역학치료는 암의 진단과 치료, 자가골수이식, 항생제, AIDS 치료, 피부이식 수술이나 관절염 등의 치료에 사용되고 있으며, 이에 제한되지 않는다.

용어 ‘광민감제(photosensitizer)’는 특정 파장의 빛을 조사하면 산소분자(Ｏ2)를 일항산소(singlet oxygen, 1Ｏ2)와 같은 활성산소종으로 변화시키거나, 새로운 라디칼을 만들거나 또는 새로운 화학종을 만들어내는 물질을 의미한다.

용어 ‘풀러렌(Fullerene)’은 탄소원자가 오각형과 육각형으로 교대로 배열된 분자를 통칭하는 말이다. 본 발명에서 풀러렌은 예를 들어 C60, C70, C74, C76, C78, C80, C82, C88, C90, C96 등의 임의의 탄소수의 것을 단독 또는 혼합물을 이용할 수 있다. 또한 순탄소 물질인 나노 튜브 풀러렌, 각종 고차원 풀러렌 등을 이용할 수 있고 금속 내포 풀러렌도 가능하다.

용어 ‘암 세포’는 비정상적으로 성장, 분열 또는 증식하는 세포를 의미하는 것으로, 여기서는‘종양 세포’와 혼용된다. 용어 ‘암’은 형질전환된 세포의 억제되지 않는 분열 또는 증식과 무질서한 성장 결과로 빚어지는 복합적인 질환을 일컬으며, 본 발명에서는 CD44 수용체를 발현하는 암을 의미하고, 보다 구체적으로는 고형암을 의미한다.

‘고형암’이란 혈액암을 제외한 모든 덩어리로 이루어진 암으로서, 고형암의 종류로는 뇌종양(Brain Tumor), 양성성상세포종 (Low- grade astrocytoma), 악성성상세포종 (High-grade astrocytoma), 뇌하수체 선종 (Pituitary adenoma), 뇌수막종 (Meningioma), 뇌림프종 (CNS lymphoma), 핍지교종 (Oligodendroglioma), 두개내인종 (Craniopharyngioma), 상의세포종 (Ependymoma), 뇌간종양 (Brain stem tumor), 두경부 종양(Head & Neck Tumor), 후두암 (Larygeal cancer), 구인두암 (Oropgaryngeal cancer), 비강/부비동암 (Nasal cavity/PNS tumor), 비인두암 (Nasopharyngeal tumor), 침샘암 (Salivary gland tumor), 하인두암 (Hypopharyngeal cancer), 갑상선암 (thyroid cancer), 구강암 (Oral cavity tumor), 흉부종양(Chest Tumor), 소세포성 폐암 (Small cell lung cancer), 비소세포성 폐암 (NSCLC), 흉선암 (Thymoma), 종격동 종양 (Mediastinal tumor), 식도암 (Esophageal cancer), 유방암 (Breast cancer), 남성유방암 (Male breast cancer), 복부종양 (Abdomen-pelvis Tumor), 위암 (Stomach cancer), 간암 (Hepatoma), 담낭암 (Gall bladder cancer), 담도암 (Billiary tract tumor), 췌장암 (pancreatic cancer), 소장암 (Small intestinal tumor), 대장(직장)암 (Large intestinal tumor), 항문암 (Anal cancer), 방광암 (Bladder cancer), 신장암 (Renal cell carcinoma), 전립선암 (Prostatic cancer), 자궁경부암 (Cervix cancer), 자궁내막암 (Endometrial cancer), 난소암 (Ovarian cancer), 자궁육종 (Uterine sarcoma), 피부암(Skin Cancer) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

용어 ‘약’이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, ‘포함하다’ 및 ‘포함하는’이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

광역학치료용 광민감제

본 발명의 일 측면은 광 조사에 의해 활성산소종을 발생시키는 광역학치료용 광민감제에 관한 것이다.

광역학 치료용 광민감제는 바람직하게는 하기 조건들을 갖추어야 한다. 첫째, 활성산소종(ROS)을 생산하는 양자수율이 높고, 둘째, 흡수하는 광의 파장이 길어야 하며, 셋째, 조사하지 않는 상태에서 독성이 낮아야 하고, 넷째, 특정 표적에 선택적으로 바인딩 되는 한편, 비특정 조직과는 결합하지 않아야 한다.

이러한 요건을 만족시키는 본 발명에 광민감제는 히알루론산과 풀러렌(Fullerene)이 접합된 히알루론산-풀러렌 접합체 및 DNA 단편에 삽입될 수 있는 검출가능한 화합물이 결합된 히알루론산-풀러렌 접합체이다.

풀러렌(Fullerene)은 근적외선 광을 흡수하는 성질을 가지고 있으며, 광역학치료에 적합한 활성산소종(ROS)을 생산하는 물질로서 기존에 사용되는 물질보다 훨씬 작은 크기를 가지고 있기 때문에 광민감제로 적합하지만, 난용성 성질 및 생체 내 흡수/분포/대사/제거의 한계를 가지고 있다. 즉, 풀러렌은 수불용성이어서 생체 내 투여가 어렵다는 문제가 있다. 이에, 본 발명에서는 생분해성 고분자로서 생체적합성 및 입자 안정성을 증진시키는 히알루론산을 풀러렌에 접합시켰다.

천연고분자로 선형 다당류인 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)은 독특한 다당류 구성 단위인 클루코닉산(Dglucuronic acid)과 아세틸클루코사민(N-acetyl-D-glucosamine) 단위체가 반복되는 구조이며, 세포 외 기질의 글리코스아미노글리칸 구성요소 중 하나이다. 히알루론산은 세포부착, 성장, 이동에서 핵심적인 역할을 담당하기 때문에 세포운동성, 염증 반응, 상처치유 그리고 암세포의 침투와 전이의 신호 분자로 알려져 있다. 장간막에 발생한 암세포에서 히알루론산이 과발현되기 때문에 히알루론산은 암세포의 확산, 이동, 침투, 전이에 대한 기질 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

일반적으로 암세포의 히알루론산 수용체인 CD44와 RHAMM의 발현은 세포 이동과 침투에 밀접하게 연관되어 있다. 즉, 악성의 암세포는 히알루론산이 많은 환경으로 침투한다. 이런 관점에서, 많은 연구자들이 히알루론산을 항암제의 전달 시 암세포 표적 분자로 사용하였다. 침투적이고 전이적인 암세포에서 CD44가 과발현되기 때문에 히알루론산과 항암제, 그리고 고분자의 결합체는 수용체 매개를 통해 이러한 암세포의 수용체를 표적으로 할 수 있다.

게다가 히알루론산의 생체적합성, 생분해성, 면역을 유도하지 않는 성질 때문에 히알루론산은 우수한 생체 삽입 물질로 여겨진다. 그러므로 히알루론산은 강력한 항암제 전달체 후보 중 하나이다. 따라서 이러한 히알루론산에 풀러렌이 결합된다면 생체내 암세포와 같은 특정세포나 또는 조직에 보다 효과적으로 전달되어 광역동치료(PDT)에 도움이 될 것이다.

또한, 본 발명에서는 광역학치료용 광민감제로서 히알루론산-풀러렌 접합체 뿐만 아니라 DNA 단편에 삽입될 수 있는 검출가능한 화합물이 결합된 히알루론산-풀러렌 접합체를 사용할 수 있다.

본 발명에서 DNA 단편에 삽입될 수 있는 검출가능한 화합물은 훽스트(Hoechst), 피코그린(PicoGreen), 사이버 그린(SYBR Green), TOTO, YOPRO, BENA435, DAPI, DRAQ5, 올리그린(OliGreen) 또는 프로피듐 요오다이드일 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 가장 바람직하게는 훽스트(Hoechst)일 수 있다.

본 발명의 접합체는 풀러렌의 가용화 및 혈액 내 입자 안정성 증진을 통해 약물효율성을 높이고 치료효과가 증대된다. 또한, 높은 광학 특성, 생체 적합성 및 생체 제거율을 나타내고, 히알루론산에 의해 암 세포에 대한 표적 지향성이 향상되어 선택적 맞춤 치료의 가능성을 높였다.

뿐만 아니라 본 발명은 히알루론산-풀러렌 접합체를 이용하여 첫 번째 광역학 치료를 하고, DNA 단편에 삽입될 수 있는 검출가능한 화합물이 결합된 히알루론산-풀러렌 접합체를 이용하여 괴사 종양 조직을 선택적으로 표적화하거나 종양의 괴사 중심부에 두 번째 광역학 치료를 하였을 때 히알루론산-풀러렌 접합체만을 이용하여 광역학 치료를 하였을 때보다 높은 광역학 치료 효과를 보여 다중 광역학 치료가 가능함을 확인할 수 있었다.

본 발명에서 사용되는 풀러렌 단량체는 종류가 특별히 한정되는 것은 아니지만, 독성이 낮고 공급 및 취급 용이성의 이점으로부터 C60 플라렌을 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 히알루론산-풀러렌 접합체들이 다수 개 결합 또는 응집되어 응집체를 형성할 수 있다.

본 발명의 히알루론산-풀러렌 접합체는 크기가 5 내지 500 nm, 바람직하게는 10 내지 100 nm일 수 있다. 이러한 직경 범위 내에 있을 경우 생체 내에서 효과적으로 제거될 수 있고, 임상 및 진단용으로 적합하기 때문이다. 일반적으로 입자를 혈관 내에 주입하려면, 혈관의 크기를 고려하여 주입되는 입자의 크기가 200㎚ 이하가 되어야 한다.

본 발명의 접합체에는 고분자인 수용성 히알루론산에 다수 개의 풀러렌 분자가 접합되어 있는바, 수용성 히알루론산의 반복단위 대비 풀러렌 분자의 수인 치환도는 0.001 내지 1일 수 있다. 수용성 히알루론산의 반복단위에 과량의 풀러렌이 결합하게되면 풀러렌의 소수성으로인해 응집현상이 일어나 접합체의 크기가 커질 가능성이 있다. 따라서 혈관크기를 벗어난 크기로 제조될 가능성이 있다.

본 발명에 따른 히알루론산-풀러렌 접합체는 표적지향성 물질이 추가적으로 결합될 수 있다. 이에 특정적인 표적 분자를 풀러렌 혹은 히알루론산 부분에 직접적으로 결합시키는 표적화가 가능하다. 즉, 종양세포와 같은 특정 세포군의 막 수용체로의 선택성 또는 표적성을 높이기 위해 종양 특이적 리간드를 상기 접합체에 결합시키는 것을 의미한다. 이러한 표적지향을 통해 세포파괴 없이 수용체-매개 엔도시토시스를 통해서 결합물을 세포내부로 흡수시킬 수 있다.

본 발명에서 상기 표적지향성 물질은 예를 들어, 엽산, 항체, 코발라민, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 B12 등을 들 수 있다. 이 중에서도 특히 엽산이 바람직하게 이용될 수 있다. 이에 대응하는 표적물질인 엽산수용체는 종양특이적 약물 전달을 위한 유용한 표적이 된다. 즉, 엽산수용체들은 난소암, 결장, 유선, 뇌, 대장, 폐, 신장-세포성암, 상피 종양의 뇌로의 전이, 백혈병에서의 골수 혈액 세포 및 신경내분비암에서 종양세포 상에서 발현된다. 한편, 정상 조직에서 엽산 수용체의 발현은 심각하게 제한되어 있어 정상조식에서의 엽산 수용체에 대한 접근은 거의 일어나지 않는다. 즉, 정상조직의 세포들은 약간의 예외를 제외하고는 매우 적은 양의 엽산수용체만을 발현하는 한편, 악성으로 형질변환된 세포들에서는 엽산에 대한 수용체의 양이 그들의 표면 상에서 증가하게 된다. 이러한 엽산수용체의 양적인 증가로 인해 현저한 양의 엽산을 효과적으로 바인딩할 수 있게 된다. 또한, 엽산은 세포표면상 엽산 수용체와 높은 친화성을 나타낸다. 엽산과 거대분자의 결합은 거의 모든 테스트된 상태에서 시험관 내 엽산수용체-발현 암세포로의 전달을 개선시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 히알루론산-풀러렌 접합체는 표적지향성, 생체적합성 및 생분해성을 나타내는바 고분자량의 단백질, 펩타이드, 핵산분자, 당류, 지질, 화합물 또는 무기물을 포함하거나 또는 그 표면에 고분자량의 화합물 또는 무기물이 결합되어 이들의 나노 운반체로서 이용될 수 있다. 상기 화합물 또는 무기물은 예를 들어 독소루비신, 파크리탁셀, 도세탁셀, 캄토테신과 시스플라틴과 같은 다양한 항암제일 수 있다.

또한, 본 발명의 히알루론산-풀러렌 접합체는 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시킬 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

실험 재료

본 발명에서 사용한 풀러렌(fullerene: C₆₀)은 NanoLab Inc(Waltham, MA, USA)에서 구입하였고, 히알루론산(Hyaluronic acid: HA, Mw = 7 kDa), 수산화리튬(lithium hydroxide: LiOH), N,N’-dicyclohexylcarbodiimide(DCC), N-hydroxysuccinimide(NHS), ethylene diamine, 4-nitrophenyl chloroformate(NPC), pyridine, 4-dimethylaminopyridine(DMAP), Hoechst, ,triethylamine(TEA), dimethylsulfoxide(DMSO)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, RPMI-1640, fetal bovine serum(FBS), 페니실린과 스트렙토마이신은 Welgene, Inc(Seoul, South Korea)에서 구입하였다.

Cell Counting Kit-8(CCK-8 assay)은 Dojindo Molecular Technologies Inc(Kumamoto, Japan)에서 구입하였고, ABfinity^TM CD44 recombinant rabbit monoclonal antibody와 goatanti-rabbitIgG-FITC: sc-2012는 Santa Cruz Biotechnology Inc(USA)에서 구입하였다.

< 실시예 2>

HO - HF 합성 나노입자 제조 방법

HA(100mg)을 DMSO(20 mL)상에서 에틸렌 디아민(200 mg), DCC(50 mg)과 NHS(50 mg)을 상온에서 전처리하였다. 전처리한 HA는 반응하지 않은 물질을 제거하기 위해 질소로 밀폐하여 깨끗한 DMSO에서 2일 동안 투석막(Spectra/Por MWCO 5K, Spectrum Lab. Inc., Rancho Dominguez, USA)으로 투석하였다. 투석하여 얻은 반응 용액을 전처리한 Hoechst[DMSO(10 mL)상에서 Hoechst(50 mg)와 NPC(5 mg), 피리딘(2 mL), DMAP(30 mg) 4℃의 온도에서 4시간 동안 화학 반응하여 준비함]와 TEA(1 mL)를 상온에서 3일 동안 반응하여 Hoechst-HA를 얻었다(도 1 참조).

히알루론산에 Hoechst가 치환된 정도(히알루론산 단량체 한 분자당 Hoechst의 수로 정량함)는 0.20± 0.3이고 ¹H-NMR(TMS를 포함한 DMSO-d ₆ 용매)로 측정한 δ 2.65 ppm(Hoechst-의 CH ₃)과 δ 1.80 ppm(HA의 CH ₃)의 피크로 계산하였다. 히알루론산에 풀러렌이 치환된 정도(히알루론산 단량체 한 분자 당 풀러렌의 수로 정량함)는 0.23± 0.4 이고 ¹H-NMR(TMS를 포함한 DMSO-d ₆ 용매)로 측정한 δ 6.60 ppm(Hoechst-의 CH ₃)과 δ 1.80 ppm(HA의 CH ₃)의 피크로 계산한 결과이다(도 2 참조).

상기와 같이 얻은 반응 용액을 투석막(Spectra/Por MWCO 5K)으로 깨끗한 DMSO로 3일, 깨끗한 증류수로 2일간 반응하지 않은 부산물을 제거하기 위해 투석하였다. 투석하여 얻은 용액을 동결 건조하였고, 톨루엔(50 mL)/DMSO(20 mL)의 co-solvent 용액에서 Hoechst-HA(100 mg)또는 HA(100 mg)와 풀러렌(40 mg)을 상온에서 7일간 반응하여 각각 Hoechst 히알루론화 풀러렌(Ho-HF) 또는 히알루론화 풀러렌(HF)를 얻었다. 반응 후, 진공회전농축기(rotary evaporator)로 톨루엔을 제거하고 얻은 용액은 투석막(Spectra/Por MWCO 8.5K)을 증류수에서 투석한 후 2일 동안 동결 건조시켰다.

본 발명자들은 DMSO(2 mL)에 상기 방법으로 제조된 Ho-HF 또는 HF(10 mg)을 용해시키고 미리 불러둔 투석막(Spectra/Por MWCO 15K)에 용액을 옮기고 150 mM 인산완충용액(PBS, pH 7.4)상에서 24시간 동안 투석하였다. 외부 상을 3시간 마다 신선한 PBS 용액으로 갈아주었고, 얻어진 용액은 2일간 동결 건조시키는 방법으로 나노입자를 제조하였다.

< 실시예 3>

나노입자 특성 조사

본 발명자들은 친수성을 띠는 Hoechst-HA(또는 HA)는 풀러렌과 화학적으로 결합하여 고분자에 풍부한 소수성을 부여하고 나노 크기의 소수성 코어(풀러렌)를 이루고 친수성 셸(Hoechst-HA 또는 HA)로 이루어져 있는 구조를 자가 조직화한 결과, Ho-HF 나노 입자의 형태는 구에 가까우며, Ho-HF 나노 입자 또는 HF 나노 입자의 평균 크기는 각각 약 141 nm 또는 147 nm임을 알 수 있었다(도 3a 참조).

또한, 본 발명자들은 상기 실시예 2의 방법으로 제조된 나노입자의 특성을 조사하기 위하여 각각 다른 pH(pH 7.4-5.0, PBS 150mM)에서 Ho-HF 또는 HF 나노 입자(0.5 mg/mL)의 입자 크기 분포는 633nm 파장의 He-Ne 레이저 90°의 각으로 고정한 제타사이저 3000(Malvern Instruments, Westborough, MA, USA)을 이용하였으며, Ho-HF 또는 HF 나노 입자(10 mg/mL) 형태는 주사전자현미경(FE-SEM, Hitachi s-4800, Tokyo, Japan)을 통해 확인하였고, 측정 전에 각각 다른 pH(pH 7.4-5.0, PBS 150mM)에 Ho-HF 또는 HF 나노 입자(0.5 mg/mL)를 노출시켜 4시간 동안 실온에서 안정화시키고 Zetasizer 3000(Malvern Instruments, Westborough, MA, USA)을 이용해 제타포텐셜을 측정하였다.

그 결과, pH 7.4에서 Ho-HF 나노입자의 제타 포텐셜은 19 mV 임을 알 수 있었고, pH 7.4(정상 pH)에서 pH 6.8(종양 세포 외부의 pH) 또는 6.0(endosome 내 pH)에서도 Ho-HF 또는 HF 나노 입자의 제타 포텐셜은 변하지 않음을 알 수 있었다(도 3b 참조).

도 4는 400-600 nm 범위(Hoechst 결합의 영향)와 650-700nm 범위(풀러렌 결합의 영향)에서의 Ho-HF나노 입자의 형광 방출 분석(λ_ex=352 nm)을 나타낸 결과이다. 그러나, 흥미롭게도 Hoechst가 결합물의 형광은 풀러렌의 일항 산소 발생과 유사하게 나타났음을 알 수 있었고, 도 4b에서는 HF 나노 입자의 DMA 형광 차이(F_f-F_s _,일항 산소 발생 측정)가 눈에 띄게 나타났으며, Ho-HF 나노 입자보다 높은 일항 산소가 발생함을 알 수 있었다(PBS상에서 응집됨). 이때 Ho-HF 나노입자는 형광 강도 차이가 감소하는 것은 Hoechst로 인한 광 방해로 일항 산소 발생이 감소하기 때문인 것으로 판단되며, 풀러렌은 PBS에서의 용해도가 낮고 자가 ??칭이 일어나기 때문에 일항 산소 또한 아주 적게 발생함을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

in vitro 광 독성 측정

본 발명자들은 상기 실시예 2의 방법으로 제조된 나노입자의 in vitro 광 독성을 측정하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

먼저, 사람 장 HCT-116 악성 종양세포를 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), 10% FBS를 첨가한 folate-free RPMI 1640 배지에서 5% CO₂농도, 37℃의 온도 조건으로 배양하였다. 실험 전에 0.25%(w/v) trypsin/0.03%(w/v) EDTA 용액을 이용해 단층상태의 세포들을 배지에서 분리하고 RPMI-1640배지를 이용해 1 X 10⁵cells/ml의 농도로 희석하였다. RPMI 1640배지에 분산된 KB 세포를 96 웰 배지에 분주하고 24시간 동안 배양한 뒤에 in vitro 실험에 사용하였다.

본 발명에서는 선행연구에서 개발했던 히알루론화 풀러렌(HF) 나노입자에서 광 조사 시 항종양 효과면을 발전시켰으며, 종양을 심은 누드 마우스에 HF 나노입자를 단일 주사한 후에 효과적인 PDT를 위한 약학적 가능성을 확인하였다. HF 나노입자는 많은 일항 산소 발생하고 종양 세포에 과발현된 CD44 수용체에 특이적으로 결합하기 때문에 항종양 작용에 영향이 있다. 하지만, 선행연구에서는 임상 절차 속의 몇 가지 문제(다중 주사 또는 약물의 조합)를 미포함하고 있다.

따라서 본 발명에서는 효과적인 광역학 치료를 위한 다른 나노 입자의 다중 주사를 설계하였다.

본 발명자들은 종양 세포에 먼저 나노입자를 1시간 동안 처리하고 PBS로 3번 씻어낸 후, 670nm 광의 5.2 mW/cm² 빛 세기로 10분간 조사하여 암전 상태로 4시간 동안 배양하였다. 이 후 이 과정을 상기 표 1과 같이 stage(A)라 칭하였고, 그 후 세포에 다시 나노입자를 처리하고 670nm 광의 5.2 mW/cm² 빛 세기로 10분간 조사하여 암전 상태로 4시간 동안 배양하였다. 이 후 이 과정을 상기 표 1과 같이 stage(B)라 칭하였다. stage(A) 또는 (B)를 이용하여 나노입자(HF 또는 Ho-HF)를 다양하게 조합하였다.

그 후 PDT 처리하여 HCT-116 종양 세포에 CCK-8 assay를 이용하여 광 독성을 측정하고, 세포 생존율은 Cell Counting Kit-8(CCK-8 assay)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 다른 처리군과 비교하였을 때 stage(A)단계에서 HF 나노입자를 처리하고, stage(B)단계에서 Ho-HF 나노입자를 처리한 뒤 각 단계에서 670nm 광의 5.2 mW/cm² 빛을 조사한 T1 처리 군에서 HCT-116 종양 세포에서 stage(A)단계 후에 52%의 세포 생존율을 보였고, stage(B)단계 후에 17%의 세포 생존율을 보여 암 세포를 가장 월등히 억제할 수 있음을 알 수 있었다(도 5 참조).

또한, 각 샘플(파란 형광: Hoechst)의 결합정도를 Axio Imager D2 형광현미경(Carl Zeiss, USA)을 이용하여 평가한 결과, T1 과정으로 세포에 처리했을 때 강한 형광(파란색: Hoechst) 강도가 나타난 것은 Ho-HF 나노 입자와 세포 사이의 상호작용이 높아서 증가한 것이고 괴사 종양 세포로부터 밖으로 방출된 DNA와 Hoechst의 다중 결합(응집)으로 stage(A) 후에 괴사한 종양 세포에 많은 Ho-HF 나노 입자의 축적되는 것을 알 수 있었다(도 6a 참조).

하지만 (i) stage(A)에서 Hoechst의 광 방해로 인해 Ho-HF 나노 입자의 일항 산소 발생 감소(도 4b)와 (ii) stage(B)에서 생존 세포와 Hoechst 사이 빈약한 상호작용으로 Ho-HF 나노 입자의 축적이 감소(도 4a에서 약한 형광이 관찰됨.)하기 때문에 stage(A) 또는 (B) 후에 세포 생존율은 T2 과정 후에 근소한 차이를 보였다(도 5b). 게다가 광 조사 없는 T3 과정은 PDT 효과(도 5b)와 세포 내에서 Ho-HF 나노 입자의 축적이 관찰되지 않았다. 이와 유사하게 세포에 HF 또는 Ho-HF 나노 입자를 처리하고 광 조사 후 24시간 동안 배양 광 독성은 근소하게 나타났다(도 6b 참조).

T4과정 stage(A)후와 stage(B)후를 비교했을 때는 광 독성이 증가하였다(도 5b). 상기 표 1의 실험 설계표를 보면 stage(A)(HF 나노 입자 이용) 후에 손상을 입은 종양 세포에 다시 HF 나노 입자를 이용하여 표적화(stage B)하였다. 하지만 T4 과정 후에 광 독성은 T1 과정 후와 비교하여 낮은 광 독성을 보임을 알 수 있었다(도 5b 참조). stage(A)(HF 나노 입자 이용) 후에 손상을 입은 종양 세포의 세포막의 CD44 수용체가 감소하였고 결과적으로 광 조사 조건에서 감소한 광 독성으로 인해 HCT-116 종양 세포 내에 HF 나노 입자의 축적이 감소함을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

CD44 표현형 분석

본 발명자들은 암 세포인 HCT-116세포에 T1 또는 T2 과정(C₆₀ 농도 1 μg/mL) 치료 전과 후의 CD44 수용체의 밀도를 유세포 분석기를 이용하여 분석하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

먼저, HCT-116 세포(1×10⁵cells/mL)에 HF 나노입자(C₆₀ 농도 1 μg/mL)를 처리하여 1시간 동안 처리한 후 150 mM PBS(pH 7.4)로 세 번 씻어주었다. 광역학 치료 시 세포에 670 nm 광의 5.2 mW/cm²빛 세기로 10분간 조사한 후 암전 상태로 4시간 동안 배양하였으며, 0.25%(w/v) trypsin/0.03%(w/v) EDTA 용액으로 세포를 떼어내어 모았다. 세포를 PBS(pH 7.4)에 AB finity^TM CD44 recombinant rabbit monoclonal antibody(1 μg/mL)와 분산시킨 후 1시간 동안 25℃의 온도에서 배양하였다. 세포를 차가운 PBS로 씻어준 다음 다시 분산시켰고, 세포를 PBS(pH 7.4)에 goat anti-rabbit IgG-FITC: sc-2012(1 μg/mL)와 분산시킨 후 1시간 동안 25℃의 온도에서 배양하였다. 형광 강도는 FACS Calibur™ flow cytometer(Becton Dickinson, USA)을 통해 분석하였다.

유세포 분석기로 분석한 평균 형광 강도는 PDT 처리 전이 5.06×10⁵로 나타났고, PDT 처리 후가 4.90×10³로 나타나 광 조사 후 CD44 수용체의 밀도가 현저히 감소하였음을 알 수 있었다(도 7a 참조).

< 실시예 6>

세포 외 DNA 분석

본 발명자들은 암 세포인 HCT-116세포에 T1 또는 T2 과정(C₆₀ 농도 1 μg/mL) 치료 전과 후의 세포 외 DNA 분석을 위하여 하기와 같이 실험하였다.

먼저, 세포(1×10⁷cells/mL)에 HF 또는 Ho-HF 나노 입자(C₆₀ 농도 1 μg/mL)를 처리하여 1시간 동안 처리한 후 150 mM PBS(pH 7.4)로 세 번 씻어주었다. 첫 번째 광역학 치료 시 670 nm 광의 5.2 mW/cm² 빛 세기로 10분간 조사한 후 암전 상태로 4시간 동안 배양하였고, 셀 스크랩퍼(Cell scraper)로 떼어냈다. 세포 용액을 1,000 rpm에서 2분 동안 원심 분리하여 얻은 세포 펠렛에 3M sodium acetate/ethanol(50/50 vol %)을 넣고 20℃에서 12시간 동안 배양하였다. 2,000 rpm에서 3분간 원심분리 후 얻어진 DNA 펠렛은 다시 증류수에 분산시켰고, 세포 외 DNA는 Nanodrop ND-1000 spectrophotometer(NanoDrop, USA)을 이용하여 분석하였다.

도 7b는 T1 또는 T2 과정(C₆₀ 농도 1 μg/mL)의 치료 후에 HCT-116 종양 세포의 핵산 농도를 측정한 결과로서, 세포에 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 종양세포에 PDT를 처리(T1 또는 T2) 시 괴사 종양으로부터 세포 외로 방출되는 DNA의 농도가 증가함을 확인할 수 있었다(도 7b 참조).

< 실시예 7>

In vivo 광 독성 실험

본 발명자들은 In vivo 상에서 PDT 치료 후 효과를 알아보기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.

먼저, In vivo 동물실험을 위하여 4-6주령의 암컷 누드 쥐(BALB/c, nu/nu mice, Institute of Medical Science, Tokyo, Japan)를 이용하였으며, 쥐는 가톨릭대학교 동물실험윤리위원회로부터 승인된 가이드라인에 따라 사육하였다.

HCT-116 종양 세포(PBS pH 7.4에 분산시킨 1×10⁷cells)로 이종이식을 준비하여 암컷 쥐에 피하 주사하였으며, 종양이 175-200 mm³까지 커졌을 때, 각 샘플(C₆₀ 농도 1.25 mg/kg)을 종양 이식한 쥐에게 꼬리 정맥 주사하였다. 주사 4시간 후에 쥐의 종양 부분에 670 nm 광의 5.2 mW/cm² 빛 세기로 40분간 조사하였고, 1시간 후 다시 각 샘플(C₆₀ 농도 1.25 mg/kg)을 종양 이식한 쥐에게 꼬리 정맥 주사하였고, 경과 시간에 따른 종양의 부피 변화를 관찰하였다. 종양 부피는 하기 식1과 같이 계산하였다. 또한, 여기서 in vivo 처리 과정은 도 5a의 in vitro 실험 방법을 기초하여 설계하였고, in vivo 실험의 나노 입자 조합은 상기 표1을 이용하였다.

더 나아가 치료가 1일 지난 쥐의 종양 조직을 추출하여 마이크로톰(microtome)을 이용하여 얇게 조각내고 2,3,5-trisphenyltetrazolium chloride(TTC)염색법으로 종양의 괴사 부분을 시각적으로 나타내 분석하였다.

그 결과, PBS 처리한 대조군과 T4 과정에 비해 T1 과정으로 치료한 누드 쥐의 종양 크기는 약 7.5 또는 2.1배 작아졌음을 알 수 있었다.

원래 TCC 염색 후, 백색 영역은 TCC 변환 시 적색 포마잔으로 변환되지 못한 결과로 하얗게 나타나는 괴사 종양 조직이며 적색 영역은 정상 종양 조직을 가리킨다.

본 발명에서 in vivo 종양 조직에 T1 또는 T4 과정을 통한 치료 후 2,3,5-trisphenyltetrazolium chloride(TTC)염색 방법을 이용하여 괴사 조직의 부분을 검토한 결과, T4 과정을 통한 치료와 비교하여 T1 과정 시 종양 조직 깊이 괴사가 일어난 것을 알 수 있었다(도 9 참조).

본 발명의 방법은 처음 PDT 치료(HF 나노 입자 이용) 후 종양 조직과의 상호작용이 매우 높아 종양 혈관으로부터 Ho-HF 나노 입자는 방출(향상된 침투성과 보존 효과)되어 확장된 종양 조직 사이 공간으로 종양 깊숙이 쉽게 침투하여 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있고, 치료한 누드 쥐 체중의 변화로 체내에서의 HF 또는 Ho-HF 나노 입자에 독성이 없음을 알 수 있었다.

상기의 실시예의 결과로 stage(A) 단계에서 히알루론화 풀러렌(HF) 나노입자를 처리하고, stage(B) 단계에서는 Hoechst 히알루론화 풀러렌(Ho-HF) 나노입자를 처리하며, 각각의 스텝 모두에서 광조사를 하여 처리한 T1 처리군에서 암세포를 효과적으로 타게팅할 수 있어 암을 효과적으로 진단할 수 있으며, 효과적으로 암을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

풀러렌의 이중결합과 히알루론산의 수산화기가 공유결합되고, 접합체에서 히알루론산의 단위 당 대비 풀러렌 분자의 접합도가 0.01 내지 1이고, 광 조사에 의하여 활성산소종을 발생시키는 것을 특징으로 하는 히알루론산-풀러렌 접합체 및 훽스트(Hoechst)가 결합된 광민감제를 포함하는 대장암 치료용 약학적 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 광민감제는 600 내지 800nm 범위 파장의 광을 조사 시 일항산소 또는 자유라디컬을 발생시키는 것을 특징으로 하는, 대장암 치료용 약학적 조성물.
(a) 피험체에 히알루론산-풀러렌 접합체를 투여하는 단계;
(b) 600 내지 800nm 파장의 광을 조사하는 단계;
(c) 피험체에 훽스트(Hoechst)가 결합된 히알루론산-풀러렌 접합체를 투여하는 단계; 및
(d) 600 내지 800nm 파장의 광을 조사하는 단계;를 포함하고,
상기 (b) 및 (d)의 광은 0.1 내지 100 mW/cm² 광강도로 1 내지 30분간 조사되는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물에 대한 대장암 치료방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제