KR101903847B1 - 암 치료용 나노 복합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 감광제, 산화 그래핀, 및 엽산-알부민-감광제 결합체를 포함하는 암 치료용 나노 복합체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 나노 복합체는 종양 조직에 특이적으로 감광제를 축적시킬 수 있고, 높은 암세포 사멸 효과를 나타내 암의 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

암 치료용 나노 복합체{Nanocomplex for cancer treatment}
본 발명은 감광제, 산화 그래핀, 및 엽산-알부민-감광제 결합체가 결합되어 포함되는 암 치료용 나노 복합체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 산화 그래핀과 엽산-알부민-감광제 결합체를 혼합하는 제1단계 및 상기 제1단계의 혼합물에 감광제를 혼합하는 제2단계를 포함하는, 나노 복합체 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 나노 복합체를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 진단 및 치료 방법에 관한 것이다.
국내 사망원인 1위인 암은, 2013년 보건복지부의 조사에 따르면 81세까지 생존할 경우, 암 발생률이 36.3%로 3명 중 1명이 암에 걸리 정도로 암의 발생률이 높다. 또한, 2000년 대비 2011년 암 발생자수는 114.2%나 증가하는 등 매년 그 수가 증가하여 암의 심각성이 날로 증가하고 있다.
대표적인 암 치료방법으로는 항암화학요법이 있으나, 이는 암세포뿐만 아니라 정상세포 중 빠르게 분열증식하는 세포에도 손상을 가할 수 있어 암세포에 대한 표적성이 낮고, 항암화학요법 후 빈혈, 백혈구 및 혈소판 수의 감소, 구토, 오심, 및 설사 등의 부작용이 발생할 수 있다.
한편, 지난 몇 년 간 항암화학요법의 부작용을 극복하기 위한 치료제로서 감광제, 빛, 및 산소분자의 조합으로 이루어진 광 역학 치료(photodynamic therapy, PDT)에 대한 관심이 증가하고 있다. 광 역학 치료는 기존의 치료 방법과 달리 빛을 조사하는 경우에만 세포를 사멸시키는 효과를 갖는 특징이 있다(CA Cancer J Clin. 2011, 61, 250-281).
감광제의 경우, 낮은 수용성, 목표 지점에 대한 낮은 선택성, 및 피부 광독성의 단점이 존재하나, 미셀, 밀봉 리포좀, 및 바이오폴리머 등의 다양한 담체 시스템과 결합하여 이를 극복하는 연구가 진행되고 있다. 이 중, 알부민은 혈액의 성분으로서 혈류에 안정한 성질을 갖고, 분자 내에 서로 다른 약물 결합 부위를 갖고 있어 약물 전달체로의 활용 가능성이 존재하였다(Drug Development Research. 2003, 58, 219-247). 그 결과, 인체에 무해하며 분해가능한 단백질 입자인 알부민과 감광제를 결합하여 암세포에 대한 감광제의 전달 효율성을 높이는 기술이 개발되었다(Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2009, 96, 66-74).
다만, 암세포에 대한 표적성은 여전히 연구가 될 필요성이 있으며, 약물 전달체와 결합된 감광제가 암세포 내에서 효과적으로 분리되어 암세포를 효과적으로 사멸시키기 위한 연구 역시 여전히 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 암세포에 대한 표적성이 뛰어나면서 암세포 내로 약물을 효율적으로 전달할 수 있는 나노 복합체를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 감광제, 산화 그래핀, 및 엽산-알부민-감광제 결합체를 포함하는 나노 복합체가 암세포에 대한 표적성이 뛰어나고, 암세포로 감광제가 효율적으로 전달될 수 있음을 확인하고, 이에 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 감광제, 산화 그래핀, 및 엽산-알부민-감광제 결합체가 포함되는 암 치료용 나노 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 산화 그래핀과 엽산-알부민-감광제 결합체를 혼합하는 제1단계 및 상기 제1단계의 혼합물에 감광제를 혼합하는 제2단계를 포함하는, 나노 복합체 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 나노 복합체를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 진단 및 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는, 감광제, 산화 그래핀, 및 엽산-알부민-감광제 결합체가 결합되어 포함되는 암 치료용 나노 복합체를 제공한다.
감광제, 산화 그래핀, 및 엽산-알부민-감광제 결합체가 결합되어 있는 나노 복합체는 레이저 조사시 단일상태산소가 생성되고, 암 세포에 우수한 표적성을 나타냄과 동시에 잘 흡수되며, 암세포와 함께 처리한 후 빛을 조사시 암세포에 대한 세포 독성 효과를 가지는 바, 상기 나노 복합체는 암의 진단 및 치료 용도로 널리 이용될 수 있다. 나아가, 본 발명은 감광제, 산화 그래핀, 및 엽산-알부민-감광제 결합체가 결합되어 있는 나노 복합체가 산화 그래핀 및 엽산-알부민-감광제 결합체만 결합되어 있는 복합체에 비해 암세포에 대한 우수한 세포 독성을 갖는 것을 최초로 발견한 것에 기초한다.
본 발명의 "감광제"는 광을 흡수하여 여기상태(excited state)가 된 계에 에너지를 이동하여 반응을 촉진시키는 것을 의미할 수 있다.
상기 감광제가 포함된 세포에 광을 조사할 경우, 감광제가 광을 흡수하여 에너지가 높은(단일상태산소) 여기상태가 된 후, 다시 에너지가 낮은 바닥상태로 이동하면서 빛을 방출한다. 상기 빛의 방출과정에서 주위의 산소는 세포에 독성을 나타내는 활성산소(단일상태산소)로 활성화되어 세포의 사멸을 이끈다. 따라서, 암 세포가 상기 감광제를 선택적으로 흡수하게 될 경우, 암 세포에 대해서만 특이적으로 세포의 사멸을 유도할 수 있다.
상기 감광제는 소랄렌(psoralen), 포르피린(porphyrin), 클로린(chlorin), 박테리오클로린(bacteriochlorin), 페오포르비드(pheophorbide), 박테리오페오포르비드(bacteriopheophorbide), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 및 프로토포르피린(protoporphyrin) Ⅸ에 대한 전구체로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 광을 조사하여 활성 산소를 형성하여 세포 사멸 효과를 나타내는 것이라면 제한없이 사용된다. 일 예로 상기 감광제는 페오포르비드-a일 수 있다.
일 실시예에서는 감광제, 산화 그래핀, 및 엽산-알부민-감광제 결합체가 결합되어 있는 나노 복합체에 670 nm 레이저를 조사한 결과 단일상태산소(singlet oxygen)가 빛의 조사에 의존적으로 생성됨을 확인하였다(도 5a, 및 5b).
또한, 일 실시예에서는 상기 나노 복합체를 쥐과의 흑색종(melanoma) 세포주 B16F10과 인간의 유방선암(adenocarcinoma) 세포 주인 MCF-7에 첨가하여 배양한 뒤 광독성을 확인한 결과, 빛을 조사한 경우 높은 광독성을 나타내나, 빛을 조사하지 않은 경우 광독성을 나타내지 않음을 확인하였으며(도 9a 내지 9d), MCF-7 종양 모델 마우스에 상기 나노 복합체를 투여한 결과, 마우스의 종양 부위에서 높은 형광 신호가 나타남을 확인하여, 상기 나노 복합체는 우수한 종양 특이성을 나타냄을 확인하였다(도 10 내지 11b).
본 발명의 "산화 그래핀"은 탄소 원자들이 2차원 상에서 벌집 모양의 배열을 이루면서 원자 한층의 두께를 갖는 전도성 물질인 그래핀이 산화된 물질을 의미한다.
상기 산화 그래핀은 감광제 및 엽산-알부민-감광제 결합체와 π-π 겹침(stacking) 및 소수성 결합으로 결합된 것일 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 나노 복합체는 산화 그래핀의 방향 고리와 감광제의 방향 고리 및 엽산-알부민-감광제 결합체에서 감광제의 방향 고리가 π-π 겹침을 형성하여 결합된 것일 수 있다.
상기 π-π 겹침은 파이 본드를 포함하는 방향 고리 사이의 비공유 결합을 의미하며, 상기 소수성 결합은 소수기가 서로 집합하는 현상을 의미한다.
본 발명의 "엽산-알부민-감광제 결합체"는 엽산과 알부민이 직접 또는 링커를 통해 결합하고, 알부민과 감광제가 직접 또는 링커를 통해 결합한 것으로서 엽산, 알부민, 및 감광제가 순서대로 결합되어 있는 결합체를 의미한다.
상기 "-"은 둘 이상의 물질이 결합되어 있는 상태를 의미하며, 상기 결합은 본 발명의 나노 복합체가 암 치료 용도를 상실하지 않는 범위 내에서 일반적으로 사용되는 종류의 결합일 수 있다.
상기 결합체에서 알부민은 시스-아코니틸(cis-aconityl) 결합으로 감광제와 결합된 것일 수 있고, 또는/및 폴리에틸렌글리콜(poly ethyleneglycol, PEG) 결합으로 엽산과 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리에틸렌글리콜은 (C2H6O2)n의 분자식을 갖는 세포융합을 일으키는데 사용하는 중합체를 의미하며, 본 발명에서는 엽산과 알부민 사이의 결합을 하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 시스-아코니틸 결합은 화학식 C6H6O6의 시스 아코니트산(cis-aconitic acid)를 매개로 하는 결합으로서, 약산성 조건에서 절단되는 것일 수 있다.
상기 약산성 조건은 pH 3.0 내지 6.0일 수 있고, 구체적으로 pH 4.0 내지 5.0 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 시스-아코니틸 결합은 알부민과 감광제 사이를 연결하여 약산성 조건에서 감광제가 알부민으로부터 절단되도록 하는 역할을 하는 것이다. 상기 약산성 조건은 암 세포 내의 환경과 유사하므로, 결국 본 발명의 나노 복합체는 시스-아코티닐 결합이 약산성 조건에서 절단되는 특징을 이용하여 암 세포 내에서 감광제가 특이적으로 축적되는 특징을 갖는다.
일 실시예에서는 본 발명의 상기 나노 복합체를 pH의 조건을 달리하여(pH 5.0 조건과 7.4 조건) 배지 내에 방출된 감광제를 분석한 결과, 산성을 띠는 pH 조건에서 감광제가 효과적으로 방출됨을 확인하였다(도 6). 특히, pH 5.0 조건은 세포 내부의 환경과 유사한 환경으로서, 상기 나노 복합체가 세포 내에 유입될 경우, 시스-아코티닐 결합이 절단되어 감광제가 특이적으로 축적될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 "알부민"은 난백(egg white, 오브알부민; ovalbumin), 소혈청, 인간혈청 또는 곡물로부터도 추출할 수 있으며, 자연적으로 존재하는 알부민과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 발현하도록 제조된 형질전환체로부터 수득한 재조합 알부민을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 알부민은 혈액 내에서 보존 효과가 뛰어나고, 강화된 침투성을 갖는 특징이 있어 약물과 결합체를 형성하여 표적 세포 내로 약물을 운반하는 운반체로서의 역할을 수행할 수 있는데, 상기 알부민에 의하여 운반된 약물은 표적 세포에 작용하여 특정 질환을 치료하는데 사용될 수 있다(Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2009, 96, 66-74).
본 발명의 "엽산"은 비타민 B9 또는 비타민 M 이라고도 불린다. 엽산은 엽산 수용체와 특이적 결합을 이루며, 엽산 수용체는 종양세포에서 주로 발현되고 정상 림프절 구성 세포에는 적게 발현이 되는 것을 특징으로 한다.
상기 "엽산 수용체"는 종양과 관련된 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커 단백질로서, 엽산 또는 엽산이 결합된 물질이 수용체-매게 엔도사이토시스를 통하여 섭취되도록 한다.
상기 엽산-알부민-감광제 결합체는 엽산에 의해 엽산 수용체가 과발현 되는 암세포에 특이적으로 결합하는 특성을 나타내고, 알부민에 의해 감광제의 전달 효율을 높이며, 감광제에 의해 암세포의 사멸 효과를 나타낼 수 있어, 상기 결합체를 포함하는 본 발명의 나노 복합체는 암세포에 대한 표적 특이성을 나타내며 암 치료 용도로 사용될 수 있다.
상기 암은 예를 들어 대장암, 췌장암, 위암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 난소암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서 설명된 여러 암의 종류 중, 세포의 표면에 엽산 수용체가 과발현되는 암에는 상피성 난소암, 자궁암, 유방암, 폐암, 신장암, 대장암, 및 뇌종양 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에서는, 본 발명의 나노 복합체를 쥐과의 흑색종(melanoma) 세포주 B16F10과 인간의 유방선암(adenocarcinoma) 세포 주인 MCF-7에 첨가하여 배양한 뒤 감광제인 PheoA의 세포 내 이동을 확인한 결과, 본 발명의 나노 복합체가 자유 PheoA 및 엽산이 결여된 나노 복합체에 비해 세포 내 표적성이 높게 나타남을 확인하였다(도 7a 내지 8d).
상기 나노 복합체는 엽산-알부민-감광제 결합체, 산화 그래핀, 및 감광제를 5 내지 15 : 3 내지 7 : 1 중량비로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로 5 내지 15 : 5 : 1 중량비로 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 10 : 5 : 1 중량비로 포함할 수 있다.
상기 나노 복합체가 상기의 중량비를 초과하여 엽산-알부민-감광제 결합체 및 산화 그래핀을 포함할 경우 나노 복합체의 크기가 세포 투과력을 갖는 일정 수준의 크기를 초과하여 나노 복합체의 세포 투과성이 현저히 떨어지는 문제점이 발생할 수 있다.
또한, 상기의 중량비에 미달된 엽산-알부민-감광제 결합체 및 산화 그래핀을 포함할 경우, 엽산-알부민-감광제 결합체, 산화 그래핀, 및 감광제를 모두 포함하는 나노 복합체의 형성이 제대로 이루어지지 않으며, 암세포로의 표적성 및 운반 효율이 떨어지는 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 산화 그래핀과 엽산-알부민-감광제 결합체를 혼합하는 제1단계 및 상기 제1단계의 혼합물에 감광제를 혼합하는 제2단계를 포함하는 나노 복합체의 제조방법을 제공한다.
상기 제1단계는 산화 그래핀과 엽산-알부민-감광제 결합체를 혼합하는 단계로서, 수용액에 존재하는 산화 그래핀과 완충용액에 존재하는 엽산-알부민-감광제 결합체를 12 내지 20시간 동안 교반하여 수행할 수 있다.
상기 제2단계는 제1단계의 혼합물에 감광제를 혼합하는 단계로서, 본 발명의 나노 복합체를 제조하기 위한 구성이 모두 포함되어 있으며, 복합체 제조시 초음파를 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업계에서 널리 알려진 방법으로 제조할 수 있다.
상기 제1단계의 혼합물에 혼합되는 감광제는 유리형 감광제일 수 있다. 상기 유리형 감광제를 혼합하는 제2단계를 포함하여 제조한 나노 복합체의 경우 제1단계만 포함하여 제조한 나노 복합체에 비해 유리형 감광제의 초기 방출능이 우수하여 암세포에 대한 세포 독성이 뛰어날 수 있다.
일 실시예에서는 상기 제조방법에 따라 제조된 나노 복합체와 제1단계만을 수행한 나노 복합체 각각의 암세포에 대한 독성을 확인한 결과, 상기 제조방법에 따라 제조된 나노 복합체의 경우 낮은 농도에서도 우수한 독성을 나타내는데 반해, 제1단계만을 수행한 나노 복합체는 동일한 농도에서 세포 독성이 현저히 낮게 나타남을 확인하였다(도 9b).
상기 제조방법은 엽산-알부민-감광제 결합체, 산화 그래핀, 및 감광제를 5 내지 15 : 3 내지 7 : 1 중량비로 혼합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로 5 내지 15 : 5 : 1 중량비로 혼합할 수 있으며, 보다 구체적으로 10 : 5 : 1 중량비로 혼합할 수 있다.
일 실시예에서는 엽산-알부민-감광제 결합체, 산화 그래핀, 및 감광제를 상기의 중량비로 혼합하여 나노 복합체를 제조한 결과, 150 내지 220 nm의 크기와 -20 내지 -40 mV의 제타 전위값을 나타내는 것을 확인하였으며, 육안으로 관찰한 결과 갈색으로 색깔이 변화함을 확인하여 나노 복합체가 정상적으로 제조될 수 있음을 확인하였으며, 상기 비율에서 최적의 나노 복합체를 제조할 수 있음을 확인하였다(표 1, 및 도 2 내지 4d).
상기 제1단계의 엽산-알부민-감광제 결합체의 제조방법은 알부민이 존재하는 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에 감광제를 첨가하여 알부민-감광제 결합체를 제조하는 단계 및 상기 알부민-감광제 결합체와 폴리에틸렌글리콜화된 엽산을 혼합하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 알부민을 완충용액에 용해시킨 후 흡습성 유기용제에 존재하는 감광제를 첨가하여 1 내지 3시간동안 상온에서 혼합하여 알부민-감광제 결합체를 제조할 수 있다. 상기 결합체의 알부민은 시스-아코니틸 결합으로 감광제와 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 약산성 조건에서 감광제가 알부민으로부터 절단되도록 하는 역할을 갖는 결합일 수 있다.
상기 알부민-감광제 결합체가 존재하는 염기성 수용액에 폴리에틸렌글리콜화된 엽산을 첨가하여 1 내지 3시간동안 혼합하여 엽산-알부민-감광제를 제조할 수 있다. 상기 결합체의 알부민은 폴리에틸렌글리콜 결합으로 엽산과 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 나노 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 진단 및 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 "개체"는 암이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 나노 복합체를 도입하는 것을 의미하며, 상기 나노 복합체가 암의 치료에 효과가 있는 특성상, 상기 조성물의 투여 경로는 경구 또는 비경구를 통하여 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 암의 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 나노 복합체는 암세포에 특이적으로 흡수되며, 세포 내 조건인 산성 조건에서 특이적으로 감광제가 방출되므로 산화 그래핀 또는 감광제의 유무를 확인하여 암의 진단이 가능할 수 있다.
본 발명의 "치료"는 본 발명에 따른 나노 복합체를 암의 발병이 의심되는 개체에 투여하여 상기 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
일 실시예에서는, 암세포가 생체이식된 동물모델에 본 발명의 나노 복합체를 투여한 결과 동물모델의 체중은 감소하지 않은 채 종양의 성장이 억제됨을 확인하여, 본 발명의 나노 복합체는 인체에 무해함과 동시에 암의 치료 효과를 나타냄을 알 수 있었다(도 12a 내지 12d).
상기 나노 복합체를 개체에 투여하는 경우 상기 나노 복합체는 감광제, 산화 그래핀, 및 엽산-알부민-감광제 결합체가 결합되어 있는 것으로서, 감광제의 신호를 확인하여 암세포의 존재 및 위치를 확인할 수 있어 암의 진단이 용이하고, 감광제의 신호가 확인된 부위에 빛을 조사할 경우 암세포의 사멸을 통한 암의 치료가 용이하여 암의 진단과 치료를 동시에 수행할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 암 치료용 나노 복합체는 암세포에 표적성을 갖고, 암세포 내로 유입이 용이하며, 암세포 내 환경에서 감광제를 효과적으로 전달하여 암을 효과적으로 치료할 수 있다.
도 1은, PheoA, GO, 및 FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노입자를 혼합하여 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체를 제조하는 과정을 나타낸 개략도이다.
도2는, PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 3은, 수용액 상태에서 자유 PheoA(Ⅰ), 자유 GO(Ⅱ), 및 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체(Ⅲ)를 비교한 사진이다.
도 4a는, GO 와 BSA-c-PheoA 결합체의 혼합 비율에 따라 나타나는 PheoA에 대한 흡광도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4b는, FA-PEG-BSA-c-PheoA 와 GO 를 혼합하여 결합체를 제조시 PheoA에 대한 흡광도가 증가하는 것을 나타낸 그래프이다.
도 4c는, GO 와 BSA-c-PheoA 결합체의 혼합 비율에 따라 나타나는 PheoA에 대한 형광도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4d는, FA-PEG-BSA-c-PheoA 와 GO 를 혼합하여 결합체를 제조시 PheoA에 대한 형광도가 감소하는 것을 나타낸 그래프이다.
도 5a는, 빛의 조사에 의존적으로 단일산소를 생성하는 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체의 특징을 나타낸 그래프이다.
도 5b는, 빛의 조사시간이 길어질수록 9,10-디메틸안트라센(dimethylanthracene, DMA)의 형광도 감소하는 것을 나타낸 그래프이다.
도 6은, pH 5.0 조건과 pH 7.4 조건에서 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체의 배양시간에 따른 PheoA의 방출 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7a는, B16F10 세포에 종류별 분석 시료를 처리한 후, 형광도를 측정한 사진이다.
도 7b는, MCF7 세포에 종류별 분석 시료를 처리한 후, 형광도를 측정한 사진이다.
도 8a는, B16F10 세포에 종류별 분석 시료를 처리한 후, 형광 밀도를 분석한 그래프이다;
초록색: PBS와 배양;
주황색: 자유 PheoA와 배양;
파란색: PheoA + GO + BSA-c-PheoA 나노 복합체와 배양;
핑크색: PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체와 배양.
도 8b는, MCF7 세포에 종류별 분석 시료를 처리한 후, 형광 밀도를 분석한 그래프이다;
초록색: PBS와 배양;
검정색: 자유 PheoA와 배양;
파란색: PheoA + GO + BSA-c-PheoA 나노 복합체와 배양;
빨간색: PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체와 배양.
도 9a는, 종류별 분석 시료를 처리한 B16F10 세포에 레이저를 조사한 후, 세포의 생존율을 분석한 그래프이다.
도 9b는, 종류별 분석 시료를 처리한 MCF-7 세포에 레이저를 조사한 후, 세포의 생존율을 분석한 그래프이다.
도 9c는, 종류별 분석 시료를 처리한 B16F10 세포에 레이저를 조사하지 않은 경우, 세포의 생존율을 분석한 그래프이다.
도 9d는, 종류별 분석 시료를 처리한 MCF-7 세포에 레이저를 조사하지 않은 경우, 세포의 생존율을 분석한 그래프이다.
도 10은, MCF-7 종양 모델 마우스에 종류별 분석 시료를 처리한 후, 시간 별 종양 부위의 형광신호를 나타낸 사진이다.
A: PBS;
B: 자유 PheoA;
C: PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체.
도 11a는, MCF-7 종양 모델 마우스에 종류별 분석 시료를 처리한 경우, 조직 별 형광신호를 나타낸 사진이다;
A: PBS;
B: 자유 PheoA;
C: PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체;
Tu: 종양;
Sk: 피부;
Li: 간;
Sp: 비장;
Ki: 신장;
Ht: 심장;
Lu: 폐;
Br: 뇌.
도 11b는, MCF-7 종양 모델 마우스에 종류별 분석 시료를 처리한 경우 종양부위와 피부에서의 시료별 형광도를 비교한 그래프이다.
도 12a는, B12F10 세포가 생체이식된 마우스에 종류별 분석 시료를 처리한 후 종양의 크기를 육안으로 확인한 사진이다;
Ⅰ: PBS;
Ⅱ: PheoA;
Ⅲ: FA-BSA-c-PheoA 결합체;
Ⅳ: PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체.
도 12b는, B12F10 세포가 생체이식된 마우스에 종류별 분석 시료를 처리한 후 종양의 부피를 나타낸 그래프이다.
도 12c는, B12F10 세포가 생체이식된 마우스에 종류별 분석 시료를 처리한 후 마우스의 체중을 나타낸 그래프이다.
도 12d는, B12F10 세포가 생체이식된 마우스에 종류별 분석 시료를 처리한 후 치료 지수(therapeutic index, TI)를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<재료의 준비>
소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA), 엽산(folic acid, FA), 산화 그래핀(graphine oxide, GO), 및 cis-아코니틱 무수물(aconitic anhydride)은 시그마-알드리치(St. Louis, Missouri)로부터 구입하였다. 페오포르비드-a(pheophorbide-a, PheoA)는 Frontier Scientific, Ltd. (Logan, UT)으로부터 구입하였다. 모든 다른 시약들은 달리 언급되지 않는 한, 시그마-알드리치 및 도쿄화학공업(Tokyo, Japan)으로부터 구입하였다.
실시예 1: PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c- PheoA 나노 복합체의 제조방법
실시예 1-1: cis - aconityl - PheoA 결합체 (conjugate)의 형성
PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체의 제조를 위한 출발 물질로서, PheoA-에틸렌디아민(PheoA-EDA)을 기존에 알려진 방법에 따라 제조하였다(Battogtokh et al, 2012). 제조된 PheoA-EDA (100 mg, 0.16 mmol)을 5 mL의 메탄올과 디클로로메테인(dichloromethane, DCM) 혼합용액에 용해시켰다. 아르곤 가스의 존재 하에 0 ℃, 어두운 조건에서 1,4-디옥산(dioxane) (1 mL)에 존재하는 cis-아코니틱 무수물(cis-aconitic anhydride) (122.9 mg, 0.787 mmol)을 상기 용액에 천천히 첨가한 후, 2시간 동안 상온에서 혼합하여 cis-aconityl-PheoA 결합체 (이하, "c-PheoA"라 한다)를 제조하였다.
실시예 1-2: BSA-c- PheoA 결합체의 합성
5 mL의 클로로포름에 존재하는, 상기 실시예 1-1에 따라 형성된 cis-aconityl PheoA (c-PheoA; 30 mg, 0.047 mmol)를 5 방울의 트리에틸아민(triethylamine)의 존재 하에, N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS, 5.4 mg, 0.047 mmol), 및 에틸렌-카르보디이미드(ethylene-carbodiimide, 14.6 mg, 0.094 mmol)와 6시간 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 반응물을 실리카 겔 컬럼에서 정제한 후에, 부분표본을 진공 하에서 건조하여 강한 향기가 나는 c-PheoA-EDA의 가루를 수득하였다.
BSA (126 mg, 0.0019 mmol)를 2 mL의 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS; 0.1 M 탄산수소나트륨을 첨가하여 pH를 8.5 유지)에 용해시킨 후, 0.2 mL의 DMSO에 존재하는 상기 succinated c-PheoA-EDA를 천천히 첨가한 다음 1시간 동안 상온에서 혼합하여, BSA와 c-PheoA가 링커를 통해 결합된 결합체(이하, "BSA-c-PheoA 결합체"라 한다)를 제조하였다.
실시예 1-3: FA-PEG-BSA-c- PheoA 결합체의 형성
폴리에틸렌 글리콜화된 (PEGylated) FA(이하, "FA-PEG"라 한다)를 아래와 같이 제조하였다. 구체적으로, 100 mg (0.225 mmol)의 FA를 1 mL의 건조 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 후, 상기 용액을 3방울의 트리에틸아민의 존재 하에 25.9 mg (0.225 mmol)의 NHS와 92.5 mg (0.45 mmol)의 디사이클로헥실 카보이미드(dicyclohexyl carbodiimide, DCC)에 첨가하였다. 상온에서 3시간 동안 혼합한 후, 281 mg (0.14 mmol)의 PEG2000-amine (1:1.6 몰비의 NH2-PEG/FA)을 상기 활성화된 FA에 첨가한 다음, 질소 하에서 상온에서 2시간 동안 혼합하였다. 회전 증발기를 사용하여 유기 용매를 제거하였고, 6 mL 증류수를 사용하여 잔여물을 다시 수화하였으며, 용해되지 않은 부산물을 제거하기 위해 10분간 4000 rpm에서 원심분리하였다. 그 뒤, 상층액을 48시간 동안 감압 하에 동결건조하였다. 이를 통해 FA-PEG-OH를 형성하였다.
한편, 2 mL의 무수 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran, THF)에서 상기 FA-PEG-OH (12.5 mg, 0.0052 mmol)의 히드록시 그룹을 활성화시키기 위해, 6.56 mg (0.025 mmol) N,N-디숙시이미딜 탄산염(disuccinimidyl carbonate)과 2 mg (0.016 mmol)의 4-(dimethylamino) pyridine을 첨가하여 상온, 아르곤 조건에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후에, 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 결과로서 얻어진 0.4 mL의 DMSO 내의 succinated FA-PEG을 상기 실시예 1-2에서 제조된 60 mg (0.00086 mmol)의 BSA-c-PheoA 결합체가 존재하는 5 mL의 탄산수소나트륨 용액(0.1M, pH 8.3)에 5분당 200 μL의 속도로 첨가한 다음, 아르곤의 존재 하에서 1시간 30분 동안 혼합하였다. Sephadex G25 column (DP-10; GE Healthcare, Little Chalfont, UK)을 사용하여 반응 생성물 내 불순물을 제거하여, FA-PEG와 BSA-c-PheoA가 결합한 결합체(이하, "FA-PEG-BSA-c-PheoA 결합체"라 한다)를 제조하였으며, 동결건조기(lyophilizer) 내에서 48시간 동안 동결건조하였다.
실시예 1-4: PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c- PheoA 나노 복합체의 제조
PheoA+ GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체의 제조방법은 도 1에서 표현된 것과 같다.
구체적으로, 정제수(Distilled water, DW)에 존재하는 2mg의 GO와 2㎖ PBS에 존재하는, 상기 실시예 1-3에 따라 제조된 FA-PEG-BSA-c-PheoA 결합체 4mg을 16시간동안 교반하였다. 상기 교반과정에서 DMSO에 존재하는 57㎕의 자유 PheoA(0.4mg)를 천천히 첨가하였다. 상기 과정에 따라 제조된 혼합물에 욕조형(bathtype) 초음파발생장치(Branson, Danbury, Connecticut)에서 10분 동안 초음파를 처리하고, 14,000 rmp, 4 ℃ 조건에서 30분간 원심분리한 후, 정제수를 이용하여 세척하였다. 잔류물에 4 ㎖ 정제수를 첨가하여 볼텍싱한 뒤, 프로브형 Sonics Vibra Cell 초음파처리기(Sonics and Materials Inc. Newtown, CT)를 이용하여 10분(진동, 2초 off 및 2초 on)간 초음파를 처리하였다. 상기 용액을 2,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 응집물을 제거하여 자유 PheoA 및 FA-PEG-BSA-c-PheoA 결합체가 각각 GO와 π-π 겹침(stacking)에 의해 형성된 복합체(이하, "PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체"라 한다)를 제조하였다.
상기 나노 복합체 내의 PheoA 함량은 Synergy MX 형광측정기(Biotek, Winooski, VT)를 사용하여 표준곡선을 기초로 하여 405 nm 내지 680 nm에서 측정하였다.
또한, 제타 전위와 입자 크기 분석기 (ELSZ-1000, Otsuka Electronics Co, Osaka, Japan)를 사용하여 동적 광산란계 및 전기영동 광산란계(레이저 Doppler)를 통해 상기 나노 복합체의 유체역학적 지름과 제타 전위를 측정하였다. 산란된 빛은 23 ℃, 90° 각도에서 측정하였고, 데이터의 분석을 위해 점도는 0.933 mPa, 굴절률은 1.333으로 설정하였다.
나아가, 형광 발산 스펙트럼은 Cary Eclipse 형광분광광도계 (fluorescence spectrophotometer) (Agilent Technology, Santa Clara, CA)를 사용하여 측정하였다. 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼은 Cary 60 UV-vis 분광광도계 (Agilent Technology, Santa Clara, CA)를 사용하여 측정하였다. 모든 광학 측정은 상온에서 수행하였다.
상기 제조방법에 따라 제조된 나노 복합체의 물리적 특성을 분석한 결과, GO:BSA-c-PheoA를 0.5:1의 비율로 혼합하여 제조한 나노 복합체의 크기는 163.8 ± 9.35 nm 이고, GO:FA-PEG-BSA-c-PheoA를 0.5:1의 비율로 혼합하여 제조한 나노 복합체의 크기는 182.0 ± 33.2 nm임을 확인하였다(표 1, 및 도 2).
PheoA의 봉입 효율과 봉입 함량은 각각 97%와 38%임을 확인하였으며, 이를 통해, 상기 나노 복합체는 적절한 양의 GO를 함유하는 것을 확인하였다(표 1, 및 도 2).
또한, PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체는 GO(-24.59 mV) 보다 더 음의 값인 -29.62 mV의 제타 전위값을 나타내는 것을 확인하였는데, 이를 통해 GO의 표면에 음의 전하를 띠는 FA-PEG-BSA-c-PheoA가 응집되었음을 확인하였다(표 1).
또한, 자유 PheoA, 자유 Go, 및 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체를 육안으로 관찰한 결과 녹색에서 갈색으로 색깔이 변화함을 확인하였다(도 3). 이를 통해, 형성된 나노 복합체에 GO가 봉입되어 있음을 확인하였다.
제형 크기(nm) 제타 전위값(mV) 다분산성지수(PDI)
GO 나노입자 248.77 ± 51.20 -24.59 ± 1.29 0.50 ± 0.11
GO:BSA-c-PheoA 나노복합체(1:1 w/w) 117.27 ± 20.35 -40.79 ± 1.12 0.14 ± 0.1
GO:BSA-c-PheoA 나노복합체(0.5:1 w/w) 163.8 ± 9.35 -37.1 ± 0.15 0.27 ± 0.03
GO:BSA-c-PheoA 나노복합체(0.1:1 w/w) 214.23 ± 33.91 -17.52 ± 0.81 0.36 ± 0.02
GO:FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노복합체(0.5:1 w/w) 149.07 ± 17.82 -28.55 ± 1.05 0.27 ± 0.02
PheoA+GO:FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노복합체(0.5:1 w/w) 182.0 ± 33.2 -29.62 ± 1.02 0.26 ± 0.02
PheoA, Go, 및 복합체의 흡수 및 형광도를 측정한 결과, 나노 복합체 형성시 혼합된 GO의 비율이 높을수록 380 nm에서 소레트 흡수대(soret band) 및 680 nm에서 Q 밴드를 나타내는 PheoA의 피크가 증가하는 것을 확인하였다(도 4a, 및 도 4b).
반면, PheoA의 형광도는 GO와 BSA-c-PheoA가 복합체 형성시, 감소하는 것을 확인하였다(도 4c, 및 도 4d). 상기 형광도 감소의 원인은 PheoA가 GO와 복합체를 형성할 경우 PheoA로부터 GO로 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)가 일어나는 것으로서, GO와 PheoA가 정상적으로 복합체를 형성하였음을 확인하였다.
또한, 상기 물리적 특성의 분석을 통해, 실시예 1-4의 제조방법에 의해 나노 복합체를 정상적으로 제조할 수 있음을 확인하였고, 특히, GO : FA-PEG-BSA-c-PheoA의 비율이 0.5 : 1인 경우 최적의 나노 복합체를 형성할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, GO : BSA-c-PheoA의 비율이 1:1인 경우 크기가 150 nm 이하이고, 0.1:1인 경우 200nm 이상으로서 나노 복합체가 세포 내로 이입되어 감광제를 전달하는데 적합하지 않음을 확인하였다.
실시예 2: 단일상태산소( singlet oxygen)의 검출
PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노복합체의 단일상태산소의 생성(singlet oxygen generation, SOG)을 측정하기 위해, 9,10-디메틸안트라센(dimethylanthracene, DMA)을 사용하여 기존에 보고된 방식으로 측정하였다(Biomaterials, 31, 6325-6335, 2010).
구체적으로, 정제수에 존재하는 상기 실시예 1-4에 따라 제조된 나노 복합체(1.5 μ/㎖ PheoA 포함)에 디메틸포름아마이드(dimethylformamide)에 존재하는 DMA(20 mM)를 첨가하여 최종적으로 DMA가 20 μM 농도가 되도록 한 후, 670 nm 레이저로 조사하였다. DMA의 형광 방출은 360nm 여기 하에 Cary Eclipse 형광 분광기(Agilent Technology, Santa Clara, CA)를 사용하여 측정하였다. 단일상태산소의 생성은 배경에 비해 DMA 형광의 감소된 정도를 비교하여 평가하였다.
평가 결과, DMA의 형광 강도는 빛이 조사되는 시간에 의존적으로 감소하였으며, 이를 통해 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체로부터 생성되는 단일산소는 빛의 조사에 의존적으로 생성됨을 확인하였다(도 5a, 및 5b).
실시예 3: In vitro 상에서 pH 조건 변화에 따른 PheoA 방출 실험
상기 실시예 1-4 따라 제조된 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체 용액 (200 μL, 50 μg/mL의 PheoA)을 12 kDa의 분자량 제한이 있는 Mini-Pur-A-Lyzer 튜브(씨그마-알드리치)에 첨가하였다. 상기 튜브를 0.5% (w/v) Tween 80을 포함한 3 mL의 PBS 배지(pH 7.4 또는 pH 5.0)에 담근 후, 50 rpm의 회전 하에서 37 °C 조건에서 배양하였다. 상기 배지 전체 양의 3mL을 특정 시간(1, 2, 3, 4, 6, 9, 24, 그리고 48 h) 에서 회수하였고, 37 ℃에서 3 mL의 신선한 배지로 교환하였다. Synergy MX 형광측정기(Biotek, Winooski, VT)를 사용하여 405 nm 내지 680 nm에서의 형광도를 측정하여 PheoA의 방출량을 측정하였다.
측정 결과, pH 5.5 조건에서 24시간 배양한 경우, PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체에서 방출된 PheoA는 약 80%인 반면, pH 7.7 조건에서 24시간 배양한 경우, 50% 미만의 PheoA만이 방출됨을 확인하였다(도 6).
이를 통해, PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체에서 cis-aconityl 결합의 제거는 산성 조건에서 일어남을 확인하였고, 산성 조건에서 PheoA가 방출됨을 확인하였다.
실시예 4: PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c- PheoA 나노 복합체의 세포 흡수와 표적화
PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체가 세포 내부로 효과적으로 흡수되는지 확인하기 위해, 자유 PheoA 및 엽산이 결여된 나노 복합체 (PheoA + GO + BSA-c-PheoA)와 비교실험을 실시하였다.
구체적으로, 쥐과의 흑색종 (melanoma) 세포 주 B16F10과 인간의 유방 선암 (adenocarcinoma) 세포 주인 MCF-7을 실험 수행 24시간 전에 10% FBS가 첨가된 2 mL의 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)이 존재하는 커버글라스를 포함하는 6-웰 플레이트에 6 × 105 세포/웰의 농도로 각각 접종하였다. 자유 PheoA, 실시예 1-4에 따라 제조된 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체 또는 엽산이 결여된 나노 복합체(PheoA + GO + BSA-c-PheoA) (10 μg/mL Pheo-A 포함)를 각각의 웰에 첨가하였고, 세포와 함께 37 ℃에서 1.5, 3, 및 24시간 동안 배양하였다. PheoA의 세포 내부로의 이동을 시각화 하기 위해서, 세포들에 15 μL의 0.5 μM Lysotracker Green DND-26 (Life Technology, Eugene, Oregon)를 30분 동안 처리한 뒤, 차가운 PBS로 2회 세척하였고, 5분 동안 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde) (2 mL)에서 고정시켰다. 다시 이를 차가운 PBS에서 2회 세척하였다. 그 후, 공초점 주사 레이져 현미경(confocal laser scanning microscopy)을 사용하여 세포에 내재하는 PheoA의 형광도를 관찰하였다(여기 405 nm; 방출 600 - 680nm).
관찰 결과, 6시간 배양시 B16F10 세포와 MDF-7세포 내의 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체의 형광 강도는 자유 PheoA와 표적화되지 않은 나노 복합체에 비해 높게 나타남을 확인하였다(도 7a, 및 7b).
이를 통해, 엽산에 의해 표적성을 갖는 나노 복합체들이 세포 내 이입 작용에 의해 세포 내로 흡수될 수 있음을 확인하였다.
실시예 5: 유동세포 계수법(Flow cytometry )의 분석
상기 실시예 4의 세포들과 자유 PheoA 또는 실시예 1-4에 따라 제조된 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체를 함께(PheoA 농도는 3μM로 동일) 6시간 동안 배양하였다. 상기 세포들을 세척하고 PBS에 재현탁한 후, Cell Quest 소프트웨어(BD, Ann Arbor, MI)를 사용하여 BD FACS Calibur 유동세포 계수법에 의해 측정하였다.
측정값을 분석한 결과, 실시예 4의 결과와 마찬가지로 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체가 B16F10 세포와 MCF-7 세포로 흡수되었음을 확인하였다(도 8a, 및 8b).
실시예 6: PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c- PheoA 나노 복합체의 광독성
나노 복합체의 광독성은 빛처리 후에 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 에세이를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, B16F10 세포 또는 MCF7 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 접종하였다 (1.0 × 104 세포/웰). 다양한 농도의 자유 PheoA, PheoA + GO + BSA-c-PheoA 나노 복합체 또는 실시예 1-4에 따라 제조된 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체 (0.375, 0.75, 및 1.5 ㎍/㎖ 의 PheoA)를 첨가하여 6시간 동안 배양한 후에, 671 ± 1 nm 레이저 광원 (Shanghai Dream Lasers Technology Co., Ltd, China)에서 나온 레이저 1.5 J/cm2 를 세포에 조사하였다.
또한 빛의 처리가 없는 상황에서 상기 나노 복합체와 자유 PheoA의 세포독성을 조사하였다. 추가적으로 세포들을 24시간 동안 배양하였고, 세포들의 생존율을 MTT 에세이를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 10 μL의 5 mg/mL MTT 용액을 각각의 세포 배양 웰에 첨가한 다음, 4시간 동안 배양하였다. 100 μL의 DMSO를 배양액에 첨가하여 혼합하였다. 흡광도는 570 nm에서 Epoch 마이크로 플레이트 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 각각의 그룹은 3개의 웰로 구성하였고, 그들의 평균값을 측정값으로 사용하였다.
측정 결과, 상기 세포들에 0.375, 및 0.75 ㎍/㎖의 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체를 6시간 동안 배양한 경우, 자유 PheoA를 배양한 경우에 비해 현저히 우수한 광독성을 나타냄을 확인하였다. 게다가, PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체는 PheoA가 봉입된 GO + BSA-c-PheoA 나노 복합체에 비해 모든 농도군에서 높은 광독성을 나타냄을 확인하였다(도 9a, 및 9b). 이는 엽산 수용체의 매개에 의해 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체의 세포 흡수가 더 잘 일어남을 의미하며, 암세포 내의 산성 환경에서 PheoA가 효과적으로 분리되어 암세포 사멸 효과를 나타낼 수 있음을 의미한다.
한편, 자유 GO는 모든 농도군에서 세포독성을 나타나지 않음을 확인하였으며, 빛을 조사하지 않은 경우 모든 제제의 투여군에서 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 9c, 및 9d). 이는 자유 GO의 낮은 투과성과 안정성에 기인한 것으로, 자유 GO가 가온요법(hyperthermia)에 효과적이지 않음을 나타내는 것이다.
나아가, MCF-7 세포에 0.375 ㎍/㎖ 농도의 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체를 투여한 군의 경우, 동일한 농도의 GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체를 투여한 군에 비해 높은 세포 독성을 나타냄을 확인하였다. 따라서, 동일한 물질을 포함하는 나노 복합체의 경우라도 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체가 다른 나노 복합체에 비해 우수한 세포 독성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 7: 동물실험을 통한 나노 복합체의 종양 표적성
동물실험은 가천대학교 동물 보호 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다. 무 흉선증 누드 마우스(Balb/c)는 Orient-Bio(성남, 한국)에서 얻었다. MCF7 종양 모델은 상기 누드 마우스의 오른쪽 지방에 200 ㎕의 PBS에 존재하는 1.4 × 107 개의 MCF-7 세포를 피하 주사하여 제조하였고, 종양의 체적이 100mm3에 도달할 때 상기 마우스를 이미지화 하였다. 나노 복합체의 PheoA를 형광 이미지를 위해, MCF7 이종 이식 종양을 갖는 마우스의 꼬리 정맥 내로 자유 PheoA, 엽산이 결여된 나노 복합체 (PheoA + GO + BSA-c-PheoA) 또는 상기 실시예 1-4에 따라 제조된 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체(200㎕, 1mg/kg for PheoA)를 주사하였다. 형광 이미지화는 주사 후 1, 3, 6, 및 24시간 경과시 IVIS 광학 이미징 시스템(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA)을 사용하여 수행하였다. PS 스펙트럼은 Living Image @3.1 software(Caliper Life Sciences)을 사용하여 자기 형광스펙트럼으로부터 확인하였다.
한편, 조직과 종양에서의 자유 PheoA 엽산이 결여된 나노 복합체 (PheoA + GO + BSA-c-PheoA) 또는 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체의 축적정도를 비교하기 위해, 상기 마우스를 정맥 주사 후 24시간 뒤 희생하였다. 상기 마우스의 간, 폐, 비장, 신장, 피부, 뇌, 및 심장, 및 종양의 조직을 절제하였다. 조직들은 IVIS 광학 이미징 시스템 및 장파 방출 필터(605 - 720 nm)를 이용하여 PheoA의 형광 강도를 측정함으로써 분석하였다.
측정 결과, PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체를 주입한 마우스의 종양 부위에서 주입 후 3시간, 6시간, 및 24시간 경과 시 형광 신호가 관찰됨을 확인하였고, 주입 후 3시간 뒤의 형광 신호는 자유 PheoA, 및 엽산이 결여된 나노 복합체 (PheoA + GO + BSA-c-PheoA)에 비해 약 2배 이상 높게 나타남을 확인하였다(도 10). 이를 통해 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체는 종양 부위에 높은 비율로 축적됨을 확인하였다. 특히, 자유 PheoA 주사 군의 경우 주입 후 1시간 경과시 피부 및 머리에서 형광 신호가 관찰됨을 확인하여, 종양 특이성이 현저히 떨어짐을 확인하였다.
또한, 마우스의 조직별 PheoA 축적 정도를 형광 강도를 측정하여 분석한 결과, 엽산이 결여된 나노 복합체 (PheoA + GO + BSA-c-PheoA)를 주입한 군(B)의 경우 종양조직이 아닌 피부와 간에서 형광 강도가 높게 나타남을 확인하였다. 이에 반해, PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체를 주입한 군(C)의 경우 종양조직에서 높은 형광 강도가 나타남을 확인하였고, 주입 후 24시간 경과시 다른 조직에는 형광이 나타나지 않았으나, 종양 조직에서는 여전히 형광이 나타남을 확인하였다(도 11a). 구체적으로, 종양 조직에서 PheoA 축적 정도를 나타내는 형광값은 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체를 주입한 군(C)이 자유 PheoA를 주입한 군(B)에 비해 약 2배 이상 높은 강도를 나타내나, 피부 조직에서는 약 2배 이상 낮게 나타남을 확인하였다(도 11b).
이를 통해, PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체는 종양조직에 대한 선택성을 나타나며, 상기 나노 복합체로부터 분리된 PheoA가 종양조직에 축적되어 지속적으로 유지될 수 있음을 확인하였다.
실시예 8: 동물실험을 통한 나노 복합체의 종양 억제 활성
나노 복합체의 종양 성장 억제능을 확인하기 위해, 암세포가 생체 이식된 동물모델에 나노 복합체를 투여하였다. 구체적으로, 6주령된 C57B16/6N 마우스의 후방 부위에 B16F10 세포를 1 × 106/150 (cells/㎕) 농도로 피하 주사하였다. 종양의 부피가 80 내지 100 mm3에 도달하였을 때, PBS, DMSO/DW에 존재하는 PheoA (2mg/kg), 실시예 1-3에 따라 제조된 FA-BSA-c-PheoA 결합체 (2mg/kg의 PheoA), 및 실시예 1-4에 따라 제조된 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체 (2mg/kg의 PheoA)를 각각의 쥐의 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 하루 경과 뒤, 671 nm 다이오드 레이저(100 mW)를 20분간 쥐의 종양 부위에 조사하였다. 종양의 직경은 아들자 캘리퍼스(vernier caliper)를 사용하여 매일 측정하였다. 감광제의 안정성 평가를 위해, 격일 단위로 마우스의 체중을 측정하였다. 각각의 종양의 부피(V)는 다음의 식을 사용하여 측정하였다;
V = (L X W2)/2, L은 가장 긴 직경, W는 길이에 직교하는 최단 직경을 의미한다.
실험의 종료 후, 경추탈골 방법으로 마우스를 희생시킨 다음, 종양 덩어리를 분리하여 치료 지수(therapeutic index, TI)를 측정하고, 종양을 이미지화 하였다. 치료지수는 하기의 식을 사용하여 치료 효과의 정량적인 척도를 측정하였다;
TI (%) = (1 - 실험군의 종양의 무게/대조군의 종양의 무게) X 100.
실험이 종료된 후 종양을 이미지화 한 결과, 대조군 및 다른 실험 군에 비해 PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체를 투여한 군(Ⅳ)에서 종양의 크기가 가장 작게 나타남을 육안으로 확인하였다(도 12a). 또한, 상기 종양의 부피를 측정한 결과, 대조군의 경우 PBS를 투여한지 14일 경과시 종양의 부피는 3903 mm3으로서, 투여 전에 비해 약 41배 이상 부피가 증가하여, B16F10 세포는 매우 빠른 속도로 성장함을 확인하였다. 이에 반해, PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체를 투여한 경우, 다른 모든 실험군에 비해서 종양의 부피가 가장 작게 나타남을 확인하였으며, 대조군에 비해 3배 이상 크기가 작게 나타남을 확인하였다(도 12b). 또한, 모든 군에서 마우스의 체중변화는 나타나지 않아 나노 복합체가 독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 12c).
나아가, 치료 지수를 측정한 결과, PheoA를 투여한 군의 경우 30%, FA-BSA-c-PheoA 결합체를 투여한 군의 경우 47% 정도인 반면, PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체 투여군의 경우 73.5%로서 매우 높은 치료 지수를 나타냄을 확인하였다(도 12d).
이를 통해, PheoA + GO + FA-PEG-BSA-c-PheoA 나노 복합체는 인체에 해를 끼치지 않음과 동시에 종양의 성장 억제능이 우수함을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 감광제, 산화 그래핀(graphene oxide), 및 엽산-알부민-감광제 결합체가 결합되어 포함되는 암 치료용 나노 복합체로서, 상기 엽산-알부민-감광제 결합체는 엽산과 알부민이 직접 또는 링커를 통해 결합하고, 알부민과 감광제가 직접 또는 링커를 통해 결합한 것이며, 상기 산화 그래핀은 감광제 및 엽산-알부민-감광제 결합체와 π-π 겹침(stacking) 및 소수성 결합으로 결합된 것인, 암 치료용 나노 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 감광제는 소랄렌(psoralen), 포르피린(porphyrin), 클로린(chlorin), 박테리오클로린(bacteriochlorin), 페오포르비드(pheophorbide), 박테리오페오포르비드(bacteriopheophorbide), 및 프탈로시아닌(phthalocyanine)을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 나노 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 나노 복합체는 엽산-알부민-감광제 결합체, 산화 그래핀, 및 감광제를 5 내지 15 : 3 내지 7 : 1 중량비로 포함하는 것인, 나노 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 나노 복합체는 엽산-알부민-감광제 결합체, 산화 그래핀, 및 감광제를 5 내지 15 : 5 : 1 중량비로 포함하는 것인, 나노 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 나노 복합체는 엽산-알부민-감광제 결합체, 산화 그래핀, 및 감광제를 10 : 5 : 1 중량비로 포함하는 것인, 나노 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 결합체의 알부민은 시스-아코니틸(cis-aconityl) 결합으로 감광제와 결합된 것인, 나노 복합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 결합체의 알부민은 폴리에틸렌글리콜(poly ethylene glycol, PEG) 결합으로 엽산과 결합된 것인, 나노 복합체.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 감광제는 pH 3 내지 pH 6에서 암세포에 특이적으로 축적되는 것을 특징으로 하는 것인, 나노 복합체.
  10. 산화 그래핀과 엽산-알부민-감광제 결합체를 혼합하는 제1단계; 및
    상기 제1단계의 혼합물에 감광제를 혼합하는 제2단계를 포함하는, 제1항의 나노 복합체 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 엽산-알부민-감광제 결합체, 산화 그래핀, 및 감광제의 중량비는 5 내지 15 : 3 내지 7 : 1 중량비인 것인, 나노 복합체 제조방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 엽산-알부민-감광제 결합체, 산화 그래핀, 및 감광제의 중량비는 5 내지 15 : 5 : 1 중량비인 것인, 나노 복합체 제조방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 엽산-알부민-감광제 결합체, 산화 그래핀, 및 감광제의 중량비는 10 : 5 : 1 중량비인 것인, 나노 복합체 제조방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 제1단계의 엽산-알부민-감광제 결합체의 제조방법은 알부민이 존재하는 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에 감광제를 첨가하여 알부민-감광제 결합체를 제조하는 단계; 및
    상기 알부민-감광제 결합체와 폴리에틸렌글리콜화된 엽산을 혼합하는 단계를 포함하는 것인, 나노 복합체 제조방법.
  15. 제1항에 따른 나노 복합체를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 진단 및 치료 방법.
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