KR20140014443A - 이황화물 연결자 함유 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체 및 이를 이용한 암의 진단 및 치료용 조성물 - Google Patents

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KR20140014443A KR1020120080391A KR20120080391A KR20140014443A KR 20140014443 A KR20140014443 A KR 20140014443A KR 1020120080391 A KR1020120080391 A KR 1020120080391A KR 20120080391 A KR20120080391 A KR 20120080391A KR 20140014443 A KR20140014443 A KR 20140014443A
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Abstract

본 발명은 이황화 연결자로 결합된 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 결합체를 이용하여 암의 선택적 형광 영상 및 광역학 치료에 사용할 수 있는 암의 진단 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

Description

이황화물 연결자 함유 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체 및 이를 이용한 암의 진단 및 치료용 조성물{Graphene oxide-photosensitizers complex containing disulfide linker and composition for diagonosis and therapy of canncer using the same}
본 발명은 그래핀 옥사이드와 광감각제가 이황화 결합된 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체 및 이의 제조방법, 이를 이용한 암의 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
광역학 치료법(photo dynamic therapy: PDT)이라 함은 광감각제(photosensitizer)를 이용하여 수술 없이 암 등의 난치병을 치료하는 기술을 일컫는다. 이러한 광역학 치료법은 BC 1400년경부터 시도되어 20세기 초에 활발한 연구가 진행되었고, 현재에 이르러는 암의 진단과 치료, 동맥경화 및 관절염을 포함한 염증성 질환의 치료, 치과 질환 치료, 자가골수이식, 항생제, AIDS치료, 피부이식 수술, 피부 질환 등의 치료에서 사용되고 있으며 그 응용범위는 점차 확대되고 있다. 광감각제는 특정 파장의 빛에 조사되어 에너지적으로 여기(excitation) 될 수 있으며, 이때는 형광 신호를 발생하거나, 또는 여기된 에너지를 주변의 기질 또는 산소에 전달하여 반응성 산소종(일항산소, 산소 라디칼, superoxide 및 peroxide)를 생성하면서 주변 종양 세포를 자멸(apoptosis) 또는 괴사(necrosis) 시킬 수 있다. 항암제의 경우에는 암세포 뿐 아니라 정상세포에서도 심각한 독성효과를 나타내는 부작용이 문제가 되고 이에 따라서 반복치료가 문제가 되는 것과는 대조적으로, 광감각제는 빛에 노출되지 않으면 높은 농도에서도 세포 독성을 거의 나타내지 않으므로 빛에 노출되지 않은 정상조직은 손상을 입지 않기 때문에 시술에 따른 부작용이 거의 없고 반복 치료가 가능하다.
광감각제를 이용한 광역학 치료법이 기존의 항암치료나 방사선 치료에서 보이는 부작용을 현저히 줄이면서도 암 치료 효과는 극대화 할 수 있는 장점이 있음에도 불구하고, 광역학 치료후 발생하는 피부 광민감성(skin photosensitivity)가 주요 문제점으로 지적이 되고 있다. 즉, 현재 미국 식약청의 허가를 받아서 암치료에 사용되는 광감각제인 Photofrin의 경우, 정상조직에 비특이적으로 축적된 광감각제가 광역학 치료 후에도 오랜기간 동안 피부와 눈 등에 잔존하므로 환자가 빛에 노출되는 경우에 피부 또는 눈의 정상세포를 죽이는 피부 광민감성 부작용을 보인다. 따라서, 환자는 광역학 치료 후 6주 이상 오랜 기간 동안 어두운 실내에서 머물러야 하는 불편함이 있다. 또한, 광감각제가 종양 조직외의 주변 정상조직에도 쌓여 있는 경우에는 광감각제를 이용한 종양의 형광 영상 진단에 있어서도 좋은 성과를 얻을 수가 없다.
정상조직에 대한 비특이적 축적을 줄이기 위하여서 친수성 특성을 띠도록 개질된 광감각제의 경우에는 정상세포에 대한 비특이적인 축적을 줄이고 체내에서 보다 빠르게 배출이 된다는 장점이 있으나, 종양 조직에 치료에 충분한 양이 전달되기 위해서는 용량을 높여서 투여해야 된다는 단점이 있으며, 세포내 침투도 어렵기 때문에 광역학 치료 효능이 낮아진다는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은, 암 세포에 대해 더욱 선택적이고 친화력이 강한 광감각제에 대해 연구하던 중, 이황화물 연결자를 함유한 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체가 그래핀 옥사이드의 작용에 의해 암세포 내로 들어갔을 때만 선택적으로 형광 신호 및 반응성 산소 생성이 활성화 된다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 형광 신호 발생 및 광역학 치료 효과가 표적 환부에서 보다 선택적으로 일어남으로써 질병 병소의 형광 영상 진단 효율을 높이고 광역학 치료 부작용을 줄일 수 있는 이황화 연결자로 결합된 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체 및 이를 함유하는 광역학 치료 또는 진단을 위한 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 광감각제, 상기 광감각제에 대하여 소광제(quencher)로 작용하는 그래핀 옥사이드 나노입자, 및 상기 광감각제와 상기 그래핀 옥사이드 나노입자를 연결하는 연결자를 포함하고, 상기 그래핀 옥사이드 표면으로부터 상기 광감각제가 20nm 이내의 거리에 위치하도록 길이가 조절되고, 상기 연결자는 이황화물 결합(disulfide bond)을 포함하는 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체를 제공한다.
이때, 상기 그래핀 옥사이드는 소광자로서 작용한다. 2차원 평면구조로 이루어져 있는 그래핀 옥사이드는 근적외선 파장 영역 (600-900nm)에서의 높은 빛 흡수 능력을 갖고 있기 때문에, 형광 염료등에 대한 초고효율의(ultra-efficient) 에너지 소광자(energy quencher)로서 가능성을 보여 왔다. 나노입자와 형광 염료간의 에너지 전달현상(resonance energy transfer)에 의한 에너지 소광 현상은 나노입자와 형광 염료간의 거리가 20nm이내에서 효과적으로 일어나는 것으로 알려져 있다. (참고문헌 J. Kim, L.J. cote, F. Kim, J. Huang. Visualizing Graphene Based Sheets by Fluorescence Quenching Microscopy. J. Am. Chem. Soc. (2010) 132, 260-267; J. Li, C-H Lu, Q-H Yao, X-L Zhang, J-J Liu, H-H Yang, G-N Chen. A Graphene Oxide Platform for Energy Transfer-based Detection of Protease Activity. Biosensors and Bioelectronics (2011) 26 3894-3899) 더욱이, 그래핀 옥사이드와 형광염료가 파이-파이 stacking을 이루는 경우에는 이러한 소광현상이 가장 효율적으로 일어난다. 따라서, 본 발명에서는 광감각제를 그래핀 옥사이드와 이황화물 연결자를 통하여 결합(conjugation)시킴으로서 광감각제와 그래핀 옥사이드 간의 거리를 가깝게 유지되도록 인위적으로 조절하였다. 그 결과, 광감각제가 빛에 의해서 조사되더라도 받은 에너지를 그래핀 옥사이드로 빼앗기기 때문에 형광 신호도 생성되지 못하고 반응성 산소종도 생성되지 못하였다. 바람직한 상기 그래핀 나노입자의 직경은 5 nm 내지 500 nm이다.
이황화물 연결자로 결합된 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체가 암세포내로 섭취되는 경우에는, 세포내 리소좀에 높은 농도로 존재하는 글루타치온(glutathione)에 의해서 이황화물 연결자가 끊어지게 되고 광감각제가 그래핀 옥사이드로부터 이탈되면서 형광신호 및 반응성 산소 생성이 다시 활성화된다. 이황화물 연결자를 분해할 수 있는 글루타치온은 혈액내에는 2 μM의 낮은 농도로 존재하지만, 세포내에서는 2~10 mM의 높은 농도로 존재한다. (참고문헌: D.P. Jones, J.L. Carlson, P.S. Samiec, P. Sternberg, Jr., V.C. Mody, Jr., R.L. Reed, L.A. Brown, Clin. Chim. Acta (1998) 275, 175-184; dR. Cheng, F. Feng, F. Meng, C. Deng, J. Feijen, Z. Zhong, J. Controlled Release (2011) 152, 2-12).
그래핀 옥사이드와 광감각제를 결합시키기 위한 이황화물 연결자의 양쪽 말단기의 화학구조는 그래핀 옥사이드 및 광감각제의 관능기(functional group)에 따라서 적절한 것을 사용할 수 있으며, 그래핀 옥사이드와 광감각제가 모두 카르복실산(carboxylic acid)를 관능기로 갖고 있는 경우에는 아래의 화학식 1로 표시되는 화합물과 같은 이황화물 연결자를 사용할 수 있다. 이 경우, 그래핀 옥사이드의 카르복실산이 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 한쪽의 아민기와 아미드 결합 (amide bond)로 공유 결합을 이루고, 광감각제의 카르복실산은 다른 한쪽의 아민기와 아미드 결합을 이루는 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체를 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001

상기 식에서, n1 및 n2는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이고, 바람직하게 n1 및 n2는 각각 2이다.
본 발명에서 광감각제는 특정파장의 빛에 의해서 강한 형광신호를 주로 발생하거나, 또는 형광신호와 반응성 산소 종을 모두 생성시킬 수 있는 화학물질을 의미하며, 그래핀 옥사이드와 거리가 가까운 경우에는 상호간 에너지 전달현상에 의해서 형광신호 및/또는 반응성 산소 생성이 억제된다.
본 발명에서 사용되는 광감각제는 아래에 기재된 광감각제 중의 하나일 수 있다. 아래 기재된 광감각제는 본 발명의 이해를 돕기위한 것이며 여기에 한정되는 것은 아니다.
광감각제의 예( Fluorochromes 및 Photosensitizers )
현재 PDT 요법에 사용되고 있는 광민감성 물질로는 유리 염기(free base) 또는 금속 착물(metal complex) 형태의 포르피린 기반(porphyrin-based) 화합물과 비포르피린(nonporphyrin)계 화합물로 크게 분류 될 수 있다(참고문헌: A.E. O'Connor, W.M. Gallagher, A.T. Byrne, Photochem. Photobiol. (2009) 85(5), 1053-1074; R.R. Allison, V.S. Bagnato, C.H. Sibata. Future Oncol. 2010 6(6), 929-940). 상기 포르피린계(porphyrins) 화합물은 예를 들어, 포르피린 유도체들(porphyrin derivatives); 포르피린을 구성하는 적어도 하나의 피롤(pyrrole)이 피롤린(pyrroline)으로 환원된 환원 포르피린계(reduced porphyrins) 예를 들어, 클로린(chlorin), 박테리오클로린(bacteriochlorin); 또는 포르피린 유사체들 (porphyrin analogues) 예를 들어, 프탈로시아닌(phthalocyanine), 나프탈로시아닌 (naphthalocyanine)이 있다. 하기에는 포피린계 화합물의 중심 골격 구조를 보여주고 있으며, 필요에 따라서 여러 가지 합성 방법에 의해서 곁가지 구조에 카르복실산 등의 관능기를 도입할 수 있다.
Figure pat00002
또한, 하기와 같이 비포르피린 화합물은 하이페리신(hypericin), 로다민(rhodamine), 로즈벵갈 (rose Bengal), 프소랄렌(psoralen), 페노씨아지늄(phenothiazinium) 계열 염료 또는 메로시아닌(merocyanine)등이 있다.
Figure pat00003
형광영상 목적으로 주로 사용되는 광감각제의 예로서는, Molecular Probe 회사로부터 얻을 수 있는 다음의 BODIPY 계열의 형광 염료들: 예를들어 BODIPY　 FL; BODIPY　 TMR STP ester; BODIPY　 TR-X STP ester; BODIPY　 630/650-X STP ester; BODIPY　 650/665-X STP ester등이 있으며, Molecular Probes 사로부터 얻을 수 있는 Alexa 계열의 형광염료들: 예를 들어 Alexa Fluor　 350 carboxylic acid; Alexa Fluor　 430 carboxylic acid; Alexa Fluor　 488 carboxylic acid; Alexa Fluor　 532 carboxylic acid; Alexa Fluor　 546 carboxylic acid; Alexa Fluor　 555 carboxylic acid; Alexa Fluor　 568 carboxylic acid; Alexa Fluor　 594 carboxylic acid; Alexa Fluor　 633 carboxylic acid; Alexa Fluor　 647 carboxylic acid; Alexa Fluor　 660 carboxylic acid; and Alexa Fluor　 680 carboxylic acid를 들수 있다. Amersham-Pharmacia Biotech으로부터 얻을 수 있는 형광 염료의 예로서는 Cy3 NHS ester; Cy 5 NHS ester; Cy5.5 NHS ester; and Cy 7 NHS ester 이며, VisEn Medical, Inc, (Woburn, MA)으로부터 얻을 수 있는 형광염료들은 VivoTag680 and VivoTag750을 예로들 수 있다. ATTO-TEC으로부터 얻을 수 있는 형광염료들: 예를 들어 ATTO 655, ATTO 665, ATTO 647N, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO MB2등을 예로 들 수 있다.
하기 화학식 2는 본 발명의 개념을 증명하기 위해 사용된 클로린(chlorin) 기반 광감각제인 클로린 e6의 구조로서, 클로린 중심 골격구조를 화학적으로 처리하여 제조된다. 본 발명에서, 상기 클로린 e6의 카르복시기는 상기 화학식 1의 아민기와 결합한다.
[화학식 2]
Figure pat00004

광감각제는 이황화물 연결자를 통하여 그래핀 옥사이드와 결합체를 형성하는데, 그래핀 옥사이드-광감각제에 존재하는 광감각제의 결합비율은 전체 결합체 질량의 1 wt% 내지 60 wt% 가 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체에 친수성 고분자가 추가로 결합된 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체를 제공한다. 이러한 친수성 고분자는 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체의 생체적합성 및 수용액상 분산도를 향상시키는 역할을 한다. 또한, 친수성 고분자의 한쪽 말단이 그래핀 옥사이드와 결합되어 있고, 다른 한쪽 말단에 특정 항체, 리보헥산(RNA) 또는 디옥시리보헥산(DNA) 압타머(aptamer), 펩타이드 리간드, 또는 엽산(folic acid)를 결합시킨 경우에는 암세포에 대한 적극적 표적(active targeting)이 가능하게 된다.
상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG); 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG); 메톡시폴리프로필렌 글리콜; 덱스트란(dextran); 히알루론산 (hyaluronic acid); 헤파린(heparin); 헤파란 설페이트(heparan sulfate); 키토산(chitosan); 글리콜 키토산(glycol chitosan); 폴리락틱-폴리글리콜릭 산 공중합체; 폴리에틸렌글리콜-이산(polyethylene glycol-diacid); 폴리에틸렌글리콜 모노아민; 메톡시폴리에틸렌글리콜 모노아민; 메톡시폴리에틸렌글리콜 하이드라자이드; 메톡시폴리에틸렌글리콜 이미다졸; 또는 폴리에틸렌글리콜, 메톡시폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜-이산, 폴리에틸렌 글리콜 모노아민, 메톡시폴리에틸렌글리콜 모노아민, 메톡시폴리에틸렌글리콜 하이드라자이드, 및 메톡시폴리에틸렌글리콜 이미다졸 중 둘 이상의 공중합체; 또는 폴리에틸렌글리콜과 폴리펩티드, 폴리에틸렌글리콜과 다당류(polysaccharide), 폴리에틸렌글리콜과 폴리아미도아민, 폴리에틸렌글리콜과 폴리에틸렌아민 또는 폴리에틸렌글리콜과 폴리뉴클레오티드의 공중합체일 수 있다.
또한, 상기 친수성 고분자로서 특정 항체, 리보헥산(RNA) 또는 디옥시리보헥산(DNA) 압타머(aptamer), 펩타이드 리간드, 또는 엽산(folic acid) 자체를 사용할 수 있다. 이 경우, 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체의 친수성을 향상시킴과 동시에 암세포에 대한 적극적 표적(active targeting)이 가능하게 된다 (참고문헌: A.M. Bugaj. Photochem. Photobiol. Sci. (2011) 10, 1097-1109; A. J. Bullous, C.M. Alonso, R.W. Boyle. Photochem Photobiol Sci. (2011) 10(5), 721-50; Y. Wang, Z. Li, D. Hu, C.T. Lin, , J. Li, Y. Lin, J Am Chem Soc. (2010) 132(27), 9274-9276.).
또한, 본 발명은 상기 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체를 포함하는, 암의 진단 또는 치료용 조성물을 제공한다.
이때, 상기 결합체는 혈액순환시 또는 정상조직에서는 광감각제와 그래핀 옥사이드 사이에서 일어나는 에너지 전달현상에 의해서 형광 신호 및 세포 광독성을 나타내지 않는다. 상기 결합체가 암조직 또는 암세포에서 표적 및 축적되면 세포내 존재하는 환원제(특히, 글루타치온)에 의해 이황화결합이 절단되어 그래핀 옥사이드와 광감각제가 분리되며, 이때는 그래핀 옥사이드와 광감각제간의 에너지 전달현상이 없어지기 때문에, 빛에 노출된 광감각제는 강한 형광 신호를 내고 또한 반응성 산소종을 생성하면서 세포 독성을 나타낸다. 즉, 암세포 밖에서는 그래핀 옥사이드에 의해 광감각제의 형광 및 반응성 산소 생성이 억제되고, 결합체가 암세포 내로 들어갔을 때에만 형광 및 반응성 산소의 생성이 활성화되어 암 선택적 형광 영상 및 광역학 치료가 가능해진다.
상기 암의 진단 및 치료용 조성물은 약제학적으로 유효량의 그래핀 옥사이드- 광감각제 결합체와, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 상기 담체는 희석제일 수 있다. 상기 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제, 및 분산제 등의 보조제를 더 포함할 수 있다.
이러한 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로와 조화되도록 제형화될 수 있다. 투여 경로의 예는, 비경구, 예를 들어 정맥내, 피부내, 피하, 비내, 경피(국소), 점막관통, 및 직장 투여를 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
비경구 투여를 위해 사용될 수 있는 적절한 담체는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 덱스트로오스 주사액, 덱스트로오스 및 염화나트륨 주사액, 및 락테이트 함유 링거 주사액를 포함하나 이들에 한정되지 않는 수성 운반체(vehicle); 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜을 포함하나 이들에 한정되지 않는 수-혼화성 운반체; 및 옥수수 유, 면실 유, 땅콩 유, 참깨 유, 에틸 올레이트, 이소프로필 미리스테이트, 및 벤질 벤조에이트를 포함하나 이들에 한정되지 않는 비-수성 운반체일 수 있다.
이러한 약제학적 조성물은 종양 치료 또는 종양 진단을 위해 사용될 수 있다. 종양 치료 또는 종양 진단을 위해 사용되는 경우에, 유효량은 케이스 별로 의사에 의해 결정될 수 있다. 이 때, 환자의 나이, 성별, 체중, 또는 치료 또는 진단되어야 할 병태의 중증도가 고려될 수 있다. 일 예로서, 그래핀 옥사이드- 광감각제 결합체는 광감각제의 당량 및 환자 체중을 기준으로 0.001㎍ 내지 10 ㎎/㎏으로 투여될 수 있다. 특정 예에서 상기 결합체는 광감각제를 기준으로 0.1㎎ 내지 1 ㎎/㎏으로 투여될 수 있다.
본 발명에서, 상기 암은 소화기, 비뇨기, 생식기, 호흡기, 순환기, 뇌 및 신경계의 암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반 암종, 중추신경계(central nervous system, CNS) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체를 포함하는 암 진단 및 치료용 조성물은 정맥주사, 복강내주사, 근육내주사, 두개내주사, 종양내주사, 상피내주사, 피부관통전달, 식도투여, 복부투여, 동맥주사, 관절내주사 및 구강내투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로로 투여될 수 있다.
본 발명의 이황화 연결자로 결합된 그래핀옥사이드-광감각제 접합체는, 표적으로 하는 암 세포 내에서만 선택적으로 형광 및 반응성 산소 생성이 활성화되어 광역학 치료의 부작용을 감소시키고, 암 선택적 형광 영상 및 광역학 치료가 가능한 장점을 가진다.
도 1은, 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체의 구성을 보여주는 모식도이다. 1은 나노크기의 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO), 2는 광감각제, 3은 이황화물 결합(disulfide bond, -SS-)을 함유하는 연결자, 4는 친수성 고분자이다.
도 2a는 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체가 빛에 의해 노출이 되더라도 형광 및 반응성 산소 생성이 발생되지 않음을 보여주는 모식도 이다.
도 2b는 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체가 표적으로 하는 세포내에 존재하는 환원제에 의해서 이황화물 결합이 분해되었을 때 강한 형광 신호가 발생하고 반응성 산소 생성도 활성화 되는 모식도이다.
도 3은, GO-SS-Ce6 결합체의 합성 과정을 나타낸 것이다.
도 4a는, GO-SS-Ce6 결합체를 이용한 형광 이미지 및 PDT 치료 도식, 도 4b는 합성된 GO-SS-Ce6 결합체의 AFM 이미지, 도 4c는 합성된 GO-SS-Ce6 결합체의 크기분포를 나타낸 그래프이다.
도 5는, GO 및 GO-SS-Ce6 결합체의 흡수 스펙트럼 및 Ce6 및 GO-SS-Ce6의 형광 발생을 나타낸 것이다.
도 6은, DDT 농도 변화에 따른 GO-SS-Ce6 결합체의 형광강도의 변화(a), Ce6, GO-SS-Ce6 및 DDT 첨가된 GO-SS-Ce6의 일항 산소 생성(b), Ce6, GO-SS-Ce6 및 DDT 첨가된 GO-SS-Ce6시료에 빛을 조사하거나 조사하지 않는 경우에 있어서 일항산소 생성정도 분석(일항산소 검출 시약인 SOSG의 형광스펙트럼) (c)을 나타낸 그래프이다.
도 7은, 각 Ce6 및 GO-SS-Ce6를 같은 조건으로 처리한 A549 세포의 공초점 형광 현미경 이미지(a) 및 FACS 데이터를 나타낸 그래프(b)이다. 도 7(c)의 공초점 현미경 형광이미지들 중, 왼쪽은 A549세포에 처리한 GO-SS-Ce6에서 발생한 형광(붉은색) 이미지이며, 중간은 Lysotracker에 의한 형광(초록색) 이미지이고, 오른쪽은 GO-SS-Ce6와 Lysotracker의 두 형광이미지를 융합시킨 사진이다. 노란색은 Ce6의 형광과 Lysotracker의 형광이 일치하는 부분이다.
도 8은, Ce6 농도에 따른 빛을 조사한/조사하지 않은 Ce6 및 GO-SS-Ce6의 세포 생존능력을 나타낸 그래프이다.
도 9는, 그래핀 옥사이드-SS-ATTO665/폴리에틸렌 글리콜 결합체(GO-SS-ATTO665/PEG)의 UV/Vis 흡수 스펙트럼이다.
도 10은, DDT 농도 변화에 따른 GO-SS-ATTO665/PEG 결합체의 형광강도의 변화를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되어지는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다
실시예 1: 그래핀 옥사이드 - Ce6 결합체의 제조( GO - SS - Ce6 )
Graphene Laboratories Inc(미국, 뉴욕, calverton)사로부터 농축 그래핀 옥사이드 수용액을 구입하였다. GO 분산액(1 mg/mL)을 100W의 초음파 프로브로 빙점조(ice bath)에서 초음파처리하고, 이어서 총 3시간 동안 bath-sonication 하였다. 균일한 단일층 GO를 얻기위하여, 생성 분산액을 30분 동안 16000rpm에서 원심분리 하고, 상등액으로부터 분리된 갈색 GO를 수득하였다. 그 후, 10 mL GO 분산액에 1.2g의 NaOH와 1.0g의 클로로아세트산(ClCH2COOH)을 첨가하였다. 산화된 GO의 OH기가 COOH로 효과적으로 변환될 수 있도록, 추가 2시간 동안 bath-sonication 하였다. 수득된 GO-COOH 분산액을 묽은 HCl로 중화하고, 반응하지 않은 화학물질 및 불순물을 제거하기 위해 48시간 동안 탈이온수에 투석하였다. 동결건조된 GO-COOH 분말을 DMSO(1 mg/mL)에 분산시키고, 연속하여 standard EDC/NHS(ethyl(dimethyl-aminopropyl)carbodiimide/N-Hydroxy-succinimide) activation chemistry를 이용하여 10 mM 시스타민 디하이드로클로라이드(CTD)와 결합시켰다. 이때 반응 용액을 2시간 동안 교반하였으며, 미결합 물질을 제거하기 위해 48시간 동안 탈이온수에 투석하였다. EDC/NHS 매개 커플링 반응을 이용하여 10 mM의 클로린 e6(Ce6)를 아민-종결된 GO에 결합시켰다. 연속하여 교반하고, 최종 생성물 GO-SS-Ce6를 수득하기 위해 48시간동안 pH 8.5의 수용액에서 투석하였다. GO에 결합된 Ce6의 농도를 계산하기 위해, GO-SS-Ce6를 0.1M NaOH/ 0.1% SDS 수용액에 분산시키고 400 nm에서의 흡광도를 측정하고, 똑같은 파장에서 GO의 흡광도 값을 뺐다. Ce6는 400 nm에서 1.5×105 M-1cm-1의 몰흡광계수를 가진다고 알려져 있다(참고문헌: M.R. Hamblin, J.L. Miller, I. Rizvi, B. Ortel, E.V. Maytin, T. Hasan. Cancer Research 61 (2001) 7155-7162).
실시예 2: GO - SS - Ce6 결합체의 특성분석
광학적 특성을 분석하기 위해, GO 및 GO-SS-Ce6 결합체를 인산완충 수용액(phosphate buffered saline, PBS, 6.7 mM, pH 7.4, NaCl 154 mM)에 분산시켰다. Ce6는 1% (v/v) Tween/PBS에 용해시켰다. 수용액에서의 Ce6, GO-SS-Ce6 및 GO의 UV/Vis 스펙트라는 UV/Vis scanning spectrophotometer(DU730, Beckman Coulter, Brea, CA)로 측정하였다. 샘플의 형광 스펙트럼은 multifunctional microplate reader를 이용하여 측정하였으며, 시료를 400 nm 파장에서 여기 시켰다. GO-SS-Ce6의 형태학적 특징, 크기, 높이, 상의 데이터를 얻기 위해 실리카 표면에 GO 및 GO-SS-Ce6 수용액을 분사하고 상온에서 건조한 후, 태핑(tapping) 모드에서 원자간력 현미경(atomic force microscopy, AFM)을 이용하여 시료를 관찰하였다. GO-SS-Ce6의 표면전하 및 유체역학적 크기는 zeta potential/particle sizer (Malvern Instrument)을 이용하여 측정 하였다.
실험 결과를 도 4 및 5에 나타내었다. 그 결과, GO-SS-Ce6는 1 내지 2 nm 두께를 가지며 (도 4b), 수용액상에서의 평균 크기는 102 nm로(도 4c) 나타났다. 도 5에 의하면 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체는 UV/Vis 흡수 스펙트럼상에서 광감각제인 chlorin e6 (Ce6)와 관련된 400 nm 및 670 nm 근처에서 강한 흡수 피크가 나타나지만, GO는 어떠한 피크도 나타나지 않음을 확인하였다. 이로부터 GO-SS-Ce6 결합체가 합성되었음을 확인하였다. 또한, GO-SS-Ce6에 결합되어있는 Ce6는 FRET현상에 의해 형광이 억제되지만, Ce6는 붉은 빛의 강한 형광을 생성함을 확인하였다.
실시예 3: 형광 및 일항 산소 발생 분석
환원제 작용에 의한 형광 및 반응성 산소 생성 회복을 분석하였다. 실험을 위하여 Ce6는 1% (v/v) Tween/PBS 에 용해시킴으로서 Ce6간 응집에 의한 자기-소광효과를 방지하였다. GO 및 GO-SS-Ce6는 인산완충(PBS) 수용액에 용해시켰다. 측정시 시료의 농도는 1 μM Ce6 당량으로 맞추었다. 형광측정은 0 ~ 1 mM DTT를 첨가한 후 GO-SS-Ce6 결합체로부터 방출되는 Ce6의 세기를 측정함으로서 수행되었다. 여기파장은 400 nm이고 430 nm ~ 700 nm의 형광스펙트럼을 관찰하였다. 일항 산소 생성의 억제 및 회복을 평가하기 위해, Ce6, GO, GO-SS-Ce6 결합체, 및 1 mM DTT 처리 GO-SS-Ce6 시료를 산소기체로 포화된 1% (v/v) Tween/PBS(산) 수용액에 용해시키고, 여기에 일항 산소 검출 시약(Singlet Oxygen Sensor Green, Molecular Probes)을 첨가 하였다. Ce6 및 GO-SS-Ce6 결합체의 최종 농도를 1μM Ce6 당량으로 맞추었다. 각각의 용액을 670 nm의 CW 레이저 빔(조사선량률 100 mW/cm2)으로 조사하면서, 일항산소 검출시약의 형광증가를 측정하였다. 모든 실험은 세 번 반복수행 하였다.
실험결과를 도 6에 나타내었다. 그 결과, 환원제인 dithiothreitol(DTT)의 처리 농도가 증가함에 따라, GO-SS-Ce6 연결자의 이황화 결합이 끊어지면서 GO로부터 Ce6가 이탈되었으며, Ce6의 형광신호의 증가로 이어졌다(도 6a). 반응성 산소인 일항산소 생성 분석결과, GO-SS-Ce6는 Ce6에 비하여 일항 산소 생성이 현저히 억제되지만, DTT를 첨가한 GO-SS-Ce6는 Ce6와 비슷한 정도로 일항 산소를 생성이 회복됨을 확인하였다(도 6b). 또한, 일항 산소 생성 시약의 형광스펙트럼을 분석한 결과, DTT를 첨가한 GO-SS-Ce6는 Ce6와 비슷한 정도의 형광 강도를 가짐을 다시한번 확인하였으며, 이는 억제되어 있던 GO-SS-Ce6의 일항산소 발생 능력이 DTT처리에 의해서 다시 회복되었음을 나타낸다(도 6c).
실시예 4: 체외 세포 흡수 및 형광 활성 시험
실험을 위하여 ATCC사로부터 구입한 Glutathione-rich A549 인간 폐암 세포를 사용하였으며, 10% 우태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640을 세포의 배양액으로 이용하였고, 37℃, humidified 5% CO2 인큐베이터에서 세포를 배양하였다. Ce6 및 GO-SS-Ce6는 세포배양액을 사용하여 용해 및 희석시킨 후 1.5 μM Ce6 당량으로 농도를 맞추었다. A549세포를 LabTek II Chambered Coverglass (Nalge Nunc International Corp.)에 5×104 cells/well의 숫자로 넣고, 용기 바닥에 세포 부착할 수 있도록 24시간 동안 배양하였다. 이후, Ce6 및 GO-SS-Ce6가 용해된 세포배양액으로 교체하고, 24시간동안 처리해주었다. 세포밖에 존재하는 광감각제를 제거하기 위하여 세포를 세포배양액으로 세번 세척하고 신선한 배지를 첨가하였다. 400 nm의 여기에 의한 형광 이미지는 confocal laser scanning microscope (CLSM, ZEISS LSM 510 META)을 이용하여 얻었다.
글루타치온이 높은 농도로 존재하는 리소솜(lysosome)에서 형광이 활성화 되는지를 확인하기 위하여, LysoTracker Green을 이용하여 세포의 리소좀을 라벨링하고 Ce6 형광이 발생되는 곳과 위치가 겹치는지를 평가하였다. 실험을 위하여 LabTek II Chambered Coverglass위에 A549세포를 5×104 cells/well로 첨가하고, 세포부착을 위해 24시간동안 배양하였다. 이후에, GO-SS-Ce6를 함유한 세포배양액으로 교체하고, 다시 24시간동안 세포를 처리하였다. 그 후, 150 nM의 LysoTracker Green을 세포에 첨가하여 30분 동안 반응시키고, CLSM을 이용하여 GO-SS-Ce6의 형광과 Lysotracker의 형광 영상을 각각 얻은 후 세포 내에서 두 형광 영상이 겹치는 곳을 확인하였다.
Ce6 및 GO-SS-Ce6의 세포 내 섭취량을 정량하기 위해, 633 nm의 여기 레이저가 장착된 flow cytometric analysis(FACS)를 이용하였다. Six-well plates 에 A549 세포를 1.0×105 cells/well의 숫자로 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 기존의 세포 배양 배지를 1.5 μM Ce6 당량의 Ce6 또는 GO-SS-Ce6를 포함하고 있는 신선한 배지로 교체하였다. 24시간 동안 세포를 처리한 후, 세포 배양배지로 세 번 세척하고, 세포를 떼어낸 후, FACS 분석을 실시하였다.
그 결과, Ce6를 처리한 세포보다 GO-SS-Ce6를 처리한 세포가 강한 형광을 나타냄을 공초점 현미경을 이용한 형광 영상으로부터 확인하였다(도 7a). 또한, FACS 데이터를 통해, Ce6 처리한 세포보다 GO-SS-Ce6를 처리한 세포의 형광 강도가 더 크다는 것을 정량적으로 확인하였다(도 7b). 이러한 결과는, Ce6에 비하여 GO-SS-Ce6가 암세포 내 섭취가 훨씬 용이하게 됨을 보여줄 뿐 아니라, GO-SS-Ce6가 세포내 섭취된 후 글루타치온등에 의해서 이황화 결합이 끊어지고 Ce6가 이탈되면서 Ce6의 형광이 다시 활성화 되었음을 말해준다. 도 7c는, 이러한 형광 활성화가 글루타치온이 높은 농도로 존재하는 리소솜에서 일어났음을 보여준다.
실시예 5: 체외 광독성 시험( In vitro phototoxicity test )
Ce6 와 GO-SS-Ce6를 10% FBS를 포함하는 세포 배양 배지로 용해 및 희석하여, 0.25 μM, 0.5 μM, 1.0 μM, 및 1.5 μM Ce6 당량의 시료를 준비하였다. 96-well plate 에 A549 세포를 1×104 cells/well로 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 기존의 세포 배양액을 Ce6 와 GO-SS-Ce6가 포함된 세포 배양액으로 교체하고, 24시간동안 처리해 주었다. 약물을 처리하지 않는 대조군 세포에는 광감각제가 없는 같은 부피의 신선한 배양 배지를 plate에 첨가하고, 24시간동안 배양하였다. 이후, 세포를 세번 세척하여 세포에 섭취되지 않은 광감각제를 제거하고, 신선한 배양 배지를 첨가해 주었다. PDT처리 그룹에서는 Ce6 와 GO-SS-Ce6를 처리해 주었던 세포를 670nm의 CW 레이저 (50 mW/cm2 및 20 J/cm2 )를 이용하여 빛을 조사해 주었다. 세포를 추가적으로 24시간동안 배양하고, a cell counting kit-8 (Dojindo Laboratories)을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 세포 생존율은 대조군 세포에 대한 퍼센트로 계산하였다. Ce6 및 GO-SS-Ce6의 암흑 독성(dark toxicity) 분석을 위하여, Ce6 및 GO-SS-Ce6를 처리해 주었던 세포를 빛을 조사해 주는 것 없이 세포 생존율을 평가하였다.
실험결과를 도 8에 나타내었다. 빛을 조사하지 않은 경우에 GO-SS-Ce6와 Ce6 세포들 모두 세포 독성을 나타내지 않았다. Ce6 경우에는 세포에 처리 후 빛을 조사한 경우에도 세포 독성을 나타내지 않았는데, 이는 암세포내 섭취량이 충분하지 않았기 때문이다 (도 7b 참조). GO-SS-Ce6를 세포에 처리하고 빛을 조사해준 경우에는 용량에 따라서 용량 의존적으로 세포 생존율이 감소하였다. 도 6에서 보여준 결과를 참고로 할 때, GO-SS-Ce6는 암세포 내로 섭취된 후 형광 및 반응성 산소 생성이 활성화 되었다는 것을 알 수 있다.
실시예 6: 그래핀 옥사이드 - SS - ATTO 665/ 폴레에틸렌 글리콜 결합체( GO - SS -ATTO665/PEG) 제조 및 특성분석
본 실시예를 위하여 형광염료이면서 카르복실기(carboxylic acid)를 갖고있는 ATTO 665를 사용하였다. ATTO 665(ATTO-TEC, Germany)는 663nm 파장에서 최대 빛 흡수파장을 갖으며, 684 nm에서 형광 피크를 나타내고 형광 수율은 60% 이다. 그래핀 옥사이드 결합체의 친수성을 높이기 위하여 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)를 추가로 결합시켰는데, 본 실시예에서는 PEG의 양쪽 말단에 아민 (amine, -NH2)와 카르복실기(carboxylic acid, -COOH)를 각각 갖고 있는 NH2-PEG-COOH (M.W. 3,400 Da, Lysan bio inc., USA)를 이용하였다.
실시예 1에서 얻어진 동결 건조된 GO-COOH 분말을 GO-COOH 분말을 DMSO(0.5 mg/mL)에 분산시키고, EDC (500 μL, 10 mM) 과 sulfo-NHS (500 μL, 20 mM)를 첨가하고 30분간 반응시켰다. 그리고, 시스타민 디하이드로클로라이드(CTD, 1 mL, 10 mM)을 첨가하고 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 미결합 물질을 제거하기 위해 48시간 동안 탈이온수에 투석함으로써 이황화물 결합을 함유하고 아민 그룹으로 개질된 GO-SS-NH2를 얻었다. 다음에 NH2-PEG-COOH(300 μL, 1 mM), EDC (500 μL, 10 mM), 및 sulfo-NHS(500 μL, 20 mM)을 DMSO에 녹인 후 30분 동안 반응시켜 카르복실기를 activation 시켰으며, ATTO665-COOH(500 μL, 1 mM), EDC (500 μL, 10 mM), 및 sulfo-NHS(500 μL, 20 mM)을 DMSO에 녹인 후 30분 동안 반응시켜 카르복실기를 activation 시켰다. 이렇게 activation된 NH2-PEG-NHS ester와 ATTO665-NHS ester를 GO-SS-NH2 (3 mL)에 첨가하고 실온에서 overnight 반응시킨 후, 결합체를 형성하지 않은 불순물을 제거하기 위하여 탈이온수에서 투석을 진행하였다. 이후 인산완충 용액 (phosphate buffered saline solution)에 재분산 시킨 후 4℃에 보관하였다.
그래핀 옥사이드에 결합된 ATTO665의 농도를 측정하기 위하여, GO-SS-ATTO665/PEG의 UV/Vis 흡광스펙트럼을 측정하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 그 결과 650 nm 내지 700 nm 파장에서 강한 흡수피크가 나타남을 확인하였다. 그래핀 옥사이드에 의한 흡광도를 고려하여 663 nm 파장에서 순수 ATTO665에 의한 흡광도를 분석하였다. 663nm에서 ATTO665의 몰 흡광계수는 1.6 × 105 M-1cm- 1 이다.
형광 소광(quenching) 및 회복현상을 관찰하기 위하여, GO-SS-ATTO665/PEG를 1% Tween/PBS (v/v)에 분산시켰다. 결합체의 농도는 2.0 μM ATTO665 당량이 되도록 하였다. 이황화물 결합이 환원제에 의해서 끊어지는 경우에 소광되어 있던 ATTO665의 형광이 다시 회복되는지 관찰하기 위하여, 환원제인 dithiothreitol (DTT)를 0 ~ 10 mM의 농도로 각각 처리하고, 각각의 경우에 형광 스펙트럼을 분석하였다. 620 nm로 여기 시키고, 640 ~ 900 nm의 형광을 스캔하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. 그 결과 DTT의 농도가 높아질수록 GO-SS-ATTO665/PEG의 형광강도가 커짐을 확인하였다.

Claims (11)

  1. 광감각제; 상기 광감각제에 대하여 소광제(quencher)로 작용하는 그래핀 옥사이드 나노입자; 및 상기 광감각제와 상기 그래핀 옥사이드 나노입자를 연결하는 연결자를 포함하고,
    상기 그래핀 옥사이드 표면으로부터 상기 광감각제가 20nm 이내의 거리에 위치하도록 길이가 조절되고,
    상기 연결자는 이황화물 결합(disulfide bond)을 포함하는 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 그래핀 옥사이드 나노 입자의 직경은 5 nm 내지 500 nm인 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 연결자는 하기 화학식 1로 표시되고, 상기 그래핀 옥사이드의 카르복시기와 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 하나의 아민기와 결합되고, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 다른 하나의 아민기와 상기 광감각제가 결합된, 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체:
    [화학식 1]
    Figure pat00005

    상기 식에서, n1 및 n2는 각각 독립적으로 1 내지 5의 정수이다.
  4. 제3항에 있어서, 상기 n1 및 n2는 각각 2인 것을 특징으로 하는 결합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 광감각제는 유리 염기(free base) 또는 금속 착물(metal complex) 형태의 포르피린 기반(porphyrin-based) 화합물, 또는 비포르피린(nonporphyrin) 화합물인 것을 특징으로 하는 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 광감각제는 클로린 e6이고, 상기 클로린 e6의 카르복시기와 상기 화학식 1의 아민기와 결합된 것을 특징으로 하는 결합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 광감각제는 로다민(rhodamine) 유도체, 알렉사 (Alexa Fluor) 유도체, BODIPY 유도체, 시아닌 (cyanine) 유도체로서, 근적외선 파장 (600~900 nm) 영역에서 형광신호를 내는 것을 특징으로 하는 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체에 친수성 고분자가 추가로 결합되는 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 친수성 고분자는 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG); 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG); 메톡시폴리프로필렌 글리콜; 덱스트란(dextran); 히알루론산 (hyaluronic acid); 헤파린(heparin); 헤파란 설페이트(heparan sulfate); 키토산(chitosan); 글리콜 키토산(glycol chitosan); 폴리락틱-폴리글리콜릭 산 공중합체; 폴리에틸렌글리콜-이산(polyethylene glycol-diacid); 폴리에틸렌글리콜 모노아민; 메톡시폴리에틸렌글리콜 모노아민; 메톡시폴리에틸렌글리콜 하이드라자이드; 메톡시폴리에틸렌글리콜 이미다졸; 또는 폴리에틸렌글리콜, 메톡시폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜-이산, 폴리에틸렌 글리콜 모노아민, 메톡시폴리에틸렌글리콜 모노아민, 메톡시폴리에틸렌글리콜 하이드라자이드, 및 메톡시폴리에틸렌글리콜 이미다졸 중 둘 이상의 공중합체; 또는 폴리에틸렌글리콜과 폴리펩티드, 폴리에틸렌글리콜과 다당류(polysaccharide), 폴리에틸렌글리콜과 폴리아미도아민, 폴리에틸렌글리콜과 폴리에틸렌아민 또는 폴리에틸렌글리콜과 폴리뉴클레오티드의 공중합체체인 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체.
  10. 제8항에 있어서, 상기 친수성 고분자는 항체, 리보헥산(RNA) 또는 디옥시리보헥산(DNA) 압타머(aptamer), 및 펩타이드인 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 그래핀 옥사이드-광감각제 결합체를 포함하는, 암의 진단 또는 치료용 조성물.
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