KR101503573B1 - 히알루론산과 풀러렌이 접합된 신규 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 용도 - Google Patents

히알루론산과 풀러렌이 접합된 신규 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히알루론산과 풀러렌이 접합된 신규한 화합물에 관한 것으로, 풀러렌을 히알루론산의 수산기와 LiOH 촉매 하에서 공유결합하도록 하여 풀러렌의 난용성을 개선하고 생체적합성 및 입자 안정성을 증진시킨 신규한 화합물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 특정 파장의 빛에서 별도의 형광 염색제 없이도 근적외선 영역의 형광 파장을 발생시키고, 활성산소종을 발생시키며, CD44 수용체에 대한 표적화 기능을 발휘할 수 있다. 따라서, 본 발명은 바이오 이미지를 통한 종양 진단과 CD44 수용체 특이적인 종양의 광역학적 치료에서 탁월한 효과를 발휘할 수 있을 것이다.

Description

히알루론산과 풀러렌이 접합된 신규 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 용도{Hyalronated Fullerene, Preparing Method of the same, and Biological Use of the same}
본 발명은 히알루론산과 풀러렌이 접합된 신규한 화합물에 관한 것으로, 더 상세하게는 생체 내외에서 바이오 이미징과 광역학 요법에 활용할 수 있는 히알루론산과 풀러렌이 접합된 신규한 화합물에 관한 것이다.
현재의 암 치료법, 예를 들어, 방사능 요법 및 화학 요법 등은 급속하게 증식되는 세포들을 공격하는 역할을 하고 있다. 이러한 공격은 암세포만을 파괴하는 데 그치지 않고 일부 정상세포도 파괴하게 된다. 그 결과, 때로 생명을 위협할 수도 있는 심각한 부작용을 수반할 뿐 아니라, 실제로 천연의 항-종양 방어기제를 저하시킬 수 있다. 방사능 및 화학 요법은 면역계의 급속분할되는 세포들에게 피해를 주고, 항-종양 및 항-감염 응답을 억압한다. 이러한 부작용을 일으키는 외에도, 현재 사용되는 요법들은 암세포만을 특정하게 공격하지 못하기 때문에 대체로, 목적하는 효과 강도를 달성하지 못하고 있다. 결과적으로, 화학 요법 또는 방사능 요법, 또는 이들의 조합으로는 암을 완벽하게 치유시킬 수 없다. 따라서, 현재 암의 주된 치료법은 외과적으로 암세포를 제거하는 것이다. 이 방법은 흔히 보조적으로 방사능 요법 및 화학 요법과 병용되어 이루어지고 있으며, 치료를 위해서는 모든 암세포를 파괴하기 위해, 환자의 신체를 외과적으로 절단하고 독성이 높은 치료법을 사용해야만 하는 실정이다.
이와 같은 암 치료의 폐해를 최소화하고 전체적인 효능을 증진시키기 위한 노력의 일환으로, 광역학 요법(Photodynamic therapy; PDT)이 개발되었다. PDT는 암세포를 파괴하는 데 있어 광민감성 물질에 빛이 조사될 때 생성된 활성산소(reactive oxygen species; ROS)를 이용하여 암세포를 파괴하는 방법이다. PDT는 암세포에 국소화시키기 위한 광민감성 물질(photosentizing agent)을 먼저 인체에 투여하고, 이어서 광민감성 물질을 암세포 부위로 이동시킨 다음 이 광민감성 물질을 함유하는 암세포에 특이적이고 적절한 파장의 빛을 조사하는 것으로 이루어진다. 따라서, PDT는 적절한 파장의 활성화 광을 부위-특이적으로 적용할 수 있으므로, 광민감성 물질과 부위-특이적인 광조사를 병용하여 암과 같은 특정 조직에서 치료적인 반응을 생성시킬 수 있다.
종래 방향족 분자 또는 염료분자들이 ROS를 생성시키는 능력을 갖고 있어 지난 수십 년간 의료계에서 광감응 물질로 사용되어 왔고, TiO2, ZnO, Au, 탄소나노튜브(carbon nanotube; CNT), 다공성 실리콘(PSi) 등의 나노물질이 ROS를 생성시킬 수 있는 새로운 PDT 광민감성 물질로 보고되고 있다.
한편, 풀러렌(fullerene)은 탄소분자의 새로운 종류로서, 풀러렌 내부에 치료제를 봉입하거나 운반할 수 있는 능력을 가지고 있어 생물학 분야, 특히 나노 크기의 약물 전달체, 항산화제, 종양치료 등에 광범위하게 적용될 수 있는 분자이다. 풀러렌은 광역학 치료에 쓰이는 광민감제로서의 기능 또한 우수하여 종양 치료를 위한 의약 분야에서의 활용 가능성에 대해 상단한 주목을 받고 있다. 그러나, 이러한 활용 가능성에도 불구하고, 풀러렌(fullerne)의 실용하는 한계를 안고 있는데, 즉 풀러렌 입자는 물이나 생물학적 용매에 녹지 않는 불용성이라는 점과 그 자체가 나타내는 극소수성에 의하여 스스로 응집 현상을 나타냄으로써 입자의 광민감성을 저해한다는 점에서 그러하다.
한편, 대다수의 광민감제가 높은 형광을 나타내는데 비하여 풀러렌은 매우 약한 형광을 나타내기 때문에 세포 내부로의 유입이나 생분해 및 특정 장기 표적화 실험에서 풀러렌 자체의 활용 가능성은 다소 낮아 보인다. 따라서, 풀러렌과 다른 생체 고분자를 결합하여 새로운 풀러렌 접합체를 설계하여 개발하려는 노력이 활발하다.
대한민국공개특허 제2008-0047070호
본 발명의 목적은 풀러렌의 난용성을 개선하고 응집반응을 완화시키며 종양으로의 표적 능력이 증진된 히알루론산과 풀러렌의 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 히알루론산과 풀러렌의 접합체 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 히알루론산과 풀러렌의 접합체를 이용한 바이오 이미지용 입자, 광역학 치료용 광민감제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 풀러렌(Fullerene)과 히알루론산이 접합된 히알루론산-풀러렌 접합체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 히알루론산-풀러렌 접합체는 풀러렌의 이중결합과 히알루론산의 수산화기가 공유결합된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 히알루론산-풀러렌 접합체는 상기 히알루론산의 단위 당(sugar) 대비 플러렌 분자의 접합도가 0.01 내지 1인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 히알루론산-풀러렌 접합체는 하기 화학식으로 표시되는 것을 특징으로 한다.
Figure 112012095374825-pat00001
상기 화학식에서 n는 1 내지 22000의 정수이다.
또한, 본 발명은 (a) 풀러렌과 하일루론산을 디메틸설폭사이도에서 수산화리튬(LiOH) 촉매를 사용하여 반응시키는 단계; (b) 용매를 제거한 후 결과물을 투석하는 단계;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 히알루론산-풀러렌 접합체 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 반응 온도는 20 내지 40℃, 반응 시간은 10 내지 50시간인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 투석단계는 붕산염 완충용액 상에서 투석하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 히알루론산과 풀러렌이 접합된 히알루론산-풀러렌 접합체를 포함하는 바이오 이미지용 입자를 제공한다.
또한, 본 발명은 히알루론산과 풀러렌이 접합된 히알루론산-풀러렌 접합체를 포함하는, 나노 운반체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노 운반체는 고분자량의 단백질, 펩타이드, 핵산분자, 당류, 지질, 화합물 또는 무기물을 포함하거나 또는 그 표면에 고분자량의 화합물 또는 무기물이 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물 또는 무기물은 항암제인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 히알루론산과 풀러렌이 접합된 히알루론산-풀러렌 접합체를 포함하는 광역학치료용 광민감제를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 풀러렌은 C60인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 히알루론산-풀러렌 접합체는 암 조직에 선택적으로 축적되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암 조직의 세포는 CD44 수용체를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명인 히알루론산과 풀러렌이 접합된 접합체에 의하면 풀러렌 자체의 난용성을 개선하고 응집반응으로 저해된 광민감성을 회복시키며 종양에의 표적 능력이 향상된 화합물 및 그 화합물 제조방법을 제공함으로써, 생체 적합성과 입자 안정성을 갖는 바이오 이미지용 입자와 광역학 치료용 광민감제로 활용할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명에 따른 광민감제는 표적세포 내에 잘 침투하여 축적되므로 표적세포 내에서의 광역학 효과에 의한 세포사멸을 유도하여 유용한 암 치료방법으로 활용될 수 있을 것이다. 그리고, 기존 광민감제들이 체내에서 분해되지 않는 특성을 개선하여, 생분해성을 가짐으로써 생체로부터 용이하게 제거될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 제조된 히알루론산-풀러렌 접합체(HA-F1)의 1H-NMR 피크이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 따라 제조된 HA-g-C60의 특성을 나타낸 그래프이다. (a) HA-g-C60(HA-F1, HA-F3, HA-F5)의 입경분포이다. (b) HA-g-C60 및 유리 C60의 UV/가시 스펙트럼이다. (c) HA-g-C60를 포함하는 well의 근적외선 형광 이미지이다. (d) HA-F1의 일항산소 발생을 나타내는 그래프이다. (e) HA-g-C60(HA-F1, HA-F3, HA-F5) 및 유리 C60의 일항산소 발생을 나타내는 그래프이다.
도 3은 HA-F1(좌), HA-F3(중), HA-F5(우)의 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM) 이미지이다.
도 4는 HA-F1의 635nm에서 여기 후 방출하는 형광 강도를 나타내는 그래프이다.
도 5는 HA-g-C60의 in vitro에서의 항-종양 효과를 나타내는 그래프이다. (a) 유리 C60, HA-F1, HA-F3, HA-F5를 처리한 HCT-116 및 KB 세포에서 광 조사 후의 광독성을 나타낸 그래프이다.(n=7) (b) 유리 C60, HA-F1, HA-F3, HA-F5를 처리한 HCT-116 및 KB 세포에서 광 조사가 없는 경우 광독성을 나타낸 그래프이다.(n=7)
도 6은 HA-F1을 처리한 후 HCT-116 또는 KB 세포에서 HA-F1의 세포 내 흡수를 보여주는 형광 이미지이다.
도 7은 HA-g-C60의 in vivo 에서의 항-종양 효과를 나타낸다. (a) HCT-116 또는 KB 종양을 가지는 누드 마우스에 HA-F1(equivalent C60 10 mg/kg body) 처리 4시간 후 비침투성 형광 이미지이다. (b) HA-g-C60가 세포 내로 침투하는 과정을 보여주는 모식도이다. (c) HCT-116 종양을 가지는 누드 마우스에서 HA-F1 또는 PBS (pH 7.4, control) 처리 후 종양 국소 조사시 종양의 크기가 감소됨는 것을 나타내는 그래프와 사진이다. 종양 부위는 적색 점선으로 표시하였다. (n = 5) [* p < 0.05 compared to control].
도 8은 HCT-116 종양 세포에 HA-g-C60 (equivalent C60 5 mg/ml) 처리 후 37℃에서 (a) 2 시간 및 (b) 6 시간 경과 후 TEM 분석. (c) (b)의 확대 이미지. HA-g-C60는 노란색 화살표로 표시.
도 9는 히알루로니다아제 type 2(Hyal-2)와 반응시킨 HA-F1의 입경 변화를 나타내는 그래프이다.
도 10은 히알루로니다아제 type 2(Hyal-2) 존부에 따른 HA-F1, HA-F3, HA-F5의 입경 변화를 나타내는 그래프이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
본 명세서에서, 용어광역학치료(photodynamic therapy)는 피부에 빛에 반응하는 광민감제(광감작제)를 바른 뒤 특정 파장의 빛을 쏘이면 질병세포에만 선택적으로 빛이 축적되어 치료적 효과를 나타내는 치료요법을 의미한다. 광역학치료는 암의 진단과 치료, 자가골수이식, 항생제, AIDS 치료, 피부이식 수술이나 관절염 등의 치료에 사용되고 있으며, 이에 제한되지 않는다.
용어 광민감제(photosensitizer)는 특정 파장의 빛을 조사하면 산소분자(Ｏ2)를 일항산소(singlet oxygen, 1Ｏ2)와 같은 활성산소종으로 변화시키거나, 새로운 라디칼을 만들거나 또는 새로운 화학종을 만들어내는 물질을 의미한다.
용어 플러렌(Fullerene)은 탄소원자가 오각형과 육각형으로 교대로 배열된 분자를 통칭하는 말이다. 본 발명에서 플러렌은 예를 들어 C60, C70, C74, C76, C78, C80, C82, C88, C90, C96 등의 임의의 탄소수의 것을 단독 또는 혼합물을 이용할 수 있다. 또한 순탄소 물질인 나노 튜브 플라렌, 각종 고차원 플라렌 등을 이용할 수 있고 금속 내포 플라렌도 가능하다.
용어 암 세포는 비정상적으로 성장, 분열 또는 증식하는 세포를 의미하는 것으로, 여기서는종양 세포와 혼용된다. 용어 암은 형질전환된 세포의 억제되지 않는 분열 또는 증식과 무질서한 성장 결과로 빚어지는 복합적인 질환을 일컬으며, 본 발명에서는 광역학 치료를 위해 고형암을 의미한다. 고형암이란 혈액암을 제외한 모든 덩어리로 이루어진 암을 의미한다. 고형암의 종류로는 뇌종양(Brain Tumor), 양성성상세포종 (Low- grade astrocytoma), 악성성상세포종 (High-grade astrocytoma), 뇌하수체 선종 (Pituitary adenoma), 뇌수막종 (Meningioma), 뇌림프종 (CNS lymphoma), 핍지교종 (Oligodendroglioma), 두개내인종 (Craniopharyngioma), 상의세포종 (Ependymoma), 뇌간종양 (Brain stem tumor), 두경부 종양(Head & Neck Tumor), 후두암 (Larygeal cancer), 구인두암 (Oropgaryngeal cancer), 비강/부비동암 (Nasal cavity/PNS tumor), 비인두암 (Nasopharyngeal tumor), 침샘암 (Salivary gland tumor), 하인두암 (Hypopharyngeal cancer), 갑상선암 (thyroid cancer), 구강암 (Oral cavity tumor), 흉부종양(Chest Tumor), 소세포성 폐암 (Small cell lung cancer), 비소세포성 폐암 (NSCLC), 흉선암 (Thymoma), 종격동 종양 (Mediastinal tumor), 식도암 (Esophageal cancer), 유방암 (Breast cancer), 남성유방암 (Male breast cancer), 복부종양 (Abdomen-pelvis Tumor), 위암 (Stomach cancer), 간암 (Hepatoma), 담낭암 (Gall bladder cancer), 담도암 (Billiary tract tumor), 췌장암 (pancreatic cancer), 소장암 (Small intestinal tumor), 대장(직장)암 (Large intestinal tumor), 항문암 (Anal cancer), 방광암 (Bladder cancer), 신장암 (Renal cell carcinoma), 전립선암 (Prostatic cancer), 자궁경부암 (Cervix cancer), 자궁내막암 (Endometrial cancer), 난소암 (Ovarian cancer), 자궁육종 (Uterine sarcoma), 피부암(Skin Cancer) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 약이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, 포함하다 및 포함하는이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
히알루론산-풀러렌 접합체
본 발명은 히알루론산과 풀러렌이 접합된 신규한 화합물에 관한 것이다.
유리 풀러렌(예를 들면, C60)은 물과 생물학적 용매에 불용성을 나타내고, 극소수성을 띠고 있어 응집현상을 나타낸다. 또한, 풀러렌의 형광 강도는 미세하여 세포 내부로 유입되어 특정 장기를 표적화하여 이미지화하는데 유용하지 못하다. 그리고, 체내에서 분해되지 않아 생체로부터 제거되는데 어려움이 있었고, 이로 인해 비특이적 세포독성을 유발할 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 풀러렌 자체의 불용성을 개선하고, 응집현상을 완화시켜 광민감성을 향상시키며, 별도의 형광 물질이나 동위 원소로 표지하지 않고도 강한 근적외선 영역의 형광파장 발생 및 활성산소 발생이 가능하고, 체내에서 분해도 가능한 신규한 화합물로써 히알루론산-풀러렌 접합체를 개발하였다.
히알루론산-풀러렌 접합체를 제조하기 위한 일예로, 풀러렌(C60)을 히알루론산염(HA)과 반응시키며 LiOH를 촉매로 사용할 수 있는데, LiOH는 풀러렌과 반응하여 풀러렌의 π=π 탄소 결합을 절단하고, 전-활성화된 풀러렌은 히알루론산의 수산기와 결합하여 다양한 형태의 탄소-산소 접합체를 생성해 낸다. 따라서, 촉매로는 LiOH외에도 풀러렌과 반응하여 풀러렌의 π=π 탄소 결합을 절단할 수 있는 것이라면 적절히 변형하여 사용할 수 있을 것이다.
하기 도식은 본 발명의 일예로 풀러렌인 히알루론산과 반응하는 반응식을 나타낸 것이다.
Figure 112012095374825-pat00002
상기 화학식에서 n는 1 내지 22000의 정수이다. 이 경우 접합체의 중량은 약 800만 달톤까지 가능하다.
풀러렌과 히알루론산이 접합한 접합체(이하 'HA-g-C60'로 표기한다.)를 1H NMR 분석한 결과, 그 일례로 도 1과 같은 피크를 확인할 수 있었고(HA-F1), 이 외에도 히알루론산 하나의 당 단위에 5.1×10-2에서 0.78까지의 C60 분자가 결합되어 다양한 형태의 히알루론산-풀러렌 접합체가 제조될 수 있을음 1H NMR 결과로부터 확인할 수 있었다(표 1).
Figure 112012095374825-pat00003
<HA - g - C 60 접합체의 특성 분석>
풀러렌은 강한 소수성 분자로 알려져 있으나, 이에 비하여 HA-g-C60는 PBS에서 효과적으로 분산되는 것으로 나타났다. HA-g-C60 접합체는 자가-조직화된 나노입자 구조를 형성하는데(도 2a), 그 크기는 대략 30-50 nm이고, C60의 농도가 증가할수록 입자의 크기도 함께 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 주사전자현미경(SEM) 이미지를 통해 HA-g-C60 나노입자는 거의 구형에 가까운 것을 확인할 수 있었다(도 3).
한편, PBS에 분산된 HA-g-C60의 색이 접합체 내에서의 C60의 비율이 증가할수록 연한 노란색에서 진한 갈색으로 점차 변화됨을 확인할 수 있었는데(도 2a), 본 발명자들은 비록 C60의 양과 HA-g-C60의 색 변화와의 정확한 상관관계를 파악할 수는 없었지만, 이는 C60의 산화 정도 및 히알루론산(HA)과의 접합 정도(π-π 탄소결합의 절단)에 따른 풀러렌의 전자 방출의 차이에 기인하여 나타나는 효과라고 판단하였다. 결론적으로, C60의 농도가 HA-g-C60의 입경, 용해도, 색을 결정하는 중요한 요인이라고 판단하였다.
HA-g-C60의 광-물리적 특성을 파악하기 위하여, UV/가시 스펙트럼과 NIR 형광 방출에 대해 조사해 본 결과, HA-g-C60(0.1 mg/ml)의 UV/가시 스펙트럼은 400-800nm에서 뚜렷한 흡수 밴드를 나타내었다(도 2b). 또한, HA-g-C60는 635nm에서 들뜸 후에 720nm에서 강한 NIR 형광 강도를 나타내었다(도 4). 그러나, C60의 농도가 증가함에 따라 C60-C60의 autoquenching 기전에 기인하여 NIR 형광 강도는 서서히 감소함을 확인할 수 있었다(도 2c). 따라서, HA-g-C60가 방출하는 NIR 형광 신호는 별도의 형광단이나 고형광 광민감제를 도입하지 않고도, in vitro 및 in vivo에서 바이오-이미지 입자로 활용할 수 있음을 보여준다.
광역학치료용 광민감제
본 발명의 일 측면은 광 조사에 의해 활성산소종을 발생시키는 광역학치료용 광민감제에 관한 것이다.
광역학 치료용 광민감제는 바람직하게는 하기 조건들을 갖추어야 한다. 첫째, 활성산소종(ROS)을 생산하는 양자수율이 높고, 둘째, 흡수하는 광의 파장이 길어야 하며, 셋째, 조사하지 않는 상태에서 독성이 낮아야 하고, 넷째, 특정 표적에 선택적으로 바인딩 되는 한편, 비특정 조직과는 결합하지 않아야 한다.
이러한 조건을 만족시키는 본 발명에 따른 광민감제는 풀러렌과 히알루론산이 접합된 히알루론산-풀러렌 접합체(HA-g-C60)이다.
플러렌(Fullerene)은 근적외선 광을 흡수하는 성질을 가지고 있으며, 광역학치료에 적합한 활성산소종(ROS)을 생산하는 물질로서 기존에 사용되는 물질보다 훨씬 작은 크기를 가지고 있기 때문에 광민감제로 적합하지만, 난용성 성질 및 생체 내 흡수/분포/대사/제거의 한계를 가지고 있다. 즉, 플러렌은 수불용성이어서 생체 내 투여가 어렵다는 문제가 있다. 이에, 본 발명에서는 생분해성 고분자로서 생체적합성 및 입자 안정성을 증진시키는 히알루론산을 플러렌에 접합시켰다.
천연고분자로 선형 다당류인 히알루론산 (Hyaluronic acid, HA)은 독특한 다당류 구성 단위인 클루코닉 산(Dglucuronic acid)과 아세틸클루코사민(N-acetyl-D-glucosamine) 단위체가 반복되는 구조이며, 세포 외 기질(extracellular matrix)의 글리코스아미노글리칸 (glycosaminoglycan) 구성요소 중 하나이다. 히알루론산(HA)은 세포부착, 성장, 이동에서 핵심적인 역할을 담당하기 때문에 세포운동성, 염증 반응, 상처치유 그리고 암세포의 침투와 전이의 신호 분자로 알려져 있다. 장간막에 발생한 암세포에서 히알루론산이 과발현되기 때문에, 히알루론산(HA)는 암세포의 확산, 이동, 침투, 전이에 대한 기질(matrix)역할을 하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 암세포의 히알루론산 수용체인 CD44와 RHAMM의 발현은 세포 이동과 침투에 밀접하게 연관되어 있다. 즉, 악성의 암세포는 히알루론산(HA)이 많은 환경으로 침투한다. 이런 관점에서, 많은 연구자들이 히알루론산을 항암제의 전달 시 암세포 표적 분자로 사용하였다. 침투적이고 전이적인 암세포에서 CD44가 과발현되기 때문에 히알루론산(HA)와 항암제, 그리고 고분자의 결합체는 수용체 매개를 통해 이러한 암세포의 수용체를 표적으로 할 수 있다. 게다가 히알루론산의 생체적합성, 생분해성, 면역을 유도하지 않는 성질 때문에 히알루론산은 우수한 생체 삽입 물질로 여겨진다. 그러므로 히알루론산은 강력한 항암제 전달체 후보 중 하나이다. 따라서 이러한 히알루론산(HA)에 풀러렌이 결합된다면 생체내 암세포와 같은 특정세포나 또는 조직에 보다 효과적으로 전달되어 광역동치료(PDT)에 도움이 될 것이다.
본 발명의 접합체는 풀러렌의 가용화 및 혈액 내 입자 안정성 증진을 통해 약물효율성을 높이고 치료효과가 증대된다. 또한, 높은 광학 특성, 생체 적합성 및 생체 제거율을 나타내고, 히알루론산에 의해 암 세포에 대한 표적 지향성이 향상되어 선택적 맞춤 치료의 가능성을 높였다.
본 발명에서 사용되는 풀러렌 단량체는 종류가 특별히 한정되는 것은 아니지만, 독성이 낮고 공급 및 취급 용이성의 이점으로부터 C60 풀러렌을 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 히알루론산-풀러렌 접합체들이 다수 개 결합 또는 응집되어 응집체를 형성할 수 있다.
본 발명의 히알루론산-풀러렌 접합체는 크기가 5 내지 500 nm, 바람직하게는 10 내지 100 nm 일 수 있다, 이러한 직경 범위 내에 있을 경우 생체 내에서 효과적으로 제거될 수 있고, 임상 및 진단용으로 적합하기 때문이다. 일반적으로 입자를 혈관 내에 주입하려면, 혈관의 크기를 고려하여 주입되는 입자의 크기가 200㎚ 이하가 되어야 한다.
본 발명의 접합체에는 고분자인 수용성 히알루론산에 다수 개의 풀러렌 분자가 접합되어 있는바, 수용성 히알루론산의 당 일단위 대비 플러렌 분자의 수인 치환도는 0.001 내지 1일 수 있다. 수용성 히알루론산의 반복단위에 과량의 풀러렌이 결합하게되면 풀러렌의 소수성으로 인해 응집현상이 일어나 접합체의 크기가 커질 가능성이 있다. 따라서 혈관크기를 벗어난 크기로 제조될 가능성이 있다.
본 발명에 따른 히알루론산-풀러렌 접합체는 풀러렌의 이중결합 부분을 히알루론산의 수산화 잔기와 공유결합시켜 플러렌의 난용성 개선 및 생체적합성과 생체 내 제거율을 증진시켰으며 그로 인해 치료 효과를 높였다.
필요에 따라, 본 발명의 히알루론산-풀러렌 접합체에는 표적지향성 물질이 추가적으로 결합될 수 있다. 이에 특정적인 표적 분자를 풀러렌 혹은 히알루론산 부분에 직접적으로 결합시키는 표적화가 가능하다. 즉, 종양세포와 같은 특정 세포군의 막 수용체로의 선택성 또는 표적성을 높이기 위해 종양 특이적 리간드를 상기 접합체에 결합시키는 것을 의미한다. 이러한 표적지향을 통해 세포파괴 없이 수용체-매개 엔도시토시스를 통해서 결합물을 세포내부로 흡수시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 표적지향성 물질은 예를 들어, 엽산, 항체, 코발라민, 비타민 A, 비타민 C, 비타민 B12 등을 들 수 있다. 이 중에서도 특히 엽산이 바람직하게 이용될 수 있다. 이에 대응하는 표적물질인 엽산수용체는 종양특이적 약물 전달을 위한 유용한 표적이 된다. 즉, 엽산수용체들은 난소암, 결장, 유선, 뇌, 대장, 폐, 신장-세포성암, 상피 종양의 뇌로의 전이, 백혈병에서의 골수 혈액 세포 및 신경내분비암에서 종양세포 상에서 발현된다. 한편, 정상 조직에서 엽산 수용체의 발현은 심각하게 제한되어 있어 정상조식에서의 엽산 수용체에 대한 접근은 거의 일어나지 않는다. 즉, 정상조직의 세포들은 약간의 예외를 제외하고는 매우 적은 양의 엽산수용체만을 발현하는 한편, 악성으로 형질변환된 세포들에서는 엽산에 대한 수용체의 양이 그들의 표면 상에서 증가하게 된다. 이러한 엽산수용체의 양적인 증가로 인해 현저한 양의 엽산을 효과적으로 바인딩할 수 있게 된다. 또한, 엽산은 세포표면상 엽산 수용체와 높은 친화성을 나타낸다. 엽산과 거대분자의 결합은 거의 모든 테스트된 상태에서 시험관 내 엽산수용체-발현 암세포로의 전달을 개선시킬 수 있다.
나노 운반체
한편, 본 발명의 히알루론산-풀러렌 접합체는 표적지향성, 생체적합성 및 생분해성을 나타내는바 고분자량의 단백질, 펩타이드, 핵산분자, 당류, 지질, 화합물 또는 무기물을 포함하거나 또는 그 표면에 고분자량의 화합물 또는 무기물이 결합되어 이들의 나노 운반체로서 이용될 수 있다. 상기 화합물 또는 무기물은 예를 들어 독소루비신, 파크리탁셀, 도세탁셀, 캄토테신과 시스플라틴과 같은 다양한 항암제일 수 있다.
약제학적 조성물
또한, 본 발명의 히알루론산-풀러렌 접합체는 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시킬 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
광역학 치료방법
본 발명의 또 다른 측면은 상술한 광역학치료용 광민감제를 이용한 광역학치료방법에 관한 것이다. 본 발명의 치료방법은 하기 단계를 포함한다.
1) 피험체에 상술한 히알루론산-풀러렌 접합체를 투여하는 단계; 및
2) 580 내지 700nm 파장의 광을 경피적으로 조사하는 단계;
상기 단계1)에서 본 발명의 히알루론산-풀러렌 접합체는 바람직하게는 비경구 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 종양내 주입 또는 병변내(intralesional) 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 광역학치료 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 1일 투여량은 0.0001-1000 ㎎/㎏이다.
상기 단계2)에서 광 파장이 580 내지 700nm 범위인 것이 바람직하다. 파장이 580nm 미만이면 레이저 파장이 짧아서 생체 조직에 깊이 침투하지 못하므로 피부 근처에서의 광역학 치료만이 가능하게 되며, 흡광 파장이 700nm 보다 길면 생체 내에 과량으로 존재하는 물의 흡수에 의한 간섭이 증가하므로 바람직하지 못하다.
상기 광 조사는 본 발명의 히알루론산-풀러렌 접합체를 활성시킬 수 있고, 표적 세포가 파괴 또는 약해질 수 있는 정도여야 하며, 바람직하게는 1 내지 200 mW/cm2 광 강도로 1 내지 60분간 조사할 수 있다. 상기 조건으로 치료 대상 동물에 조사하는 경우, 동물의 체내에 존재하는 상기 플러렌 다량체가 주입된 암 세포에 활성산소종이 발생하여 암 세포는 사멸 또는 괴사된다.
본 발명의 광역학치료방법은 악성세포에서 광역학에 의한 세포 제거를 통해 고형암의 치료에 바람직하게 이용될 수 있으나, 이들 질병에 한정되지 않는다.
플러렌 -글리콜 키토산 접합체의 제조방법
본 발명의 또 하나의 측면은 앞서 설명한 히알루론산-풀러렌 접합체의 제조방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 본 발명의 제조방법은 하기 단계들을 포함한다.
1) 풀러렌과 히알루론산을 디메틸설폭사이드 또는 무수벤젠과 디메틸설폭사이드 혼합용매에서 수산화리튬 촉매를 사용하여 반응시키는 단계;
2) 용매를 제거한 후 결과물을 투석 및 건조하는 단계;
반응 온도는 약 -20～100℃, 바람직하게는 0～50℃, 보다 바람직하게는 실온～37℃이고, 반응 시간은 약 1～72 시간, 바람직하게는 10～50 시간이다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예>
재료 준비
풀러렌(C60)은 NanoLab Inc. (Waltham, MA, USA)사로부터 구입하였고, Sodiu hyaluronate(HA, Mw=4kDa), 수산화 리튬(LiOH), hyaluronidase type 2(Hyal-2), 디메틸 술폭시드(DMSO), 9,10-디메틸안트라센(DMA)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사로부터 구입하였다. RPMI 1640, fetal bovine serum (FBS), 페니실린 및 스트렙토마이신은 Welgene Inc (Seoul, South Korea)사로부터 구입하였다. Cell Counting Kit-8 은 Dojindo Molecular Technologies Inc (Kumamoto, Japan)사로부터 구입하였다.
동물 실험 관리
In vivo 연구를 46 주령의 암컷 BALB/c 누드마우스(Institute of Medical Science, Tokyo, Japan)에 대해 수행하였다. 마우스는 한국 카톨릭대의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인된 프로토콜의 가이드라인에 따라 처치하였다.
통계분석
모든 결과를 Students t-test 또는 ANOVA를 통해 분석하였고, p < 0.05의 경우 귀무가설로 배척하였으며, MINITAB　가 배포한 14 statistical software를 사용하였다(Minitab, State College, PA, USA).
<실시예 1>
히알루론산- 풀러렌 접합체( HA-g-C 60 )의 합성
풀러렌(C60)과 히알루론산을 DMSO 용매에서 수산화리튬(LiOH)을 촉매로 하여 상온에서 2일 동안 반응시켰다. 반응액을 미리 팽창된 투석막 튜브(Spectra/Por　 MWCO 15K)에 넣고 붕산염 버퍼 용액(pH 7.4) 상에서 투석함으로써, 미반응 화학물질을 제거하였다. 투석막 튜브로부터 빼낸 용액을 2일간 동결건조 시킨 후 냉동건조하였다. 하일루론산과 풀러렌의 접합체는 δ7.25 ppm [-CH in C60 part of HA-g-C60]과 δ2.30 ppm [-CH 3 in HA]에서의 피크를 통해 1H NMR (DMSO-d 6 with TMS)을 이용하여 확인할 수 있었다(도 1).
<실시예 2>
히알루론산-풀러렌 접합체( HA-g-C 60 )의 특성 분석
150 mM PBS (pH 7.4) 상에서의 HA-g-C60 (1 mg/ml)의 입경 분포도를 He-Ne 레이저빔을 구비한 Zetasizer 3000 instrument (Malvern Instruments, Westborough, MA, USA)로 633nm 파장에서 90°의 고정된 산란각으로 측정하였다(도 2). HA-g-C60 (10 mg/ml)의 모폴로지는 전계 방출 주사형 전자 현미경(FE-SEM, Hitachi s-4800, Tokyo, Japan)으로 확인하였다. HA-F1 (1 mg/1 ml, equivalent C60 0.05 mg/ml), HA-F3 (1 mg/1 ml, equivalent C60 0.20 mg/ml) 및 HA-F5 (1 mg/1 ml, equivalent C60 0.40 mg/ml)가 담긴 바이알(vials)의 광학 이미지는 PBS (pH 7.4) 상에서 얻을 수 있었다.
150 mM PBS(pH 7.4) 상에서의 HA-g-C60 conjugates (0.1 mg/ml) 및 C60 (0.1 mg/ml)의 UV/가시 스펙트럼은 400 - 800 nm 파장에서 관찰하였다. HA-g-C60 conjugates (0.1 mg/ml)의 자기소멸 효과는 KODAK image station (λexcitation = 635 nm, λemission = 720 nm)을 이용하여 DMSO 상에서 관찰하였다.
150 mM PBS (pH 7.4) 또는 DMSO 상에서의 HA-g-C60 (equivalent C60 0.1 mg/ml) 및 유리 C60 (0.1 mg/ml)의 일항산소(singlet oxygen) 발생은 9,10-dimethylanthracene (DMA)를 이용하여 확인하였다. DMA (20 mmol)를 150 mM PBS (pH 7.4) 또는 DMSO 상의 HA-g-C60 (equivalent C60 0.1 mg/ml)와 혼합하였다. 혼합액을 670 nm laser source를 이용하여 5분 동안 10 mW/cm2의 광도로 빛을 비추어 주고, DMA 형광강도(himadzu RF-5301PC spectrofluorometer, λex 360 nm, λem 380-550 nm)가 1시간 후 정체기에 도달했을 때, DMA 형광강도(Ff - Fs)의 변화를 전체 DMA 형광강도(HA-g-C60 또는 C60가 없는 상태, 일항산소가 없는 상태, Ff)로부터 각 샘플의 형광강도(Fs)를 뺀 후 그래프로 표시하였다.
0.1-5 mg/ml의 hyaluronidase type 2 (Hyal-2)와 37℃에서 1시간 반응한 후, HA-g-C60 conjugates (0.1 mg/ml)의 입경분포도는 Zetasizer 3000 instrument (Malvern Instruments)를 이용하여 분석하였다(도10).
<실시예 3>
In vitro 광독성 실험
HA-g-C60의 광독성은 인간 결장 상피암 세포주인 HCT-116(Korean Cell Line Bank) 및 인간 비인두 상피암 세포주인 KB 세포(Korean Cell Line Bank)에서 평가하였다. 각 세포(1×105 cells/ml)를 단층 배양하고, 이를 0.25 % (w/v) 트립신, 0.03% (w/v) EDTA 용액으로 트립신처리하여 수득하였다. RPMI-1640 배지에 부유시킨 상기 세포를 well plates에 분주하고, in vitro 세포 실험에 앞서 24시간 배양하였다. 배양 조건은 2 mM L-글루타민, 1 % 페니실린-스트렙토마이신, 10 % FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 37℃, 5 % CO2 가습 분위기에서 배양하였다.
HA-g-C60의 광독성은 각각 CD44 수용체를 가지고 있는 HCT-116 세포 및 CD44 수용체를 가지고 있지 않은 KB 세포에서 실험하였는데, RPMI1640 배지에 부유시킨 HA-g-C60 또는 free C60를 96-well plates에 분주한 세포에 처리하고 4시간 배양한 후, 150 mM PBS (pH 7.4)로 3번 세척하였다. 그 후, 670 nm laser source로 10 mW/cm2 의 광도로 5분간 조사한 후, 12시간 추가 배양하였다. 세포 생존율을 Cell Counting Kit-8 (CCK-8 assay)으로 측정하였다.
한편, HA-g-C60 자체의 독성을 테스트하기 위하여, 빛 조사 없이 HA-g-C60 (equivalent C60 1-50 mg/ml)을 처리한 HCT-116 및 KB 세포의 세포 생존율도 측정해 보았는데, 즉, HA-g-C60를 처리하고 24시간 배양한 후 세포 생존율을 Cell Counting Kit-8 (CCK-8 assay)으로 측정하였다.
< 실시예 4>
투과전자현미경에 의한 분석
상기한 HCT-116 및 KB 세포를 HA-g-C60 (equivalent C60 5 mg/ml)와 함께 37℃에서 2-6시간 배양한 후, PBS로 3번 세척하고, PBS 0.1M에 4% paraformaldehyde/2.5 % glutaraldehyde를 포함하는 고정액으로 하룻밤 동안 고정하였다. 0.1M PBS로 세척한 후, 표본을 1% osmium tetroxide를 포함하는 PBS로 1시간 동안 추가 고정하였다. 그 후 표본을 순수 에탄올 또는 아세톤으로 탈수시키고, Epon 812 (embedding resin)에 담구었다. Epon 812의 중합 반응은 60℃에서 3일간 시행하였다. ultra-microtome (Leica Ultracut UCT, Germany)을 이용하여 상기 표본으로부터 초박편(60-70 nm)을 수득하였다. 초박편은 탄소-코팅된 구리 격자판 위에서 마운팅 한 후, 60kV에서 작동하는 TEM (JEM 1010, Japan)과 CCD camera (SC1000 Orion, USA)로 관찰하였다.
< 실시예 5>
In vivo 광루비네센스 이미지 및 종양 억제 실험
In vivo 동물 실험을 위하여, HCT-116 및 KB 종양 세포를 PBS pH 7.4 (ion strength: 0.15)에 부유시켜 1×104씩 피하주사 하였다. 종양의 크기가 약 40 mm3가 되었을 때, HA-g-C60 conjugates (equivalent C60 10 mg/kg body) 또는 PBS solution (control, 150 mM, pH 7.4)을 꼬리 정맥을 통하여 정맥주사하였다. pecial C-mount lens와 장파 emission filter (720 nm; Omega Optical, Brattleboro, VT, USA)를 갖는 12-bit CCD camera (Image Station 4000 MM; Kodak, Rochester, NY, USA)를 준비하고, 누드 마우스의 광 루미네센스 이미지를 포착하였다. 추가적으로, 주사 후 24시간이 지나서 누드 마우스의 종양 부위는 670 nm laser source를 이용하여 10 mW/cm2 광도로 40분간 국소적으로 방사하였다. 종양 크기의 변화는 경과 시간에 따라 관찰하였다.
종양 크기 = 길이×(폭)2/2
한편, 상기 방사된 누드 마우스의 몸무게 변화 및 바이탈 징후는 처리되지 않은 누드 마우스와 차이가 거의 없거나 미세한 차이만을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 상기와 같은 방사 처리의 부작용은 거의 없는 것으로 판단되었다.
< 실험예 1>
HA - g - C 60 의 특성 평가 결과
HA의 수산화기와 C60의 C=C 이중결합 사이의 화학 반응을 통해 HA-g-C60를 제조하였다. 치환도(HA의 당 반복단위 대비 C60 분자의 수로 정의)를 5.1◎0-2 내지 0.78로 하였고(표 1 참조),δ 7.26 ppm [-CH in C60 part of GC-g-C60] to δ 3.50 ppm [-CH2 in GC]에서의 1H-NMR (DMSO-d6 with TMS)피크로 측정하였다.
C60의 접합은 다당류 접합체에 광역학 활성 및 자가-조직 구조를 위한 풍부한 친유성을 주기 위한 것이다. HA에 접합된 C60 분자가 하나의 HA 반복 당 단위 대비 5.1×10- 2 에서 0.78 분자로 증가됨으로써, HA-g-C60 는 PBS (150 mM, pH 7.4)에서 자가-조직화된다. 도 2a에 나타난 것과 같이, HA-g-C60 나노입자(표 1의 HA-F1, HA-F3, HA-F5)의 평균 입경은 약 30 내지 50nm이고, C60의 농도가 증가할수록 입자의 크기도 함께 증가하며, PBS에 분산된 HA-g-C60의 색도 C60의 농도가 증가할수록 연한 노란색에서 진한 갈색으로 변화됨을 확인할 수 있었다.
한편, HA-g-C60(0.1mg/ml)와 유리 C60(0.1mg/ml)의 UV/가시 스펙트럼을 조사해 본 결과, HA-g-C60(0.1 mg/ml)의 UV/가시 스펙트럼은 400-800nm에서 뚜렷한 흡수 밴드를 나타내는데, 이는 유리 C60 분자와 현저한 차이가 있다(도 2b). 또한, DMSO 상에서 HA-g-C60(equivalent C60 0.1mg/ml)의 NIR 형광 방출(λexcitation=635nm, λemission=720nm)에 대해 조사해 본 결과, HA-g-C60에서의 C60 비율이 상대적으로 적은 HA-F1에서 더 높은 형광 방출을 확인할 수 있었다.
한편, 주사전자현미경(SEM)을 이용한 이미지 분석에 의해 HA-g-C60 나노입자는 거의 구형에 가까운 것을 확인할 수 있었고(도 3), HA-F1(0.05mg/ml) in PBS(150mM, pH 7.4)는 635nm에서 들뜸 후에 720nm에서 강한 NIR 형광 강도를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 4).
< 실험예 2>
HA - g - C 60 의 일항산소 발생
종래 in vivo 광역학 치료는 조직 침투력 향상을 위하여 주로 적외선을 이용하였으나, 근적외선(NIR)에서 HA-g-C60의 개선된 흡광도는 유리 C60 자체의 청색 또는 녹색 부근에서의 흡수 밴드와 비교하여 볼 때, 일항산소와 같은 활성 산소종(ROS)을 생산할 수 있도록 여기 에너지를 공급할 수 있는 더 나은 공급책이 될 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명자들은 C60과 비교하여 HA-g-C60의 탁월한 광활성을 조사하기 위하여, HA-g-C60(equivalent C60 0.1mg/ml)의 일항산소 발생을 측정하였다. 테스트를 위해, 9,10-디메틸안트라센(DMA)을 극단적으로 빠른 일항산소의 화학적 포집자로 이용하였는데, 형광 DMA는 일항산소와 선택적으로 반응하여 엔도페록시드(endoperoxide)를 형성하고(Gomes et al., 2005), 그에 따라 DMA의 형광체에는 환원이 일어난다. 본 실험에서, 본 발명자들은 HA-g-C60 접합체 (equivalent C60 0.1 mg/ml) 또는 유리 C60 분자(0.1 mg/ml)에 대해 일항산소의 발생을 확인하기 위하여 HA-g-C60 접합체 또는 유리 C60 분자에서 DMA 형광 강도의 변화를 모니터링하였다(λexcitation=360nm, λemission=380-550nm). HA-g-C60(HA-F1)은 PBS 또는 DMSO에 용해하고, DMA와 혼합한 후, 670 nm laser source를 이용하여 10 mW/cm2의 광도로 5분간 조사하였는데, DMA 형광체 강도의 변화(Ff - Fs)는 실질적으로 더 많은 일항 산소가 발생하였음을 의미한다. 그 결과, DMSO에 용해된 HA-F1 및 PBS에 용해된 HA-g-C60(HA-F1, HA-F3, HA-F5)는 PBS에서 응집된 C60 분자보다 더 높은 일항산소 발생 결과를 나타내었다. 한편, HA-g-C60(HA-F1, HA-F3, HA-F5)로부터의 일항산소 발생은 C60의 분자내 비율이 증가함에 따라 현저히 감소하였는데, 이는 C60-C60의 auto-quenching에 기인하는 것으로 판단된다(도 2d, 도 2e).
< 실험예 3>
HA - g - C 60 의 in vitro 항종양 활성
도 5는 HA-g-C60의 항종양 활성을 in vitro 상에서 확인한 결과이다. 광독성은 종양세포인 HCT-116과 KB 세포에 유리 C60, HA-F1, FA-F3, HA-F5를 처리한 후 CCK-8 assay로 측정하였는데, 우선 96-well plate에 세포를 배양하고, 상기 유리 C60, HA-F1, FA-F3, HA-F5를 처리하여 4시간 동안 추가 배양한 후 PBS(pH 7.4)로 3번 세척하였다. 세포들을 100 mW/cm2 의 광도로 670 nm 레이저원을 이용하여 5분간 조사한 다음, 12시간 동안 추가적으로 배양하거나(도 6a), 또는 광 조사 없이 24시간 동안 배양하였다(도 5b).
그 결과, HA-g-C60(HA-F1, HA-F3, HA-F5)는 유리 C60에 비하여 종양 세포에서의 광독성이 현저히 높게 나타났다. 한편, 광 조사가 없는 상태에서 HA-g-C60(HA-F1, HA-F3, HA-F5)의 세포독성은 유리 C60와 전혀 차이가 없는 것으로 나타났다.
< 실험예 4>
HA - g - C 60 의 흡수에 CD44 수용체가 미치는 영향
한편, 본 발명자들은 CD44 수용체를 가지고 있는 HCT-116 세포 및 CD44 수용체를 가지고 있지 않은 KB 세포에서 각각 HA-F1이 세포 내로 흡수 되는 비율을 비교해 보았다.
즉, HA-F1(1ug/ml)을 4시간 동안 처리한 HCT-116 세포와 KB 세포에서 HA-F1의 형광 발현을 관찰하였는데(λexcitation=635nm, λemission=720nm), 그 결과, HA-F1는 HCT-116 세포에 훨씬 높은 형광 발현을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 6). 또한, TEM anaylsis를 통해서도 HA-g-C60가 HCT-116 세포에 효과적으로 흡수될 수 있음을 확인할 수 있었다(도 8). 이처럼, HA-g-C60는 CD44 수용체를 가지고 있는 세포에서 CD44 수용체에 의한 엔도시토시스에 의하여 더 빠른 흡수가 가능한데, 그 결과, HA-g-C60(HA-F1, HA-F3, HA-F5)는 CD44 수용체를 가지고 있는 세포에서 훨씬 효과좋은 광독성을 나타낼 수 있을 것이다.
한편, 자연에서 존재하는 다당류인 HA는 다양한 종양 세포에서 과발현되는 CD44 수용체에 결합하는 것으로 이미 알려져 있다. 도 5에서 볼 수 있듯이 HA-F1이 HA-F3 또는 HA-F5보다 훨씬 높은 광독성을 나타내는 것을 확인할 수 있는데, 이들 결과는 수용성 및 퀀칭되지 않는 HA-F1이 상당량의 일항산소를 발생시키고, 이는 자체 퀀칭되는 HA-F3 또는 HA-F5에 비하여 더 큰 광독성을 가지며, 특히 이들 효과는 CD44 수용체를 가지고 있는 종양 세포에서 극대화 되는 것을 나타낸다.
< 실험예 5>
HA - g - C 60 의 in vivo 항종양 활성
본 발명자들은 HA-g-C60의 종양 치료용 광민감제로서 HA-g-C60의 잠재성을 더욱 자세히 평가하기 위하여, HA-g-C60의 in vivo 활용 가능성에 대해 연구해 보았다. 우선, HA-g-C60의 종양 진단 효과를 확인하기 위하여, CD44+ HCT-116 및 CD44- KB 종양을 갖는 누드 마우스를 동물 모델로 선정하여, HA-F1(equivalent C60 10 mg/kg body)을 꼬리에 정맥주사하였다. 그 후 HA-F1의 정맥주사 4시간이 경과하여, 단계적인 근적외선 광루미네센스 이미지(λexcitation=635nm, λemission=720nm)를 관찰할 수 있었는데, 그 결과 시간의 경과에 따라 종양 부위에서 HA-F1으로부터 근적외선 형광 신호가 현저히 증가됨을 확인할 수 있었고(도 7a), 이로써 HA-g-C60가 in vivo에서 종양 진단용으로 사용될 수 있음을 확인하였다. 특히, 근적외선 형광 신호는 CD44- KB 종양에서보다 CD44+ HCT-116 종양에서 더 강하게 감지되었는데, 이는 HA-g-C60가 혈류를 통해 순환하는 과정에서 강화된 투과성 및 정체로 인해 목적 세포를 검색할 기회를 가지고, CD44 수용체를 가지고 있는 종양 세포에 특이적으로 결합하는 것으로 판단된다(도 7b).
또한, 본 화합물의 광역학 치료를 통한 항-종양 효과를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 HCT-116 종양을 가지는 누드 마우스에 HA-F1 또는 PBS(pH 7.4, 대조군)를 단계적으로 처리하였다. 투입 후 24시간 경과하여, 고형암에 670nm 레이저원를 이용하여 10 mW/cm2 의 강도로 40분간 국소 방사하고 7일간 종양의 부피 변화를 매일 관찰하였다(도 7c). 그 결과, PBS만을 처리한 대조군에서는 종양 크기가 37±2 에서 50±2 mm3으로 점점 증가한 반면, HA-F1 처리군에서는 종양의 크기가 48±3에서 11±1 mm3으로 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
한편, HA-F1 처리군에서 체중 변화나 생리 활성의 변화는 대조군에 비하여 커다란 변화를 보이지 않은바, HA-F1 처리에 의한 부작용은 거의 없는 것으로 판단할 수 있었다.
< 실험예 6>
HA - g - C 60 의 분해능
광민감제가 체내에서 분해되지 않는다면, 체내로부터 제거되는데 어려움이 있고, 이로 인해 비특이적 세포독성을 유발할 위험이 있다. 따라서, 본 발명자들은 HA-g-C60의 생분해성을 실험해 보았는데, 즉, 본 발명자들은 히알루론산을 특이적으로 분해할 수 있는 히알루로니다아제(HYAL)가 HA-g-C60도 분해 가능한지 확인해 보았다. HA-g-C60의 생분해능을 확인하기 위하여 Hyal-2를 사용하였는데, 우선 HA-g-C60 접합체(HA-F1, HA-F3, HA-F5)를 1mg/ml의 Hyal-2와 1시간 반응시킨 결과, HA-g-C60의 입경이 현저히 증가함을 확인할 수 있었다(도 9, 도 10). 특히, HA-F1의 경우 입경은 Hyal-2의 농도가 0.1~5 mg/ml에서 현저히 증가하였는데, 이는 HA-g-C60 나노입자가 붕괴되어 커다란 C60 침전물이 발생하는 것을 의미한다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (15)

  1. 풀러렌(Fullerene)의 이중결합과 히알루론산의 수산화기가 공유결합된 히알루론산-풀러렌 접합체에 있어서, 상기 히알루론산-풀러렌 접합체는 히알루론산의 단위 당 대비 풀러렌 분자의 접합도가 0.01 내지 1의 분자 접합도로 결합한 것이고, 하기 화학식으로 표시되는 것을 특징으로 하는 히알루론산-풀러렌 접합체:
    Figure 112015005124574-pat00015

    상기 화학식에서 n는 1 내지 22000의 정수이다.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. (a) 풀러렌과 하일루론산을 디메틸설폭사이드 용매에서 수산화리튬(LiOH) 촉매를 사용하여 반응시키는 단계; 및
    (b) 용매를 제거한 후 결과물을 투석하는 단계;
    를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 히알루론산-풀러렌 접합체 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 반응 온도는 20 내지 40℃, 반응 시간은 10 내지 50시간인 것을 특징으로 하는 히알루론산-풀러렌 접합체 제조방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 투석단계는 붕산염 완충용액 상에서 투석하는 것을 특징으로 하는 히알루론산-풀러렌 접합체 제조방법.
  8. 히알루론산-풀러렌 접합체를 유효성분으로 포함하는 바이오 이미지용 입자에 있어서,
    상기 접합체는 풀러렌의 이중결합과 히알루론산의 수산화기가 공유결합된 것이고, 상기 접합체는 히알루론산의 단위 당 대비 풀러렌 분자의 접합도가 0.01 내지 1의 분자 접합도로 결합한 것이며, 하기 화학식으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 바이오 이미지용 입자:
    Figure 112015005124574-pat00016

    상기 화학식에서 n는 1 내지 22000의 정수이다.
  9. 히알루론산-풀러렌 접합체를 유효성분으로 포함하는 나노 운반체에 있어서,
    상기 접합체는 풀러렌의 이중결합과 히알루론산의 수산화기가 공유결합된 것이고, 상기 접합체는 히알루론산의 단위 당 대비 풀러렌 분자의 접합도가 0.01 내지 1의 분자 접합도로 결합한 것이며, 하기 화학식으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 나노 운반체:
    Figure 112015005124574-pat00017

    상기 화학식에서 n는 1 내지 22000의 정수이다.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 나노 운반체는 고분자량의 단백질, 펩타이드, 핵산분자, 당류, 지질, 화합물 또는 무기물을 포함하거나 또는 그 표면에 고분자량의 화합물 또는 무기물이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 나노 운반체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 화합물 또는 무기물은 항암제인 것을 특징으로 하는, 나노 운반체.
  12. 히알루론산-풀러렌 접합체를 유효성분으로 포함하는 광역학치료용 광민감제에 있어서,
    상기 접합체는 풀러렌의 이중결합과 히알루론산의 수산화기가 공유결합된 것이고, 상기 접합체는 히알루론산의 단위 당 대비 풀러렌 분자의 접합도가 0.01 내지 1의 분자 접합도로 결합한 것이며, 하기 화학식으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 광역학치료용 광민감제:
    Figure 112015005124574-pat00018

    상기 화학식에서 n는 1 내지 22000의 정수이다.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 풀러렌은 C60인 것을 특징으로 하는, 광역학치료용 광민감제.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 히알루론산-풀러렌 접합체는 암 조직에 선택적으로 축적되는 것을 특징으로 하는, 광역학치료용 광민감제.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 암 조직의 세포는 CD44 수용체를 갖는 것을 특징으로 하는, 광역학치료용 광민감제.
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