KR20200012254A - 암세포 특이적 항암 단백질-형광 복합체 및 이를 포함하는 암의 진단 및 영상화용 조성물 - Google Patents
암세포 특이적 항암 단백질-형광 복합체 및 이를 포함하는 암의 진단 및 영상화용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에 따른 단백질-형광 복합체는 암 조직에서 과발현하는 CD47에 의해 단백질이 세포 내로 함입되어, 형광을 재방출하는 프로브를 결합한 형태로, 암부위에 효과적으로 전달되고, 스스로 대식세포의 식세포 작용을 증대할 수 있으며, 세포 내에서 분해되어 형광을 방출하기 때문에 암세포에 특이적으로 이미징할 수 있는 기술이다. 향후 이 단백질-형광 복합체를 전달체로 다양한 약물과 결합하여 함암 효과 및 암세포 이미징을 더욱 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은 암세포 특이적 항암 단백질-형광 복합체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 암세포에 과다하게 존재하는 단백질 수용체를 통해, 암세포에 특이적으로 전달하여 식세포의 식작용 효과를 증대시킬 뿐만 아니라 세포 내에서 형광을 나타내는 새로운 단백질-형광 복합체에 관한 것이다.
지난 수년간 사망원인 1위를 차지하는 질병인 암을 진단하고 치료하고자 다양한 기술들이 개발되었다. 개발된 세포독성 항암 치료제들은 암세포의 성장억제나 사멸에 우수한 효과를 나타내지만, 정상세포와 암세포 모두에게 성장억제와 사멸효과를 가지기 때문에, 심각한 부작용을 유발하는 문제가 있다. 또한 진단 형광 조영제의 경우 형광이 세포 내에 들어가서 약이 작용하는 건지 바깥에 붙어서 작용하는지 기전이 불분명한 한계점이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 키토산나노파티클(chitosan nanoparticle), PLGA, 리포좀(liposome) 등 다양한 나노입자를 이용하여 암에 효과적으로 전달하고자 하는 노력이 계속되어오고 있다. 하지만 나노입자를 전달체로 사용하는 경우, 나노입자 그 자체가 외부물질이기 때문에 체내에서 독성을 유발하는 문제가 발생하게 된다. 이에 다양한 체내에 존재하는 물질(단백질, 엑소좀(exosome), 항체 등)을 전달체로 이용해 생체적합성을 가지는 입자를 이용하는 방법이 계속 연구되어 오고 있다.
생체적합성을 갖는 단백질, 엑소좀 등을 이용한 전달체들은 전달 효용성이 낮다는 문제가 있고, 엑소좀(exosome)의 경우 표적화 능력은 우수하나, 체내에서 빨리 분해 및 제거되기 때문에 목적 부위로 약물의 전달 효과가 현저히 낮다는 한계가 있다. 항체의 경우 크기가 크기 때문에 약물을 세포 내로 전달하는데 어려움이 있다. 또한 수용체 특정 항체를 이용하는 경우, 약물이 특정 수용체를 통해 전달이 되는지 결합만 이루고 있는지 등 약의 기전에 대해 현재 불분명하여, 임상적 사용에 제한이 있다.
따라서 상술한 문제점을 극복하기 위해서 생체적합성을 가지며 암부위에 전달될 수 있고 세포 내에서만 발광할 수 있는 새로운 항암 약물 및 형광체 기술 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 약물을 암세포 수용체를 통해 특이적으로 전달하여, 스스로 항암 작용 및 세포 내에서 형광을 낼 수 있는 단백질-형광복합체 및 암의 진단 또는 영상화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단백질-형광복합체를 약물 전달 능력이 있는 전달체로서 가능성을 제시하여 이 후 다른 약물과 응용한 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드(a)를 중심으로, 상기 폴리펩티드 양 말단에 형광체(b)와 소광체(c)가 접합되어 있고, 상기 폴리펩티드(a)의 COO- 기에 SIRPα 단백질(d)이 결합되어 있는, 단백질-형광 복합체를 제공한다.
상기 폴리펩티드(a)의 N-말단에 상기 형광체(b)가 결합되고, 상기 폴리펩티드(a)의 라이신 또는 아르기닌 아미노산 잔기의 입실론 아민기에 소광체(c)가 결합되어 있을 수 있다.
상기 단백질-형광 복합체는 암 세포 내에서 형광을 나타내는 것일 수 있다.
상기 단백질-형광 복합체의 분자량은 형광체의 개수의 따라 18kDa 내지 21kDa일 수 있다.
상기 형광체(b)는 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 텍사스 레드(Texas red), Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 인도카르보사이아닌(indocarbocyanine), 로다민(rhodamine), 옥사카르보사이아닌(oxacarbocyanine), 티아카르보사이아닌(thiacarbocyanine), 메로사이아닌(merocyanine), 피리딜록사졸(pyrodyloxazole), 니트로벤족사디아졸(nitrobenzoxadiazole), 벤족사디아졸(benzoxadiazol), 나일 레드(Nile red), 나일 오렌지(Nile orange), 아크리딘 옐로우(acridine yellow), 오마린(aumarine), 크리스탈 바이올렌(crystal violet), 및 말라카이트 그린(malachite green)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 소광체(c)는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 SIRPα 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있다.
상기 단백질-형광 복합체는 암 세포에서 과발현하는 CD47에 특이적으로 결합하여, 암 세포 내로 함입되며, 함입 후 암 세포내에 존재하는 리소좀 효소에 의해 분해되어 형광을 복원하는 것일 수 있다.
상기 단백질-형광 복합체는 하기 구조식 1로 표시되는 것일 수 있다.
[구조식 1]
또한, 본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 상기 단백질-형광복합체를 포함하는 암의 진단 또는 영상화용 조성물을 제공한다.
상기 암은 유방암, 난소암, 위암, 결장암, 폐암, 대장암, 골암, 췌장암, 피부암, 자궁암, 소장암, 직장암, 항나팔관암종, 자궁경부암종, 질암종, 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 및 섬유육종암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 상기 단백질-형광복합체를 유효성분으로 하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 암은 유방암, 난소암, 위암, 결장암, 폐암, 대장암, 골암, 췌장암, 피부암, 자궁암, 소장암, 직장암, 항나팔관암종, 자궁경부암종, 질암종, 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 및 섬유육종암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 암 예방 또는 치료용 조성물은 항암제를 더 포함하고, 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 1) 상기 단백질-형광 복합체를 개체에 투여하는 단계; 및 2) 상기 개체로부터 상기 단백질-형광 복합체에 의한 이미지를 수득하는 단계;를 포함하는 상기 개체의 암의 진단방법을 제공한다.
본 발명에 따른 단백질-형광 복합체는 암세포에 특이적으로 반응하여 활성화되기 때문에, 암 세포를 효과적으로 진단 및 영상화할 수 있을 뿐만 아니라, 자체적으로 암 세포에서의 대식세포 식세포 작용을 촉진할 수 있어, 암을 치료하는 효과를 갖는다.
또한 상기 단백질-형광 복합체는 암조직에서 특이적으로 발현하는 CD47 수용체에 의해 세포 내로 대부분 흡수되고, 세포 내로 흡수되어야만 형광을 방출하기 때문에, 암 세포를 정확히 타겟하고, 정확히 진단할 수 있다.
본 발명에 따른 단백질-형광 복합체와 종래 나노입자 및 형광체가 가지고 있는 독성 문제와 암 특이적 활성이 낮다는 문제 등을 해결할 수 있고, 생체 내에서 별도의 담체, 전달체 및 나노 캐리어를 포함하지 않아도, 이러한 구성만으로 암 조직을 정확히 타겟하고, 암 조직 내로 흡수되어 진단 및 치료하는 효과를 갖는다는 장점이 있다. 또한 상기 단백질-형광 복합체는 별도의 약물을 포함하지 않아도, 스스로 식세포의 대식작용을 증대하는 항암 역할을 할 수 있다는 큰 장점이 있다.
도 1a는 암 세포 내에서 분해되는 리소좀 프로브(probe)의 화학적 구조식을 나타낸 도면이다. 이는 암 세포 내에서 리소좀 분해 효소들에 의해 잘리도록 펩타이드(GFLG)기반에 아민기가 있는 펩타이드(lysine, K)에 근적외선 형광체인 Cy5.5를 도입하고, N-말단기에 위치하는 라이신 또는 아르기닌의 입실론 아민기에 소광체(BHQ-3)가 결합되도록 설계하였다. 각각의 합성과정은 DMSO 상태에서 이루어졌으며, N-Methylmorpholine(NMM) 과 4-Dimethylaminopyridine (DMAP)을 촉매 하에 합성하였다. 각각의 합성과정은 형광체 도입, 보호 그룹(protecting group) 제거 및 소광체 도입 세 가지로 이루어진다. 각각의 과정은 고성능액체크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography, HPLC)로 확인 및 정제하였다.
도 1b는 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체에 대한 자외선/가시광선 분광광도계(UV-VIS spectroscopy)로 측정한 결과 그래프이다.
도 1c는 인산염완충식염수 (phosphate-buffered saline, PBS) 존재하에서, 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체의 농도에 따른 자외선/가시광선 분광광도계로 정량화한 그래프이다.
도 1d는 인산염완충식염수 (phosphate-buffered saline, PBS) 존재하에서, 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체가 형광을 흡수하는 정도를 형광기계(photoluminescence, F-7000, Hitach, Tokyo, Japan)로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 1e는 세포 내 펩타이드내부가수분해효소(endopeptidase)인 파파인(papain)이 존재하거나, 존재하지 않는 조건하에서, 실시예 3으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 처리하고, 형광(photoluminescence, PL) 세기를 측정한 그래프와 사진이다.
도 2a는 본 발명의 단백질-형광 복합체의 구조를 나타낸 것으로, 단백질(SIRPα)과 리소좀 프로브(probe)의 결합관계를 나타낸 모식도이다. 상기 단백질은 리소좀 프로브의 카복실기(-COOH)를 인산염완충액 pH6.0 하에서 Sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)와 EDC(1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) 반응으로 아민(amine)기와 결합할 수 있는 NHS 형태로 바꿔준 후, 단백질(SIRRPα)을 처리하여, 상온에서 4시간동안 반응하여 제조된다.
도 2b는 pET-28 벡터에 CD47과 결합력을 향상시킨 변형된 SIRPα DNA 서열을 삽입하여 클로닝 후 대장균에서 SIRPα 단백질을 정제하여 쿠마씨 블루(coomassie blue)로 염색한 사진이다.
도 2c는 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체, 실시예 4-1)로부터 제조된 SIRPα 단백질, 비교예 1로부터 제조된 SIRPα-Cy5.5를 파파인 효소와 함께 배양한 다음, 15% Polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE gel)로 SDS-PAGE 분석 후, 각각의 밴드에 대한 형광을 확인하기 위해, 형광 기기(IVIS lumina)로 촬영한 사진이다.
도 2d는 실시예 4의 단백질-형광 복합체의 정제 및 크기를 단백질 액체 크로마토 그래피 (Fast protein liquid chromatography,FPLC)로 분석한 그래프이다.
도 2e는 실시예 4 내지 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 파파인 효소(papain, sigma)로 처리하고, 20분 후에 재발광효과를 형광 기계(photoluminescence, PL)로 확인한 그래프이다.
도 2f는 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체(SIRPα-probe)와 비교예 1의 소광체를 붙이지 않은 단백질-형광체(SIRPα-Cy5.5)를 비교하기 위하여, 이들 각각을 형광기계(photoluminescence, PL)로 측정하여 도식화한 결과 그래프이다.
도 3a는 암세포(HT29)에 실시예 6의 단백질-형광복합체를 처리한 후 시간에 따른(30분, 1시간, 2시간, 4시간) 세포 흡수를 공초점 현미경(confocal microscopy)이다. 이때 푸른색은 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 핵 염색을 나타내며, 적색은 Cy5.5(Cyanine5.5)로 프로브 형광을 나타낸다.
도 3b는 CD47 저해제(CD47 Ab)를 처리 유무(+, -)에 따른, 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 처리한 암세포(HT29, CT26CL25, B16F10) 각각의 공초점 현미경 이미지이다(bar=50 ㎛). 이때 적색은 실시예 6의 단백질-형광 복합체에서 분해된 Cy5.5의 형광이며, 푸른색은 DAPI용액으로 염색된 세포의 핵이다.
도 3c는 암세포(CT26CL25)를 확대하여 세포 수준에서 실시예 6의 단백질-형광 복합체의 세포 내 흡수 변화를 시간에 따라(1h, 2h, 4h) 촬영한 공초점 현미경 이미지와 CD47 저해제와 실시예 6의 단백질-형광 복합체를 처리한 암세포(CT26CL25)를 확대하여 세포 수준에서 촬영한 공초점 현미경 이미지(4h+inhibitor)이다.
도 4a는 종양동물모델에 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 주입하고, 1시간, 3시간, 6시간 및 24시간이 경과된 후의 종양동물모델을 각각 촬영한 형광이미지이다. 이때, 왼쪽 암에는 CD47 저해제(CD47 blockin Ab)를 주입하였다.
도 4b는 도 4a의 종양동물모델 중에서 실시예 6의 단백질-형광 복합체를 주입하고 24시간이 경과한 후의 종양동물모델의 양쪽의 암조직을 적출한 다음, IVIS Lumina Series III(PerkinElmer, Massachusetts, USA)로 형광을 관찰한 사진이다.
도 4c는 도 4b의 양쪽 암 조직을 각각 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 촬영한 것이다. 이때 푸른색은 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 핵 염색을 나타내며, 적색은 Cy5.5(Cyanine5.5)를 나타낸다.
도 4d는 종양동물모델에 인산염완충액(PBS), 실시예 3으로부터 제조된 리소좀 프로브, 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 정맥 주사하고, 시간에 따라 형광 변화를 IVIS Lumina Series III (PerkinElmer, Massachusetts, USA)로 촬영한 이미지이다.
도 4e는 종양동물모델에 인산염완충액(PBS), 실시예 3으로부터 제조된 리소좀 프로브, 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 정맥 주사하고, 24시간이 경과한 후, 모든 장기(간, 폐, 쓸개, 신장, 심장, 암)를 적출하고, 이의 형광 변화를 IVIS Lumina Series III (PerkinElmer, Massachusetts, USA)로 촬영한 이미지이다.
도 4f는 종양동물모델에 인산염완충액(PBS), 실시예 3으로부터 제조된 리소좀 프로브, 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 정맥 주사하고 24시간 후 암 조직을 적출하고, 이의 형광 변화를 IVIS Lumina Series III (PerkinElmer, Massachusetts, USA)로 촬영한 이미지이다.
도 1b는 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체에 대한 자외선/가시광선 분광광도계(UV-VIS spectroscopy)로 측정한 결과 그래프이다.
도 1c는 인산염완충식염수 (phosphate-buffered saline, PBS) 존재하에서, 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체의 농도에 따른 자외선/가시광선 분광광도계로 정량화한 그래프이다.
도 1d는 인산염완충식염수 (phosphate-buffered saline, PBS) 존재하에서, 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체가 형광을 흡수하는 정도를 형광기계(photoluminescence, F-7000, Hitach, Tokyo, Japan)로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 1e는 세포 내 펩타이드내부가수분해효소(endopeptidase)인 파파인(papain)이 존재하거나, 존재하지 않는 조건하에서, 실시예 3으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 처리하고, 형광(photoluminescence, PL) 세기를 측정한 그래프와 사진이다.
도 2a는 본 발명의 단백질-형광 복합체의 구조를 나타낸 것으로, 단백질(SIRPα)과 리소좀 프로브(probe)의 결합관계를 나타낸 모식도이다. 상기 단백질은 리소좀 프로브의 카복실기(-COOH)를 인산염완충액 pH6.0 하에서 Sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)와 EDC(1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) 반응으로 아민(amine)기와 결합할 수 있는 NHS 형태로 바꿔준 후, 단백질(SIRRPα)을 처리하여, 상온에서 4시간동안 반응하여 제조된다.
도 2b는 pET-28 벡터에 CD47과 결합력을 향상시킨 변형된 SIRPα DNA 서열을 삽입하여 클로닝 후 대장균에서 SIRPα 단백질을 정제하여 쿠마씨 블루(coomassie blue)로 염색한 사진이다.
도 2c는 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체, 실시예 4-1)로부터 제조된 SIRPα 단백질, 비교예 1로부터 제조된 SIRPα-Cy5.5를 파파인 효소와 함께 배양한 다음, 15% Polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE gel)로 SDS-PAGE 분석 후, 각각의 밴드에 대한 형광을 확인하기 위해, 형광 기기(IVIS lumina)로 촬영한 사진이다.
도 2d는 실시예 4의 단백질-형광 복합체의 정제 및 크기를 단백질 액체 크로마토 그래피 (Fast protein liquid chromatography,FPLC)로 분석한 그래프이다.
도 2e는 실시예 4 내지 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 파파인 효소(papain, sigma)로 처리하고, 20분 후에 재발광효과를 형광 기계(photoluminescence, PL)로 확인한 그래프이다.
도 2f는 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체(SIRPα-probe)와 비교예 1의 소광체를 붙이지 않은 단백질-형광체(SIRPα-Cy5.5)를 비교하기 위하여, 이들 각각을 형광기계(photoluminescence, PL)로 측정하여 도식화한 결과 그래프이다.
도 3a는 암세포(HT29)에 실시예 6의 단백질-형광복합체를 처리한 후 시간에 따른(30분, 1시간, 2시간, 4시간) 세포 흡수를 공초점 현미경(confocal microscopy)이다. 이때 푸른색은 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 핵 염색을 나타내며, 적색은 Cy5.5(Cyanine5.5)로 프로브 형광을 나타낸다.
도 3b는 CD47 저해제(CD47 Ab)를 처리 유무(+, -)에 따른, 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 처리한 암세포(HT29, CT26CL25, B16F10) 각각의 공초점 현미경 이미지이다(bar=50 ㎛). 이때 적색은 실시예 6의 단백질-형광 복합체에서 분해된 Cy5.5의 형광이며, 푸른색은 DAPI용액으로 염색된 세포의 핵이다.
도 3c는 암세포(CT26CL25)를 확대하여 세포 수준에서 실시예 6의 단백질-형광 복합체의 세포 내 흡수 변화를 시간에 따라(1h, 2h, 4h) 촬영한 공초점 현미경 이미지와 CD47 저해제와 실시예 6의 단백질-형광 복합체를 처리한 암세포(CT26CL25)를 확대하여 세포 수준에서 촬영한 공초점 현미경 이미지(4h+inhibitor)이다.
도 4a는 종양동물모델에 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 주입하고, 1시간, 3시간, 6시간 및 24시간이 경과된 후의 종양동물모델을 각각 촬영한 형광이미지이다. 이때, 왼쪽 암에는 CD47 저해제(CD47 blockin Ab)를 주입하였다.
도 4b는 도 4a의 종양동물모델 중에서 실시예 6의 단백질-형광 복합체를 주입하고 24시간이 경과한 후의 종양동물모델의 양쪽의 암조직을 적출한 다음, IVIS Lumina Series III(PerkinElmer, Massachusetts, USA)로 형광을 관찰한 사진이다.
도 4c는 도 4b의 양쪽 암 조직을 각각 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 촬영한 것이다. 이때 푸른색은 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 핵 염색을 나타내며, 적색은 Cy5.5(Cyanine5.5)를 나타낸다.
도 4d는 종양동물모델에 인산염완충액(PBS), 실시예 3으로부터 제조된 리소좀 프로브, 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 정맥 주사하고, 시간에 따라 형광 변화를 IVIS Lumina Series III (PerkinElmer, Massachusetts, USA)로 촬영한 이미지이다.
도 4e는 종양동물모델에 인산염완충액(PBS), 실시예 3으로부터 제조된 리소좀 프로브, 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 정맥 주사하고, 24시간이 경과한 후, 모든 장기(간, 폐, 쓸개, 신장, 심장, 암)를 적출하고, 이의 형광 변화를 IVIS Lumina Series III (PerkinElmer, Massachusetts, USA)로 촬영한 이미지이다.
도 4f는 종양동물모델에 인산염완충액(PBS), 실시예 3으로부터 제조된 리소좀 프로브, 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 정맥 주사하고 24시간 후 암 조직을 적출하고, 이의 형광 변화를 IVIS Lumina Series III (PerkinElmer, Massachusetts, USA)로 촬영한 이미지이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현 예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"란 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
참고로, 대표적인 아미노산과 각각의 약어는, 알라닌(Ala, A), 이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 발린(Val, V), 아스파라긴(Asn, N), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글리신(Gly, G), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 티로신(Try, Y), 아스파르트산(Asp, D), 글루탐산(Glu, E), 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H), 리신(Lys, K)과 같다.
본 발명의 일 측면은 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드(a)를 중심으로, 상기 폴리펩티드 양 말단에 형광체(b)와 소광체(c)가 접합되어 있고, 상기 폴리펩티드(a)의 COO- 기에 SIRPα 단백질(d)이 결합되어 있는, 단백질-형광 복합체에 관한 것이다.
종래 암 세포를 표지 또는 영상화하기위한 물질들은 생체 내에서 빨리 분해 및 제거되고, 목적 부위를 타겟하는 기능이 현저히 낮을 뿐만 아니라, 세포 내로 전달이 용이하지 않아 실질적인 적용에 제한이 있었다. 이러한 문제들을 해결하기 위하여 본 발명자들은 암 세포를 선택적으로 표지하며, 세포 내로 효과적으로 침투하되, 암 세포내에 존재하는 리소좀에 의해 분해되어 형광을 나타내도록 하는 물질을 발명하고자 노력한 바, 완성하게 되었다.
본 발명의 단백질-형광 복합체는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드(a)를 중심으로, 상기 폴리펩티드 양 말단에 형광체(b)와 소광체(c)가 접합되어 형성된 구조식 a로 표시되는 리소좀 프로브와, 서열번호 3으로 표시되는 SIRPα 단백질의 아민기가 결합된 형태이다. 상기 단백질-형광 복합체는 평소에는 소광상태로, 거의 0에 가까운 형광 세기를 나타내다가, 암 세포 내에 존재하는 리소좀에 의해 분해되어 형광을 낼 수 있도록 설계되었기 때문에, 상기 단백질-형광 복합체는 암 세포 내부로 함입되어 침투될 경우, 암 세포 내에 존재하는 리소좀(lysosome)에 의해 효과적으로 분해됨으로써, 형광이 발현되는 것이다.
나아가 상기 단백질-형광 복합체는 분해되었을 때, SIRPα 단백질 자체가 항암제로서의 효과를 가지고 있다. 따라서, 종래 기존 나노입자 및 여러 합성전달체가 가지고 있던 부작용 문제를 극복 및 해결함과 동시에 생체 내 적합성 및 형광 전달체뿐만 아니라 항암제로서의 역할도 동시에 수행할 수 있도록 현저히 개선되었다.
즉, 본 발명의 단백질-형광 복합체는 생체적합성이 뛰어나 부작용이 적으며, 암 세포를 특이적으로 영상화할 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 단백질-형광 복합체는 여러 약물의 전달체로서 효율적으로 사용할 수 있음을 다양한 실험예를 통해 확인하였다.
또한, 상기 단백질-형광 복합체는 생리학적 용액에 쉽게 용해되므로, 흡수가 용이하여 생체 이용률이 뛰어나고, 안정성 및 암세포 특이성이 개선되었으므로 항암 효과를 가진 전달체로서 영상 이미징 및 치료에 매우 유용하다.
상기 단백질-형광 복합체는 암 세포 내에 함입되고, 세포 내에 존재하는 리소좀(lysosome)에 의해 분해되어 형광 물질이 방출되고, SIRPα 단백질(서열번호 3)은 분해되어, 암 세포 내에 흡수 및 전달되어 암조직의 생장과 전이를 억제하는 효과를 갖는다. 이후, 상기 분해된 단백질-형광 복합체들은 모두 체내 대사과정을 통해 분해되거나, 신장을 통해 체외로 배출되어, 생체 내에 잔류하지 않으므로, 독성을 야기하지 않기 때문에 생체 적합성이 매우 우수하다.
본 발명에 따른 단백질-형광 복합체는 상기 SIRPα 단백질 1몰에 대해 상기 리소좀 프로브가 1몰의 몰비 이상으로 결합한 것일 수 있다. 만약 상기 SIRPα 단백질 1몰에 대해 상기 리조솜 프로브가 1몰 이하일 경우, SIRPα 단백질의 몰이 증가할수록 엉김현상이 발생하여, 세포 내 함입이 어려워지는 문제가 있다. 또한 SIRPα 단백질의 몰이 증가할수록 단가가 급증한다.
나아가 본 발명에 따른 단백질-형광 복합체는 간단한 합성법을 통하여 어떠한 추가적인 과정의 도입 없이 높은 수율로 재발광 효과를 나타내도록 하기 위해서는, 상기 SIRPα 단백질 1몰에 대해 상기 리소좀 프로브가 2몰의 몰비 이상으로 결합한 것이 바람직하다. 상술한 비율로 제조된 단백질-형광 복합체는 암 세포 내에서 리소좀에 의해 효율적으로 재발광됨으로 형광의 민감도가 현저히 향상되는 장점이 있다.
상기 폴리펩티드(a)는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 암 세포 내에서 리소좀 분해 효소들에 의해 잘리도록 펩타이드(GFLG)기반으로, C 말단에 하나 이상의 글리신과 라이신(lysine, K) 또는 아르기닌(Arginine, R) 아미노산 잔기가 결합되어 있는 펩타이드이다.
상기 폴리펩티드(a)의 N-말단에 상기 형광체(b)가 결합되고, 상기 폴리펩티드(a)의 라이신 또는 아르기닌 아미노산 잔기의 입실론 아민기(ε-amino group; 측쇄 아민기)에 소광체(c)가 결합되어 있을 수 있다.
즉, 상기 단백질-형광 복합체는 상기 형광체(b)의 발광을 흡수하여 소광 효과를 나타낼 수 있는 소광체(c)가 결합되어 있는 것으로, 형광체(b)가 발산하는 파장의 빛을 흡수하여 강한 소광 효과(quenching effect)를 달성하도록 하는 것이다. 다시 말해 상기 폴리펩티드(a)가 암 세포 내에 존재하는 리소좀에 의해 분해되지 않으면 형광이 발광되지 않으며, 이러한 소광 효과는 형광체와 소광체의 거리가 수십 ㎚ 이내에 있을 경우에 나타난다. 효소에 의해 폴리펩티드(a)가 분해되면, 여기에 결합되어 있던 형광체(b)와 소광체(c)가 서로 분리되어 떨어지면서 소광효과가 없어지고, 이에 따라 형광체 고유의 형광을 발광하여 암 세포의 내부에서 암 세포의 존재유무를 확인할 수 있도록 이미징(영상화)할 수 있게 된다. 본 발명의 단백질-형광 복합체는 CD47을 과발현하는 암 세포만을 특이적으로 검출할 수 있기 때문에, 암 진단 또는 암 영상화 또는 암 세포 모니터링에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 형광체(b)는 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 텍사스 레드(Texas red), Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 인도카르보사이아닌(indocarbocyanine), 로다민(rhodamine), 옥사카르보사이아닌(oxacarbocyanine), 티아카르보사이아닌(thiacarbocyanine), 메로사이아닌(merocyanine), 피리딜록사졸(pyrodyloxazole), 니트로벤족사디아졸(nitrobenzoxadiazole), 벤족사디아졸(benzoxadiazol), 나일 레드(Nile red), 나일 오렌지(Nile orange), 아크리딘 옐로우(acridine yellow), 오마린(aumarine), 크리스탈 바이올렌(crystal violet), 및 말라카이트 그린(malachite green)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 형광체(b)의 발광 파장의 범위에 따라 사용되는 소광체의 종류가 달라지며, 이는 형광체의 발광파장과 같거나 거의 유사한 파장대의 소광체를 사용하여야만 소광효과를 극대화할 수 있기 때문이다. 본 발명에서, 소광체는 여기된(excited) 형광체의 에너지를 흡수하지만 형광 에너지를 밖으로 방출하지 않으므로 형광체의 형광을 소광시킬 수 있는 물질인 dark quencher로, 상업적으로 널리 상용화되어 있는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 사용될 수 있다.
본 발명에서는 상기 폴리펩티드(a)의 C 말단에 근적외선 형광체인 Cy5.5를 도입하고, N 말단에 위치한 라이신(lysine, K) 또는 아르기닌의 입실론 아민기(측쇄 아민기)에 소광체(BHQ-3)가 결합되도록 설계하였다. 이는 당업자에게 잘 알려진 다양한 기술을 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 폴리펩티드(a)에 소광체(c) 또는 형광체(b)를 결합시키는 방법은 DMSO 상태에서 이루어졌으며, N-Methylmorpholine(NMM) 과 4-Dimethylaminopyridine (DMAP)을 촉매 하에 합성하였다. 합성과정은 형광체 도입, 보호 그룹(protecting group) 제거 및 소광체 도입 세 가지로 이루어지며, 각각의 과정은 고성능액체크로마토그래피(High-performance liquid chromatography, HPLC)로 확인 및 정제하였다. 상기 폴리펩티드에 아민기가 존재하고, 형광체 및 소광체에 N-하이드록시숙신이미드(NHS 형태) 작용기가 존재하는 경우, 상기 두 분자 간의 공유 결합이 가능하다. 또는 상기 폴리펩티드에 COOH 기가 존재하고, 형광체 및 소광체에 아민기가 존재하는 경우에, 상기 두 잔기가 직접적으로 결합하는 것이 불가능하므로, 크로스링커 (예컨대, 디사이클로헥실카보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드, 하이드로클로라이드(EDAC))를 이용하여 두 개를 화학적으로 결합시키는 것이 가능하다.
상기 SIRPα 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있고, 이는 서열번호 4로 표시되는, CD47과 결합력을 향상시킨 변형된 SIRPα DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 미생물에 도입하여 형질전환된 미생물을 얻고, 이 형질전환된 미생물을 배양하여 얻은 것으로써, 후술하는 실험예에서 상기 SIRPα 단백질은 암 조직에서 과다 발현되는 CD47과 매우 우수한 결합력을 가지고 있음을 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드(a)에 COOH 기가 존재하고, 상기 SIRPα 단백질에 아민기가 존재하는 경우에, 상기 두 잔기가 직접적으로 결합하는 것이 불가능하므로, 상기 폴리펩티드(a)의 COOH 기를 Sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)와 EDC(1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)와 반응시켜 N-하이드록시숙신이미드(NHS 형태) 작용기로 치환한 후, 상기 두 분자 간의 공유 결합을 형성한다.
상기 단백질-형광 복합체는 암 조직에서 과다 발현되는 CD47과 반응하여, 세포 내로 함입되고, 세포 내에서 리소좀에 의해 분해되어, 형광을 발광하게 된다. 이때, 상기 형광체는 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5이고, 근적외성 빛(650-900 ㎚)을 방출한다. 이에 소광체는 상기 형광체의 형광을 흡수하여 소광 효과를 극대화시킬 수 있는 BHQ3을 사용하였다. 상기 근적외성 형광체를 사용할 경우, 통상의 가시광선대 빛을 방출하는 형광분자에 비하여 더 심도가 깊은 곳의 암 세포를 영상화할 수 있기 때문에 인간과 같은 부피가 큰 동물의 생체 내 형광이미징에 적합하다.
또한, 필요에 따라, 상기 제조된 단백질-형광 복합체를 정제 또는 확인할 수 있는데, 이는 당업자에게 잘 알려진 다양한 기술을 사용할 수 있다.
상기 단백질-형광 복합체의 분자량은 18kDa 내지 21kDa일 수 있다. 상기 분자량을 초과할 경우, 응집현상이 발생하여 효과적으로 암세포를 형광 표지할 수 없으며, 미만일 경우 형광 정도가 낮아져 생체 내 영상화에 불리하다는 문제가 있다.
상기 단백질-형광 복합체는 하기 구조식 1로 표시되는 것일 수 있다.
[구조식 1]
본 발명의 단백질-형광 복합체의 적용이 가능한 종양은, 이에 특별히 제한되지 않으나, 고체 암 및 혈액 암(blood born tumor)을 포함하는 일반적인 암 질환일 수 있고, 예를 들어 유방암, 난소암, 위암, 결장암, 폐암, 대장암, 골암, 췌장암, 피부암, 자궁암, 소장암, 직장암, 항나팔관암종, 자궁경부암종, 질암종, 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 또는 섬유육종암일 수 있다.
본 발명의 단백질-형광 복합체의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해 본 발명의 투여량은 유효성분인 단백질-형광 복합체 기준으로 성인 남성 기준 1일 0.0001 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 ㎎/㎏ 내지 60 ㎎/㎏이다. 투여는 1일 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으나 시간의 간격을 두어 형광 배출 후 투여하는 것이 바람직하다. 환자의 나이, 성별, 체중, 대사 작용, 현재 복용중인 다른 약물에 따라 적절히 증감하여 투여될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 단백질-형광 복합체는 유효량의 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 제형화된 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감독하거나 관리하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법 및 제제법을 사용하거나 일정시간 간격으로 수 회 투여할 수 있다.
본 발명의 단백질-형광 복합체는 랫트, 마우스, 토끼, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면 경구로 또는 복강내, 비강내, 직장내, 정맥내, 근육내, 피하, 뇌혈관내로 주사 등에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 단백질-형광 복합체는 매우 낮은 농도로 세포에 주입시키는 것만으로 암 세포에 특이적으로 함입되어, 암 세포의 내에서 선택적으로 형광을 발광할 수 있다. 세포에 주입 후, 형광 현미경으로 700 내지 900 ㎚에서 형광의 세기를 측정한다. 본 발명의 단백질-형광 복합체는 생체 내 또는 생체 외에서 암세포 내부에 침투하여 형광을 발광하므로, 비침습적으로 암 세포의 분포를 효과적으로 이미징할 수 있다. 즉, 본 발명의 단백질-형광 복합체는 개체로부터 암 세포가 존재하는지, 어디에 분포하고 있는지를 영상화하여, 암을 진단할 수 있도록 하는 조성물로 활용될 수 있고, 암 환자의 암 치료 효과의 모니터링 또는 예후 확인용 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명의 단백질-형광 복합체는 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태 일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 단백질-형광복합체를 유효성분으로 하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 암이 의심되는 개체에 투여되어 암의 존재 여부 및 암의 분포를 모니터링함으로써 암을 진단하기 위한 정보를 제공하거나, 항임 치료 효과를 확인하거나, 미리 특정 약물에 대한 반응성을 예측하거나, 암의 위치를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이와 같은 방식은 암의 치료와 관련하여 매우 중요하다.
본 발명의 단백질-형광 복합체의 적용이 가능한 종양은, 이에 특별히 제한되지 않으나, 고체 암 및 혈액 암(blood born tumor)을 포함하는 일반적인 암 질환일 수 있고, 예를 들어 유방암, 난소암, 위암, 결장암, 폐암, 대장암, 골암, 췌장암, 피부암, 자궁암, 소장암, 직장암, 항나팔관암종, 자궁경부암종, 질암종, 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 또는 섬유육종암일 수 있다.
본 발명의 단백질-형광 복합체의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해 본 발명의 투여량은 유효성분인 단백질-형광 복합체 기준으로 성인 남성 기준 1일 0.0001 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 ㎎/㎏ 내지 60 ㎎/㎏이다. 투여는 1일 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으나 시간의 간격을 두어 형광 배출 후 투여하는 것이 바람직하다. 환자의 나이, 성별, 체중, 대사 작용, 현재 복용중인 다른 약물에 따라 적절히 증감하여 투여될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 단백질-형광 복합체는 유효량의 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 제형화된 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감독하거나 관리하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법 및 제제법을 사용하거나 일정시간 간격으로 수 회 투여할 수 있다.
본 발명의 단백질-형광 복합체는 랫트, 마우스, 토끼, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면 경구로 또는 복강내, 비강내, 직장내, 정맥내, 근육내, 피하, 뇌혈관내로 주사 등에 의해 투여될 수 있다.
상기 조성물에서 단백질-형광 복합체는 암세포의 CD47 수용체 존재 하에서 세포 내로 흡수되어 리소좀(lysosome)에서 효소분해 되어 형광을 발현한다. 이로 암의 영상화뿐만 아니라 세포 내로 잘 전달되었는지 알아볼 수 있는 지표로 작용할 수 있다.
상기 단백질-형광 복합체는 암세포의 수용체에 보다 강하게 결합하여 암세포 특이적 전달력을 가질 뿐만 아니라 식세포의 대식작용을 증대시켜 암세포의 증식을 억제하는 항암 효과를 갖는다. 구체적으로 암세포에서 과발현되는 CD47수용체는 흔히 'Don't eat me' 신호로 식세포가 암세포를 인식하여 제거하는 역할을 방해하여 암세포가 살아남는 생존 방법이다. 상기 단백질-형광 복합체는 단백질이 CD47과 결합하여 암세포의 대식작용 억제를 방해한다. 즉, 암세포 주위에 식세포가 자발적으로 암세포를 공격하게 함으로써 자가 면역으로 항암효과를 낼 수 있음을 의미한다.
따라서, 본 발명의 단백질-형광 복합체는 암 예방 또는 치료용 조성물로도 활용될 수 있다.
상기 암 예방 또는 치료용 조성물은 상기 단백질-형광 복합체 만으로도 항암효과를 달성할 수 있으나, 추가적인 항암 효과를 위해 항암제를 더 포함할 수 있고, 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 1) 제1항에 따른 단백질-형광 복합체를 개체에 투여하는 단계; 및 2) 상기 개체로부터 상기 단백질-형광 복합체에 의한 이미지를 수득하는 단계;를 포함하는 상기 개체의 암의 진단방법에 관한 것이다.
상기 방법에 있어서, 상기 개체로부터 형광으로 발광하는 영역이 존재하는 이미지가 관찰되는 경우, 암 세포가 존재하는 것으로 판정할 수 있고, 암 세포의 위치를 파악할 수 있다.
항암제를 투여하고, 상기 방법으로 측정하였을 때, 상기 이미지 상에서 형광으로 표시되는 영역이 감소하거나 증가하지 않을 경우 상기 항암제에 의한 치료효과가 양성인 것으로 판정하고, 형광으로 표시되는 영역이 증가할 경우 상기 항암제에 의한 치료효과가 음성인 것으로 판정할 수 있다.
이하에서 다양한 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
실시예 1 및 2. 펩타이드(a) 합성
리소좀 프로브(lysosomal protease cleavable probe)로 사용될 서열번호 1 또는 2로 표시되는 폴리펩타이드를 설계하여, peptron(Daejeon, South korea)에 의뢰하여 구입하였다. 합성과정은 간략하게, 하기 서열번호 1 또는 2로 표시되는 폴리펩타이드를 설계하고, 아미드가 C-말단에 고정되어 있는 형태인 링크 아미드 레진에 Fmoc으로 보호된 아미노산 단량체를 차례로 붙여나가는 SSPS(solid-phase peptide synthesis) 방법을 사용하였다. 상기 폴리펩타이드의 아민과 sulfo-NHS 결합을 1대1로 하기 위해 라이신(lysin, k)기 또는 아르기닌 기(Arginine, R)에 tert-Butyloxycarbonyl protecting group(BOC) 보호그룹을 결합시켰다.
N-메틸모르폴린(N-Methylmorpholine(NMM)), 4-디메틸아미노피리딘(4-Dimethylaminopyridine) 및 파파인(papain) 가수분해 효소 Sigma Aldrich에서 구입하였다.
[서열번호 1]
GFLGGGKG
[서열번호 2]
GFLGGGRG
본 발명은 라이신기 또는 아르기닌기의 아민기에 소광체를 직접 결합시키기 때문에, 상기 리소좀 프로브의 사슬 길이는 결합시키는 소광체의 형태에 따라 달라질 수 있고, 본 실험예에서는 소광체로 BHQ-3를 사용하였다.
상기 구입한 폴리펩티드는 Vydac Everest C18 컬럼(250 ㎜×22 ㎜, 10 ㎛, USA)를 사용한 역상 HPLC(Shimadzu prominence HPLC, Japan)으로 정제하였다. 용리(elution)는 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)를 함유하는 물-아세토니트릴 선형 구배 용리액(water-acetonitrile linear gradient)(5~95%(v/v) of acetonitrile)으로 수행하였다. 정제한 물질은 FDT12012(Operon, Korea)을 사용하여 동결건조하였다. 상기 폴리펩티드는 세포 내에서 리소좀 분해 효소들에 의해 잘리도록 설계되었고, 구체적으로 GFLG 서열의 펩타이드를 백본으로, C 말단에 하나 이상의 글리신과 라이신(lysine, K) 또는 아르기닌(Arginine, R) 아미노산 잔기가 결합되어 있다.
실시예 3. 리소좀 프로브(lysosomal protease cleavable probe) 제조
[구조식 a]
상기 제조예 1로부터 합성된 폴리펩티드의 N-말단에 근적외선 형광체인 Cy5.5가 접합되고, 상기 폴리펩티드의 라이신 아미노산 잔기의 입실론 아민기에 소광체인 BHQ-3가 결합되도록, 리소좀 프로브를 설계하였다. 구체적인 합성과정은 다음과 같다.
합성과정은 형광체 도입 단계, 보호 그룹(protecting group) 제거 단계 및 소광체 도입 단계 총 세가지 단계로 수행하였다. 각각의 합성과정은 DMSO 상태에서 이루어졌으며, N-Methylmorpholine(NMM) 과 4-Dimethylaminopyridine (DMAP)을 촉매 하에 합성하였다. 각각의 합성과정이 끝난 후에는 고성능액체크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography, HPLC)로 확인 및 정제한 후 동결건조하여 냉동보관하였다.
1) 형광체 도입 단계
먼저 실시예 1로부터 제조된 폴리펩타이드의 N-말단 부분에 형광체 Cy5.5(cyanine5.5)를 이메틸 일산화황(Dimethyl sulfoxide,DMSO) 하에 촉매 N-Methylmorpholine(NMM) 과 4-Dimethylaminopyridine (DMAP)을 이용하여 2시간 상온에서 합성한 후 고속액체크로마토그래피(High-performance liquid chromatography, HPLC)로 분석 및 정제하였다.
2) 보호 그룹 제거 단계
상기 1) 단계에서 합성된 Cy5.5(형광체)가 결합된 폴리펩티드의 라이신기에 존재하는 보호그룹을 제거하기 위해 트리플루오르아세트산(Trifluoroacetic acid): 아니솔(anisol): 3차 증류수=95:2.5:2.5 강산 조건에서 반응 후 증발기(evaporator)를 통해 용매를 제거하였다.
3) 소광체 도입 단계
상기 2) 단계를 통해 보호그룹이 제거된 Cy5.5(형광체)가 결합된 폴리펩티드를 얻고, 상기 폴리펩티드의 노출된 라이신(lysine, K)의 입실론 아민기에 BHQ3-NHS(Black Hole Quencher3-NHS)를 N-Methylmorpholine(NMM) 과 4-Dimethylaminopyridine(DMAP) 촉매하에 2시간 상온 반응 후, 형광체와 소광체가 모두 도입된 구조식 a의 리소좀 프로브를 제조하였다. 이를 고성능액체크로마토그래피(High-performance liquid chromatography, HPLC)로 확인 및 정제한 후 동결건조하여 냉동보관하였다.
실시예
4. 단백질-형광복합체(
SIRP
α-
LS
probe) 합성
[반응식 1]
실시예 2로부터 제조된 리소좀 프로브를 SIRPα 단백질에 다양한 몰 비(1:1(실시예 4), 1:1.5(실시예 5), 1:2(실시예 6))로 혼합하여 제조하였다.
1) SIRPα 단백질의 제조
우선, SIRPα 단백질은 cosmogenetech에서 다음과 같은 유전자(서열번호 4:CATATGGAAGAGGAGCTGCAGATCATCCAGCCTGACAAGTCCGTGCTGGTCGCTGCTGGTGAAACTGCCACTCTGCGTTGTACGATTACCAGCCTGTTCCCGGTGGGTCCAATCCAGTGGTTCCGTGGTGCTGGTCCGGGTCGTGTTCTGATCTACAACCAGCGTCAAGGTCCGTTCCCGCGTGTAACTACCGTTAGCGATACCACGAAGCGTAACAACATGGACTTTTCCATCCGCATTGGCAATATTACCCCGGCCGACGCGGGCACCTACTATTGCATCAAATTTCGCAAAGGCTCCCCGGATGATGTAGAATTTAAATCTGGCGCAGGCACCGAACTGTCTGTTCGCGCAAAACCGGTCGACGGTGGGTTTCTGGGTGGGGGAGGATGCGGTTGAAAGCTT)를 구입 후, PCR하고, 이를 pET-28 벡터에 상기 SIRPα DNA 서열(CD47과 결합력이 향상되도록 변형함)을 삽입하여 클로닝한 다음 대장균에 형질감엽시켜 배양하였다. 상기 형질감염된 대장균의 배양액으로부터 SIRPα 단백질을 분리 및 정제하기 위해, His-tag 컬럼을 사용하였다. 상기 정제한 SIRPα 단백질은 SDS-PAGE를 통해 로딩한 다음 Coomassie Brilliant Blue 염색으로 확인하였다(도 2b). 도 2b는 pET-28 벡터에 CD47과 결합력을 향상시킨 변형된 SIRPα DNA 서열을 삽입하여 클로닝 후 대장균에서 SIRPα 단백질을 정제하여 쿠마씨 블루(coomassie blue)로 염색한 사진으로, 본 발명의 실시예 4에서 정제한 SIRPα 단백질이 잘 분리 및 정제되었음을 알 수 있다.
2) 단백질-형광 복합체의 제조
실시예 2로부터 제조된 리소좀 프로브를 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDC) 및 N-hydroxysulfosuccinimide(Sulfo-NHS)과 혼합하여, 커플링 반응으로 인산염 완충제 (Phosphate-buffered saline, PBS) pH 6.0 용매하에 5 분간 반응시켜, 리소좀 프로브의 카복실기(-COOH)를 NHS 형태로 변환하였다. 이 후 인산염 완충제 용매 하에 상기 정제한 SIRPα 단백질을 첨가한 후, 4시간동안 반응시키고, PD-10 column을 통해 정제하여 단백질-형광 복합체를 제조하였다. 이때, 상기 리소좀 프로브와 SIRPα 단백질의 몰비를 1:1(실시예 4), 1:1.5(실시예 5), 1:2(실시예 6)로 혼합하여 제조하였다.
상기 제조된 단백질-형광 복합체는 동결건조하여 보관하였다(반응식 2).
비교예 1. 소광체를 붙이지 않은 단백질-형광체(SIRPα-Cy5.5)의 제조
상기 제조예 1로부터 합성된 폴리펩티드의 N-말단에 근적외선 형광체인 Cy5.5를 결합하는 과정만을 수행하고, 소광체인 BHQ-3는 결합하는 과정은 수행하지 않은 것을 제외하고는 실시예 3과 모두 동일하게 하여, 소광체가 결합하지 않은 리소좀 프로브를 제조하였다.
상기 소광체가 결합되지 않은 리소좀 프로프를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 모두 동일하게 단백질 형광 복합체를 제조하였다.
실험예 1. 단백질-형광복합체(SIRPα-LS probe) 특성분석
생성된 단백질-형광 복합체의 합성 분석 및 성능은 이하와 같이 확인하였다.
실험군과 대조군의 차이는 one-way ANOVA을 사용하여 분석하였고, 통계적으로 유의하다고 간주되었다(도면에서 별표(*)로 표시함, * P<0.05, ** P<0.01, ***P<0.0001).
도 1b는 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체에 대한 자외선/가시광선 분광광도계(UV-VIS spectroscopy)로 측정한 결과 그래프로, 단백질-형광 복합체 내에 형광체와 소광체가 결합되어 있음을 확인하였다.
도 1c는 인산염완충식염수 (phosphate-buffered saline, PBS) 존재하에서, 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체의 농도에 따른 자외선/가시광선 분광광도계로 정량화한 그래프로, 농도의 증가에 따라 자외선, 가시광선의 세기가 증가함을 확인하였다.
도 1d는 인산염완충식염수 (phosphate-buffered saline, PBS) 존재하에서, 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체가 형광을 흡수하는 정도를 형광기계(photoluminescence, F-7000, Hitach, Tokyo, Japan)로 측정하여 나타낸 그래프로, 680~690 ㎚ 형광세기가 높았으나, 700 ㎚부터는 형광세기가 거의 0에 가까운 것을 확인하였다.
실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체체가 세포 내에 존재하는 효소에 의해서만 절단됨을 확인하기 위하여, 세포 내 펩타이드내부가수분해효소(endopeptidase)인 파파인(papain)을 사용하였을 때, 형광 변화를 분석하였다. 우선 인산염 완충용액(Phosphate-buffered saline, PBS) pH 6.0에 용해한 파파인 용액을 준비하고, 상기 파파인 용액에 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 처리하였다. 효소와 반응한 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체의 형광 복원효과를 PL(Photoluminescence)로 확인하였다.
도 1e는 세포 내 펩타이드내부가수분해효소(endopeptidase)인 파파인(papain)이 존재하거나, 존재하지 않는 조건하에서, 실시예 3으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 처리하고, 형광(photoluminescence, PL) 세기를 측정한 그래프와 사진이다. 이에 따르면, 본 발명의 단백질-형광 복합체는 세포 내에 존재하는 효소에 의해서만 분해되어 형광을 나타냄을 확인할 수 있다. 세포 내 존재하는 효소가 없을 경우에는 형광세기가 0에 가까운 것을 알 수 있다.
실험예 2. 리소좀 효소와의 배양시, 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광복합체(SIRPα-LS probe)의 형광 분석
실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체가 세포 내에 존재하는 효소에 의해서만 절단됨을 확인하기 위하여, 세포 내 펩타이드내부가수분해효소(endopeptidase)인 파파인(papain)을 사용하였을 때, 형광 변화를 분석하였다. 우선 인산염 완충용액(Phosphate-buffered saline, PBS) pH 6.0에 용해한 파파인 용액을 준비하고, 상기 파파인 용액에 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체, 실시예 4-1)로부터 제조된 SIRPα 단백질, 비교예 1로부터 제조된 SIRPα-Cy5.5를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 처리하였다. 각각의 복합체 또는 단백질의 형광 복원효과를 PL(Photoluminescence)로 확인하였다.
도 2c는 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체, 실시예 4-1)로부터 제조된 SIRPα 단백질, 비교예 1로부터 제조된 SIRPα-Cy5.5를 파파인 효소와 함께 배양한 다음, 15% Polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE gel)로 SDS-PAGE 분석 후, 각각의 밴드에 대한 형광을 확인하기 위해, 형광 기기(IVIS lumina)로 촬영한 사진이다.
도 2c에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 단백질-형광 복합체는 파파인과 함께 배양할 경우, 밝은 형광을 나타내고 있음을 확인하였다. 이에 반해 소광체를 결합하지 않은 단백질-형광체의 경우, 본 발명과 동일한 분자량을 가지고 있음에도 불구하고 육안으로 보았을 때, 그 밝기가 현저히 어두운 것을 확인할 수 있다. 또한 SIRPα 단백질만 존재하는 경우에는 전혀 형광이 관찰되지 않았다.
실험예 3. 몰비에 따른 단백질-형광복합체(SIRPα-LS probe)의 특성 분석
도 2d는 실시예 4의 단백질-형광 복합체를 단백질 액체 크로마토 그래피 (Fast protein liquid chromatography,FPLC)로 분석한 그래프로, 이에 따르면, 실시예 4의 단백질-형광 복합체는 높은 순도로 분리 및 정제되었음을 확인하였다.
도 2e는 실시예 4 내지 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 파파인 효소(papain, sigma)로 처리하고, 20분 후에 재발광효과를 형광 기계(photoluminescence, PL)로 확인한 그래프이다. 이때 대조군으로 아무것도 처리하지 않은 파파인 효소용액을 사용하였다.
도 2e에 나타난 바와 같이, 실시예 4 내지 6의 단백질-형광 복합체는 대조군에 비해 3~9 배 이상의 형광 세기를 나타내었으며, 육안으로도 현저한 형광을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명에 따른 단백질-형광 복합체는 세포 내 존재하는 효소와의 반응을 통해서만 형광을 발생하고, 평소에는 형광세기가 0에 가까운 소광상태로 존재함을 확인하였다.
또한 단백질-형광 복합체를 제조할 때, SIRPα 단백질과 리소좀 프로브(LS)의 몰비가 1:1 이상이면 충분한 형광세기가 발현되나, 2~2.5배 이상 더 높은 형광세기는 1:2부터 임을 알 수 있다.
실험예 4. 소광체 결합 여부에 따른 단백질-형광복합체(SIRPα-LS probe)의 소광 특성 분석
도 2f는 실시예 4로부터 제조된 단백질-형광 복합체(SIRPα-probe)와 비교예 1의 소광체를 붙이지 않은 단백질-형광체(SIRPα-Cy5.5)를 비교하기 위하여, 이들 각각을 형광기계(photoluminescence, PL)로 측정하여 도식화한 결과 그래프이다.
도 2f에 나타난 바와 같이, 실시예 4의 단백질-형광 복합체는 690~800 nm의 파장 범위에서 거의 0에 가까운 세기를 나타내는 것을 확인하였고, 이를 통해 본 발명의 단백질-형광 복합체는 암 세포 내에 존재하는 효소가 없는 한, 소강상태로 존재함을 확인하였다. 이에 반해, 비교예 1의 단백질-형광체는 소광체를 포함하고 있지 않으므로 680~760 nm의 파장범위에서 1000 이상의 형광 세기를 나타내고 있음을 확인하였다. 즉, 소광체를 붙이지 않은 단백질-형광체는 목적하는 암 세포 내에 함입되지 않더라도, 일반적인 상태에서도 형광을 나타내고 있으므로, 명확한 진단이 어렵다는 문제가 있음을 알 수 있다.
실험예 5. 단백질-형광 복합체의 생체 외에서(In vitro) 세포 내 전달 확인
본 발명에 따른 단백질-형광 복합체의 특정 세포를 표적하고, 영상화할 수 있는지 여부를 관찰하기 위해, 인간유래 대장암 세포인 HT-29 세포를 35 ㎜ 커버글라스 바텀디쉬에 2 x 105 개씩 분주하고, 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체(20 μg/ml)로 처리한 배양액에 4시간까지 이산화탄소 배양기에서 37 ℃에서 배양하였다. 또한, 상기 HT29 세포외에 다른 세포주(HT-29, CT26CL25, B16F10)를 이용해서, 상기와 동일한 과정을 수행하였다. 그리고 세포 고정액을 처리한 뒤 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) 용액을 10분간 처리하여 핵 염색을 실시한 뒤, 공초점 현미경으로 흡수되어 분해된 단백질-형광 복합체(실시예 6) 및 4,6-디아미디노-2-페닐인돌을 관찰하였다.
도 3a는 암세포(HT29)에 실시예 6의 단백질-형광복합체를 처리한 후 시간에 따른(30분, 1시간, 2시간, 4시간) 세포 흡수를 공초점 현미경(confocal microscopy)이다. 이때 푸른색은 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 핵 염색을 나타내며, 적색은 Cy5.5(Cyanine5.5)로 프로브 형광을 나타낸다.
도 3a에 나타난 바와 같이, 2시간부터 세포 내에 섭취되어 분해된 단백질-형광 복합체의 형광이 관찰됨을 확인하였다. 즉, 본 발명의 단백질-형광 복합체는 세포에 처리할 경우, 암세포에 특이적으로 세포 내에 섭취되며, 세포 내에 존재하는 효소에 의해 분해되어 소강상태에서 형광상태로 변함에 따라, 발광하게 됨을 알 수 있다. 따라사 본 발명의 단백질-형광 복합체는 암세포에 특이적으로 세포 내로 섭취되며, 세포 내에서 분해되어 형광을 나타내므로, 암세포만을 효과적으로 영상화할 수 있다. 본 발명의 단백질-형광 복합체를 처리하고 1시간부터 세포의 영상화가 진행되고, 4시간부터는 완전히 형광을 나타내는 것을 알 수 있다.
도 3b는 CD47 저해제(CD47 Ab)를 처리 유무(+, -)에 따른, 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 처리한 암세포(HT29, CT26CL25, B16F10) 각각의 공초점 현미경 이미지이다(bar=50 ㎛). 이때 적색은 실시예 6의 단백질-형광 복합체에서 분해된 Cy5.5의 형광이며, 푸른색은 DAPI용액으로 염색된 세포의 핵이다.
도 3b에 나타난 바와 같이, CD47 저해제(CD47 Ab)가 처리된(+) 암세포(HT29, CT26CL25, B16F10)에서는 본 발명에 따른 단백질-형광 복합체가 세포에 거의 흡수되지 못하고 있음을 확인할 수 있다. 이에 반해 CD47 저해제(CD47 Ab)를 처리하지 않은(-) 암세포(HT29, CT26CL25, B16F10)의 경우, 대부분의 암세포 내에 단백질-형광 복합체(실시예 6)이 흡수되고 분해되어 형광을 나타내고 있음을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 단백질-형광 복합체가 CD47가 결합하여 세포 내로 함입되고 있음을 알 수 있다.
즉, 본 발명의 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체는 암세포 밖에서는 형광세기가 거의 0에 미치는 소강상태로 존재하다가, 암세포가 존재할 경우, 암세포의 CD47과 수용체-리간드 결합을 통해, 세포 내로 함입되고, 함입된 단백질-형광 복합체는 암세포 내에 존재하는 효소에 의해 분해되어 재발광함을 알 수 있다. 상술한 결과를 통해 생체 외에서(in vitro) 본 발명에 따른 단백질-형광 복합체는 효과적으로 암세포에 특이적으로 함입되고, 분해되어 암세포 내에서 형광을 나타냄을 확인하였다.
도 3c는 암세포(CT26CL25)를 확대하여 세포 수준에서 실시예 6의 단백질-형광 복합체의 세포 내 흡수 변화를 시간에 따라(1h, 2h, 4h) 촬영한 공초점 현미경 이미지와 CD47 저해제와 실시예 6의 단백질-형광 복합체를 처리한 암세포(CT26CL25)를 확대하여 세포 수준에서 촬영한 공초점 현미경 이미지(4h+inhibitor)이다.
도 3c에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 단백질-형광 복합체를 처리하고 1 시간 후부터 서서히 암세포 내에 형광을 나타내었으며, 4 시간째에는 본 발명의 단백질-형광 복합체에 의해 모든 암 세포가 형광표지되었음을 확인하였다. 일반적인 이미징 조성물은 세포 외부를 표지하기 때문에, 세포 외부에서도 형광이 나타나는 경우가 있다. 그러나 본 발명의 단백질-형광 복합체는 세포 내부에 함입된 상태에서 분해되면서 세포를 형광으로 영상화할 수 있는 것으로, 세포가 존재하지 않는 곳에서는 전혀 형광을 나타내지 않는 매우 높은 정확성을 나타내고 있음을 확인하였다. 또한, 이미지에 존재하는 3개의 암세포 모두를 정확히 형광으로 영상화하고 있음을 확인하였다.
한편, CD47 저해제(+inhibitor)를 처리한 암세포에서는 형광이 거의 나타나지 않음을 확인하였는 바, 본 발명의 단백질-형광 복합체는 암세포의 CD47과 수용체-리간드 결합을 통해, 세포 내로 함입되고, 함입된 단백질-형광 복합체는 암세포 내에 존재하는 효소에 의해 분해되어 재발광함을 다시 한번 확인할 수 있었다.
실험예 6. 종양동물모델에 CD47 저해제(CD47 blockin Ab) 투여 후 단백질-형광 복합체의 선택적 축적
본 발명에서의 동물실험은 한국과학기술연구원(KIST)의 원칙에 따라 수행되었으며, 기관윤리회(institutional committees)로부터 승인을 받았다.
종양동물모델은 Nara Bio INC(경기도, Korea)으로 구입한 흉선 누드 마우스(6 주령, 20-25 g, 수컷)를 이용하여 수행하였다. 상기 수컷 누드마우스에 1 X 107 개의 HT-29 세포를 양쪽 허벅지에 접종(n=3)하거나 왼쪽 허벅지에 접종 후 종양동물모델을 제작하였고, 3-4 주 후 암의 크기가 80-100 ㎣ 일 때 실험을 실시하였다.
도 4a는 종양동물모델에 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 주입하고, 1시간, 3시간, 6시간 및 24시간이 경과된 후의 종양동물모델을 각각 촬영한 형광이미지이다. 이때, 왼쪽 암에는 CD47 저해제(CD47 blockin Ab)를 주입하였다. 저해제를 주입하고 30분 후에 단백질-형광 복합체를 정맥 주사로 투여하였다. 도 4b는 도 4a의 종양동물모델 중에서 실시예 6의 단백질-형광 복합체를 주입하고 24시간이 경과한 후의 종양동물모델의 양쪽의 암조직을 적출한 다음, IVIS Lumina Series III(PerkinElmer, Massachusetts, USA)로 형광을 관찰한 사진이다. CD47 blocking Ab-는 CD47 억제제를 처리하지 않은 암 조직이고, CD47 blocking Ab+는 CD47 억제제를 처리한 암 조직이다.
도 4a에 나타난 바와 같이 CD47 억제제를 주입한 왼쪽 암에서보다 주입하지 않은 오른쪽 암에서 형광이 나타남을 확인하였다. 또한, 본 발명의 단백질-형광 복합체는 암세포가 아닌 일반세포에서는 전혀 형광을 나타내지 않음을 확인하였다. 이를 통해 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체가 CD47 수용체에 의해 세포 내로 들어가 형광이 발현된다는 것을 세포 실험 뿐만 아니라 동물 실험에서도 확인하였다. 본 발명에 따른 단백질-형광 복합체는 최대 6시간 까지 암세포를 이미지화할 수 있음을 알 수 있다.
또한 도 4a, 4b를 살펴보면, CD47 억제제의 방해없이(CD47 blocking -) 실시예 6의 단백질-형광 복합체를 처리한 경우, 암세포의 크기가 시간에 따라 줄어들고 있다. 게다가 24시간이 경과한 후, 양쪽의 암 조직크기를 비교하였을 때에도 CD47 억제제의 방해없이(CD47 blocking -) 본 발명의 단백질-형광 복합체(실시예 6)가 제대로 기능한 암 조직이 더 크기가 작음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 단백질-형광 복합체는 항암 효과도 지니고 있음을 알 수 있다.
종합하면, 본 발명의 단백질-형광 복합체는 정확한 암세포의 위치를 분명하게 영상화할 수 있으므로, 본 발명의 단백질-형광 복합체를 통해 암을 영상화하고 진단할 수 있음을 확인하였다. 또한 본 발명의 단백질-형광 복합체는 생체 외, 내에서 정확하게 암 세포만을 표적한다는 것을 확인한 바, 이를 약물 전달체로 활용할 경우 높은 항암 효과를 달성할 수 있음을 알 수 있다. 게다가 본 발명의 단백질-형광 복합체는 그 자체적으로 항암효과를 가지고 있음을 알 수 있다.
종양동물모델에 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 주입하고, 24시간이 경과된 후의 종양동물모델을 준비하였다. 이때, 왼쪽 암에는 CD47 저해제(CD47 blockin Ab +)를 주입하였다. 저해제를 주입하고 30분 후에 단백질-형광 복합체를 정맥 주사로 투여하였다. 상기 준비된 종양동물모델의 양쪽 암 조직을 추출하였다. 추출한 암 조직을 절편화(10 ㎛)하고, 상기 절편 슬라이드(10 ㎛)를 DPBS로 3 회 세척하고 실온에서 15 분동안 DAPI 처리한 후, 커버 글래스(cover glass)에 놓은 다음, 공초점 레이저 현미경으로 관찰하여 도 4c에 나타내었다. 도 4c는 도 4b의 양쪽 암 조직을 각각 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 촬영한 것이다. 이때 푸른색은 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 핵 염색을 나타내며, 적색은 Cy5.5(Cyanine5.5)를 나타낸다.
도 4c에 나타난 바와 같이, CD47 저해제를 처리하지 않은 왼쪽 암 조직의 세포 내에 형광이 발현되고 있음을 확인하였다. 즉 본 발명의 단백질-형광 복합체를 정맥으로 투여하였을 때 암 조직만을 영상화 한 것은, 상기 단백질-형광 복합체가 암 세포의 CD47과 반응하여 암 세포 내로 특이적으로 함입되고, 세포 내 존재하는 효소에 의해 분해되어 소광상태가 해지됨으로써, 형광이 나타나기 때문이다. 즉 단백질-형광 복합체(실시예 6)에 의해 생체 내, 외에서 암 세포만을 정확하게 표적하고, 영상화할 수 있음을 확인할 수 있다.
실험예 7. 종양동물모델에 단백질-형광 복합체의 정맥 주입을 통한 암 세포의 이미징
종양동물모델의 왼쪽 허벅지에 1 x 107 개의 HT-29 세포를 직접 주사하였다(n=3, 각 군). 약 3~4주 후 암 크기가 약 100 ㎣에 도달하면 인산염완충액(PBS), 실시예 3으로부터 제조된 리소좀 프로브, 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체을 각각 정맥 주사하여, 1시간, 3시간, 6시간, 24시간 후 형광 변화를 관찰하였다. 이 때 인산염 완충액 및 리소좀 프로브는 대조군으로 각각 100 ㎕를 종양동물모델에 꼬리정맥에 주사하였다.
도 4d는 종양동물모델에 인산염완충액(PBS), 실시예 3으로부터 제조된 리소좀 프로브, 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 정맥 주사하고, 시간에 따라 형광 변화를 IVIS Lumina Series III (PerkinElmer, Massachusetts, USA)로 촬영한 이미지이다.
도 4e는 종양동물모델에 인산염완충액(PBS), 실시예 3으로부터 제조된 리소좀 프로브, 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 정맥 주사하고, 24시간이 경과한 후, 모든 장기(간, 폐, 쓸개, 신장, 심장, 암)를 적출하고, 이의 형광 변화를 IVIS Lumina Series III (PerkinElmer, Massachusetts, USA)로 촬영한 이미지이다.
도 4f는 종양동물모델에 인산염완충액(PBS), 실시예 3으로부터 제조된 리소좀 프로브, 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체를 정맥 주사하고 24시간 후 암 조직을 적출하고, 이의 형광 변화를 IVIS Lumina Series III (PerkinElmer, Massachusetts, USA)로 촬영한 이미지이다.
도 4d, e, f에 나타난 바와 같이, 실시예 3으로부터 제조된 리소좀 프로브(probe)는 시간이 경과함에 따라 빠르게 체내에서 배출되어 암 조직에 축적되는 것이 거의 없었다. 게다가 암 조직을 이미징하지 못하고 동물모델 체내에 전체적으로 퍼져있음을 확인하였다. 이에 반해 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체는 단백질로 인해 전달 효과와 축적능이 향상됨에 따라 24시간 후에도 암 조직 내에 형광이 축적되어, 암 조직의 위치를 정확히 이미징할 수 있음을 확인하였다.
또한, 투여한지 24시간이 지난 후, 적출한 동물모델의 장기에서, 실시예 6으로부터 제조된 단백질-형광 복합체의 형광이 더욱 강하게 발하고 있음을 확인하였다.
상술한 결과를 통해서 본 발명의 단백질-형광복합체 형태로 주입할 경우 암 조직 내 CD47 수용체로 들어감에 따라 전달능력 및 암 조직 내에서 축적이 활성화 되었으며, 세포 내에서만 형광을 발현하기 때문에 형광체가 세포 내에서 발생할 수 있는 불확실성 제거할 뿐만 아니라 형광의 민감도를 증가시켰다. 이 외에도 단백질-형광 복합체 스스로 대식세포의 식작용을 증대시켜 스스로 항암작용을 할 뿐만 아니라 형광을 내는 즉, 진단 및 치료를 동시에 할 수 있는 물질로서 활용할 수 있다. 또한 향후 이 물질에 다른 약물을 결합하여 항암효과를 증대할 수 있는 전달체로서 활용가능성이 높다.
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Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro
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Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Val Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Asp Thr Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn
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Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu
100 105 110
Ser Val Arg Ala Lys Pro
115
<210> 4
<211> 405
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SIRPa polynucleotide
<400> 4
catatggaag aggagctgca gatcatccag cctgacaagt ccgtgctggt cgctgctggt 60
gaaactgcca ctctgcgttg tacgattacc agcctgttcc cggtgggtcc aatccagtgg 120
ttccgtggtg ctggtccggg tcgtgttctg atctacaacc agcgtcaagg tccgttcccg 180
cgtgtaacta ccgttagcga taccacgaag cgtaacaaca tggacttttc catccgcatt 240
ggcaatatta ccccggccga cgcgggcacc tactattgca tcaaatttcg caaaggctcc 300
ccggatgatg tagaatttaa atctggcgca ggcaccgaac tgtctgttcg cgcaaaaccg 360
gtcgacggtg ggtttctggg tgggggagga tgcggttgaa agctt 405
Claims (15)
- 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드(a)를 중심으로, 상기 폴리펩티드 양 말단에 형광체(b)와 소광체(c)가 접합되어 있고,
상기 폴리펩티드(a)의 COO- 기에 SIRPα 단백질(d)이 결합되어 있는, 단백질-형광 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 폴리펩티드(a)의 N-말단에 상기 형광체(b)가 결합되고, 상기 폴리펩티드(a)의 라이신 또는 아르기닌 아미노산 잔기의 입실론 아민기에 소광체(c)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질-형광 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 단백질-형광 복합체는 암 세포 내에서 형광을 나타내는 것을 특징으로 하는 단백질-형광 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 단백질-형광 복합체의 분자량은 18kDa 내지 21kDa인 것을 특징으로 하는 단백질-형광 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 형광체(b)는 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 텍사스 레드(Texas red), Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 인도카르보사이아닌(indocarbocyanine), 로다민(rhodamine), 옥사카르보사이아닌(oxacarbocyanine), 티아카르보사이아닌(thiacarbocyanine), 메로사이아닌(merocyanine), 피리딜록사졸(pyrodyloxazole), 니트로벤족사디아졸(nitrobenzoxadiazole), 벤족사디아졸(benzoxadiazol), 나일 레드(Nile red), 나일 오렌지(Nile orange), 아크리딘 옐로우(acridine yellow), 오마린(aumarine), 크리스탈 바이올렌(crystal violet), 및 말라카이트 그린(malachite green)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 단백질-형광 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 소광체(c)는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 단백질-형광 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 SIRPα단백질은 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 단백질-형광 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 단백질-형광 복합체는 암 세포에서 과발현하는 CD47에 특이적으로 결합하여, 암 세포 내로 함입되며, 함입 후 암 세포내에 존재하는 리소좀 효소에 의해 분해되어 형광을 복원하는 것을 특징으로 하는 단백질-형광 복합체. - 제1항에 있어서,
상기 단백질-형광 복합체는 하기 구조식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 단백질-형광 복합체.
[구조식 1]
- 제1항에 따른 단백질-형광복합체를 포함하는 암의 진단 또는 영상화용 조성물.
- 제10항에 있어서,
상기 암은 유방암, 난소암, 위암, 결장암, 폐암, 대장암, 골암, 췌장암, 피부암, 자궁암, 소장암, 직장암, 항나팔관암종, 자궁경부암종, 질암종, 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 및 섬유육종암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암의 진단 또는 영상화용 조성물. - 제1항에 따른 단백질-형광복합체를 유효성분으로 하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
- 제12항에 있어서,
상기 암은 유방암, 난소암, 위암, 결장암, 폐암, 대장암, 골암, 췌장암, 피부암, 자궁암, 소장암, 직장암, 항나팔관암종, 자궁경부암종, 질암종, 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 및 섬유육종암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 조성물. - 제12항에 있어서,
상기 암 예방 또는 치료용 조성물은 항암제를 더 포함하고, 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 조성물. - 1) 제1항에 따른 단백질-형광 복합체를 개체에 투여하는 단계; 및
2) 상기 개체로부터 상기 단백질-형광 복합체에 의한 이미지를 수득하는 단계;를 포함하는 상기 개체의 암의 진단방법.
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| US11718625B2 (en) | 2020-10-23 | 2023-08-08 | Nanjing Uoyuan Medical Devices Co., Ltd | Near-infrared fluorescent molecule active targeting folate receptor and preparation method thereof |
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-
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