KR20170111601A - 항원 반응형 항체-형광염료 결합체 및 이를 이용한 표적 세포의 형광영상 검출방법 - Google Patents

항원 반응형 항체-형광염료 결합체 및 이를 이용한 표적 세포의 형광영상 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암세포 특이적 형광영상 진단이 가능한 항체-형광염료 결합체에 관한 것으로, 형광염료가 공유결합에 의하여 표지된 항체를 포함하되, 상기 형광염료는 항체 내 트립토판, 타이로신, 히스티딘 및 메티오닌으로 이루어진 군 중에서 선택되는 잔기와의 상호 작용에 의하여 소광되고, 세포 표면에 존재하는 항원과 항체가 결합할 때에는 소광작용이 해소되어 형광을 발생하여, 표적 항원을 표면에 갖는 세포를 영상 진단할 수 있다. 본 발명에 따른 항체-형광염료 결합체를 사용할 경우, 비트로(in vitro) 세포시험, 대용량 세포 스크리닝 및 미세유체를 이용한 세포진단 방법에 있어서 세척과정 없이도 특정 항원을 세포 표면에 발현하고 있는 암세포의 존재를 높은 특이도 및 감도로서 확인 할 수 있는 효과가 있고, 짧은 시간 내에 원발성 및 전이 암세포의 위치를 높은 대조도로 확인할 수 있기 때문에 형광영상-유도 수술에 의한 수술의 정확도 및 치료 효과를 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

항원 반응형 항체-형광염료 결합체 및 이를 이용한 표적 세포의 형광영상 검출방법{Antigen-responsive antibody-fluorochrome conjugates and method detecting target-cells using fluorescence imaging by thereof}
본 발명은 항원 반응형 항체-형광염료 결합체 제조 및 이를 사용한 표적 세포 특이적 형광영상 방법에 관한 것이다.
형광영상 기술은 자기공명영상, 핵의학영상, 초음파 영상과 비교하여 높은 민감도를 갖으면서도 실시간 영상획득이 가능하다는 커다란 장점이 있기 때문에 수술 중 암 등의 병변의 위치를 실시간으로 확인하여 제거할 수 있는 가장 강력한 도구로 평가된다. 더욱이, 최근 들어서 내시경 및 복강경 장비에 근적외선 형광 영상화 기능을 구현할 수 있는 시스템이 점차 상업화됨에 따라서, 형광영상을 이용한 시술은 앞으로 환자 시술에 있어서 폭넓게 사용될 것으로 예측된다.
항체는 세포 표면에 존재하는 수용체 또는 항원에 높은 결합력을 가지고 특이적으로 결합할 수 있으므로, 암세포 특이적 형광영상 진단을 위하여 다양한 항체-형광염료 결합체가 개발되고 사용되어 오고 있다. 기존에 개발된 항체-형광염료 결합체는 표적으로 하는 암세포에 대한 결합 특이성이 높다는 장점이 있으나, 기존의 항체-형광염료 결합체의 경우에는 표적세포에 결합했을 때에든지 표적세포의 근처에 있는 경우에도 모두 강한 형광신호를 발생하므로 결합체의 표적세포 결합 여부를 구분할 수가 없다. 따라서, 형광 영상을 통하여 표적세포를 검출하기 위해서는 표적세포와 결합하지 않은 항체-형광염료 결합체를 세척(washing)과정을 통하여 제거하여 줌으로써 표적 세포와 결합하지 않은 항체로부터 생성되는 배경신호를 제거하여 주어야만 높은 대조도(contrast)의 형광영상을 얻을 수 있었다. 즉, 특정 세포의 형광영상 검출을 위한 인비트로(in vitro) 세포실험에 있어서, 항체-형광염료 결합체를 세포 또는 생체 조직에 처리한 후에는 표적세포와 결합하지 않은 결합체를 제거하기 위하여 세척과정을 반드시 거치고 형광영상을 얻어야 되는 번거로움이 있다. 특히, 분석해야 하는 세포의 양이 적어서 세척에 의한 세포의 손실이 우려되는 경우나, 대용량 약물 스크리닝에 있어서 세척과정에 의한 분석 시간이 증가되는 경우, 부유세포(suspension cells)인 경우, 또는 실시간으로 항체와 세포간의 상호작용을 영상화 하고자 하는 경우에는 세척과정이 커다란 제한사항으로 작용하고 있다. 또한, 미세유체 (microfluidics) 시스템을 이용하여 암 또는 세균을 진단하는 경우에는, 세척과정을 행하기 어려운 경우가 많으므로, 세척과정을 거치지 않고도 좋은 대조도의 형광영상을 얻을 수 있는 항체-형광염료 결합체의 개발이 요구되고 있다.
표적세포에 결합한 항체-형광염료 결합체와 표적세포에 결합하지 않은 결합체 모두 강한 형광신호를 발생하는 특성은, 수술 도중에 암의 위치를 형광영상으로 진단하기 위하여 항체-형광염료를 환자에게 정맥 투여한 경우에 더욱 문제가 된다. 분자량이 큰 항체-형광염료 결합체는 혈액 내 반감기(blood half-life)가 몇 일에서 몇 주로 길기 때문에 혈액내에 오랫동안 환류하면서 배경 잡신호를 높게 유지시킴에도 불구하고, 혈액내 존재하는 항체-형광염료 결합체를 인위적으로 제거할 수 없기 때문에, 정상조직 또는 혈류에 존재하고 있는 항체-형광염료 결합체가 충분히 제거되기 까지 몇 일에서 몇주를 기다린 후에야 형광영상을 얻어야 만이 높은 종양-대-배경 신호비(tumor-to-background ratio)의 형광 영상을 얻을 수 있다는 문제점이 있다(비특허문헌 1 참조).
이러한 문제점을 해결하기 위하여 미국 국립암 연구소 (National Cancer Institute)의 Hisataka Kobayashi 박사는 표적세포 특이적 항체-형광염료 결합체를 개발하였다(비특허문헌 2 참조). 표적세포 특이적 항체-형광염료 결합체 에서는, 하나의 항체에 여러 개의 근적외선 형광염료 결합됨으로써 형광염료끼리의 거리가 충분히 가까워지게 하였고, 형광염료 사이에서 일어나는 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 메커니즘에 의하여 소광(quenching)이 되면서 형광신호를 발생하지 않게 하였다. 표적으로 하는 암세포 밖에서는 항체-형광염료 결합체가 소광된 상태로 있는데 반하여, 표적세포 특이적 항체-형광염료 결합체가 암세포 표면에 결합하고, 수용체-매개 엔도시토시스(receptor-mediated endocytosis)에 의해서 암세포 내의 라이소좀(lysosomes)으로 들어간 경우에는 라이소좀 내의 효소들에 의해서 항체가 완전히 분해되면서 형광염료간 거리도 멀어지게 되고, 따라서 FRET 작용에 의한 소광효과가 사라지면서 이때부터 강한 형광신호를 발생할 수 있게 된다. 따라서, 표적세포 특이적 항체-형광색소 결합체를 이용하면, 표적으로 하는 암세포를 높은 종양-대-배경신호 비율로서 검출할 수 있다. 그러나, 표적세포 특이적 항체-형광색소 결합체는 세포표면에 결합 후에도 암세포내로 들어가서 라이소좀 내의 효소들에 의해서 결합체가 분해가 될 때에만 강한 형광신호를 낼 수 있기 때문에, 이러한 과정(즉, 결합 → 세포내 이동 → 라이소좀에서의 분해)을 거치는 동안 긴 시간이 소요된다. 특히, 암세포의 종류에 따라서 표면에 존재하는 항원이 암세포 내로 이동 하는데에 걸리는 시간이 12시간 이상이 되는 경우가 많고 세포 내 라이소좀에서 결합체가 분해되는 데에도 시간이 소요되기 때문에, 표적세포 특이적 항체-형광색소 결합체 투여 후 최소한 하루 이상의 시간을 기다린 후에 형광영상을 얻어야 되는 단점이 있었다. 더욱이, 세포 표면에 존재하는 항원 중에서 세포 내로의 섭취 (endocytosis)를 일으키지 않는 항원들의 경우에는 라이소좀으로 항체 결합체가 이동할 수 없기 때문에, 이러한 항원의 형광영상 진단에는 사용할 수 없다는 문제점이 있다. 또한, 이러한 단점 때문에, 표적세포 특이적 항체-형광염료 결합체는 체외 또는 인비트로 (in vitro) 세포실험에서의 높은 대조도 영상을 얻는 데에는 적합하지 않다.
1. 미국공개특허 2011-0237942 2. 미국공개특허 2013-0039861 3. 한국공개특허 2014-0102968 4. 한국등록특허 1,452,819
1. Terwisscha van Scheltinga AG et al, Intraoperative near-infrared fluorescence tumor imaging with vascular endothelial growth factor and human epidermal growth factor receptor 2 targeting antibodies, The Journal of Nuclear Medicine 2011, 52(11), pp 1788-1785. 2. Hisataka Kobayashi and et al, Target-Cancer-Cell-Specific Activatable Fluorescence Imaging Probes: Rational Design and in Vivo Applications, Accounts of Chemical research, 2011, 44 (2), pp 83-90. 3. Klervi Even-Desrumeaux, Daniel Baty and Patrick Chames, State of the Art in Tumor Antigen and Biomarker Discovery, Cancers 2011, 3, pp 2554-2596.
본 발명은 암 세포 표면에 존재하는 특정 항원에 대하여 높은 결합 특이성을 가지면서도, 소광되어 있던 항체-형광염료 결합체의 형광이 세포 표면에 존재하는 표적항원과 결합하는 즉시 소광 효과가 사라지면서 강한 형광신호를 발생함으로써, 세척과정 없이도 빠른 시간 내에 형광영상을 통하여 암세포를 영상화 및 검출 할 수 있는 항원 반응형 항체-형광염료 결합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 항체-형광염료 결합체를 유효성분으로 포함하는, 형광영상을 통한 암의 진단 또는 검출용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 항체-형광염료 결합체를 시료에 처리하여 형광신호 영상을 수득하는 단계를 포함하는, 형광영상을 통한 암 검출 또는 진단용 정보제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상술한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 형광염료가 공유결합에 의하여 표지된 항체를 포함하되, 상기 형광염료는 항체 내 트립토판, 타이로신, 히스티딘 및 메티오닌으로 이루어진 군 중에서 선택되는 잔기와의 상호 작용에 의하여 소광되고, 세포 표면에 존재하는 항원과 항체가 결합할 때에는 소광작용이 해소되어 형광을 발생하여, 표적 항원을 표면에 갖는 세포를 영상 진단 할 수 있는 항원 반응형 항체-형광염료 결합체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항체가 결합하는 항원은, 표피 성장인자 수용체 (epidermal growth factor receptor, EGFR, HER1), 인간 표피 성장인자 수용체 2 (human epidermal growth factor receptor 2, HER2), 인간 표피 성장인자 수용체 3 (human epidermal growth factor receptor 3, HER3, ERBB-3), 인간 표피 성장인자 수용체 4 (human epidermal growth factor receptor 4, HER4, ERBB-4), EpCam (epithelial cell adhesion molecule), CD19, CD20, CD22 (Siglec-2), CD30 (TNFRSF1), CD33 (Siglec-3), CD44, CD44v6, CD52, CD56 (NCAM), CD152 (CTLA4), MUC1 (mucin 1), CEA (carcinoembryonic antigen), LEWIS Y, PSMA (prostate-specific membrane antigen), TAG-72 (tumor-associated glycoprotein 72), GD2 ganglisoside, GD3 ganglisoside, HLA-DR10 (human leukocyte antigen-DR), IGF1R (insulin-like growth factor 1 receptor), TAL6 (tumor-associated antigen L6), TRAILR2 (tumor-necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor), vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor 2), platelet-derived growth factor receptor alpha (PDFGRA), hepatocyte growth factor receptor (HGFR), Alpha-v beta-3, Folate receptor, EGF-like domain-containing protein 7 (EGFL7), Fibroblast activation protein alpha (FAP), Carbonic anhydrase 9 (CA9/CAIX) 및 Vimentin으로 구성된 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항체는 EGFR에 대한 항체인 Cetuximab (Erbitux), Panitumumab (Vectibix), Necitumumab (Portrazza), Imgatuzumab, Matuzumab, Nimotuzumab, Futuximab 및 Zalutumumab; HER2에 대한 항체인 Trastuzumab (Herceptin)과 Pertuzumab (Perjeta); HER3에 대한 항체인 Duligotumab, Patritumab 및 Seribantumab; VEGF-A에 대한 항체인 Bevacizumab (Avastin); EpCam에 대한 항체인 Catumaxomab (Removab)과 Adecatumumab (MT201); IGF1R에 대한 항체인 Cixutumumab (IMC-A12), Figitumumab, Ganitumab, Robatumuma, Teprotumumab 및 Dalotuzumab; TRAILR2에 대한 항체인 Conatumumab (AMG 655), Drozitumab, Lexatumumab 및 Tigatuzumab; CD20에 대한 항체인 Rituximab (Rituxan), Ibritumomab tiuxetan (Zevalin), Tositumomab (Bexxar), Ofatumumab (Arzerra), Ocaratuzumab, Ublituximab 및 Obinutuzumab; CD22에 대한 항체인 Epratuzumab (LymphoCide), Inotuzumab 및 Narnatumab; CD30에 대한 항체인 Brentuximab과 Iratumumab; CD33에 대한 항체인 Gentuzumab (Mylotarg)과 Lintuzumab; CD44v6에 대한 항체인 Bivatuzumab; CD52 에 대한 항체인 Alemtuzumab (Campath); GD2 ganglisoside에 대한 항체인 Dinutuximab (Unituxin); GD3 ganglisoside에 대한 항체인 Ecromeximab; platelet-derived growth factor receptor alpha (PDFGRA)에 대한 항체인 Olaratumab; hepatocyte growth factor receptor (HGFR)에 대한 항체인 Emibetuzumab; Alpha-v beta-3에 대한 항체인 Etaracizumab (Abegrin); Folate receptor alpha에 대한 항체인 Farletuzumab; EGF-like domain-containing protein 7 (EGFL7)에 대한 항체인 Parsatuzumab; Fibroblast activation protein alpha (FAP)에 대한 항체인 Sibrotuzumab; Carbonic anhydrase 9 (CA9/CAIX)에 대한 항체인 Girentuximab (Rencarex), anti-CD44 및 anti-Vimentin; 으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광염료는 로다민, 쿠마린, 에보블루(EvoBlue), 옥사진, 카보피로닌, 나프탈렌, 비페닐, 안트라센, 페난트렌, 피렌 또는 카바졸을 기본 골격으로 갖는 형광염료 또는 상기 형광염료의 유도체일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광염료는 플루오레세인 (Fluorescein), CR110 : 카복시로다민 110 : 로다민 그린(상표명), TAMRA : 카복시테트라메틸로다민 : TMR, 카복시로다민 6G : CR6G, BODIPY FL(상표명) : 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 493/503(상표명) : 4,4-디플루오로-1,3,5,7-테트라메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-8-프로피온산, BODIPY R6G(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3-부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 558/568(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 564/570(상표명) : 4,4-디플루오로-5-스티릴-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 576/589(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(2-피롤릴)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 581/591(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3-부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, EvoBlue10(상표명), EvoBlue30(상표명), MR121, ATTO 655(상표명), ATTO 680(상표명), ATTO 700(상표명), ATTO MB2(상표명), Alexa Fluor 350(상표명), Alexa Fluor 405(상표명), Alexa Fluor 430(상표명), Alexa Fluor 488(상표명), Alexa Fluor 532(상표명), Alexa Fluor 546(상표명), Alexa Fluor 555(상표명), Alexa Fluor 568(상표명), Alexa Fluor 594(상표명), Alexa Fluor 633(상표명), Alexa Fluor 680(상표명), Alexa Fluor 700(상표명), Alexa Fluor 750(상표명), Alexa Fluor 790(상표명), Flamma 496(상표명), Flamma 507(상표명), Flamma 530(상표명), Flamma 552(상표명), Flamma 560(상표명), Flamma 575(상표명), Flamma 581(상표명), Flamma 648(상표명), Flamma 675(상표명), Flamma 749(상표명), Flamma 774(상표명), Flamma 775(상표명), Rhodamine Red-X(상표명), Texas Red-X(상표명), 5(6)-TAMRA-X(상표명), 5TAMRA(상표명), Indocyanine green (ICG) 및 2-((E)-2-((E)-2-(4-(2-carboxyethyl)phenoxy)-3-((E)-2-(3,3-dimethyl-5-sulfonato-1-(3-(tri-methyl ammonio)-propyl)indolin-2-ylidene)ethylidene)cyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-1-(3-(trimethyl ammonio)-propyl)-3H-indolium-5-sulfonate disodium bromide (ZW800-1)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 항체-형광염료 결합체를 유효성분으로 포함하는 세포, 조직 및 조직절편 영상 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 항체-형광염료 결합체를 유효성분으로 포함하는, 형광영상을 통한 암의 진단 또는 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 주사용 제형 또는 스프레이용 제형일 수 있다.
나아가 본 발명은 본 발명에 따른 항체-형광염료 결합체를 시료에 처리하여 형광신호 영상을 수득하는 단계를 포함하는, 형광영상을 통한 암 검출 또는 진단용 정보제공 방법을 제공한다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 항원 반응형 항체-형광염료 결합체를 제공하는데, 항원 반응형 항체-형광염료에 사용되는 항체에는 트립토판 (또는 타이로신)이 한 개 이상 함유되어 있고, 항체에 결합시킨 형광염료는 트립토판 (또는 타이로신) 잔기와의 상호작용에 의하여 소광(quenching) 현상을 일으킴으로써 형광발생이 억제된다. 항체에 결합된 형광염료와 트립토판 (또는 타이로신)과의 거리가 1.5 나노미터 이내에 있을 때에는 광유도 전자전달(photo-induced electron transfer, PET)현상에 의해서 형광이 소광(quenching)된다. 반면, 세포 표면에 존재하는 항원과 항체가 특이적으로 결합하면, 항체의 3차원 형태 변화(conformational change)로 인하여 형광염료와 트립토판 (또는 타이로신) 잔기와의 거리가 멀어지고 소광 효과도 사라지게 됨으로써, 형광염료로부터 강한 형광신호가 발생하게 된다. 이러한 원리에 의하여, 항원 반응형 항체-형광염료 결합체는 표적 세포 밖의 공간에 위치해 있을 때에는 소광되어 있다가, 항체-형광염료 결합체가 암세포 표면에 존재하는 표적항원 (또는 수용체)와 결합하는 경우에는 강한 형광신호를 발생하게 됨으로써, 세척 과정을 거치지 않더라도 표적으로 하는 암세포만을 형광영상으로부터 실시간으로 검출할 수 있게 해준다.
본 발명에 따른 항체-형광염료 결합체가 특이적으로 결합하는 항원은, 종양과 관련된 세포 또는 특정 정상세포의 표면에 과발현(overexpression) 되어 있는 항원일 수 있다.
본 발명에 따른 항원 반응형 항체-형광염료 결합체는 세포외 영역에 존재할 때에는 형광발생이 억제되어 있다가, 표적으로 하는 항원에 결합하는 즉시 소광 현상이 사라지면서 강한 형광신호를 낼 수 있으므로, 생체내 및 생체외 시험에서 표적으로 하는 암세포를 매우 효과적으로 검출 및 영상진단 할 수 있다. 따라서, 암세포를 이용한 연구 또는 스크리닝에 있어서 세척과정을 거치지 않고도 표적으로 하는 암세포를 빠른 시간에 실시간으로 영상 검출할 수 있다. 형광영상 유도 암 수술에 있어서도, 항체-형광염료 결합체를 정맥투여 한 후 몇시간 ~ 24시간 이내에 암세포 또는 암조직의 위치를 높은 대조도 (contrast)로 검출함으로써, 수술의 정확도와 암 치료효율을 획기적으로 향상 시킬 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 항원 반응형 항체-형광염료 결합체의 작용 기전에 대한 모식도이다. 세포외의 영역에 존재할 때에는 형광신호가 발생하지 않으며(turn OFF), 암세포 표면에 존재하는 항원에 결합하는 즉시 항체에 결합되어 있던 형광염료가 강한 형광신호를 낼 수 있게 (turn ON) 된다.
도 2a는 본 발명에 따른 실시예 1의 Trastuzumab-플루오레세인 (Fluorescein) 결합체에서 표지 비율에 따른 형광 세기 억제를 보여주는 결과이다 (λex. 494 nm, λem. 518 nm).
도 2b는 본 발명에 따른 실시예 1의 Trastuzumab-Alexa Fluor®488 결합체에서 표지 비율에 따른 형광 세기 억제를 보여주는 결과이다 (λex. 495 nm, λem. 519 nm).
도 2c는 본 발명에 따른 실시예 1의 Trastuzumab-Alexa Fluro®750결합체에서 표지 비율에 따른 형광 세기 억제를 보여주는 결과이다 (λex. 753 nm, λem. 782 nm).
도 2d는 본 발명에 따른 실시예 1의 Trastuzumab-ATTO 655 결합체에서 표지 비율에 따른 형광 세기 억제를 보여주는 결과이다 (λex. 663 nm, λem. 684 nm).
도 2e는 본 발명에 따른 실시예 1의 Trastuzumab-ATTO MB2 결합체에서 표지 비율에 따른 형광 세기 억제를 보여주는 결과이다 (λex. 658 nm, λem. 680 nm).
도 2f는 본 발명에 따른 실시예 1의 Trastuzumab-ATTO 700 결합체에서 표지 비율에 따른 형광 세기 억제를 보여주는 결과이다 (λex. 700 nm, λem. 719 nm).
도 2g는 본 발명에 따른 실시예 1의 Trastuzumab-ICG 결합체에서 표지 비율에 따른 형광 세기 억제를 보여주는 결과이다 (λex. 790 nm, λem. 800 nm).
도 2h는 본 발명에 따른 실시예 1의 Trastuzumab-ZW800-1 결합체에서 표지 비율에 따른 형광 세기 억제를 보여주는 결과이다 (λex. 770 nm, λem. 788 nm).
도 3a는 본 발명에 따른 실시예 1의 Trastuzumab-ATTO 680 결합체에 대한 표지 비율(Degree of Labeling, DL)에 따른 형광 스펙트럼 (λex. 620 nm, λem. 640-850 nm) 자료이다. 동일한 농도 (1 uM)의 자유 형광염료인 ATTO680의 형광 스펙트럼을 비교하여 보이고 있다.
도 3b는 본 발명에 따른 실시예 1의 Trastuzumab-ATTO 680 결합체에서 표지 비율에 따른 형광 세기 억제를 보여주는 결과이다.
도 3c는 본 발명에 따른 실시예 1의 농도가 5 uM일 때 ATTO 680과 Trastuzumab-ATTO 680 결합체 (표지비율 3.77 시료), 변성된 Trastuzumab-ATTO 680 결합체(표지비율 3.77 시료)의 흡광 스펙트럼을 비교한 결과이다.
도 3d는 본 발명에 따른 실시예 1의 농도가 1 uM일 때 ATTO 680과 Trastuzumab-ATTO 680 (표지비율 3.77 시료), 변성된 Trastuzumab-ATTO 680(표지비율 3.77 시료)의 형광 스펙트럼을 비교한 결과이다. 대조를 위하여 염료가 포함되지 않은 인산완충액 (PBS)에 대한 형광스펙트럼을 보이고 있다.
도 3e는 본 발명에 따른 실시예 1의 Trastuzumab-ATTO 680(표지비율 3.77 시료)에 대한 근적외선 형광 이미지 측정 결과이다 (λex. 640/25 nm, λem. 732/37 nm). 1: 인산완충 수용액(PBS), 2: ATTO680 염료, 3: Trastuzumab-ATTO 680 결합체, 4: 변성된 Trastuzumab-ATTO 680 결합체.
도 4는 본 발명에 따른 실시예 1의 형광 염료인 Trastuzumab-ATTO 680 (표지비율 3.77)이 혈청 조건하에서 형광 소광 효과가 안정적으로 유지되는지를 분석한 자료이다. 결합체를 인산완충액 및 혈청 배양액에 각각 분산시키고 시간에 따른 근적외선 형광세기의 변화를 측정하였다. 0시간째 형광 (F0)과 비교하여 각 시간대별 형광(F) 비율을 볼 때, 혈청 배양액 에서도 Trastuzumab-ATTO 680 결합체의 소광 상태가 안정적으로 유지됨을 알 수 있다.
도 5a는 본 발명에 따른 실시예 1에서, HER2 음성의 대조군 암세포 (MDA-MB-231)에 Trastuzumab-ATTO 680 결합체를 10 ug/mL 농도로 각각 30분과 1 시간 동안 처리하고, 세척 후 컨포컬 현미경을 사용하여 형광 영상을 얻은 결과이다 (λex. 633 nm, λem.647~754 nm).
도 5b는 본 발명에 따른 실시예 1에서, HER2 과발현 암세포 (SK-BR-3)에 Trastuzumab-ATTO 680 결합체를 10 ug/mL 농도로 각각 30분과 1 시간 동안 처리하고, 세척 후 컨포컬 현미경을 사용하여 형광 영상을 얻은 결과이다 (λex. 633 nm, λem. 647~754 nm).
도 5c는 본 발명에 따른 실시예 1에서, HER2 과발현 암세포 (Calu-3)에 Trastuzumab-ATTO 680 결합체를 10 ug/mL 농도로 각각 30분과 1 시간 동안 처리하고, 세척 후 컨포컬 현미경을 사용하여 형광 영상을 얻은 결과이다 (λex. 633 nm, λem. 647~754 nm).
도 6a는 본 발명에 따른 실시예 1에서, HER2 과발현 암세포 (SK-BR-3)에 Trastuzumab-ATTO 680 결합체를 처리하고, 세척 과정 없이 1분 간격으로 컨포컬 현미경을 사용하여 형광 영상을 얻은 결과이다 (λex. 633 nm, λem. 647~754 nm). 소광되어 있던 Trastuzumab-ATTO 680 결합체가 세포막의 HER2 항원과 결합함에 따라서 세포막에서 강한 형광신호가 발생됨을 보여주고 있다. 세포외의 영역에서는 결합체가 소광되어 있기 때문에 형광신호가 거의 검출이 되지 않고 있다.
도 6b는 도 6a의 흰색선 부위에서 발생되는 형광신호의 시간에 따른 강도 변화를 분석하여 그래프로 나타낸 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 실시예 1에서, 형광염료인 ATTO680을 SK-BR-3 세포에 1 uM 농도로 처리 한 후, 세척을 하기전과 세척한 후의 광학영상(bright-field image), 형광영상(fluorescence image), 및 두 영상의 융합영상(merged image) 자료이다. 비교를 위하여 형광염료를 처리하지 않은 SK-BR-3 세포(untreated control)의 형광영상을 보이고 있다. ATTO680을 처리한 경우에는 세포외의 영역에서 강한 형광신호를 발생함을 알 수 있으며, 세척 후에는 형광염료가 모두 제거되었기 때문에 형광영상에서 형광신호가 검출되지 않았다.
도 8은 본 발명에 따른 실시예 1에서, HER2 과발현 암세포 (SK-BR-3)에 Trastuzumab-ATTO 680 결합체를 10 ug/mL 농도로 30 분 동안 처리한 후, 세척을 통하여 결합하지 않은 Trastuzumab-ATTO 680을 제거하고, 각각 1 시간, 5 시간, 24 시간 이후에 라이소트렉커(Lysotracker)로 라이소좀(lysosome)을 추가 염색하고 관찰한 형광 영상이다. 세포막에 결합한 Trastuzumab-ATTO 680의 세포내로 섭취는 매우 느리며, 24시간 이후에도 대부분의 항체-형광염료 결합체가 세포막에 위치하고 있음을 알 수 있다.
도 9a는 본 발명에 따른 실시예 1에서, HER2-음성 MDA-MB-231 종양 이종이식 마우스, HER2-양성 Calu-3 종양 이종이식 마우스에 각각 Trastuzumab-ATTO 680 결합체를 50 ug/50 ul 농도로 정맥 투여한 후, 1시간, 5시간, 및 24시간 후에 근적외선 형광영상을 얻은 자료이다. 대조를 위하여서 종양이 없는(normal) 마우스에 인산 완충액(PBS)을 투여하고 영상을 얻은 자료를 보이고 있다. Calu-3 종양 이종이식 마우스에서는 형광영상으로부터, 종양의 위치를 높은 대조도(contrast)로 명확하게 구분을 할 수 있다.
도 9b는 9a에서 얻어진 영상에서 종양-대-배경 형광 신호비를 관찰 시간에 따라서 분석하여 나타낸 자료이다. HER2-양성 Calu-3 종양 이종이식 마우스의 경우에는 시간이 지남에 따라서 종양-대-배경 형광 신호비가 상당히 높아짐을 볼 수 있다.
도 9c는 본 발명에 따른 실시예 1에서, Trastuzumab-ATTO 680 결합체 투여 후, 각 시간별로 종양조직 및 장기들을 절취하고 근적외선 형광영상을 얻은 결과이다. HER2과발현 암 조직인 Calu-3 그룹의 경우에는, 종양에서의 형광신호가 강하게 발생되는 것을 알 수 있다.
도 9d는 본 발명에 따른 실시예 1에서, Trastuzumab-ATTO 680 결합체를 투여 후 각 시간별로 얻어진 종양조직에 대한 7 um 두께의 동결 조직절편을 얻고, 암세포의 핵을 DAPI 형광염료로 염색한 후에 촬영한 컨포컬 형광영상 결과이다. 시간이 지남에 따라서 암 조직내에서 Trastuzumab-ATTO 680 결합체에 의한 형광신호가 점점 증가하였으며, 이것은 암 조직내에 항체 결합체가 시간이 흐를수록 더 많이 결합하고 축적 되었음을 말해준다.
도 10a는 본 발명에 따른 실시예 2 에서, Cetuximab-ATTO680 결합체의 표지 비율별 형광 스펙트럼 (λex. 620 nm, λem. 640-850 nm) 자료이다. 동일한 농도 (1 uM)의 자유 형광염료인 ATTO680의 형광 스펙트럼을 비교하여 보이고 있다.
도 10b는 본 발명에 따른 실시예 2에서, Cetuximab-ATTO680 결합체의 표지 비율별 형광 세기를 분석한 결과이다.
도 10c는 본 발명에 따른 실시예 2의 농도가 1 uM일 때 ATTO 680과 Cetuximab-ATTO680, 변성된 Cetuximab-ATTO 680의 형광 스펙트럼을 비교한 결과이다.
도 11a는 본 발명에 따른 실시예 2에서, EGFR-음성 암세포인 MCF7에 Cetuximab-ATTO680 결합체를 10 ug/mL 농도로 30 분, 1 시간, 및 2 시간 동안 각각 처리하고 세척한 후 형광 영상을 관찰한 결과이다. MCF7 세포에는 Cetuximab-ATTO680 결합체를 2시간동안 처리하더라도 항체가 세포 표면에 결합하지 않았다.
도 11b는 본 발명에 따른 실시예 2에서, EGFR-양성 암세포인 MDA-MB-468에 Cetuximab-ATTO680 결합체를 10 ug/mL 농도로 30 분, 1 시간, 및 2 시간 동안 각각 처리하고 세척한 후 형광 영상을 관찰한 결과이다. Cetuximab-ATTO680 결합체가 EGFR-양성 암세포에 특이적으로 결합한 것을 알 수 있다.
도 12는 본 발명에 따른 실시예 2에서, EFGR-양성 암세포인 MDA-MB-468에 Cetuximab-ATTO680 결합체를 10 ug/mL 농도로 30 분 동안 처리한 후, 세척을 통하여 항체 결합체를 제거하고 30 분, 1 시간, 5 시간, 24 시간 이후에 관찰한 형광 영상 자료이다.
도 13a는 본 발명에 따른 실시예 3에서, anti-VEGF-ATTO680 결합체의 표지 비율별 형광 스펙트럼 (λex. 620 nm, λem. 640-850 nm) 자료이다. 동일한 농도 (0.1 uM)의 자유 형광염료인 ATTO680의 형광 스펙트럼을 비교하여 보이고 있다.
도 13b는 본 발명에 따른 실시예 3 에서, anti-VEGF-ATTO680 결합체의 표지 비율별 형광 세기를 분석한 결과이다.
도 14a는 본 발명에 따른 실시예 4 에서, anti-Vimentin-ATTO680 결합체의 표지 비율별 형광 스펙트럼 (λex. 620 nm, λem. 640-850 nm) 자료이다. 동일한 농도 (0.1 uM)의 자유 형광염료인 ATTO680의 형광 스펙트럼을 비교하여 보이고 있다.
도 14b는 본 발명에 따른 실시예 4 에서, anti-Vimentin-ATTO680 결합체의 표지 비율별 형광 세기를 분석한 결과이다.
도 15a는 본 발명에 따른 실시예 5 에서, anti-CD44 (8E2)-ATTO680 결합체의 표지 비율별 형광 스펙트럼 (λex. 620 nm, λem. 640-850 nm) 자료이다. 동일한 농도 (0.1 uM)의 자유 형광염료인 ATTO680의 형광 스펙트럼을 비교하여 보이고 있다.
도 15b는 본 발명에 따른 실시예 5 에서, anti-CD44 (8E2)-ATTO680 결합체의 표지 비율별 형광 세기를 분석한 결과이다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 형광염료가 표지된 항체를 포함하되, 상기 형광염료는 항체 내 아미노산 트립토판 (또는 타이로신) 잔기와의 상호 작용에 의하여 소광되고, 항체-항원 결합시 3차원 구조의 변화가 일어날 때에 소광이 해소되는 것을 특징으로 하는 항체-형광염료 결합체 및 이를 사용한 암세포의 영상 및 진단 방법을 제공한다. 상기 형광염료는 항체 내 존재하는 트립토판에 의하여 가장 효과적으로 소광 효과가 일어나지만, 항체 내 존재하는 타이로신, 히스티딘, 또는 메티오닌 잔기와의 상호작용에 의해서도 소광 효과를 얻을 수 있고, 부분적으로는 형광염료간 응집(aggregation)에 의해서도 소광 효과를 얻을 수 있다. 문헌들에 의하면 형광염료들이 녹아있는 수용액에 트립토판, 타이로신, 히스티딘, 및 메티오닌을 농도를 높이면서 같이 녹이면, 이들 아미노산들과 형광염료들 사이에서 광유도 전자전달을 일으키며 형광염료들이 소광 되는 것으로 알려져 있다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 형광염료에 의하여 표지된 항체를 포함하되, 상기 형광염료는 항체 내 트립토판 (또는 타이로신, 히스티딘, 메니오닌) 잔기와의 상호 작용에 의하여 소광되고, 항체-항원 결합시 항체의 3차원구조가 변화 하면서 형광염료와 트립토판 (또는 타이로신, 히스티딘, 메티오닌)간의 거리가 멀어지게 되고, 또한 형광염료간 거리도 멀어지면서 소광이 해소되는 것을 특징으로 하는 항체-형광염료 결합체를 제공한다. 본 발명에 사용되는 항체는 특정 종류에 제한되지 않고 한 개 이상의 트립토판 또는 두 개 이상의 트립토판/타이로신/히스티딘/메티오닌 혼합물을 포함 함으로써 항체에 결합된 형광염료의 소광 효과를 유도할 수 있는 것으로써, 암 세포의 세포막 표면에 존재하는 항원 (또는 수용체)과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다. 상기 형광 소광 특징을 효과적으로 구현하기 위하여, 항체 분자 내 트핍토판 (또는 타이로신, 히스티딘, 메티오닌)이 잘 보존되어 있어 형광염료의 소광 효과를 얻을 수 있고, 형광염료 결합을 위한 라이신(lysine) 또는 시스테인(cystein)잔기를 항체 내에 포함하고 있는 것이 바람직하나 기존의 기술에 알려진 바와 같이 항체 내에 존재하는 다른 아미노산의 개질(modification)반응 후 형광염료의 표지도 가능하다. 항원 반응형 항체-형광염료 결합체는, 형광염료 결합을 위한 라이신 또는 시스테인 잔기가 항체내 경쇄(light chain) 또는 중쇄(heavy chain)의 불변부위(constant region)에 존재하는 것이 바람직하며, 형광염료가 결합된 위치로부터 1.5 나노미터 이내의 거리에 트립토판 (또는 타이로신, 히스티딘, 메티오닌)이 존재하는 것을 특징으로 하는 항체가 바람직하다.
본 발명에 따른 항체-형광염료 결합체의 형광염료는 상술한 특징을 갖고 기능을 발휘하도록 적절한 위치에 표지 될 수 있으며, 항체와 공유결합을 통하여 표지되는 형광염료의 숫자는 하나 또는 그 이상인 것이 바람직하나 열개 이상을 넘지 않는 것이 좋다.
본 발명에 따른 항체-형광염료 결합체는, 공지된 화학 합성법, 유전자 재조합 기술, 항체 분자의 단백질 분해 효소에 의한 분해 방법 등을 이용하여 조제할 수 있지만, 그 중에서도, 비교적 용이한 조작으로 또한 대량으로 조제하는 것이 가능한 유전자 재조합 기술에 의해 조제하는 것이 바람직하다. 유전자 재조합 기술에 의해 상기의 특성을 갖는 아미노산 서열의 항체를 조제하는 경우, 이러한 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 포함하는 DNA를 적합한 발현 벡터에 도입하여 재조합 벡터를 제조하고, 박테리아, 효모, 곤충, 동식물 세포 등을 숙주로서 이용한 발현계나, 무세포 번역계에 의해 원하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 발현시킬 수 있다. 또한, 항체-형광염료 결합체 제조를 위한 항체는 상기에서 언급되었던 기존제품을 입수하여 통상법에 의해 합성하여 사용할 수도 있다. 예를 들어 인간 표피 성장인자 수용체2(HER2)를 특이적으로 인식하는 Trastuzumab(Herceptin)에 형광염료를 결합시켜 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 형광염료를 표지하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 항체의 중쇄 및 경쇄에 존재하는 라이신 또는 시스테인 잔기의 측쇄(side chain)를 이용하여 직접 또는 가교제 등을 통해 표지하는 방법을 사용할 수 있으나 여기에 한정되지 않고 기타 아미노산의 개질 반응 후 형광염료를 표지 할 수 있다.
본 발명에 따른 항체-형광염료 결합체에 의하여 검출 또는 측정할 수 있는 항원은 상기 항체에 의하여 특이적으로 인식되는 항원이면 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 단백질, 펩티드, 당질, 지질, 당지질, 저분자 화합물 외에, 인산화, 메틸화 등의 단백질 수식 등이나 이들 수식을 받은 단백질 등을 들 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체-형광염료 결합체가 특이적으로 결합하는 암세포와 관련된 항원들은 표피 성장인자 수용체 (epidermal growth factor receptor, EGFR, HER1), 인간 표피 성장인자 수용체 2 (human epidermal growth factor receptor 2, HER2), 인간 표피 성장인자 수용체 3 (human epidermal growth factor receptor 3, HER3, ERBB-3), 인간 표피 성장인자 수용체 4 (human epidermal growth factor receptor 4, HER4, ERBB-4), EpCam (epithelial cell adhesion molecule), CD19, CD20, CD22 (Siglec-2), CD30 (TNFRSF1), CD33 (Siglec-3), CD44, CD44v6, CD52, CD56 (NCAM), CD152 (CTLA4), MUC1 (mucin 1), CEA (carcinoembryonic antigen), LEWIS Y, PSMA (prostate-specific membrane antigen), TAG-72 (tumor-associated glycoprotein 72), GD2 ganglisoside, GD3 ganglisoside, HLA-DR10 (human leukocyte antigen-DR), IGF1R (insulin-like growth factor 1 receptor), TAL6 (tumor-associated antigen L6), TRAILR2 (tumor-necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor), vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor 2), platelet-derived growth factor receptor alpha (PDFGRA), hepatocyte growth factor receptor (HGFR), Alpha-v beta-3, Folate receptor, EGF-like domain-containing protein 7 (EGFL7), Fibroblast activation protein alpha (FAP), Carbonic anhydrase 9 (CA9/CAIX) 및 Vimentin인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서 항체는, 상기의 항원을 표적으로 하는 여러 가지 항체들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 임상사용을 목적으로 하여 개발된 단일클론 항체의 예로서, EGFR 항원에 대한 항체인 Cetuximab (Erbitux), Panitumumab (Vectibix), Necitumumab (Portrazza), Imgatuzumab, Matuzumab, Nimotuzumab, Futuximab 및 Zalutumumab, HER2 항원에 대한 항체인 Trastuzumab (Herceptin)과 Pertuzumab (Perjeta), HER3 항원에 대한 항체인 Duligotumab, Patritumab 및 Seribantumab, VEGF-A 항원에 대한 항체인 Bevacizumab (Avastin), EpCam 항원에 대한 항체인 Catumaxomab (Removab)과 Adecatumumab (MT201), IGF1R 항원에 대한 항체인 Cixutumumab (IMC-A12), Figitumumab, Ganitumab, Robatumuma, Teprotumumab 및 Dalotuzumab, TRAILR2 항원에 대한 항체인 Conatumumab (AMG 655), Drozitumab, Lexatumumab 및 Tigatuzumab, CD20 항원에 대한 항체인 Rituximab (Rituxan), Ibritumomab tiuxetan (Zevalin), Tositumomab (Bexxar), Ofatumumab (Arzerra), Ocaratuzumab, Ublituximab 및 Obinutuzumab, CD22 항원에 대한 항체인 Epratuzumab (LymphoCide), Inotuzumab 및 Narnatumab, CD30 항원에 대한 항체인 Brentuximab과 Iratumumab, CD33 항원에 대한 항체인 Gentuzumab (Mylotarg)과 Lintuzumab, CD44v6 항원에 대한 항체인 Bivatuzumab, CD52 항원에 대한 항체인 Alemtuzumab (Campath), GD2 ganglisoside 항원에 대한 항체인 Dinutuximab (Unituxin), GD3 ganglisoside 항원에 대한 항체인 Ecromeximab 를 들 수 있다. 기타 항체로는 platelet-derived growth factor receptor alpha (PDFGRA) 항원에 대한 항체인 Olaratumab, hepatocyte growth factor receptor (HGFR) 항원에 대한 항체인 Emibetuzumab, Alpha-v beta-3 항원에 대한 항체인 Etaracizumab (Abegrin), Folate receptor alpha 항원에 대한 항체인 Farletuzumab, EGF-like domain-containing protein 7 (EGFL7) 항원에 대한 항체인 Parsatuzumab, Fibroblast activation protein alpha (FAP) 항원에 대한 항체인 Sibrotuzumab, Carbonic anhydrase 9 (CA9/CAIX) 항원에 대한 항체인 Girentuximab (Rencarex)를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 항체 표지에 이용하는 형광염료는 트립토판, 타이로신, 메티오닌, 또는 히스티딘과 1.5 nm 이내의 거리에 위치해 있을 때에 효과적으로 소광 되는 특성을 갖는 것으로서, 항체와 결합체를 형성한 상태에서, 항원 비존재 하에서는 상기의 아미노산들과의 상호 작용, 보다 구체적으로는 광유도 전자전달 메카니즘에 의하여 소광 되었다가, 항체-형광염료 결합체와 항원이 결합했을 때에는 소광 기능이 해제되고 형광 발생이 회복되는 형광염료이면 특별히 제한되지 않는다. 형광 표지에 이용하는 형광염료로는, 로다민, 쿠마린, 에보블루(EvoBlue), 옥사진, 카보피로닌, 나프탈렌, 비페닐, 안트라센, 페난트렌, 피렌, 카바졸 등을 기본 골격으로서 갖는 형광염료나 그 형광염료의 유도체를 예시할 수 있고, 구체적으로는, 플루오레세인 (Fluorescein), CR110 : 카복시로다민 110 : 로다민 그린(상표명), TAMRA : 카복시테트라메틸로다민 : TMR, 카복시로다민 6G : CR6G, BODIPY FL(상표명) : 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 493/503(상표명) : 4,4-디플루오로-1,3,5,7-테트라메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-8-프로피온산, BODIPY R6G(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3-부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 558/568(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 564/570(상표명) : 4,4-디플루오로-5-스티릴-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 576/589(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(2-피롤릴)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 581/591(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3-부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, EvoBlue10(상표명), EvoBlue30(상표명), MR121, ATTO 655(상표명), ATTO 680(상표명), ATTO 700(상표명), ATTO MB2(상표명), Alexa Fluor 350(상표명), Alexa Fluor 405(상표명), Alexa Fluor 430(상표명), Alexa Fluor 488(상표명), Alexa Fluor 532(상표명), Alexa Fluor 546(상표명), Alexa Fluor 555(상표명), Alexa Fluor 568(상표명), Alexa Fluor 594(상표명), Alexa Fluor 633(상표명), Alexa Fluor 680(상표명), Alexa Fluor 700(상표명), Alexa Fluor 750(상표명), Alexa Fluor 790(상표명), Flamma 496(상표명), Flamma 507(상표명), Flamma 530(상표명), Flamma 552(상표명), Flamma 560(상표명), Flamma 575(상표명), Flamma 581(상표명), Flamma 648(상표명), Flamma 675(상표명), Flamma 749(상표명), Flamma 774(상표명), Flamma 775(상표명), Rhodamine Red-X(상표명), Texas Red-X(상표명), 5(6)-TAMRA-X(상표명), 5TAMRA(상표명), Indocyanine green (ICG), 2-((E)-2-((E)-2-(4-(2-carboxyethyl)phenoxy)-3-((E)-2-(3,3-dimethyl-5-sulfonato-1-(3-(tri-methyl ammonio)-propyl)indolin-2-ylidene)ethylidene)cyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-1-(3-(trimethyl ammonio)-propyl)-3H-indolium-5-sulfonate disodium bromide (ZW800-1)를 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 상기 상술한 항체-형광염료 결합체를 포함하고, 통상 이러한 종류의 면역 측정 키트에 이용되는 시약 등, 기구, 취급 설명서 등을 추가로 포함하여 구성된 종양 영상 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 (a) 형광염료에 의하여 표지된 항체를 포함하되, 상기 형광염료는 항체 내 트립토판 또는 타이로신 잔기와의 상호 작용에 의하여 소광되고, 항체-항원 결합시 소광이 해소되는 것을 특징으로 하는 항체-형광염료 결합체를, 시료 중의 항원에 접촉시키는 단계; 및 (b) 형광염료의 형광을 영상으로 얻고 분석하는 단계를 포함하는 형광영상 및 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 항체-형광염료 결합체를 항원과 접촉시키는 방법은 특별한 방법에 제한되지 않고, 액체상에서 수행하거나, 생체 내 또는 생체 외에서 수행할 수 있다. 액체상 검체는, 그대로 측정용 시료로서 측정에 제공하는 경우도, 혹은 항원을 손상시키는 경우나 항원 농도 측정 검출을 저해하는 경우도 없는 한, 완충액이나 세포배양액 등으로 희석, 혹은 농축, 또는 pH나 염 농도 등을 적절히 조정하여 사용할 수도 있다.
상기 액체상 검체로는, 예컨대 측정 대상이 되는 부착성(adherent) 및 부유성(suspension)의 세포일 수 있으며, 항체-형광염료 결합체를 처리 후 형광영상을 통하여 진단을 시행한다.
본 발명에 있어서는, 또한, 생체 내의 혈액이나 수액 등의 체액, 조직 등도 측정 대상 시료로 할 수 있다. 즉, 실험 동물 또는 인간에게 본 발명의 항체-형광염료 결합체를 투여함으로써, 본 발명의 항체-형광염료 결합체와 생체 내의 항원을 접촉시킬 수 있다. 상기 투여 방법도 특별히 제한되지 않고, 근육내 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 피하 주사, 매립, 도포, 분사 등의 비경구적인 국소 투여 방법이나, 경구적인 투여 방법 중에서 적절히 선택할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체-형광염료 결합체 투여와 동시, 혹은 그 전후에 다른 약제 등을 투여해도 좋다. 본 발명의 항체-형광염료 결합체를 투여함으로써, 생체 내에서의 항원의 위치나 그 이동, 항원량이나 그 변화를 형광영상으로부터 보여주고 정성 및 정량적으로 분석함으로써 수술 중 표적 세포의 위치를 실시간으로 확인 하여 수술의 정확도 및 치료효과를 획기적으로 향상시킬 수 있다.
생체외 형광영상 분석을 위하여, 예컨대 생체로부터 채취된 조직 및 세포에 직접적으로 항체-형광염료 결합체가 분산된 용액을 처리하고 형광영상을 얻을 수 도 있고, 조직 또는 세포의 절편(sections)을 제조하고 여기에 항체-형광염료 결합체가 분산된 용액을 처리하고 형광영상을 얻을 수도 있다. 또한, 생체로부터 얻은 조직 또는 세포의 미세배열체 (tissue or cell microarray)에 항체-형광염료 결합체가 분산된 용액을 처리하고 형광영상을 얻음으로써 표적 항원의 존재 여부를 진단할 수도 있다.
본 발명의 항체-형광염료 결합체와 측정용 시료 중의 항원을 접촉시키는 반응 조건으로는, 측정용 시료에 본 발명의 항체-형광염료 결합체를 첨가하고, 항원 항체 반응에 일반적으로 이용할 수 있는 조건에서 배양하는 것이면 특별히 제한되지 않고, 온도 조건은, 예컨대 1~40℃, 바람직하게는 18~37℃, 반응 시간은, 예컨대 순간~180분, 바람직하게는 1~90분으로 하여 형광영상을 얻을 수 있다. 또한, 인간 또는 동물의 체내에 투여한 경우에는, 투여 후 예컨대 5분~24시간을 기다린 후에 형광영상 장비를 사용하여 형광영상을 얻고 분석을 실시한다.
본 발명에서의 측정용 시료 중의 형광 영상 방법은, 형광염료로부터 발하여지는 형광을 검출할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 상기 반응 후의 측정용 시료에 여기광(excitation light)을 조사하여 형광염료의 형광 발생을 영상화 및/또는 검출하는 것이면 된다. 조사하는 여기광 및, 측정 및/또는 검출하는 형광의 파장은, 사용하는 형광염료의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예컨대 형광염료에 ATTO 680을 이용한 경우에는 여기광 파장 660 nm와 형광 방출파장 710 nm 조합으로 할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
<실시예 1>
1.1. Trastuzumab-형광염료 결합체의 합성
실시예 1 에서는, 암세포 표면에 과발현 되어 있는 것으로 알려진 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (Human epidermal growth factor receptor-2, HER2)와 특이적으로 결합하는 항체를 이용하고 여기에 여러 가지 형광염료를 결합시킴 으로써 항원 반응형 항체-형광염료 결합체의 기본 개념 및 효용성을 증명하고자 하였다. 특히, HER2에 특이적으로 결합하는 항체 중에서 임상에서 사용되고 있는 대표적 항체인 Trastuzumab (Herceptin)에 여러 가지 형광 염료들을 결합한 후 형광 소광 효과를 분석하였다. 항체-형광염료 결합체의 합성을 위하여, Trastuzumab (0.5 mg, 3.4 nmol)과 아민 반응성 형광 염료들인 NHS-Fluorescein, Alexa Fluor®488-NHS ester, Alexa Fluor®750-NHS ester, ATTO655-NHS ester, ATTO680-NHS ester, ATTO700-NHS ester, 메틸렌 블루(methylene blue) 유도체인 ATTO MB2-NHS ester, Indocyanine green sulfo-NHS ester (ICG) 및 ZW800-1-NHS ester를 여러 가지 몰 비율 (항체:염료 몰 비율=1:1, 1:5, 1:10, 및 1:15)로 0.3 mL의 인산 완충액 (phosphate buffered saline, PBS, pH 7.4, 10 mM, NaCl 137 mM)에 같이 녹이고, 실온에서 1시간동안 교반 시키면서 항체-형광염료 결합 반응을 진행하였다. 반응 완료 후, 결합하지 않은 형광염료와 반응부산물은 PD-10 컬럼 (GE Healthcare)를 사용하여 제거하였다. 정제 후 얻어진 Trastuzumab-형광염료 결합체는 Amicon Ultra-0.5 mL((cut off: 50 kDa) 원심분리 필터를 이용하여 농축시키고 4℃ 냉장고에 보관하였다.
1.2. Trastuzumab-형광염료 결합체의 분석
(1) 결합체의 표지 비율 및 소광 특성 분석
항체에 결합된 형광염료의 표지비율 (degree of labeling, DL)을 분석하기 위하여, 항체 결합체를 인산 완충액에 녹이고 UV/Vis 흡광 스펙트럼을 측정하였다. 항체의 농도는 280nm에서의 Trastuzumab의 몰흡광계수 (210,000 M-1cm-1)을 사용하여 계산하였고, 형광염료는 각 염료에 대한 알려진 몰 흡광계수 값을 사용함으로써, 항체에 결합된 형광염료의 표지 비율을 분석하였다.
결합된 항체-형광염료 결합체의 소광(quenching) 정도를 측정하기 위하여, Trastuzumab-형광염료 결합체들을 1 uM 농도(형광염료 농도 기준)로 녹이고, 형광 세기를 측정한 후, 표지 비율에 따른 형광세기 감소를 분석하였다. 비교를 위하여 항체에 결합하지 않은 동일 농도의 자유 형광염료 (free dye)에 대한 형광 스펙트럼 및 형광 세기를 측정하고, 항체-형광염료 결합체와 비교하였다.
항체-형광염료 결합체의 3차원 구조가 변할 때에 형광이 회복되는지를 관찰하기 위하여, Trastuzumab-ATTO680 결합체 (표지비율 3.77 시료)를 인산완충액 과 변성용 완충제 용액(1% sodium dodecyl sulfate (SDS) and 1 mM 2-mercaptoethanol 함유 인산완충액)에 각각 처리하고 흡광도 및 형광 스펙트럼을 비교하였다 (λex. 620 nm, λem. 640 ~850 nm).
합성된 Trastuzumab-형광염료 결합체의 소광 특성 분석 결과가 도 2에 보이고 있다. 표지비율 0에서의 값은 동일 농도의 자유 형광염료에 대한 형광값이다. 도 2 및 도 3b에서 볼 수 있는 것처럼 플루오레세인(Fluorescein), Alexa Fluor®488, Alexa Fluor®750, ATTO655, ATTO700, ATTO MB2, ATTO680, ICG 및 ZW800-1 등의 여러 가지 형광염료 결합체에서 모두 표지비율이 1인 경우에도 소광 효과를 얻을 수 있는 것으로 분석되었으며, 이것은 소광효과 작용기전이 트립토판 (또는 타이로신, 히스티딘, 메티오닌)과 형광염료간의 광유도 전자전달에 의한 것임을 뒷받침 한다. 형광염료의 소광 효과는 표지 비율이 증가함에 따라서 더욱 증가 되었다.
도 3d 및 3e에 의하면, ATTO680 형광 염료는 항체에 3.77개 표지 되었을 때에, 같은 농도의 자유 형광염료(free ATTO 680, 대조군)에 비하여 형광 신호가 7.9배 약해진 것으로 분석되었다. 또한, 결합체를 변성 완충액에서 처리하면 원래의 형광 세기만큼 형광이 다시 회복되는 것을 알 수 있었다. 도 3e에서는 항체-형광염료 결합체의 소광 특성 및 형광회복을 가시적으로 보여주기 위하여 동물용 형광영상 장비를 사용하여 촬영한 근적외선 형광영상(λex. 640/25 nm, λem. 732/37 nm) 사진이다. 원래는 강한 형광을 발생 할 수 있는 형광염료가 (도 3e의 2번튜브) 항체에 결합한 후에 소광 되어 있음을 가시적으로 확인 할 수 있고(도 3e의 3번튜브) 변성 완충액을 처리하여 형광염료와 아미노산과의 상호작용을 제거하는 경우에는 형광이 다시 회복되는 것을 직관적으로 볼 수 있다 (도 3e의 4번튜브). 비교를 위하여 형광염료가 들어있지 않은 인산 완충액 (PBS, 도 3e의 1번튜브)에 대한 형광영상도 보이고 있으며, 인산완충액 자체는 형광이 발생하지 않음을 보여준다.
이어지는 세포 및 동물실험에서는 Trastuzumab에 ATTO680을3.77개 결합시킨 것을 사용하여 실험을 진행함으로써, 항원 반응형 항체-형광염료 결합체의 기본 개념 및 효용성을 증명하고자 하였다.
(2) 혈청 내에서의 안정성 분석
항원 반응형 항체-형광염료 결합체가 단백질이 포함된 혈청 조건하에서도 결합체의 소광 효과가 안정적으로 유지되는 지를 분석하였다. 이것을 위하여, Trastuzumab-ATTO680 결합체 (표지비율 3.77 시료)를 인산 완충액 및 혈청 용액에 각각 분산 시키고, 24시간 동안 형광강도 변화를 측정하였다.
평가 결과, 결합체가 혈청 조건 하에서도 24시간동안 안정적으로 소광 상태를 유지하는 것을 알 수 있었으며 (도 4 참조), 이것은 Trastuzumab-ATTO680 결합체가 항원(HER2)과 결합하였을 때에만 형광 생성이 회복되면서 강한 형광신호를 낼 것이라는 것을 의미한다.
(3) Trastuzumab-ATTO680 결합체의 항원결합 특이성 분석
항체인 Trastuzumab이 ATTO680 형광 염료와 결합한 후에도, 표적 항원인 HER2에 대하여 결합 특이성을 유지하고 있는지 확인하는 세포 실험을 진행 하였다. 이것을 위하여 HER2를 발현하지 않는 HER2-음성 암세포주인 MDA-MB-231과 HER2를 과발현 하는 HER2-양성 암세포주인 Calu-3 및 SK-BR-3를 미국의 ATCC 사에서 구매하여 사용하였다. MDA-MB-231 암 세포주와 SK-BR-3 및 Calu-3 암 세포주에 Trastuzumab-ATTO680을 10 mg/mL 농도로 각각 30분 또는 1시간 동안 처리하고, 세척(washing)에 의하여 세포와 결합하지 항체를 제거한 후, 컨포컬 현미경을 사용하여 형광 영상을 얻음으로써 항체-형광염료 결합체가 각 세포 표면에 결합하는지 확인 하였다 (λex. 633 nm, λem. 647~754 nm).
도 5의 컨포컬 현미경 자료에 의하면, Trastuzumab-ATTO680 결합체는 HER2를 과발현하는 암세포 표면에서 강한 형광 신호를 볼 수 있지만, HER2-음성 암세포인 MDA-MB-231 세포의 표면에서는 형광신호를 검출할 수 없었다. 이로부터, Trastuzumab-ATTO680 결합체가 HER2 과발현 암 세포주를 특이적으로 영상 진단 하는데 이용될 수 있음을 알 수 있다.
(4) 항원과 상호 작용에 의한 형광신호 활성화 특성 분석
항체-형광염료 결합체가 암세포 표면에 존재하는 항원과 반응하는 즉시 형광신호가 활성화(turn ON)되는 지를 세포 실험을 통하여 검증하고자 하였다. Trastuzumab-ATTO 680 결합체는 세포 배양액 상에 존재할 때에는 형광신호를 발생하지 않다가, 암세포 표면에 존재하는 표적 항원인 HER2와 결합하는 경우에는 형광발생이 활성화되면서 강한 형광신호를 낼 것으로 기대되었다. 따라서, 본 실시예 에서는 항체-형광염료 결합체를 항원 과발현 암세포주에 처리 후 형광영상을 얻을 때에 세척(washing)을 하지 않고 매 1분 마다 형광영상을 촬영함으로써, 항원 반응형 항체-형광염료 결합체의 기본 개념 및 효용성을 증명하고자 하였다. 이를 위하여, Trastuzumab-ATTO 680 결합체를 HER2 과발현 암세포인 SK-BR-3에 10 ug/mL 농도로 처리 한 후, 세척 과정 없이 1분 마다 컨포컬 현미경을 사용하여 암세포의 형광 영상을 얻었다 (λex. 633 nm, λem. 647~754 nm). 비교를 위하여, 자유 형광염료 (free ATTO680)를 SK-BR-3 암세포에 1 uM 농도로 처리 한 후, 세척을 하기전과 세척한 후의 컨포컬 형광영상을 얻었다.
도 6a에 의하면, Trastuzumab-ATTO 680을 처리한 SK-BR-3 암세포에서, 초기에는 형광 신호 발생이 억제되어 있다가, 시간이 지남에 따라서 세포 표면에서 강한 형광 신호가 발생함으로써 세포의 모양과 위치를 관찰할 수 있었다. 이것은 Trastuzumab-ATTO 680이 세포외의 배양액 상에 존재할 때에는 형광이 소광되어 있다가, SK-BR-3 세포의 표면에 존재하는 항원과의 결합에 반응하여 형광발생이 즉시 활성화 됨으로써, 세척과정 없이도 암세포의 위치를 영상을 통하여 검출할 수 있음을 뒷받침하는 자료이다. 도 6a의 형광회복 특성을 정량적으로 분석하기 위하여 도 6a의 흰색선 위치에서 시간에 따른 형광 세기의 변화를 분석하였다 (도 6b). 도 6b에 의하면, 항원이 존재하는 세포 표면에서의 형광강도는 5분 이내에 정점에 도달하는 것으로 확인되었으며, 이것은 표적 항원과의 결합에 의한 형광신호 활성화가 매우 빠르게 일어나고, 항체가 세포 표면의 대부분의 항원과 5분 이내에 결합함을 나타낸다.
비교를 위하여, 자유 형광염료인 ATTO680을 동일 농도로 암세포에 처리하고 세척 전·후의 상태를 형광 영상으로 촬영한 결과를 도 7에 보이고 있다. 항체에 결합하지 않은 ATTO680을 처리한 경우에는 세포 밖의 영역에서 강한 형광신호를 발생함을 알 수 있었으며, 세척 후에는 형광염료가 모두 제거되었기 때문에 영상에서 형광신호가 검출되지 않았다. 이것은 도 6a에서 얻어진 결과가 소광 때문이라는 것을 뒷받침 해주고 있으며, ATTO680는 암세포 표면에 비특이적으로 흡착되거나 암세포 내로 섭취 되지는 않음을 보여준다.
(5) Trastuzumab-ATTO 680이 암세포 내로 섭취되는 속도 분석
암세포 표면에 존재하는 항원(HER2)과 결합한 Trastuzumab-ATTO 680이 암세포 내로 이동되는 시간을 관찰하기 위하여, HER2 과발현 암세포인 SK-BR-3에 Trastuzumab-ATTO 680를 20 ug/mL 농도로 30분동안 처리였다. 이후에, 3회 세척하여 세포 밖 영역에 있는 항체 결합체를 제거한 후, 24시간에 걸쳐서 형광영상을 촬영함으로써, 암세포 표면에 결합한 항체 결합체가 암세포 내로 유입(endocytosis)되는 속도를 관찰하였다.
도 8에 의하면, SK-BR-3의 경우에는 세포막에 결합된 항체-형광염료 결합체가 24시간이 지난 후에도 상당 부분이 암세포 표면에 그대로 존재하는 것을 알 수 있다. 이것을 통하여, 암세포 표면에 존재하는 항원이 암세포 내로 순환되는 속도가 느린 암세포들의 경우에도 높은 대조도의 영상을 얻기 위해서는, 세포 표면에 존재하는 항원에 반응할 때 형광이 활성화되는 항체-형광염료 결합체를 사용하여 형광영상을 얻어야 함을 보여준다.
(6) 이종이식 종양 동물 모델에서의 영상성능 평가
암컷 무흉선 누드 마우스 (Balb/c-nu, 5 주령)에 HER2-양성 Calu-3와 HER2-음성 MDA-MB-231 암세포 5×106 개를 0.1 mL EMEM 및 RPMI 배지에 희석하여 피하 주사한 후, 주기적으로 종양 세포 크기를 측정하여, 종양 크기가 약 190 mm3에 도달했을 때 실험에 사용하였다. 근적외선 형광영상을 위하여, Calu-3 및 MDA-MB-231 종양이 이식된 6마리의 마우스에 Trastuzumab-ATTO 680을 (50ug/50ul 인산완충액) 정맥 투여하였다. 비교를 위하여 또 다른 대조군으로서 종양을 이식하지 않은 마우스를 사용하였고, 동일한 부피의 인산 완충액(PBS)을 정맥투여 하였다. 정맥 투여 후 1시간, 5시간, 및 24시간 째 에 IVIS Lumina 영상 장비를 사용하여 근적외선 형광 영상을 촬영하였다 (λex. = 640/25 nm, λem. = 732/37 nm).
도 9a에 의하면, HER2-양성인 Calu-3 종양이 이식된 마우스의 경우, Trastuzumab-ATTO 680 투여 후 1시간 째 에도 종양의 위치를 형광영상으로부터 확인할 수 있었으며, 시간이 지날수록 종양의 위치가 더욱 뚜렷이 구별이 됨을 알 수 있었다. 반면, HER2-음성인 MDA-MB-231 종양이 이식된 마우스의 경우, 형광영상으로부터 종양의 위치를 구별하기 힘들었다. 이러한 결과는 Trastuzumab-ATTO680이 HER2-양성 암 조직에 특이적으로 결합하고, 형광이 활성화 됨을 보여준다. 도 9b에 의하면, HER2-양성 Calu-3 종양이 이식된 마우스에서 분석된 종양-대-배경 신호비가 2.5 (1시간째), 4.7 (5시간째) 및 8.2 (24시간째)로 높게 나왔으며, HER2-음성 MDA-MB-231 종양이 이식된 마우스에서는 1시간째 종양-대-배경 신호비가 1.4이고 24시간째에는 1.9 였다.
(7) 항체-형광염료 결합체의 생체내 분포 및 종양 내 축적 분석
정맥 투여된 항체-형광염료 결합체의 생체 내 분포를 관찰하기 위하여, Calu-3 및 MDA-MB-231 종양이 이식된 6마리의 마우스에 Trastuzumab-ATTO 680을 (50 ug/50ul 인산완충액) 정맥 투여 한 후, 1시간, 5시간, 및 24시간 째에 종양조직, 신장, 비장 및 간을 절취하고 근적외선 형광영상을 촬영하였다 (λex. = 640/25 nm, λem. = 732/37 nm).
도 9c에 의하면, 시간에 따라서 Calu-3 종양에서의 형광 신호가 증가함을 다시 한번 확인할 수 있으며, 간 등의 다른 장기에 비해서 매우 높은 신호를 종양에서 얻을 수 있음을 알 수 있다. MDA-MB-231 종양에는 항체의 축적이 미미한 수준임을 확인할 수 있다.
또한, 정맥투여 후 각 시간대 별로 얻어진 종양조직을 OCT화합물에 담근 후, 7 um 두께로 동결절편 조직을 얻고, 절편에 있는 세포들의 핵을 DAPI가 포함된 마운팅 용액을 이용하여 형광염색 하였다. 조직 절편 내 존재하는 Trastuzumab-ATTO 680과 세포들을 컨포컬 현미경을 통하여 관찰 하였다 (Trastuzumab-ATTO 680: λex. 633 nm 및 λem. 647-754 nm, 핵염색용 DAPI: λex. = 405 nm 및 λem. 420-480 nm).
종양 절편에 대한 형광사진 (도 9d)를 보면, Trastuzumab-ATTO 680에 해당하는 형광신호의 세기가 시간에 따라서 점점 늘어나고 확대되는 것을 볼 수 있으며, MDA-MB-231 종양에서는 매우 약한 형광신호만이 감지되었다. 이것은 Trastuzumab-ATTO 680이 HER2-양성 Calu-3 종양 조직에만 시간에 따라서 축적되면서 근적외선 형광 신호가 활성화 되는 것을 의미한다.
<실시예 2>
2.1. Cetuximab-ATTO680 결합체의 합성
실시예 2에서는, 항원 반응형 항체-형광염료 결합체의 기본 개념과 효용성이 여러 가지 항체들에 적용될 수 있음을 더욱 증명하기 위하여, 또 다른 항체의 예로서 인간 상피 성장 인자 수용체 (epidermal growth factor receptor, EGFR)을 표적으로 하는 항체인 Cetuximab (Erbitux, Merck Serono 사 제품)을 이용하여 두 번째 실시 예를 수행하였다.
실시예 1에서 여러 가지 형광염료에 대하여 소광 개념이 구현됨을 이미 보였으므로, 본 실시예 2에서는 형광염료로서 ATTO 680 N-hydroxysuccinimidyl ester(ATTO 680-NHS ester)로 한가지로 고정하고, Cetuximab에 ATTO680을 여러 가지 비율로 반응시킴으로써 항원 반응형 항체-형광염료 결합체의 특성 및 효용성을 더욱 검증하고자 하였다. 결합체 합성을 위하여 Cetuximab과 ATTO 680-NHS ester를 몰 비율 1:1 및 그 이상으로 혼합한 인산 완충액(PBS, 10 mM, pH 7.4)에 녹인 후 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 항체와 반응하지 않고 남은 형광염료 및 부산물은 PD-10 컬럼으로 제거하였고, Amicon Ultra-0.5 mL 필터 (EMD Millipore)로 농축하여 4 ℃에 보관하였다.
2.2. Cetuximab-ATTO680 결합체의 분석
(1) 형광 소광 및 회복 특성 분석
Cetuximab에 대한 형광염료의 표지비율 (degree of labeling, DL)은 실시예 1에서 기술된 것과 같은 방법에 의하여 측정하였으며, 표지비율에 따른 소광 효과를 분석하였다.
도 10a 및 10b는 형광염료의 표지 비율에 따른 소광 정도를 보여주고 있다. 예상한 데로 표지 비율이 증가함에 따라서 형광 소광 효과도 커졌으며, 표지비율이 5.4인 시료를 이용하여 이후의 실험을 진행 하였다.
도 10c는 Cetuximab-ATTO680 결합체 (표지비율 5.4)를 인산 완충액 (PBS) 또는 변성용 완충제 용액(1% sodium dodecyl sulfate (SDS) and 1 mM 2-mercaptoethanol 함유 인산완충액)에 각각 처리하고 흡광도 및 형광 스펙트럼을 비교한 결과이다 (λex. 620 nm, λem. 640 ~850 nm). 도 10c에 의하면, 결합체의 형광 신호는 소광되어 자유염료에 비하여 7.6배 약해진 것을 확인하였고, 변성용 완충용액에 처리 시에는 자유염료와 비슷한 수준으로 형광세기가 다시 회복됨을 알 수 있다.
(2) Cetuximab-ATTO680 결합체의 항원 결합 특이성 분석
상기 제작한 Cetuximab-ATTO680 결합체를 EGFR-음성 MCF7 암세포 및 EGFR-양성 MDA-MB-468 암 세포주에 10 ug/mL 농도로 각각 30분, 1시간 및 2시간 동안 처리하고, 세척(washing)에 의하여 세포와 결합하지 항체를 제거한 후, 컨포컬 현미경을 사용하여 형광 영상을 얻었다 (λex. 633 nm, λem. 647~754 nm).
도 11a에 의하면, EGFR-음성 MCF-7에는 2시간 처리에도 형광 신호가 검출 되지 않았으며, EGFR-양성 MDA-MB-468(도 11b) 에서는 30분째에 세포막에서 강한 형광신호가 관찰되었다. 이 결과는 Cetuximab-ATTO680이 EGFR-양성 암세포에 특이적으로 결합하고, 소광되어 있던 형광이 다시 회복되는 것을 의미한다.
(3) Cetuximab-ATTO680 세포 내 섭취 속도 분석
Cetuximab-ATTO680 결합체를 MDA-MB-468 암세포에 처리 후 시간 별 세포 내 유입(endocytosis) 정도를 확인하기 위하여 Cetuximab-ATTO680을 20 ug/mL 농도로 30분 동안 처리하고, 세척에 의하여 결합하지 않은 항체를 제거하였으며, 각각 30 분, 1 시간, 5 시간, 24 시간째에 형광 영상을 관찰하였다. 그 결과 5 시간째부터 세포 내 라이소좀으로 결합체가 이동하기 시작하는 것을 알 수 있었으며, 24시간째에는 대부분의 결합체가 세포내에 있으나, 일부 결합체는 여전히 세포막에 존재함을 확인하였다 (도 12). 이 결과에 의하면, EGFR-양성 MDA-MB-468 암세포의 경우에도 항체 결합체가 세로내로 충분히 축적되는데 24시간이 소요됨을 알 수 있으며, 따라서 EGFR-양성 암세포의 경우에도 빠른 시간내에 암세포를 형광영상 진단 하기 위해서는 Hisataka Kobayashi 박사가 제안한 표적세포 특이적 항체-형광염료 결합체를 사용하는 것 보다는 본 발명에서 제시한 항원 반응형 항체-형광염료 결합체가 매우 적합함을 알 수 있었다.
<실시예 3>
3.1. anti-VEGF-ATTO680 결합체의 합성
실시예 3에서는, 항원 반응형 항체-형광염료 결합체의 기본 개념과 효용성이 여러 가지 항체들에 적용될 수 있음을 더욱 증명하기 위하여, 또 다른 항체의 예로서 혈관표피성장인자 (vascular endothelial growth factor, VEGF)를 표적으로 하는 anti-VEGF (Abcam 제품, ab46154)를 이용하여 세 번째 실시 예를 수행하였다.
실시예 1에서 여러 가지 형광염료에 대하여 소광 개념이 구현됨을 이미 보였으므로, 본 실시예 3에서는 형광염료로서 ATTO 680 N-hydroxysuccinimidyl ester(ATTO 680-NHS ester)로 한가지로 고정하고, VEGF 항체에 ATTO680을 여러 가지 비율로 반응 시킴으로써 항원 반응형 항체-형광염료 결합체의 특성 및 효용성을 더욱 검증하고자 하였다. 결합체 합성을 위하여 VEGF 항체와 ATTO 680-NHS ester를 몰 비율 1:1 및 그 이상으로 혼합한 인산 완충액(PBS, 10 mM, pH 7.4)에 녹인 후 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 항체와 반응하지 않고 남은 형광염료 및 부산물은 PD-mini Trap G25 컬럼으로 제거하였고, Amicon Ultra-0.5 mL 필터 (EMD Millipore, 30 kDa)로 농축하여 4 ℃에 보관하였다.
3.2 anti-VEGF-ATTO680 결합체의 분석
(1) 형광 소광 및 회복 특성 분석
VEGF 항체에 대한 형광염료의 표지비율 (degree of labeling, DL)은 실시예 1에서 기술된 것과 같은 방법에 의하여 측정하였으며, 표지비율에 따른 소광 효과를 분석하였다.
도 13a 및 13b는 형광염료의 표지 비율에 따른 소광 정도를 보여주고 있다. 예상한 데로 표지 비율이 증가함에 따라서 형광 소광 효과도 커진 것을 확인하였다.
<실시예 4>
4.1. anti-Vimentin-ATTO680 결합체의 합성
실시예 4에서는, 항원 반응형 항체-형광염료 결합체의 기본 개념과 효용성이 여러 가지 항체들에 적용될 수 있음을 더욱 증명하기 위한 또 다른 항체의 예로서, 종양이 전이될 때 이동의 용이성을 위해 종양 세포의 골격이 바뀌게 되는데 이 때 발현되는 세포 골격 표지자인 Vimentin 을 표적으로 하는 anti-Vimentin (Abcam 제품, ab92547)을 이용하여 네 번째 실시 예를 수행하였다.
실시예 1에서 여러 가지 형광염료에 대하여 소광 개념이 구현됨을 이미 보였으므로, 본 실시예 4에서는 형광염료로서 ATTO 680 N-hydroxysuccinimidyl ester(ATTO 680-NHS ester)로 한가지로 고정하고, Vimentin 항체에 ATTO680을 여러 가지 비율로 반응시킴으로써 항원 반응형 항체-형광염료 결합체의 특성 및 효용성을 더욱 검증하고자 하였다. 결합체 합성을 위하여 Vimentin 항체와 ATTO 680-NHS ester를 몰 비율 1:1 및 그 이상으로 혼합한 인산 완충액(PBS, 10 mM, pH 7.4)에 녹인 후 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 항체와 반응하지 않고 남은 형광염료 및 부산물은 PD-mini Trap G25 컬럼으로 제거하였고, Amicon Ultra-0.5 mL 필터 (EMD Millipore, 30 kDa)로 농축하여 4 ℃에 보관하였다.
4.2. anti-Vimentin-ATTO680 결합체의 분석
(1) 형광 소광 및 회복 특성 분석
Vimentin 항체에 대한 형광염료의 표지비율 (degree of labeling, DL)은 실시예 1에서 기술된 것과 같은 방법에 의하여 측정하였으며, 표지비율에 따른 소광 효과를 분석하였다.
도 14a 및 14b는 형광염료의 표지 비율에 따른 소광 정도를 보여주고 있다. 예상한 데로 표지 비율이 증가함에 따라서 형광 소광 효과도 커진 것을 확인하였다.
<실시예 5>
5.1. anti-CD44-ATTO680 결합체의 합성
실시예 5에서는, 항원 반응형 항체-형광염료 결합체의 기본 개념과 효용성이 여러 가지 항체들에 적용될 수 있음을 더욱 증명하기 위한 또 다른 항체의 예로서, 세포 간 및 세포-기질간의 교류에 관여하는 막통과 단백질 중 하나인 CD44를 표적으로 하는 CD44 항체 (R & D 제품, AF3660)를 이용하여 다섯 번째 실시 예를 수행하였다.
실시예 1에서 여러 가지 형광염료에 대하여 소광 개념이 구현됨을 이미 보였으므로, 본 실시예 2에서는 형광염료로서 ATTO 680 N-hydroxysuccinimidyl ester(ATTO 680-NHS ester)로 한가지로 고정하고, CD44 항체에 ATTO680을 여러 가지 비율로 반응 시킴으로써 항원 반응형 항체-형광염료 결합체의 특성 및 효용성을 더욱 검증하고자 하였다. 결합체 합성을 위하여 CD44 항체와 ATTO 680-NHS ester를 몰 비율 1:1 및 그 이상으로 혼합한 인산 완충액(PBS, 10 mM, pH 7.4)에 녹인 후 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 항체와 반응하지 않고 남은 형광염료 및 부산물은 PD-mini Trap G25 컬럼으로 제거하였고, Amicon Ultra-0.5 mL 필터 (EMD Millipore, 30 kDa)로 농축하여 4 ℃에 보관하였다.
5.2. anti-CD44 -ATTO680 결합체의 분석
(1) 형광 소광 및 회복 특성 분석
CD44 항체에 대한 형광염료의 표지비율 (degree of labeling, DL)은 실시예 1에서 기술된 것과 같은 방법에 의하여 측정하였으며, 표지비율에 따른 소광 효과를 분석하였다.
도 15a 및 15b는 형광염료의 표지 비율에 따른 소광 정도를 보여주고 있다. 예상한 데로 표지 비율이 증가함에 따라서 형광 소광 효과도 커진 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 형광염료가 공유결합에 의하여 표지된 항체를 포함하되, 상기 형광염료는 항체 내 트립토판, 타이로신, 히스티딘 및 메티오닌으로 이루어진 군 중에서 선택되는 잔기와의 상호 작용에 의하여 소광되고, 세포 표면에 존재하는 항원과 항체가 결합할 때에는 소광작용이 해소되어 형광을 발생하여, 표적 항원을 표면에 갖는 세포를 영상 진단 할 수 있는 항원 반응형 항체-형광염료 결합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체가 결합하는 항원은, 표피 성장인자 수용체 (epidermal growth factor receptor, EGFR, HER1), 인간 표피 성장인자 수용체 2 (human epidermal growth factor receptor 2, HER2), 인간 표피 성장인자 수용체 3 (human epidermal growth factor receptor 3, HER3, ERBB-3), 인간 표피 성장인자 수용체 4 (human epidermal growth factor receptor 4, HER4, ERBB-4), EpCam (epithelial cell adhesion molecule), CD19, CD20, CD22 (Siglec-2), CD30 (TNFRSF1), CD33 (Siglec-3), CD44, CD44v6, CD52, CD56 (NCAM), CD152 (CTLA4), MUC1 (mucin 1), CEA (carcinoembryonic antigen), LEWIS Y, PSMA (prostate-specific membrane antigen), TAG-72 (tumor-associated glycoprotein 72), GD2 ganglisoside, GD3 ganglisoside, HLA-DR10 (human leukocyte antigen-DR), IGF1R (insulin-like growth factor 1 receptor), TAL6 (tumor-associated antigen L6), TRAILR2 (tumor-necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor), vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGFR2 (vascular endothelial growth factor receptor 2), platelet-derived growth factor receptor alpha (PDFGRA), hepatocyte growth factor receptor (HGFR), Alpha-v beta-3, Folate receptor, EGF-like domain-containing protein 7 (EGFL7), Fibroblast activation protein alpha (FAP), Carbonic anhydrase 9 (CA9/CAIX) 및 Vimentin으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체-형광염료 결합체.
  3. 제1항에 있어서,
    항체는 EGFR에 대한 항체인 Cetuximab (Erbitux), Panitumumab (Vectibix), Necitumumab (Portrazza), Imgatuzumab, Matuzumab, Nimotuzumab, Futuximab 및 Zalutumumab; HER2에 대한 항체인 Trastuzumab (Herceptin)과 Pertuzumab (Perjeta); HER3에 대한 항체인 Duligotumab, Patritumab 및 Seribantumab; VEGF-A에 대한 항체인 Bevacizumab (Avastin); EpCam에 대한 항체인 Catumaxomab (Removab)과 Adecatumumab (MT201); IGF1R에 대한 항체인 Cixutumumab (IMC-A12), Figitumumab, Ganitumab, Robatumuma, Teprotumumab 및 Dalotuzumab; TRAILR2에 대한 항체인 Conatumumab (AMG 655), Drozitumab, Lexatumumab 및 Tigatuzumab; CD20에 대한 항체인 Rituximab (Rituxan), Ibritumomab tiuxetan (Zevalin), Tositumomab (Bexxar), Ofatumumab (Arzerra), Ocaratuzumab, Ublituximab 및 Obinutuzumab; CD22에 대한 항체인 Epratuzumab (LymphoCide), Inotuzumab 및 Narnatumab; CD30에 대한 항체인 Brentuximab과 Iratumumab; CD33에 대한 항체인 Gentuzumab (Mylotarg)과 Lintuzumab; CD44v6에 대한 항체인 Bivatuzumab; CD52 에 대한 항체인 Alemtuzumab (Campath); GD2 ganglisoside에 대한 항체인 Dinutuximab (Unituxin); GD3 ganglisoside에 대한 항체인 Ecromeximab; platelet-derived growth factor receptor alpha (PDFGRA)에 대한 항체인 Olaratumab; hepatocyte growth factor receptor (HGFR)에 대한 항체인 Emibetuzumab; Alpha-v beta-3에 대한 항체인 Etaracizumab (Abegrin); Folate receptor alpha에 대한 항체인 Farletuzumab; EGF-like domain-containing protein 7 (EGFL7)에 대한 항체인 Parsatuzumab; Fibroblast activation protein alpha (FAP)에 대한 항체인 Sibrotuzumab; Carbonic anhydrase 9 (CA9/CAIX)에 대한 항체인 Girentuximab (Rencarex), anti-CD44 및 anti-Vimentin; 으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체-형광염료 결합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 형광염료는 로다민, 쿠마린, 에보블루(EvoBlue), 옥사진, 카보피로닌, 나프탈렌, 비페닐, 안트라센, 페난트렌, 피렌 또는 카바졸을 기본 골격으로 갖는 형광염료 또는 상기 형광염료의 유도체인 것을 특징으로 하는 항체-형광염료 결합체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 형광염료는 플루오레세인 (Fluorescein), CR110 : 카복시로다민 110 : 로다민 그린(상표명), TAMRA : 카복시테트라메틸로다민 : TMR, 카복시로다민 6G : CR6G, BODIPY FL(상표명) : 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 493/503(상표명) : 4,4-디플루오로-1,3,5,7-테트라메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-8-프로피온산, BODIPY R6G(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3-부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 558/568(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 564/570(상표명) : 4,4-디플루오로-5-스티릴-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 576/589(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(2-피롤릴)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 581/591(상표명) : 4,4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3-부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, EvoBlue10(상표명), EvoBlue30(상표명), MR121, ATTO 655(상표명), ATTO 680(상표명), ATTO 700(상표명), ATTO MB2(상표명), Alexa Fluor 350(상표명), Alexa Fluor 405(상표명), Alexa Fluor 430(상표명), Alexa Fluor 488(상표명), Alexa Fluor 532(상표명), Alexa Fluor 546(상표명), Alexa Fluor 555(상표명), Alexa Fluor 568(상표명), Alexa Fluor 594(상표명), Alexa Fluor 633(상표명), Alexa Fluor 680(상표명), Alexa Fluor 700(상표명), Alexa Fluor 750(상표명), Alexa Fluor 790(상표명), Flamma 496(상표명), Flamma 507(상표명), Flamma 530(상표명), Flamma 552(상표명), Flamma 560(상표명), Flamma 575(상표명), Flamma 581(상표명), Flamma 648(상표명), Flamma 675(상표명), Flamma 749(상표명), Flamma 774(상표명), Flamma 775(상표명), Rhodamine Red-X(상표명), Texas Red-X(상표명), 5(6)-TAMRA-X(상표명), 5TAMRA(상표명), Indocyanine green (ICG) 및 2-((E)-2-((E)-2-(4-(2-carboxyethyl)phenoxy)-3-((E)-2-(3,3-dimethyl-5-sulfonato-1-(3-(tri-methyl ammonio)-propyl)indolin-2-ylidene)ethylidene)cyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-1-(3-(trimethyl ammonio)-propyl)-3H-indolium-5-sulfonate disodium bromide (ZW800-1)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체-형광염료 결합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체-형광염료 결합체를 유효성분으로 포함하는 세포, 조직 및 조직절편 영상 키트.
  7. 제 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체-형광염료 결합체를 유효성분으로 포함하는, 형광영상을 통한 암의 진단 또는 검출용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 주사용 제형 또는 스프레이용 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항체-형광염료 결합체를 사용하여 종양 인자를 영상을 통하여 검출 또는 측정할 수 있는, 영상을 통한 암 진단용 정보제공 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200012254A (ko) 2018-07-26 2020-02-05 한국과학기술연구원 암세포 특이적 항암 단백질-형광 복합체 및 이를 포함하는 암의 진단 및 영상화용 조성물

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021173705A (ja) * 2020-04-28 2021-11-01 国立大学法人北海道大学 標的ポリペプチドの情報取得方法および試薬キット
CN111690038A (zh) * 2020-06-23 2020-09-22 南京诺源医疗器械有限公司 一种用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的制备方法
CN113063761B (zh) * 2021-03-17 2023-02-10 北京化工大学 一种用于检测muc1粘蛋白的荧光适配体传感器及其应用方法
CN113109566A (zh) * 2021-05-24 2021-07-13 上海理工大学 一种基于抗原有色化的食源性致病菌的荧光免疫层析联检方法
CN115177751B (zh) * 2022-03-16 2023-07-04 北京药明博锐生物科技有限公司 缀合物、其制备方法和用途
CN115524307A (zh) * 2022-09-23 2022-12-27 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种近红外胃癌检测试剂盒及其制备方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19925402C2 (de) * 1999-06-02 2001-12-20 Molecular Machines & Ind Gmbh Screening von Target-Ligand-Wechselwirkungen
US7597878B2 (en) * 2000-09-19 2009-10-06 Li-Cor, Inc. Optical fluorescent imaging
US20130039861A1 (en) 2005-04-06 2013-02-14 Immunomedics, Inc. Dye Conjugated Peptides for Fluorescent Imaging
RU2450832C2 (ru) * 2006-10-25 2012-05-20 Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. Контрастные вещества для детекции рака предстательной железы
WO2008148546A2 (en) * 2007-06-06 2008-12-11 F.Hoffmann-La Roche Ag Composition of a first non-labeled monoclonal antibody binding to a tumor antigen and a non-cross reactive second monoclonal antibody labeled with a nir fluorescence label
CN101802214A (zh) * 2007-09-10 2010-08-11 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 具有单读出的通用激酶/磷酸酶测定法
US20110237942A1 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Tamotsu Zako Bioimaging method using near-infrared (nir) fluorescent material
CN103917872B (zh) * 2011-11-02 2016-05-18 优志旺电机株式会社 使用含荧光标记抗体可变区域的多肽复合体的荧光免疫测定方法
KR101452819B1 (ko) 2012-11-01 2014-10-23 국립암센터 환원제 반응형 이황화물 연결자 함유 고분자-광감각제 결합체 및 이를 포함하는 형광 영상 진단 및 광역학 치료용 조성물
KR101510513B1 (ko) 2013-02-15 2015-04-10 경희대학교 산학협력단 신규한 양자점-앱타머 결합체 및 이의 용도
KR101659855B1 (ko) * 2014-05-08 2016-09-26 국립암센터 엽산을 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 결합체 및 그를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 조성물
KR20160037411A (ko) 2014-09-28 2016-04-06 목포대학교산학협력단 미생물 발효차 용기 및 그 제조방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200012254A (ko) 2018-07-26 2020-02-05 한국과학기술연구원 암세포 특이적 항암 단백질-형광 복합체 및 이를 포함하는 암의 진단 및 영상화용 조성물

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