CN111690038A - 一种用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的制备方法 - Google Patents

一种用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的制备方法，如下：用6‑氨基己酸(Fmoc‑acp‑OH)与cRGDyK生成Fmoc‑acp‑cRGDyK，氨基脱保护后与谷氨酸生成Fmoc‑glu‑acp‑{cRGDyK}2，再与Fmoc‑acp‑OH反应生成Fmoc‑acp‑glu‑acp‑{cRGDyK}2，脱保护Fmoc基团形成NH2‑acp‑glu‑acp‑{cRGDyK}2，再与ZW800‑COOH脱水缩合形成ZW800‑glu‑acp‑{cRGDy}2，进行分离和提纯，这样制备的ZW800‑bi‑cRGDyK成品率高，能有效地降低同类产品的成本，易于产业化推广。

Description

一种用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的制备方法
技术领域
本发明涉及医疗领域，更具体地说，涉及一种用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的制备方法。
背景技术
目前临床可用的近红外荧光小分子只有FDA批准的吲哚菁绿(Indocyaninegreen,ICG)，它是一种亲水性荧光示踪剂，主要应用于肝功能、心输出量的评估以及眼底血管造影。由于ICG光吸收在780nm左右，近红外荧光发出波长为820nm左右，避免了人体组织的自发荧光而且具有较深的组织穿透性，在一些深层的组织同样具有较好的成像效果。其双亲性进入血液后，能迅速与血液中的蛋白结合成7nm左右的纳米粒子，这使其在体内具有较好的EPR效应，在肿瘤组织中富集后对肿瘤具有较好的实时成像效果，从而成为目前主流的手术实时导航成像的近红外小分子。但是基于大量研究报告总结，ICG还存在以下问题：第一，在水溶液具有较低的荧光量子产率中<1％，这将极大的降低了设备的检测限。根据我国药监法规，人体ICG最大注射剂量应小于2mg/kg，在此剂量下，文献报道ICG在人体肿瘤的浓度在10-1000nM，这对检测设备提出极高的要求；第二，短时间内，ICG在肿瘤及正常组织的代谢速率差别不大，只有大于12小时后才能产生足够的荧光对比度(肿瘤：正常组织)，增加了医院及病人的负担；第三，ICG聚集后容易发生光漂白，较大的降低了其在成像过程中的稳定性；第四，也是最重要的一条，ICG在肿瘤中富集是通过EPR效应，缺乏肿瘤细胞的主动靶向性，大幅度降低了荧光示踪剂成像的准确性；从而ICG在转移灶如转移淋巴结，微小转移灶等的诊断上完全失去了优势，所以在更加严重的转移病灶成像上，主动靶向性的开发变得尤为重要。
由此可见，针对成像精度更高的转移灶，研制高荧光量子产率、具有高灵敏肿瘤细胞主动靶向荧光示踪剂，在临床实时手术成像的应用中具有很高的应用价值。大量研究证实，整合素在多种恶性肿瘤细胞表面或肿瘤组织新生血管内皮细胞上具有较高水平的表达，而正常组织的细胞或成熟血管内皮细胞则表达很少。RGD多肽对肿瘤细胞或者肿瘤新生血管内皮细胞特异性高表达某些整合素受体，但由于肿瘤内部血供不足和生长紊乱RGD多肽在肿瘤细胞上仍具有较差的靶向精准性。因此增加RGD在整合素受体上结合程度，增加RGD的量，并改用靶向作用更强的cRGDyK环肽作为靶向基团，不仅增加主动靶向性，并增大了近红荧光示踪剂的水溶性，减少了组织吞噬的程度。这在某种程度上较大的减少了病人手术的时间和费用，提高了手术的准确度。为转移淋巴结和转移病灶实时手术成像提供了重要的参照。然而现有的制备方法成品率低且成本较高，严重制约了此类产品的应用。
发明内容
本发明旨在提供一种用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的制备方法，旨在解决现有技术中该示踪剂的制备方法的成品率低且成本较高的问题。
为实现此目的，本发明提供了一种用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、使用6-氨基己酸(Fmoc-acp-OH)与cRGDyK链接合成带有氨基保护的Fmoc-acp-cRGDyK；
S2、将Fmoc-acp-cRGDyK的氨基脱保护形成NH2-acp-cRGDyK；
S3、将NH2-acp-cRGDyK与氨基保护的谷氨酸(Fmoc-glu-OH)聚合形成Fmoc-glu-acp-{cRGDyK}2；
S4、将Fmoc-glu-acp-{cRGDyK}2的氨基脱保护，形成长链NH2-glu-acp-{cRGDyK}2；
S5、Fmoc-acp-OH与NH2-glu-acp-{cRGDyK}2进行反应后形成Fmoc-acp-glu-acp-{cRGDyK}2，对Fmoc-acp-glu-acp-{cRGDyK}2进行脱保护Fmoc基团形成NH2-acp-glu-acp-{cRGDyK}2；
S6、将NH2-acp-glu-acp-{cRGDyK}2与ZW800-COOH脱水缩合形成ZW800-glu-acp-{cRGDy}2；即ZW800-bi-cRGDyK，对其进行分离和提纯。
优选的，步骤S1包括以下步骤：
S11、合成氨基保护的Fmoc-acp-cRGDyK；
S12、采用自动多肽连续合成仪，称量2-CL树脂0.5g，放入反应器中；
S13、用二氯甲烷(DCM)浸泡10min后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤2次，再用二氯甲烷洗涤一次，备用；
S14、使用固相法制备cRGDyK，留在柱子上，称取Fmoc-acp-OH0.5g；用2mL DCM混合溶液溶解，加入0.4ml N,N-二异丙基乙胺(DIEA)摇匀；
S15、将溶解后的溶液加入装有树脂的反应器中，摇晃或氮气鼓泡反应90min，反应过程中由于DCM挥发，需要补加DCM；
S16、反应结束后，补加分析级甲醇1mL和2ml DCM，封闭反应20min后，DMF洗涤树脂三次后得到Fmoc-acp-cRGDyK(1)。
Figure BDA0002552891450000041
优选的，步骤S2包括以下步骤：
S21、脱Fmoc-acp-cRGDyK；使用20％哌啶+80％DMF去脱保护Fmoc基团；
S22、脱保护20min后用DMF洗涤5次，每次30s；
S23、取少量树脂加入两滴茚三酮在100℃检测显色；
S24、到固体柱上无颜色为止，合成的NH2-acp-cRGDyK(2)在柱子上保持。
Figure BDA0002552891450000042
优选的，步骤S3包括以下步骤：
S31、称取0.36mmol氨基酸Fmoc-glu-OH和0.36mmol EDC，用2mL DMF溶解加入0.4mL NHS；
S32、将反应液活化1min后加入反应器中反应1h；
S33、反应结束后，用DMF洗涤树脂4次后取少量树脂茚三酮检
测无色即可，若有颜色则需要重复投料，在柱子上制备得到Fmoc-glu-acp-{cRGDyK}2(3)。
Figure BDA0002552891450000051
优选的，步骤S4包括以下步骤：
S41、用20％哌啶和80％DMF溶液去脱保护Fmoc基团，摇匀20分钟，沥干洗涤9次；
S42、每一个酰基化和去保护环节都被实时监测；
S43、取少量树脂加入两滴茚三酮在100℃检测显色；
S44、在重复脱保护和酰化反应后，从树脂中保留NH2-glu-acp-{cRGDyK}2(4)。
Figure BDA0002552891450000052
优选的，步骤S5包括以下步骤：
S51、称取氨基酸0.36mmol Fmoc-acp-OH和0.36mmol EDC，用2mL DMF溶解后加入0.4mL NHS；
S52、在反应器中反应1h后，用DMF洗涤树脂4次后取少量树脂茚三酮检测无色即可，若有颜色需要重复投料，得到Fmoc-acp-glu-acp-{cRGDyK}2；
S53、用20％哌啶和80％DMF溶液去脱保护Fmoc基团，摇匀20分钟，沥干洗涤9次，得到NH2-acp-glu-acp-{cRGDyK}2(5)。
Figure BDA0002552891450000061
优选的，步骤S6包括以下步骤：
S61、用二甲基亚砜溶解染料0.12mmol；
S62、加入0.13mmol EDC，加入用1mL DMF溶解的0.2mL NHS，再加入0.12mmolDIEA；
S63、在避光以及室温条件下反应，反应结束用DMF洗涤3次，再加入甲醇洗涤3次后抽干准备切割；
S64、配置切割液，包括95ml的TFA、1ml水、2.5ml的TIS和2.5ml的EDT；
S65、将树脂粗品称重，放入50ml离心管进行切割反应，在室温下裂解2h；
S66、将切割液过滤得到存有粗品的滤液，加入温度为-20℃的冰乙醚，其中滤液与乙醚的比例为1：8，析出的多肽经过离心处理后得到粗品ZW800-bi-cRGDyK(6)；
Figure BDA0002552891450000071
S67、切割粗品ZW800-bi-cRGDyK并进行分离；
S68、将ZW800-bi-cRGDyK通过HPLC液相纯化得到纯品，再将纯品冻干成为粉末。
本发明的另一个目的在于提供由上述制备方法制备的ZW800-bi-cRGDyK。
相比于现有技术，本发明的优点在于：
使用该方法制备的ZW800-bi-cRGDyK成品率高，可以有效地降低同类产品的成本，易于产业化推广。
附图说明
图1是该用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的合成流程图；
图2是该用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的水溶液荧光测试图；
图3是该用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的高效液相分析图；
图4是该用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的质谱图；
图5是该用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂用于肿瘤转移淋巴结的体内成像图；
图6是该用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的高效液相分析纯度表。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，是本发明的用于诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成流程图，该用于诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的制备方法包括以下步骤：
S1、使用6-氨基己酸(Fmoc-acp-OH)与cRGDyK链接合成带有氨基保护的Fmoc-acp-cRGDyK，包括以下步骤：
S11、合成氨基保护的Fmoc-acp-cRGDyK；
S12、采用自动多肽连续合成仪，称量2-CL树脂0.5g，放入反应器中；
S13、用二氯甲烷(DCM)浸泡10min后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤2次，再用DCM洗涤一次，备用；
S14、使用固相法制备cRGDyK，留在柱子上，称取Fmoc-acp-OH(0.5g*0.3mmol/g*1.33＝0.20mmol),用2mL DCM混合溶液溶解，加入0.4ml N,N-二异丙基乙胺(DIEA)摇匀；
S15、将溶解后溶液加入装有树脂的反应器中，摇晃或氮气鼓泡反应90min，反应过程中DCM挥发，需要补加DCM；
S16、反应结束后，补加分析级甲醇1mL，2ml DCM，封闭反应20min后，DMF洗涤树脂三次得到Fmoc-acp-cRGDyK(1)。
Figure BDA0002552891450000091
S2、将Fmoc-acp-cRGDyK的氨基脱保护形成NH2-acp-cRGDyK，包括以下步骤：
S21、脱Fmoc-acp-cRGDyK,使用20％哌啶+80％DMF去脱保护Fmoc基团；
S22、脱保护20min后用DMF洗涤5次，每次30s；
S23、取少量树脂加入两滴茚三酮(配比2.5g茚三酮/50ml无水乙醇)100℃检测显色；
S24、直到固体柱上无颜色为止，合成的NH2-acp-cRGDyK(2)在柱子上保持。
Figure BDA0002552891450000101
S3、将NH2-acp-cRGDyK与氨基保护的谷氨酸(Fmoc-glu-OH)聚合形成Fmoc-glu-acp-{cRGDyK}2，包括以下步骤：
S31、称取氨基酸Fmoc-glu-OH(0.4g*0.3mmol/g*3＝0.36mmol)和0.36mmol EDC，用2mL DMF溶解加入0.4mL NHS；
S32、将反应液活化1min加入反应器中反应1h；
S33、反应结束DMF洗涤树脂4次后取少量树脂茚三酮检测无色即可，若有颜色需要重复投料，在柱子上制备得到Fmoc-glu-acp-{cRGDyK}2(3)。
Figure BDA0002552891450000102
S4、将Fmoc-glu-acp-{cRGDyK}2的氨基脱保护，形成长链NH2-glu-acp-{cRGDyK}2，包括以下步骤：
S41、然后，用20％哌啶和80％DMF溶液去脱保护Fmoc基团，摇匀20分钟，沥干洗涤9次；
S42、每一个酰基化和去保护环节都被实时监测；
S43、取少量树脂加入两滴茚三酮(配比2.5g茚三酮/50ml无水乙醇)100℃检测显色；
S44、在重复脱保护和酰化反应后，从树脂中保留NH2-glu-acp-{cRGDyK}2(4)。
Figure BDA0002552891450000111
S5、Fmoc-acp-OH再次与NH2-glu-acp-{cRGDyK}2反应形成Fmoc-acp-glu-acp-{cRGDyK}2及脱保护，包括以下步骤：
S51、称取氨基酸Fmoc-acp-OH(0.4g*0.3mmol/g*3＝0.36mmol)和0.36mmol EDC，用2mL DMF溶解加入0.4mL NHS；
S52、在反应器中反应1h后，用DMF洗涤树脂4次后取少量树脂茚三酮检测无色即可，若有颜色需要重复投料。得到Fmoc-acp-glu-acp-{cRGDyK}2；S53、然后，用20％哌啶和80％DMF溶液去脱保护Fmoc基团，摇匀20分钟，沥干洗涤9次，得到NH2-acp-glu-acp-{cRGDyK}2(5)。
Figure BDA0002552891450000112
S6、所合成的NH2-acp-glu-acp-{cRGDyK}2与ZW800-COOH脱水缩合形成ZW800-glu-acp-{cRGDy}2,即ZW800-bi-cRGDyK，进一步分离提纯，包括以下步骤：
S61、用二甲基亚砜(DMSO)溶解染料(0.12mmol)；
S62、加入0.13mmol EDC，加入用1mL DMF溶解的0.2mL NHS，再加入0.12mmolDIEA；
S63、在避光以及室温条件下反应，反应结束用DMF洗涤3次，再加入甲醇洗涤3次抽干准备切割；
S64、配置切割液，包括95ml的TFA、1ml水、2.5ml的TIS和2.5ml的EDT；
S65、将树脂粗品称重，放入50ml离心管进行切割反应，在室温下裂解2h；
S66、将切割液过滤得到还有粗品的滤液，加入温度为-20℃的冰乙醚，其中滤液与乙醚的比例为1：8，析出的多肽经过离心处理后得到粗品ZW800-bi-cRGDyK(6)；
Figure BDA0002552891450000121
S67、切割粗品形成ZW800-bi-cRGDyK并进行分离；
S68、将ZW800-bi-cRGDyK通过HPLC液相纯化得到纯品，再将纯品冻干成为粉末，使用该方法制备的ZW800-bi-cRGDyK成品率高，可以有效地降低同类产品的成本，易于产业化推广。
本发明的一种用于诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的制备方法，是通过全合成的方法，使水溶性较好的ZW800具有高荧光量子产率的近红外荧光小分子与双cRGDyK小分子多肽相结合形成高特异性主动靶向荧光示踪剂，该示踪剂比传统的ICG在淋巴结诊断上具有更好的主动靶向性、较强的特异性，且没有降低它的水溶性和荧光量子产率等优点。
主动靶向性近红外小分子的结构和性能表征，具体操作为：(1)荧光性质的测试：如图2所示，所得荧光小分子用荧光分度计进行测试其荧光性能，在不同激发波长下得到的荧光谱图。链接双cRGDyK后，其荧光峰与ZW800保持一致，仍然保持在800nm左右并没有发生明显的改变。(2)高效液相色谱和质谱分析：如图3、图4和图6所示，链接双cRGDyK后的荧光小分子在高效液相分析中具有具有较高的纯度(92.7％)，质谱分析和分子量相吻合为2617。
(3)动物体内成像的表征：如图5所示，通过尾静脉注射ZW800-bi-cRGDyK近红外主动靶向性小分子对小鼠的肿瘤转移淋巴结进行特异性成像，在近红外手术导航设备观察发现经过0.5h后,小分子就可以富集在肿瘤转移淋巴结上，清楚地观察到转移淋巴结的荧光信号和大小，与非转移淋巴结的成像上具有明显的信号差异。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、使用6-氨基己酸(Fmoc-acp-OH)与cRGDyK链接合成带有氨基保护的Fmoc-acp-cRGDyK；
S2、将Fmoc-acp-cRGDyK的氨基脱保护形成NH2-acp-cRGDyK；
S3、将NH2-acp-cRGDyK与氨基保护的谷氨酸(Fmoc-glu-OH)聚合形成Fmoc-glu-acp-{cRGDyK}2；
S4、将Fmoc-glu-acp-{cRGDyK}2的氨基脱保护，形成长链NH2-glu-acp-{cRGDyK}2；
S5、Fmoc-acp-OH与NH2-glu-acp-{cRGDyK}2进行反应后形成Fmoc-acp-glu-acp-{cRGDyK}2，对Fmoc-acp-glu-acp-{cRGDyK}2进行脱保护Fmoc基团形成NH2-acp-glu-acp-{cRGDyK}2；
S6、将NH2-acp-glu-acp-{cRGDyK}2与ZW800-COOH脱水缩合形成ZW800-glu-acp-{cRGDy}2；即ZW800-bi-cRGDyK，对其进行分离和提纯。
2.根据权利要求1所述的用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的制备方法，其特征在于，步骤S1包括以下步骤：
S11、合成氨基保护的Fmoc-acp-cRGDyK；
S12、采用自动多肽连续合成仪，称量2-CL树脂0.5g，放入反应器中；
S13、用二氯甲烷(DCM)浸泡10min后用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤2次，再用二氯甲烷洗涤一次，备用；
S14、使用固相法制备cRGDyK，留在柱子上，称取Fmoc-acp-OH 0.5g；用2mL DCM混合溶液溶解，加入0.4ml N,N-二异丙基乙胺(DIEA)摇匀；
S15、将溶解后的溶液加入装有树脂的反应器中，摇晃或氮气鼓泡反应90min，反应过程中由于DCM挥发，需要补加DCM；
S16、反应结束后，补加分析级甲醇1mL和2ml DCM，封闭反应20min后，DMF洗涤树脂三次后得到Fmoc-acp-cRGDyK(1)。
Figure FDA0002552891440000021
3.根据权利要求1所述的用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的制备方法，其特征在于，步骤S2包括以下步骤：
S21、脱Fmoc-acp-cRGDyK，使用20％哌啶+80％DMF去脱保护Fmoc基团；
S22、脱保护20min后用DMF洗涤5次，每次30s；
S23、取少量树脂加入两滴茚三酮在100℃检测显色；
S24、到固体柱上无颜色为止，合成的NH2-acp-cRGDyK(2)在柱子上保持。
Figure FDA0002552891440000022
4.根据权利要求1所述的用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的制备方法，其特征在于，步骤S3包括以下步骤：
S31、称取0.36mmol氨基酸Fmoc-glu-OH和0.36mmol EDC，用2mL DMF溶解加入0.4mLNHS；
S32、将反应液活化1min后加入反应器中反应1h；
S33、反应结束后，用DMF洗涤树脂4次后取少量树脂茚三酮检测无色即可，若有颜色则需要重复投料，在柱子上制备得到Fmoc-glu-acp-{cRGDyK}2(3)。
Figure FDA0002552891440000031
5.根据权利要求1所述的用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的制备方法，其特征在于，步骤S4包括以下步骤：
S41、用20％哌啶和80％DMF溶液去脱保护Fmoc基团，摇匀20分钟，沥干洗涤9次；
S42、每一个酰基化和去保护环节都被实时监测；
S43、取少量树脂加入两滴茚三酮在100℃检测显色；
S44、在重复脱保护和酰化反应后，从树脂中保留NH2-glu-acp-{cRGDyK}2(4)。
Figure FDA0002552891440000032
6.根据权利要求1所述的用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的制备方法，其特征在于，步骤S5包括以下步骤：
S51、称取氨基酸0.36mmol Fmoc-acp-OH和0.36mmol EDC，用2mL DMF溶解后加入0.4mLNHS；
S52、在反应器中反应1h后，用DMF洗涤树脂4次后取少量树脂茚三酮检测无色即可，若有颜色需要重复投料，得到Fmoc-acp-glu-acp-{cRGDyK}2；
S53、用20％哌啶和80％DMF溶液去脱保护Fmoc基团，摇匀20分钟，沥干洗涤9次，得到NH2-acp-glu-acp-{cRGDyK}2(5)。
Figure FDA0002552891440000041
7.根据权利要求1所述的用于诊断转移淋巴结的近红外荧光示踪剂的制
备方法，其特征在于，步骤S6包括以下步骤：
S61、用二甲基亚砜溶解染料0.12mmol；
S62、加入0.13mmol EDC，加入用1mL DMF溶解的0.2mL NHS，再加入0.12mmol DIEA；
S63、在避光以及室温条件下反应，反应结束用DMF洗涤3次，再加入甲醇洗涤3次后抽干准备切割；
S64、配置切割液，包括95ml的TFA、1ml水、2.5ml的TIS和2.5ml的EDT；
S65、将树脂粗品称重，放入50ml离心管进行切割反应，在室温下裂解2h；
S66、将切割液过滤得到存有粗品的滤液，加入温度为-20℃的冰乙醚，其中滤液与乙醚的比例为1：8，析出的多肽经过离心处理后得到粗品ZW800-bi-cRGDyK(6)；
Figure FDA0002552891440000051
S67、切割粗品ZW800-bi-cRGDyK并进行分离；
S68、将ZW800-bi-cRGDyK通过HPLC液相纯化得到纯品，再将纯品冻干成为粉末。
8.由权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的ZW800-bi-cRGDyK。
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