CN106967152B - 一种氟-18标记的化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种氟-18标记的化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于放射性药物及核医学技术领域，具体涉及一种氟‑18标记的化合物及其制备方法与应用。本发明中首次将18F‑AMBF3引入到CBT和半胱氨酸之间的炔丙基甘氨酸残基。当还原性生物硫醇与该探针反应时，可进行缩合反应，并进行原位纳米聚集(18F‑NP)，产生高密度的18F信号，可以对还原性生物硫醇进行高灵敏和特异性检测。

Description

一种氟-18标记的化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于放射性药物及核医学技术领域，具体涉及一种氟-18标记的化合物及其制备方法与应用。
背景技术
正电子发射断层扫描(PET)作为21世纪生物医学研究和临床诊断的尖端技术，被称为“活体生化显像”技术，可以从体外无创、定量、动态地观察人体内的生理、生化变化，洞察标记药物在正常人或病人体内的活动。与SPECT相比，PET具有分辨率高和可定量分析等明显优势，且已成为现今用于活体中分子靶标确认和临床疾病诊断重要的成像技术。
PET成像优越的灵敏度归因于使用了正电子核素(例如碳-11，氟-18，镓-68，铜-64等)标记的靶向分子探针。在众多适用于PET成像的β+发射核素中，18F是临床使用最广泛的核素。因为它具有诸多优异的性质，如：较低的正电子能量，半衰期短(t1/2＝109.8min)和来自医用回旋加速器的大量的按需生产。18F的短物理半衰期使其需要简单和快速的18F标记方法，这已成为放射化学家的长期挑战。现有技术中，一般的18F标记的化合物，是通过在干燥条件和高温条件下进行亲核反应获得，而对于多肽类的靶向分子，其标记通常需要更多的步骤。因此，一般的化合物放射标记通常是繁琐且耗时的，这给临床使用带来巨大的挑战。
近期，一些新的氟化反应，如18F-硅、18F-硼、以及18F-铝螯合物的发展为直接18F标记合成提供了新策略。其中，利用离子交换法进行18F-标记的两性离子烷基铵甲基三氟硼酸盐(AMBF3)是非常有应用前景的，因为其可以在温和的温度下在弱酸性水中获得具有高纯度和高比活性的示踪剂。并且这种标记方法便利简易，可以“试剂盒”化，特别适合大规模生产及临床应用。
在诊断疾病的分子成像中，检测异常氧化还原状态是非常必要的，因为它常常与许多临床疾病相关，包括癌症，肝损伤和阿尔茨海默病。当前，已有一些荧光、核磁共振成像(MRI)以及两种模态的融合探针相继得以开发，如含有二硫键的探针被内源性硫醇有效地切割，包括谷胱甘肽(GSH)和硫氧还蛋白(TRX)，其通常在肿瘤中水平升高。因此，它们在广泛范围的肿瘤的早期诊断中显示出有前途的应用。
尽管这方面的研究有了一定的发展，但用于检测活体中氧化还原状态的氧化还原可激活PET成像探针的开发从未有报道过。已有报道2-氰基苯并噻唑(CBT)和半胱氨酸的1,2-氨基硫醇基团在生理条件下的可发生缩合反应，并通过自组装形成纳米聚集体。这种策略结合小分子探针与纳米材料的优势，为发展新型PET成像剂进行疾病的早期诊断提供了一种新思路。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种18F标记的化合物，并进一步公开其用于制备PET成像探针的用途。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种18F标记的化合物，具有如下式(1)所示的结构：
本发明还公开了制备所述18F标记的化合物的标记前体，具有如下式(1-cold)所示的结构：
本发明还公开了一种制备所述标记前体的方法，包括如下步骤：
(1)在惰性气体保护下，以N-Boc-炔丙基甘氨酸和6-氨基-2-氰基苯并噻唑为反应原料，在N-甲基吗啉和氯甲酸异丁酯存在下，溶于有机溶剂中于0℃进行反应，并于反应结束后，以酸性试剂停止反应，得到化合物A；
(2)取化合物A溶于DCM溶液，并加入TFA于室温下反应，得到化合物B；
(3)在惰性气体保护下，以化合物B和半胱氨酸为反应原料，溶于THF溶液，在HBTU和DIPEA或三乙胺共同存在下，于室温下进行反应，得到化合物C；
(4)取化合物C溶于有机溶剂，并加入TFA于室温下反应，得到化合物D；
(5)在惰性气体保护下，取化合物D和三氟硼酸盐溶于DMF-H2O溶液中，在抗坏血酸钠和铜催化剂存在下，于45℃下加热反应，并将反应液通过半制备型HPLC分离纯化，得到化合物1-Cold；
所述步骤(1)中，还包括提纯所述化合物A的步骤，具体包括：以乙酸乙酯和H2O萃取所得反应液，剩余有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤，并用无水Na2SO4干燥；取粗产品过层析柱分离，得到化合物A。
所述步骤(1)中，所述有机溶剂为THF或DMF溶剂；所述酸液为稀HCl、稀硫酸或三氟乙酸等酸性试剂；
所述步骤(2)中，还包括提纯所述化合物B的步骤，具体包括：取反应液进行减压蒸馏，并加入乙醚沉淀，取粗产品通过半制备型HPLC制备得到化合物B。
所述步骤(3)中，还包括提纯所述化合物C的步骤，具体包括：取反应液旋干溶剂，将粗产品过柱层析分离，得到化合物C。
所述步骤(4)中，还包括提纯所述化合物D的步骤，具体包括：取反应液进行减压蒸馏，并加入乙醚沉淀，取粗产品通过半制备型HPLC制备得到化合物D。
所述步骤(4)中，所述有机溶剂为DCM、甲醇或乙腈溶液。
所述步骤(5)中，所述铜催化剂为CuSO4·5H2O、Cu(I)Cl或者六氟磷酸四(乙腈)铜(I)。
本发明还公开了一种制备所述18F标记的化合物的方法，取化合物1-cold与无水K18F，在加热条件下，进行标记反应，制得式(1)所述的18F标记的化合物。
本发明还公开了一种PET成像探针，为所述的18F标记的化合物。
本发明还公开了所述的PET成像探针在检测还原性生物硫醇显像领域的应用。
本发明中首次将18F-AMBF3引入到CBT和半胱氨酸之间的炔丙基甘氨酸残基。当还原性生物硫醇与该探针反应时，可进行缩合反应，并进行原位纳米聚集(18F-NP)，产生高密度的18F信号，可以对还原性生物硫醇进行高灵敏和特异性检测。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为化合物A的HPLC检测谱图；
图2为化合物A的ESI-MS谱图；
图3为化合物B的HPLC检测谱图；
图4为化合物B的ESI-MS谱图；
图5为化合物B的1H NMR检测谱图；
图6为化合物B的13C NMR检测谱图；
图7为化合物C的HPLC检测谱图；
图8为化合物C的ESI-MS谱图；
图9为化合物C的1H NMR检测谱图；
图10为化合物C的13C NMR检测谱图；
图11为化合物D的HPLC检测谱图；
图12为化合物D的ESI-MS谱图；
图13为化合物D的1H NMR检测谱图；
图14为化合物D的13C NMR检测谱图；
图15为化合物1-cold的HPLC检测谱图；
图16为化合物1-cold的ESI-MS谱图；
图17为化合物1-cold的1H NMR检测谱图；
图18为化合物1-cold的13C NMR检测谱图；
图19为化合物1-cold的19F NMR检测谱图；
图20为实施例2中反应液纯化前后化合物情况，其中，图(a)为纯化前化合物1的含量，图中(b)为纯化后化合物1的含量，图中(c)为化合物1-cold的含量；
图21为放射性化合物的放射化学纯度检测结果，其中，图(a)为在PBS中的放射化学纯度，图(b)为在人血清中的放射化学纯度；
图22为放射性反应条件优化曲线，其中，图(a)为不同温度的标记率曲线，图(b)为不同标记时间的标记率曲线；
图23为不同pH值下化合物1-cold的成环测定结果；
图24为化合物1-cold在还原剂中的HPLC检测结果；
图25为化合物1-cold和TCEP在pH3.0条件下的ESI-MS检测结果；
图26为化合物1-cold和TCEP在pH7.4条件下的ESI-MS检测结果；
图27为化合物1-cold纳米自组装的纳米表征特征，其中，图(a)为DLS分析谱图，图(b)为探针1-cold的纳米自组装TEM图，图(c)和(d)为不同视角下分子二聚体的结构；
图28为不同浓度和培养时间下的细胞毒性研究结果；
图29为不同温度下化合物1-cold在哒嗪-盐酸缓冲液(pH＝2.0-2.5)中的HPLC检测结果；
图30为不同培养时间下探针1在U87MG和HCT116细胞中的吸收情况；
图31为裸鼠中GSH的现象情况，其中，图(a)为小鼠皮下注射化合物1(左)和同时注射化合物1和GSH(10毫米，右)的PET成像情况，箭头所示注射部位，图(b)为按照(a)中量化注射的辐射强度；图(c)为小鼠皮下注射化合物1(左)和同时注射化合物1和GSH(10毫米，右)的切伦科夫发光成像结果；图(d)按照(c)中量化注射的荧光信号强度，误差标准差(n＝3)；
图32肿瘤异种移植中小鼠的PET成像情况，其中，图(a)为右前侧形成U87MG肿瘤，图(b)为小鼠皮下注射化合物1(103μCi，100μL)的PET成像情况，图(c)为肿瘤和肌肉的吸收情况；
图33为10-15min下，U87MG肿瘤单独用化合物1以及化合物1和NEM的裸鼠PET成像情况。
具体实施方式
实施例1标记前体的制备
本实施例所述标记前体具有如下式(1-cold)所示的结构：
本实施例所述标记前体的合成路线如下：
本实施例所述标记前体按照如下步骤合成制得：
(1)化合物A的合成：在氮气保护下，向含有N-Boc-炔丙基甘氨酸(768mg，3.6mmol)的THF(3mL)溶液中加入N-甲基吗啉(660μL，6.0mmol)和氯甲酸异丁酯(390μL，3.0mmol)，于0℃温度下搅拌2h，至溶液呈米黄色；反应2h后，在0℃下，加入6-氨基-2-氰基苯并噻唑(350mg，2.0mmol)的THF(5mL)溶液，反应液在RT下搅拌反应12h。12h后，向溶液中加入1MHCl(3mL)，使反应停止，此时溶液呈深红色。将含有化合物A的反应液用乙酸乙酯和H2O萃取，留下的有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤3次，随后用无水Na2SO4干燥，并旋干；将粗产品过层析柱(正己烷：乙酸乙酯＝1:1)，即得到化合物A(676mg，91％)。
测定其ESI-MS：C18H18N4O3SNa+([M+Na]+)，计算值：393.10；理论值：393.13。纯化后化合物A的HPLC检测谱图和ESI-MS谱图分别见图1和2。
(2)化合物B的合成：将化合物A(670mg)加入反应瓶中，加入DCM(6mL)溶解，再加入TFA(6mL)，于室温下反应1h。反应结束后，将反应液减压蒸馏，并加入乙醚沉淀，粗产品通过半制备HPLC制备得到化合物B(461mg，94％)。所述HPLC的条件参数见下表1。
表1化合物B纯化的HPLC条件参数
检测化合物B数据如下：1H NMR(400MHz,d6-DMSO),δ(ppm):11.06(s,1H),8.73(s,1H),8.52(s,1H),8.25(d,J＝8.00Hz,1H),7.79(d,J＝8.00Hz,1H),4.20(t,J＝8.00Hz,1H),3.17(s,1H),2.88(m,2H)；13C NMR(101MHz,d6-DMSO),δ(ppm):166.9,148.6,138.8,137.2,136.3,125.5,121.4,114.0,112.6,77.8,76.2,52.1,21.5；ESI-MS：C13H11N4OS+([M+H]+)，计算值：271.07；理论值：271.14。
纯化后化合物B的HPLC检测谱图、ESI-MS谱图、1H NMR谱图、13C NMR谱图分别见图3-6。
(3)化合物C的合成：在氮气保护下，取化合物B(368mg，1.4mmol)和半胱氨酸(463mg，1.5mmol)加入反应瓶中，加入THF(5mL)溶解，再加入HBTU(594mg)、DIPEA(562μL)，于室温下反应2h。反应结束后，旋干溶剂，将粗产品过柱层析分离，得到化合物C(457mg，60％)。
检测化合物C数据如下：1H NMR(400MHz,d6-DMSO),δ(ppm):10.53(s,1H),8.73(s,1H),8.44(s,1H),8.22(d,J＝8.00Hz,1H),7.81(d,J＝8.00Hz,1H),7.17(s,1H),4.65(s,1H),4.27(s,1H),3.07(s,1H),2.93(m,2H),2.68(m,2H),1.38(s,9H),1.30(s,9H)；13C NMR(100MHz,d6-DMSO),δ(ppm)170.9,169.5,155.8,148.3,139.4,137.1,135.8,125.3,121.4,114.0,112.2,80.3,79.0,73.9,54.4,52.9,48.2,41.8,30.0,28.6,22.2；ESI-MS：C25H31N5O4S3Na+([M+Na]+)，计算值：584.14；理论值：584.15。
纯化后化合物C的HPLC检测谱图、ESI-MS谱图、1H NMR谱图、13C NMR谱图分别见图7-10。
(4)化合物D的合成：将化合物C(280mg，0.5mmol)加入反应瓶中，加入DCM(3mL)溶解，再加入TFA(3mL)，于室温下反应1h。反应结束后，取反应液减压蒸馏，并加入乙醚沉淀，将粗产品通过半制备型HPLC制备得到化合物D(230mg，94％)。所述HPLC的条件参数见下表2。
表2化合物D纯化的HPLC条件参数
检测化合物D数据如下：1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ(ppm)10.85(s,1H),9.26(s,1H),8.73(s,1H),8.43(d,J＝8.00Hz,2H),8.24(d,J＝8.00Hz,1H),7.84(d,J＝8.00Hz,1H),4.77(m,1H),4.16(t,J＝8.00Hz,1H),3.18(m,2H),2.96(s,1H),2.72(m,2H),1.34(s,9H)；13C NMR(101MHz,d6-DMSO),δ(ppm):169.2,167.4,148.4,139.4,137.1,135.9,125.4,121.4,114.0,112.2,79.9,74.2,53.1,52.0,48.6,41.8,29.9,22.5；ESI-MS：C20H24N5O2S3 +([M+H]+)462.11，计算值：462.11；理论值：462.25。
纯化后化合物D的HPLC检测谱图、ESI-MS谱图、1H NMR谱图、13C NMR谱图分别见图11-14。
(5)化合物1-Cold的合成：在氮气保护下，将化合物D(210mg，0.461mmol)，三氟硼酸盐(135mg，0.692mmol)，溶于3mL DMF：H2O(1:1，v/v)溶剂中，将抗坏血酸钠(182mg，0.922mmol)、CuSO4·5H2O(230mg，0.922mmol)依次加入上述溶液中，于45℃下加热反应30min。停止反应后，通过半制备型HPLC分离纯化，得到化合物1-Cold(137mg，72％)。所述HPLC的条件参数见下表3。
表3化合物1-cold纯化的HPLC条件参数
检测化合物1-cold数据如下：1H NMR(400MHz,CD3OD),δ(ppm):8.48(s,1H),8.00(d,J＝8.00Hz,1H),7.89(d,1H),7.59(d,J＝8.00Hz,1H),4.11(t,J＝8.00Hz,1H),3.71(t,J＝8.00Hz,2H),3.27(m,1H),3.22(m,2H),3.13(m,2H),3.02(t,J＝8.00Hz,2H),2.98(s,6H),2.40(d,J＝4.00Hz,2H),1.28(s,9H)；13C NMR(101MHz,CD3OD),δ(ppm):169.9,167.4,148.6,138.8,138.7,136.6,135.7,124.6,121.2,121.1,112.7,111.9,63.3,54.4,53.9,52.6,48.3,47.0,44.1,40.7,28.8,27.6；19F NMR(386MHz,CD3OD),δ(ppm)76.7；ESI-MS：C25H36BF3N9O2S3 +([M+H]+)，计算值：658.22；理论值：658.23。
纯化后化合物1-cold的HPLC检测谱图、ESI-MS谱图、1H NMR谱图、13C NMR谱图、19FNMR谱图分别见图15-19。
实施例2标记前体的制备
本实施例所述标记前体按照如下步骤合成制得：
(1)化合物A的合成：在氮气保护下，向含有N-Boc-炔丙基甘氨酸(768mg，3.6mmol)的DMF(3mL)溶液中加入N-甲基吗啉(660μL，6.0mmol)和氯甲酸异丁酯(390μL，3.0mmol)，于0℃温度下搅拌2h，至溶液呈米黄色；反应2h后，在0℃下，加入6-氨基-2-氰基苯并噻唑(350mg，2.0mmol)的THF(5mL)溶液，反应液在RT下搅拌反应12h。12h后，向溶液中加入三氟乙酸试剂使反应停止，此时溶液呈深红色。将含有化合物A的反应液用乙酸乙酯和H2O萃取，留下的有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤3次，随后用无水Na2SO4干燥，并旋干；将粗产品过层析柱(正己烷：乙酸乙酯＝1:1)，即得到化合物A。
(2)化合物B的合成：将化合物A加入反应瓶中，加入DCM(6mL)溶解，再加入TFA(6mL)，于室温下反应1h。反应结束后，将反应液减压蒸馏，并加入乙醚沉淀，粗产品通过半制备HPLC制备得到化合物B。
(3)化合物C的合成：在氮气保护下，取化合物B和半胱氨酸(463mg，1.5mmol)加入反应瓶中，加入THF(5mL)溶解，再加入HBTU(594mg)、三乙胺(562μL)，于室温下反应2h。反应结束后，旋干溶剂，将粗产品过柱层析分离，得到化合物C(457mg，60％)。
(4)化合物D的合成：将化合物C(280mg，0.5mmol)加入反应瓶中，加入甲醇(3mL)溶解，再加入TFA(3mL)，于室温下反应1h。反应结束后，取反应液减压蒸馏，并加入乙醚沉淀，将粗产品通过半制备型HPLC制备得到化合物D。
(5)化合物1-Cold的合成：在氮气保护下，将化合物D(210mg，0.461mmol)，三氟硼酸盐(135mg，0.692mmol)，溶于3mL DMF：H2O(1:1，v/v)溶剂中，将抗坏血酸钠(182mg，0.922mmol)、Cu(I)Cl(0.922mmol)依次加入上述溶液中，于45℃下加热反应30min。停止反应后，通过半制备型HPLC分离纯化，得到化合物1-Cold。
经检测，所得化合物1-cold的结构正确。
实施例3 18F标记的化合物的制备
本实施例所述18F标记的化合物具有如下式(1)所示的结构：
本实施例所述18F标记的化合物的合成路线如下：
本实施例所述18F标记的化合物按照如下步骤合成制得：
(1)[18F]氟离子合成：放射性标记实验中，无载体溶液的[18F]氟离子可以直接获得使用，或经阴离子交换柱(QMA)[18F]氟离子被吸附，用300-700μL的PBS的缓冲液将[18F]氟离子从QMA柱上洗脱；
(2)将100nmol实施例1中制得的所述前体1-cold用20μL DMF溶解在反应管中，并加入200mCi[18F]，在80℃下加热30min，将反应液加入20mL去离子水中稀释，通过C18柱(SepPak plus C-18)将杂质去除，用去离子水(10mL)洗涤三次，然后用0.5mL将标记产物淋洗到西林瓶中，再用盐水稀释以备使用，取少量溶液稀释，通过放射性高效液相检测纯化情况。附图20给出了纯化前后溶液中的化合物情况。
将制得的放射性化合物1(100μCi)溶解在盐水(100μL)中，测定其在PBS(0.1M；pH＝7；1mL)和人血清(1mL)中的稳定性。取各溶液在37℃下培养，取样品(50μL)通过放射性HPLC测定放射化学纯度(RCP)，检测结果见附图21。可见，本发明所述放射性化合物1在PBS和胎牛血清中在37℃下4小时内非常稳定，这有利于运输和进一步的生物学研究。
实施例4
在实施例3基础上，对放射性实验的条件进行优化研究，包括反应温度和加热时间。将冻干的前体加入到聚丙烯管中，然后仅需要加入用缓冲液洗脱的[F18]-氟化物阴离子。然后，反应混合物通过C-18光柱纯化，并用含<10％EtOH的盐水配制用于进一步使用。为了测定温度对RLY(％)的影响，分别测定30，40，50，60，70，80，90，100℃下的反应情况；为了测定反应时间的影响，分别在80℃下测定0-120min的反应情况。各反应条件下的放射性标记结果见附图22。
可见，当孵育温度和孵育时间分别为80℃和20分钟时，可以取得令人满意的RLY。化合物1的F18标记的总方法小于30分钟，并且获得了具有高比活性(1.2Ci/μmol)和高纯度(>99％)的良好产率(>120mCi，60％)。这些结果都表明，所需的F18-放射性标记方法已经可以应用于探针1的制备，其中可以避免干燥F18-氟离子和HPLC纯化，其可以实施为试剂盒样方式，其对于大规模生产和临床应用更方便。
实验例
本发明下述实验例中分析型HPLC的条件见下表4。
表4所有化合物的分析型HPLC条件
实验例1化合物1-cold的性质
1.1、化合物1-Cold中二硫键还原使得分子间成环
为了确定是否化合物1-Cold中二硫键还原使得分子间成环，将化合物1-Cold(100μL，3.3mM)用柠檬酸缓冲液(pH＝3.0)溶解，加入TCEP·HCl(66μL，50mM)。将溶液混合在室温下反应1h，反应1h后，通过HPLC分析检测。继续反应后，用氢氧化钠将反应液的pH值调节到7.4，每个实验重复三次，结果见附图23。
将化合物1-Cold(100μL，3.3mM)用磷酸缓冲液(10mM PB，pH＝7.4)溶解，分别加入GSH(66μL，50mM)和细胞裂解液反应。4h后，反应液通过HPLC和LC-MS进行检测，结果见图24-26。
可以看出1-Cold溶液在TCEP中，pH＝3是澄清的，结果可以通过HPLC和LC-MS得到。之后，将溶液pH值调节到7.4，溶液变得浑浊，这是因为得到成环产物。同样，在GSH和细胞裂解液中(pH＝7.4)也观察到相同的现象。
在酸性条件下将1-Cold(100μL，3.3mM)与三(2-羧基乙基)膦(TCEP)孵育后，溶液变澄清。然而，当将pH调节至7.4时，该溶液立即变混浊。通过高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱(LC-MS)检查后，发现1-Cold中的二硫键在酸性条件下被切割，并且在溶液的pH变化时，转化成其二聚产物。在生理条件(pH＝7.4)下，当1-Cold在GSH或细胞裂解物中孵育4小时时，还观察到环化产物的主要部分，表明探针还特异性地响应于内源性生物硫醇。这些结果表明，以此制备探针可以在还原环境下还原，产生环状二聚体，为特异性检测生物硫醇状态提供了潜在的应用。
1.2、纳米自组装特性
如图27中显示的化合物1-cold纳米自组装的纳米表征特征，动态光散射(DLS)测量表明纳米颗粒具有窄的分布和140nm的平均直径。直接将上述分散体用于透射电子显微镜(TEM)观察，发现纳米颗粒具有120nm的平均直径。根据二聚体的两亲性结构的理论计算，它们以与分子间π-π堆积相互作用相同的顺序排列。二聚体中的荧光素面对面堆积，层间距为表明分子间相互作用非常强，促进自组装成纳米颗粒。这些结果表明，探针可以在生理条件下在还原环境下被触发成纳米颗粒。这将帮助放射性探针集中癌细胞内的放射性，因为癌细胞内GSH浓度(1-10mM)比在细胞外的正常组织中高得多。
1.3、化合物1-Cold在细胞中的生物兼容性
通过MTT实验测定化合物1-Cold在人的恶性胶质瘤细胞U87MG中的细胞毒性。在96孔板中每孔铺5×103细胞，细胞在37℃下含5％的CO2的培养箱中培养12h。1-Cold用0.1％的DMSO(二甲基亚砜)溶解，再用DMEM稀释成浓度分别为12.5、25、50、100μM的溶液。细胞与不同浓度的探针1-Cold在37℃，5％的CO2中分别培养3、6、12、24h。培养结束后，用20μL的MTT(5mg/mL)处理细胞后再培养4h。在MTT实验中，去除培养基后，向每孔中加入150μL的DMSO。OD(光密度值)用ELISA仪器在470nm下读取。所有的测试重复6次并且有至少三个独立的实验，细胞生存能力(％)＝(实验组的平均OD值/对照组的平均OD值)×100。检测结果见附图28所示。
通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)2,5-二苯基-四唑溴化物(MTT)测定来评价1-Cold在U87MG癌细胞中的生物相容性。分别在25、50和100μM的1-Cold孵育24小时后，分别有97％、98％和92％的U87MG细胞存活。这证明1-Cold在24小时内的细胞毒性是可忽略的。
1.4、前体(1-Cold)在缓冲液(pH＝2.0-2.5)中的稳定性实验
测定前体(1-Cold)在哒嗪-盐酸缓冲液(pH＝2.0-2.5)中不同温度下的稳定性实验。100nmol的1-Cold溶解在500μL的哒嗪-盐酸缓冲液中，分别在50、60、70、80、90、100℃下反应30min。取少量样品用于HPLC分析(UV254nm)，检测结果见附图29。发现前体(1-Cold)甚至在100℃下在哒嗪-HCl缓冲液中非常稳定，表明放射性标记可在宽的操作温度范围内进行。
实验例2放射性化合物1的性质
2.1、脂水分配系数(logP)的测定
测定化合物1在正辛醇/水中的脂水分配系数。将PBS缓冲液与等体积的正辛醇充分振荡，使两相相互饱和，在室温下静置一天以上，用分液漏斗将两相分离。取1mL正辛醇、1mL PBS缓冲液、标记产物混合，用涡旋混合器振荡5min，充分混匀。4000转/min，离心5min，在有机相和水相中分别平行取3个样(100μL)于放敏管中，用γ计数仪测定其放射性活度，每个样品测定3次。计算脂水分配系数的logP值。log P＝log(Co/Cw)，Co和Cw分别是探针在正辛醇和水中的放射性计量。结果至少重复三次，用±SD表示。确定的所述立体内酯的辛醇/水分配系数(logP)为0.37±0.04，表明其是亲脂性的并且可能具有有利的细胞通透性。
2.2、细胞摄取实验
人的恶性胶质瘤细胞U87MG和人的结肠癌细胞HCT116用DMEM，含10％(v/v)的胎牛血清(Biological Industries，Kibbutz Beit Haemek,Israel)在37℃下含5％的CO2中培养。细胞摄取实验用U87MG和HCT116在6孔板(5×105细胞/孔)中培养过夜，细胞用PBS洗三次，加入含1μCi化合物1的无太牛血清，分别在37℃下培养30、60、210、240min。在每个时间点，都要去除培养基，再用冷PBS洗涤两次，再用0.1M的氢氧化钠裂解。收集裂解液和PBS，放射性剂量用γ计数仪测定，细胞摄取率用％AD(总加入计量的百分数)表示，标准化为5×105细胞。然后，通过将探针1与人胶质母细胞瘤细胞U87MG和人结肠直肠癌细胞HCT116一起温育，进一步研究立体内标物的细胞通透性，并通过用γ-计数器计数放射性来定量细胞摄取。检测结果见附图30。
上述结果可见，化合物1的细胞摄取快速接近在U87MG中的最大值的2.83％和在30分钟内的HCT116的最大值的2.31％。这些结果表明，探针1可以快速有效地靶向癌细胞U87MG和HCT116，前者具有相对较高的摄取。
2.3PET成像和切伦科夫发光成像(CLI)
肿瘤通过在每只裸鼠的右肩皮下注射5×106U87MG细胞，然后大约长3到4周，肿瘤直径大约为0.5-1.0cm，可以用于成像实验。
PET成像使用Inveon Dedicated PET(Siemens)仪器进行实验。在所有的实验中，老鼠均使用异氟烷麻醉(2％的异氟烷在流速为2L/min的氧气中)。对于老鼠体内谷胱甘肽的成像，～100μCi探针1和～100μCi探针1含有10mM的谷胱甘肽在100μL生理盐水中，直接注射到老鼠的右后腿。对于肿瘤鼠成像，探针1(～100μCi探针1在100μL生理盐水中)通过静脉注射。对于阻断实验，1mg NEM(100μL)预先10min注射。PET成像需要收集60min的数据。PET数据分成12帧，每一帧用microPET Manager(version 6869，Siemens)通过OSEM3D/MAPalgorithm重新构建。重新构建的像素尺寸为0.78×0.78×0.80mm，在一个128×128×159图像矩阵中。所有PET图像纠正衰变但不衰减。图像分析使用ASIPRO(Siemens)软件。为了描述示踪剂在肿瘤内的累积，感兴趣区域(ROI)分析通过肉眼观察肿瘤尺寸，他们出现在皮肤下的肿块以确定肿瘤区域内的放射性。
取化合物1(～100μCi，溶解在100μL生理盐水中)通过肌肉注射到老鼠的后腿上。注射后，小鼠通过异氟烷(2％)麻醉。切伦科夫发光用小动物荧光成像光谱测定。CLI信号表示单位每球面度光子/厘米2/秒(P cm-2s-1sr-1)。
在人工生物硫醇小鼠中研究了GSH在体内诱导的探针1。将与或不与GSH(10mM)混合的探针1(106μCi，100μL)的溶液分别立即皮下注射到两个不同部位上的同一健康裸鼠中，然后使用PET扫描仪。结果见附图31-33所示。
结果显示，小鼠中放射性在全身迅速代谢。含有探针1和GSH的注射部位显示出高且持久的放射性，而另一个仅注射了探针1部位的放射性降低较快。对于注射1的位点和仅注射1(左)的位点GSH(右侧)(分别在10分钟2.16倍和30分钟3.36倍)观察到放射性强度的增加比率。肝脏是合成和保留GSH的最重要的器官，GSH的浓度在正常肝脏中高达7mM。在整个成像期间，它也是高的和持续的摄取。然而，当肝脏受伤时，GSH水平将大大降低。因此，肝脏中生物硫醇水平的非侵入性成像对肝脏疾病和肝脏毒性的检测至关重要。在肝脏和具有高的人工补充的GSH(右腿)的位置中的高放射性表明探针1可以被生物硫醇还原，导致纳米粒子装配用于体内持久信号。还值得注意的是，可以用cherenkov荧光图像(CLI)观察到类似的现象。然而，即使使用近似的注射剂量，CLI中的信号与PET中的信号相比也相对较弱。
通过基于可激活的探针1的PET图像进一步检测具有皮下U87MG肿瘤的裸鼠中的内源性生物硫醇。从体内18F放射性的生物分布观察，观察到肝，肾和肿瘤显示出高水平的绝对摄取，显示示踪剂的主要肾清除率。肌肉中的低放射性在PET成像中承诺最小的背景信号。肿瘤中18F放射性的每克组织的注射剂量的百分比(％ID/g)在15分钟内达到最大，值为4.93±0.76％ID/g，肿瘤与肌肉的摄取比为3.1。肿瘤的18F放射性在45-50分钟逐渐降低至2.95±0.51％ID/g。这些结果表明放射性探针1在具有过表达的GSH水平的U87MG肿瘤中具有良好的摄取并触发用于持续PET成像肿瘤信号的纳米聚集。当肿瘤中的生物硫醇水平被包含硫醇清除剂N-乙基马来酰亚胺(NEM)抑制时，在用10mM NEM预处理时，PET信号从4.93显着降低至2.01％ID/g。这证实了探针1中的二硫化物由肿瘤中的内源性生物硫醇触发以原位聚集18F放射性的信号。因此，探针1可以用作方便和精确检测活体中生物硫醇水平的有利的PET成像剂。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种18F标记的化合物，其特征在于，具有如下式(1)所示的结构：
2.权利要求1所述18F标记的化合物的标记前体，其特征在于，具有如下式(1-cold)所示的结构：
3.一种制备权利要求2所述标记前体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在惰性气体保护下，以N-Boc-炔丙基甘氨酸和6-氨基-2-氰基苯并噻唑为反应原料，在N-甲基吗啉和氯甲酸异丁酯存在下，溶于有机溶剂中于0℃进行反应，并于反应结束后，以酸性试剂停止反应，得到化合物A；
(2)取化合物A溶于DCM溶液，并加入TFA于室温下反应，得到化合物B；
(3)在惰性气体保护下，以化合物B和半胱氨酸为反应原料，溶于THF溶液，在HBTU和DIPEA或三乙胺共同存在下，于室温下进行反应，得到化合物C；
(4)取化合物C溶于有机溶剂，并加入TFA于室温下反应，得到化合物D；
(5)在惰性气体保护下，取化合物D和三氟硼酸盐溶于DMF-H2O溶液中，在抗坏血酸钠和铜催化剂存在下，于45℃下加热反应，并将反应液通过半制备型HPLC分离纯化，得到化合物1-Cold；
4.根据权利要求3所述的制备所述标记前体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，还包括提纯所述化合物A的步骤，具体包括：以乙酸乙酯和H2O萃取所得反应液，剩余有机相用饱和NaHCO3溶液洗涤，并用无水Na2SO4干燥；取粗产品过层析柱分离，得到化合物A。
5.根据权利要求4所述的制备所述标记前体的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，还包括提纯所述化合物B的步骤，具体包括：取反应液进行减压蒸馏，并加入乙醚沉淀，取粗产品通过半制备型HPLC制备得到化合物B。
6.根据权利要求5所述的制备所述标记前体的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，还包括提纯所述化合物C的步骤，具体包括：取反应液旋干溶剂，将粗产品过柱层析分离，得到化合物C。
7.根据权利要求6所述的制备所述标记前体的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，还包括提纯所述化合物D的步骤，具体包括：取反应液进行减压蒸馏，并加入乙醚沉淀，取粗产品通过半制备型HPLC制备得到化合物D。
8.一种制备权利要求1所述18F标记的化合物的方法，其特征在于，取权利要求2所述的化合物1-cold与无水K18F，在加热条件下，进行标记反应，制得权利要求1所述的式(1)所示的18F标记的化合物。
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