CN101555280A - 氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氟－18标记的新乳糖白蛋白化合物及其制备方法和应用，该化合物的化学表达式为18FB－NGA。以放射性N－琥珀酰亚胺4－[18F]氟苯甲酸酯([18F]SFB)与新乳糖白蛋白(NGA)在碱性条件下反应制备得到所述的放射性氟－18标记的新乳糖白蛋白化合物；该化合物的化学稳定性及生物性能好、初始摄取值与化学纯度高、制备简单并且使用成本低，作为一种新型的肝脏受体PET显像剂应用在放射性药物化学和临床核医学技术领域中。
Description
所属技术领域
本发明涉及到氟-18标记的放射性药物化学和临床核医学技术领域，特别是涉及到一种氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物及其制备方法和应用。
背景技术
ASGP受体(Asialoglycoprotein receptor，ASGP-R)是去唾液酸糖白蛋白受体的简写，存在于哺乳动物肝细胞膜上，是介导肝脏清除血液中去唾液酸糖蛋白(Asialoglycoprotein，ASGP)的专一位点。除了白蛋白之外几乎所有血浆蛋白都为糖蛋白，在被肝脏合成并释放到血液时，其糖链末端为唾液酸。唾液酸与其它糖基形成较弱的连接，在血液中并不稳定，很易被清除。唾液酸部分被清除，标志着这个糖蛋白寿命的结束。大部分血浆蛋白中半乳糖结构都位于末端的第二位上，因此当末端的糖被酶解后，以半乳糖结尾的糖蛋白就可以作为ASGP受体的作用底物。去唾液酸糖蛋白一旦在细胞表面与ASGP受体结合，所形成的配体-受体复合物迅速内化，5分钟左右进入前溶酶体囊泡后由于pH的作用而解离，受体再循环到质膜，大部分配体经溶酶体酶的作用而被分解代谢，小部分配体则绕过溶酶体的降解而排入胆汁，或穿过细胞膜返回细胞表面仍与受体相结合。这个过程可以维持血浆糖蛋白的动态平衡。ASGP受体可以在一定程度上反映出有效肝细胞功能，在肝炎、肝硬化或肝癌等肝损伤性疾病发生时，其数量和活性均受到损害。肝炎疾病在世界范围内都是一种高发疾病，特别是肝硬化继发肝癌患者众多，严重影响人类健康与生活质量，其重要性现在已经引起广泛关注突现。1984年Vera等通过化学合成方法将半乳糖结构与人血清白蛋白偶联得到新乳糖白蛋白(galactosyl-neoglycoalbumin，NGA)，并经99mTc标记后进行肝显像研究。1986年Kubota等研制了一种99mTc标记GSA(99mTc-diethylenetriamine pentaaceticacid-galactosyl-human serum albumin)，通过增加双功能连接剂DTPA(二乙烯三胺五乙酸)结构，简化了标记条件，减少了非特异性结合。日本已经利用ASGPR显像剂为核医学肝脏SPECT显像建立了三维肝脏模型，该显像技术可以真实、数字化地反映肝脏功能，这样既可以对肝硬化患者术前肝功能进行正确的评估，帮助预测手术风险、制定治疗方案，降低肝脏手术的围手术期死亡率。
正电子发射型计算机断层显像(PET)是核医学领域先进的临床检查影像技术。与SPECT相比具有更高的分辨率和灵敏度，特别是PET与CT结合在一起，提高了定位的准确性。1985年Vera等报道了用68Ga标记的NGA可用于PET显像，其在小鼠中的生物分布与99mTc-GSA相似。氟-18是核医学最常用的PET核素，通过加速器生产，其具有优良的物理性能和合适的半衰期(110min)。正电子标记的ASGP受体显像剂对于肝脏显像，特别是对于建立三维肝脏数字模型有重要的意义。目前深入研究开发用于肝受体显像的PET显像剂，特别是氟-18标记的ASGP受体显像剂是本技术领域需要解决的重要课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有化学稳定性强、生物性能好、初始摄取值及化学纯度高、制备简单及使用成本低，应用在肝脏受体正电子发射型计算机断层显像领域的氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物。
本发明的另一目的是提供一种所述配合物作为肝脏受体显像剂的制备方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物(18FB-NGA)，其结构通式为：
式中：18FB-NGA通过对氟苯甲酸与新乳糖白蛋白分子链的赖氨酸残基连接得到。
氟-18标记的新乳糖白蛋白的制备方法如下：
以放射性N-琥珀酰亚胺4-[18F]氟苯甲酸酯([18F]SFB)与新乳糖白蛋白(NGA)在碱性条件下反应制备得到所述的放射性氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物，其制备步骤为：
a.在K2CO3、K2.2.2和18F-F-与4-三甲胺基苯甲酸乙酯三氟甲基磺酸盐在加热条件下反应20分钟后，用NaOH水解后，加入HCl得到4-[18F]氟苯甲酸；
b.4-[18F]氟苯甲酸与O-(N-琥珀酰亚胺)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯在加热条件下反应5分钟，并用醋酸酸化后得到N-琥珀酰亚胺4-[18F]氟苯甲酸酯([18F]SFB)；
c.将新乳糖白蛋白NGA溶于缓冲液中加入步骤b制备的N-琥珀酰亚胺4-[18F]氟苯甲酸酯中，混匀后在10～40℃条件下反应10～60min；
d.将步骤c所得溶液通过凝胶色谱进行纯化。
上述步骤a中所述的反应温度为90～140℃。
上述步骤b中所述的反应温度为80～100℃。
上述步骤c中所述的缓冲液为：0.1mol/LpH8.6硼酸缓冲液，用量为0.1mL～1mL；
上述步骤d中所述的凝胶色谱柱选用填料为葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)的凝胶柱(HiTrap Desalting凝胶柱)；
上述制备方法中所述新乳糖白蛋白的用量为1mg～5mg。
本发明以放射性N-琥珀酰亚胺4-[18F]氟苯甲酸酯([18F]SFB)与新乳糖白蛋白(NGA)在碱性条件下反应制备得到所述的放射性氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物(18FB-NGA)，是一种新型的肝细胞去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)显像剂，通过残余的赖氨酸氨基，在NGA分子中放射性的氟-18，可用于正电子发射型计算机断层显像(PET)。18FB-NGA化学稳定性及生物性能好、初始摄取值及靶与化学纯度高。与99mTc-GSA相比，其有相似的生物性能和更高的空间分辨率，可以成为一种新型的肝脏显像剂。
检测表明：18FB-NGA通过层析及RP-HPLC鉴定，其放射化学纯度大于99％，而在室温下放置4小时后放化纯度无变化，有较好的稳定性。衰变校正后的放化产率为8～10％。
实验表明，18FB-NGA的基本的性能如下：
1.18FB-NGA在正常小鼠体内生物分布
取10只正常昆明小白鼠，于尾静脉注射0.1mL 18FB-NGA(约0.185MBq，含2μg NGA)。于注射后5和30min后断头处死。取出心、肝、肺、肾、肌肉、骨、血等组织，称量并在γ计数器中测其放射性计数。
18FB-NGA在正常小鼠中的生物分布见表1；
表1.18FB-NGA在正常小鼠体内生物分布数据(％ID/g±sd，n＝5)及与99mTc-GSA(％ID/g±sd，n＝3)生物性能的对比
在正常小鼠中的生物分布结果显示，18FB-NGA在肝脏中有较高的初始摄取，注射5min后，在肝脏中有(79.18±7.17)％ID/g的摄取值。在心、肺、脾等脏器的放射性浓集较低，与99mTc-GSA相似。同99mTc-GSA相比，腹腔中的肾脏、脾脏和肠等器官的摄取值明显降低，大大降低对肝脏的影响。另外，其它非靶器官肺、骨和肌肉等的放射性摄取也要低于99mTc-GSA。基于以上生物分布实验结果，加上PET显像技术自身空间分辨率优势，在未来的显像中将能够获得更清晰的图像。
2.18FB-NGA在小鼠体内抑制实验
取同批次5只正常昆明小白鼠，于尾静脉预注射0.1mL抑制剂(NGA溶于生理盐水，按10mg/kg体重的剂量注射)，5min后，于尾静脉注射0.1mL18FB-NGA(约0.185MBq，含2μgNGA)。注射后5min后断头处死。取出心、肝、肺、肾、肌肉、骨、血等组织，称量并在锝分析仪内测其放射性计数。
18FB-NGA在正常小鼠体内抑制实验结果见表2；
表2.18FB-NGA在正常小鼠体内抑制实验数据(注药后5min，％ID/g±sd，n＝5)
抑制实验的结果表明，在通过预注射NGA，在5min时能够明显的抑制18FB-NGA在小鼠肝脏中的摄取(P＜0.0001)，大量未进入肝脏的18FB-NGA滞留在血液中，在心、肺、肾等各脏器摄取也明显增加。
抑制实验的结果说明通过预注射NGA，可有效抑制18FB-NGA在肝中的摄取。证明18FB-NGA对ASGP受体具有亲和性。
3.18FB-NGA在大鼠体内显像实验
取同批次2只SD大鼠，一只于尾静脉预注射0.1mL抑制剂(NGA配体溶于生理盐水，按10mg/kg体重的剂量注射)，5min后，将两只小鼠同时于尾静脉注射0.5mL 3.7MBq 18FB-NGA。注射后5、15min在Siemens Inveon microPET上进行显像。结果显示18FB-NGA在正常大鼠中有较高的肝脏摄取和较好的保留，而在抑制后大鼠肝脏摄取明显降低，说明18FB-NGA在肝脏中的摄取是通过ASGP受体机制。5min在抑制后的大鼠心脏部分有较高的浓集，这是由于未进入肝脏的18FB-NGA大量滞留在血液中，造成心血池中的放射性浓度较高，随着时间的推移，18FB-NGA逐渐代谢，心脏部位的摄取也有所降低。PET显像结果见附图。18FB-NGA在大鼠体内的显像实验结果与小鼠体内生物分布结果及其抑制实验结果一致。上述各项实验足以证明，本发明所述的氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物具有优良的生物性能，能够满足作为肝细胞受体PET显像剂的条件，说明本发明所述新型化合物可作为肝细胞受体显像剂在临床上推广应用。
上述各项实验说明，本发明所述的(18FB-NGA)化合物，其放射化学纯度大于99％，具有优良的生物性能，在肝脏中有较高的初始摄取，并随着时间增加从肝脏中清除；与99mTc-GSA相比有较低的肾、脾等脏器的摄取，能满足用作肝细胞受体显像剂的条件，从而能减少不必要的放射性损伤，可作为新型的肝细胞去唾液酸糖蛋白受体显像剂，18FB-NGA作为一种新型化合物具有高化学稳定性和良好的生物分布性质，可作为肝细胞受体PET显像剂在临床上推广应用。
具体实施方式：
下面通过实施例详述本发明，一种氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物：
(1)4-[18F]氟苯甲酸的制备
在1.5mL含有6mg K2CO3和11mg K2.2.2的18F-F-溶液加入10mL反应瓶中，浸入120℃油浴中，通入氮气(1mL/min)吹干，加入0.5mL无水乙腈蒸发至干，重复三次。加入溶于1mLDMSO中的4mg 4-三甲胺基苯甲酸乙酯三氟甲基磺酸盐，120℃条件下密闭反应20分钟。然后加入0.5mL 0.2mol/L用NaOH水解。反应结束后冷却至室温，加入0.5mL 1mol/L HCl后，用水稀释至10mL，充分混合后用10mL注射器加入Sep-Pak C18Plus柱，用10mL水淋洗，洗出液弃去。氮气吹干柱子后，用3mL乙腈(含0.1％三氟乙酸)淋洗至另一反应瓶中，测定产物放射性活度。
(2)N-琥珀酰亚胺4-[18F]氟苯甲酸酯的制备
向4-[18F]氟苯甲酸中加入10μL 40％的Bu4NOH水溶液，在120℃油浴中通入氮气(1mL/min)吹干，加入0.5mL无水乙腈蒸发至干，重复三次。然后向其中加入15mg O-(N-琥珀酰亚胺)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU，溶于1mL无水乙腈中)，在80～90℃密闭反应5min。反应结束后冷却至室温，用0.5mL的50％醋酸酸化，并用水稀释到10mL。充分混合后用10mL注射器加入Sep-Pak C18Plus柱，用10mL水淋洗，洗出液弃去。氮气吹干柱子后，用2.5mL二氯甲烷淋洗至另一反应瓶中，测定产物放射性活度。
(3)[18F]氟新乳糖白蛋白(18FB-NGA)的制备
N-琥珀酰亚胺4-[18F]氟苯甲酸酯在50℃油浴中通入氮气(1mL/min)吹干溶剂。加入50μL DMSO将反应瓶中的残余物溶解，加入3mg新乳糖白蛋白(NGA，溶于200μL 0.1mol/L pH8.6硼酸缓冲液)，室温反应30min。
将HiTrap脱盐凝胶柱(Sephadex G25)用25mL淋洗液(0.05mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液)平衡，控制流速在1～10mL/min之间。将0.25mL标记好的18FB-NGA用1mL注射器上样，先用1.25mL淋洗液淋洗后，收集1mL淋洗液，得到除去杂质、回收率＞95％的18FB-NGA溶液。
通过层析及RP-HPLC鉴定，其保留时间为12.3min，放射化学纯度大于99％。HPLC条件为：高效液相色谱仪SHIMADZU(SCL-10Avp)；Kromaisl C4柱250×4.6mm，5μm
A相为水(含0.1％TFA)，B相为乙腈(含0.1％TFA)；淋洗梯度为：0～30min：30％～70％B相；流速1mL/min。
Claims (7)
1.一种氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物，其分子表达式为18FB-NGA；其结构通式为：
其中：18FB-NGA是通过对氟苯甲酸与新乳糖白蛋白分子链的赖氨酸残基连接得到。
2.一种氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物的制备方法，其特征在于：以放射性N-琥珀酰亚胺4-[18F]氟苯甲酸酯([18F]SFB)与新乳糖白蛋白(NGA)在碱性条件下反应制备得到所述的放射性氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物，其制备步骤为：
a.在K2CO3、K2.2.2.和18F-F-与4-三甲胺基苯甲酸乙酯三氟甲基磺酸盐在加热条件下反应20分钟后，用NaOH水解后，加入HCl得到4-[18F]氟苯甲酸；
b.4-[18F]氟苯甲酸与O-(N-琥珀酰亚胺)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯在加热条件下反应5分钟，并用醋酸酸化后得到N-琥珀酰亚胺4-[18F]氟苯甲酸酯([18F]SFB)；
c.将新乳糖白蛋白NGA溶于缓冲液中加入步骤b制备的N-琥珀酰亚胺4-[18F]氟苯甲酸酯中，混匀后在10℃～40℃条件下反应10～60min；
d.将步骤c所得溶液通过凝胶色谱进行纯化。
3.如权利要求2所述的氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物的制备方法，其特征在于：步骤a中所述的加热反应温度为90～140℃，步骤b中所述的加热反应温度为80～100℃。
4.如权利要求2所述的氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物的制备方法，其特征在于：步骤c中所述的缓冲液为：0.1mol/L pH8.6硼酸缓冲液，用量为0.1mL～1mL。
5.如权利要求2所述的氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物的制备方法，其特征在于：步骤d中所述的凝胶色谱柱选用填料为葡聚糖凝胶的G25凝胶柱。
6.如权利要求2所述的氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物的制备方法，其特征在于：所述新乳糖白蛋白的用量为1mg-5mg。
7.如权利要求1或2所述的氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物及其制备方法和应用，其特征在于：所述氟-18标记的新乳糖白蛋白化合物作为肝脏受体显像剂在核医学领域的应用。
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