CN114699539A - 一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，利用有机全合成的方法合成了双环bi‑cRGDyK修饰的ZW800‑1近红外小分子即ZW800‑bi‑cRGDyK，其在鉴定转移淋巴结时具有良好的主动靶向作用，可以有效的区分转移淋巴结和正常淋巴结。这种链接双环cRGDyK的近红外荧光染料保留了染料的水溶性和对肿瘤细胞的特异性。该主动靶向近红外荧光分子在鉴定转移淋巴结具有高效特异性，灵敏的识别被转移的肿瘤淋巴结。该示踪剂具有水溶性好和荧光量子产率高等优点，在转移淋巴结手术导航成像及医学细胞标记等领域具有巨大的发展潜力。
Description
技术领域
本发明提供一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，涉及近红外手术导航荧光分子、动物成像及细胞标记等领域。
技术背景
近红外(NIR)光具有穿透深、吸收小、组织散射较少等明显优势。其在图像引导干预的应用中具有巨大潜力，并可提供优越的信号背景比(SBR)。目前，唯一获得美国FDA批准的NIR荧光团吲哚菁绿(ICG)已被用于各种临床手术造影。然而，由于分子电势较高，表面电荷不平衡，且与血清蛋白结合严重，ICG 易被肝脏摄取。另外，ICG还存在以下问题：第一，在水溶液具有较低的荧光量子产率中<1％，这将极大的降低了设备的检测限。根据我国药监法规，人体ICG 最大注射剂量应小于2mg/kg，在此剂量下，文献报道ICG在人体肿瘤的浓度在 10-1000nM，这对检测设备提出极高的要求。第二，短时间内，ICG在肿瘤及正常组织的代谢速率差别不大，只有大于12小时后才能产生足够的荧光对比度(肿瘤：正常组织)，增加了医院及病人的负担。第三，ICG聚集后容易发生光漂白，较大的降低了其在成像过程中的稳定性。第四，ICG在肿瘤中富集是通过EPR效应，缺乏肿瘤细胞的主动靶向性，大幅度降低了荧光示踪剂成像的准确性。从而 ICG在转移灶如转移淋巴结，微小转移灶等的诊断上完全失去了优势，所以在更加严重的转移病灶成像上，主动靶向性的开发变得尤为重要。因此，这些因素极大地限制了ICG的临床应用，因此有必要进一步寻找适合临床手术成像的近红外荧光团。
RGD多肽对肿瘤细胞或者肿瘤新生血管内皮细胞特异性高表达某些整合素受体，但由于肿瘤内部血供不足和生长紊乱RGD多肽在肿瘤细胞上仍具有较差的靶向精准性。本技术组成员通过对一种近红外荧光示踪剂的合成方法研究，研制了一种基于RGD主动靶向基团的高效近红外荧光示踪剂，该示踪剂具有灵敏度高、主动靶向性强、水溶性好和荧光量子产率高等优点，特别对转移淋巴结具有重要的应用前景。
发明内容
发明目的在于：提供了一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，它是基于RGD主动靶向基团的高效近红外荧光示踪剂，该示踪剂具有灵敏度高、主动靶向性强、水溶性好和荧光量子产率高等优点，特别对转移淋巴结具有重要的应用前景。
为了实现上述发明的目的，其具体的技术方案如下：
一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：
步骤A：ZW800-1分子中羧酸的特殊活化形成ZW800-Bop-NHS产品及提纯
A1、搅拌下将称量的ZW800-1加入二甲基亚砜(DMSO)中，加热到40-45℃，搅拌溶解，形成溶液；A2、向上述溶液中加入称量的六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBop)和丁二酰亚胺，保温反应2-3小时，制得具有特殊活化形式的ZW800-Bop-NHS混合溶液；A3、向步骤A2所制得溶液缓慢滴加到乙酸乙酯与乙醇的混合溶液中，反应体系为浑浊液，滴加完毕，过滤出固体物，用少量乙醇淋洗除杂，得到纯度可达98％的ZW800-Bop-NHS蓝绿色粉末(如分子式1)；
步骤B：ZW800-Bop-NHS与NH2-glu-acp-{cRGDyK}2缩合反应，制备出 ZW800-bi-cRGDyK近红外靶向分子
B1、搅拌下将称量的ZW800-Bop-NHS加入150ml二甲基亚砜中，常温搅拌 30-60min，制得溶液；B2、称取NH2-glu-acp-{cRGDyK}2，苯并三氮唑-1-基 氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(4.5mmol)加入称量的DMF中，将所制得 溶液滴加加入步骤B1所制得的溶液中，维持搅拌速度200-400r/min，常温反 应2-6h，制得含ZW800-bi-cRGDyK(如分子式2)产品的混合液；B3、将上述 混合液冰冻冷却，过滤固体物，得到ZW800-bi-cRGDyK粗品，将粗品加入甲 醇中打浆，所得溶液冷却至-10℃～20℃，过滤，用少量冰冻甲醇洗涤，再 用冰乙醚洗涤，将固体物干燥，得到绿色粉末产品；
步骤C:将新制备的ZW800-bi-cRGDyK分子进行细胞及动物层面的转移淋巴结靶向验证
C1、ZW800-bi-cRGDyK分子对肿瘤细胞灵敏度响应：为检测ZW800-bi-cRGDyK 对转移淋巴结鉴定的灵敏度，用1×10-5～1×10-9mol·L-1浓度的ZW800-bi-cRGDyK、 CW800-bi-cRGDyK、ZW800-cRGDyK等荧光小分子与整合素高表达的乳腺癌细胞4T1； C2、利用活体成像仪收集荧光信号并比较荧光强度，同时利用荧光显微镜进行细胞成像比较成像结果的差异；C3、使用术中导航设备检测方法对ZW800-bi-cRGDyK、 CW800-bi-cRGDyK、ZW800-cRGDyK等荧光小分子与转移淋巴结的成像做对比；
步骤D:将ZW800-bi-cRGDyK分子对分期转移淋巴结鉴定
D1、在小鼠乳头注射4T1细胞构建淋巴结转移模型，分别尾静脉注射10nmol 的ZW800-bi-cRGDyK、CW800-bi-cRGDyK、ZW800-cRGDyK分子；D2、使用活体成像仪和术中荧光导航设备对各种小分子进行诊断转移淋巴结的数量和效果。
优选的，步骤A中，所述ZW800-1与六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBop)的摩尔比为1:1-1:2。
优选的，步骤A中，所述ZW800-1与丁二酰亚胺的摩尔比为1:1-1:2。
优选的，步骤B中，所述NH2-glu-acp-{cRGDyK}2与ZW800-Bop-NHS的摩尔比为1:1-1.5:1。
优选的，步骤B中，所述NH2-glu-acp-{cRGDyK}2与苯并三氮唑-1-基氧基三 (二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐的摩尔比为1:1-1.5:1。
本发明的优点在于，本发明公开一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，利用有机合成的方法合成了双环bi-cRGDyK修饰的ZW800-1近红外小分子即ZW800-bi-cRGDyK，其在鉴定转移淋巴结时具有良好的主动靶向作用，可以有效的区分转移淋巴结和正常淋巴结。这种链接双环cRGDyK的近红外荧光染料保留了染料的水溶性和对肿瘤细胞的特异性。该主动靶向近红外荧光分子在鉴定转移淋巴结具有高效特异性，灵敏的识别被转移的肿瘤淋巴结。该示踪剂具有水溶性好和荧光量子产率高等优点。
本发明所述示踪剂的制备方法，工艺简便，易于实现，产品收率高。
附图说明
图1是近红外荧光示踪剂的合成流程图。
图2是该近红外荧光示踪剂的水溶液荧光测试图。
图3是该近红外荧光示踪剂的高效液相分析图。
图4是该近红外荧光示踪剂的质谱图。
图5是多种示踪剂对4T1细胞靶向成像对比图。
图6是多种示踪剂对转移淋巴结体内成像的对比图。
图7是该近红外荧光示踪剂的高效液相分析纯度表。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，如图1流程图所示。
实施例1
一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：
步骤A：ZW800-1分子中羧酸的特殊活化形成ZW800-Bop-NHS产品及提纯
A1、搅拌下将ZW800-1(10g,10.8mmol)加入500ml二甲基亚砜(DMSO)中，加热到40-45℃，搅拌溶解，形成溶液；A2、向上述ZW800-1溶液中依次加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(6.2g,11.9mmol)，丁二酰亚胺 (1.2g,11.9mmol)温度控制在40-45℃，搅拌反应2-3小时，制得具有特殊活化形式的ZW800-Bop-NHS混合溶液；A3、将A2所制得ZW800-Bop-NHS混合溶液缓慢滴加到250ml乙酸乙酯与100ml乙醇的混合溶液中，反应体系逐渐变浑浊，滴加完毕，过滤出固体物，用少量乙醇淋洗除杂，得到纯度可达98.5％的ZW800-Bop-NHS蓝绿色粉末9.3g(如分子式1)，收率82.0(以ZW800-1计)；
步骤B、ZW800-Bop-NHS与NH2-glu-acp-{cRGDyK}2缩合反应，制备出 ZW800-bi-cRGDyK近红外靶向分子
B1、搅拌下将称量的ZW800-Bop-NHS(5g，4.9mmol)加入150ml二甲基亚砜中，常温搅拌30-60min，制得溶液；B2、称取NH2-glu-acp-{cRGDyK}2(7.6g， 4.5mmol)，苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(2.0g， 4.5mmol)加入200ml DMF中，将所制得溶液滴加加入步骤B1所制得的溶液中，维持搅拌速度200-400r/min，常温反应2-6h，制得含ZW800-bi-cRGDyK(如2 分子式)产品的混合液；B3、将上述混合液冰冻冷却，过滤固体物，得到 ZW800-bi-cRGDyK粗品，将粗品加入甲醇中打浆，所得溶液冷却至-10～20℃，过滤，用少量冰冻甲醇洗涤，再用冰乙醚洗涤，将固体物干燥，得到绿色粉末产品5.8g,含量95.2％，收率45.0％(以NH2-glu-acp-{cRGDyK}2计)；
步骤C:将新制备的ZW800-bi-cRGDyK分子进行细胞及动物层面的转移淋巴结靶向验证
C1、ZW800-bi-cRGDyK分子对肿瘤细胞灵敏度响应：为检测ZW800-bi- cRGDyK对转移淋巴结鉴定的灵敏度，用1×10-5～1×10-9mol·L-1浓度的ZW800- bi-cRGDyK、CW800-bi-cRGDyK、ZW800-cRGDyK等荧光小分子与整合素高表达的 乳腺癌细胞4T1；C2、利用活体成像仪收集荧光信号并比较荧光强度，同时利用 荧光显微镜进行细胞成像比较成像结果的差异；C3、使用术中导航设备检测方 法对ZW800-bi-cRGDyK、CW800-bi-cRGDyK、ZW800-cRGDyK等荧光小分子与转移 淋巴结的成像做对比；
步骤D:将ZW800-bi-cRGDyK分子对分期转移淋巴结鉴定
D1、在小鼠乳头注射4T1细胞构建淋巴结转移模型，分别尾静脉注射10nmol 的ZW800-bi-cRGDyK、CW800-bi-cRGDyK、ZW800-cRGDyK分子；D2、使用活体成像仪和术中荧光导航设备对各种小分子进行诊断转移淋巴结的数量和效果。
实施例2
一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：
步骤A：ZW800-1分子中羧酸的特殊活化形成ZW800-Bop-NHS产品及提纯
A1、搅拌下将ZW800-1(10g,10.8mmol)加入500ml二甲基亚砜(DMSO)中，加热到40-45℃，搅拌溶解，形成溶液；A2、向上述ZW800-1溶液中依次加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(8.4g,16.2mmol)，丁二酰亚胺 (1.6g,16.2mmol)温度控制在40-45℃，搅拌反应2-3小时，制得具有特殊活化形式的ZW800-Bop-NHS混合溶液；A3、将A2所制得ZW800-Bop-NHS混合溶液缓慢滴加到250ml乙酸乙酯与100ml乙醇的混合溶液中，反应体系逐渐变浑浊，滴加完毕，过滤出固体物，用少量乙醇淋洗除杂，得到纯度可达98.1％的ZW800-Bop-NHS蓝绿色粉末9.4g，收率82.3％(以ZW800-1计)；
步骤B、ZW800-Bop-NHS与NH2-glu-acp-{cRGDyK}2缩合反应，制备出 ZW800-bi-cRGDyK近红外靶向分子
B1、搅拌下将称量的ZW800-Bop-NHS(6.9g，6.7mmol)加入150ml二甲基亚砜中，常温搅拌30-60min，制得溶液；B2、称取NH2-glu-acp-{cRGDyK}2(7.6g， 4.5mmol)，苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(2.0g， 4.5mmol)加入200ml DMF中，将所制得溶液滴加加入步骤B1所制得的溶液中，维持搅拌速度200-400r/min，常温反应2-6h，制得含ZW800-bi-cRGDyK产品的混合液；B3、将上述混合液冰冻冷却，过滤固体物，得到ZW800-bi-cRGDyK粗品，将粗品加入甲醇中打浆，所得溶液冷却至-10～20℃，过滤，用少量冰冻甲醇洗涤，再用冰乙醚洗涤，将固体物干燥，得到绿色粉末产品5.8g,含量 95.5％，收率45.2％(收率以NH2-glu-acp-{cRGDyK}2计)；
步骤C:将新制备的ZW800-bi-cRGDyK分子进行细胞及动物层面的转移淋巴结靶向验证
C1、ZW800-bi-cRGDyK分子对肿瘤细胞灵敏度响应：为检测ZW800-bi-cRGDyK 对转移淋巴结鉴定的灵敏度，用1×10-5～1×10-9mol·L-1浓度的 ZW800-bi-cRGDyK、CW800-bi-cRGDyK、ZW800-cRGDyK等荧光小分子与整合素高表达的乳腺癌细胞4T1；C2、利用活体成像仪收集荧光信号并比较荧光强度，同时利用荧光显微镜进行细胞成像比较成像结果的差异；C3、使用术中导航设备检测方法对ZW800-bi-cRGDyK、CW800-bi-cRGDyK、ZW800-cRGDyK等荧光小分子与转移淋巴结的成像做对比；
步骤D:将ZW800-bi-cRGDyK分子对分期转移淋巴结鉴定
D1、在小鼠乳头注射4T1细胞构建淋巴结转移模型，分别尾静脉注射10nmol 的ZW800-bi-cRGDyK、CW800-bi-cRGDyK、ZW800-cRGDyK分子；D2、使用活体成像仪和术中荧光导航设备对各种小分子进行诊断转移淋巴结的数量和效果。
实施例3
一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：
步骤A：ZW800-1分子中羧酸的特殊活化形成ZW800-Bop-NHS产品及提纯
A1、搅拌下将ZW800-1(10g,10.8mmol)加入500ml二甲基亚砜(DMSO)中，加热到40-45℃，搅拌溶解，形成溶液；A2、向上述ZW800-1溶液中依次加入六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(5.6g,10.8mmol)，丁二酰亚胺 (1.1g,10.8mmol)温度控制在40-45℃，搅拌反应2-3小时，制得具有特殊活化形式的ZW800-Bop-NHS混合溶液；A3、将A2所制得ZW800-Bop-NHS混合溶液缓慢滴加到250ml乙酸乙酯与100ml乙醇的混合溶液中，反应体系逐渐变浑浊，滴加完毕，过滤出固体物，用少量乙醇淋洗除杂，得到纯度可达98.2％的ZW800-Bop-NHS蓝绿色粉末9.3g，收率81.9％(以ZW800-1计)；
步骤B、ZW800-Bop-NHS与NH2-glu-acp-{cRGDyK}2缩合反应，制备出 ZW800-bi-cRGDyK近红外靶向分子
B1、搅拌下将称量的ZW800-Bop-NHS(4.6g，4.5mmol)加入150ml二甲基亚砜中，常温搅拌30-60min，制得溶液；B2、称取NH2-glu-acp-{cRGDyK}2(7.6g， 4.5mmol)，苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(2.0g， 4.5mmol)加入200ml DMF中，将所制得溶液滴加加入步骤B1所制得的溶液中，维持搅拌速度200-400r/min，常温反应2-6h，制得含ZW800-bi-cRGDyK产品的混合液；B3、将上述混合液冰冻冷却，过滤固体物，得到ZW800-bi-cRGDyK粗品，将粗品加入甲醇中打浆，所得溶液冷却至-10～20℃，过滤，用少量冰冻甲醇洗涤，再用冰乙醚洗涤，将固体物干燥，得到绿色粉末产品5.7g,含量 95.0％，收率44.5％(收率以NH2-glu-acp-{cRGDyK}2计)；
步骤C:将新制备的ZW800-bi-cRGDyK分子进行细胞及动物层面的转移淋巴结靶向验证
C1、ZW800-bi-cRGDyK分子对肿瘤细胞灵敏度响应：为检测ZW800-bi-cRGDyK 对转移淋巴结鉴定的灵敏度，用1×10-5～1×10-9mol·L-1浓度的 ZW800-bi-cRGDyK、CW800-bi-cRGDyK、ZW800-cRGDyK等荧光小分子与整合素高表达的乳腺癌细胞4T1；C2、利用活体成像仪收集荧光信号并比较荧光强度，同时利用荧光显微镜进行细胞成像比较成像结果的差异；C3、使用术中导航设备检测方法对ZW800-bi-cRGDyK、CW800-bi-cRGDyK、ZW800-cRGDyK等荧光小分子与转移淋巴结的成像做对比；
步骤D:将ZW800-bi-cRGDyK分子对分期转移淋巴结鉴定
D1、在小鼠乳头注射4T1细胞构建淋巴结转移模型，分别尾静脉注射10nmol 的ZW800-bi-cRGDyK、CW800-bi-cRGDyK、ZW800-cRGDyK分子；D2、使用活体成像仪和术中荧光导航设备对各种小分子进行诊断转移淋巴结的数量和效果。
实施例4
一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，实施例1 3基础上，本发明主动靶向性近红外小分子的结构和性能表征，具体操作为：
(1)荧光性质的测试：如图2所示，所得荧光小分子用荧光分度计进行测试其荧光性能，在不同激发波长下得到的荧光谱图。链接双cRGDyK后，其荧光峰与 ZW800保持一致，仍然保持在800nm左右并没有发生明显的改变。
(2)高效液相色谱和质谱分析：如图3、4和表1所示，链接双cRGDyK后的荧光小分子在高效液相分析中具有具有较高的纯度(92.7％)，质谱分析和分子量相吻合为2617。
(3)由细胞成像和整合素受体结合分析可以看出，ZW800-bi-cRGDyK对乳腺癌细胞特异性结合灵敏度最高。
(4)动物体内成像的表征：如图7所示，通过尾静脉注射ZW800-bi-cRGDyK近红外主动靶向性小分子对小鼠的肿瘤转移淋巴结进行特异性成像，在近红外手术导航设备观察发现经过0.5h后,小分子就可以富集在肿瘤转移淋巴结上，清楚地观察到转移淋巴结的荧光信号和大小，与非转移淋巴结的成像上具有明显的信号差异。
Claims (9)
1.一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，其特征在于，使用ZW800-1与NH2-glu-acp-{cRGDyK}2缩合制备出ZW800-bi-cRGDyK近红外靶向分子示踪剂，包括主要如下工艺步骤：
步骤A、ZW800-1分子中羧酸经六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBop)和丁二酰亚胺的特殊活化，得到活化的ZW800-Bop-NHS产品及产品提纯过程；
步骤B、NH2-glu-acp-{cRGDyK}2在苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐的催化作用下，与活化的ZW800-Bop-NHS缩合反应，制备出ZW800-bi-cRGDyK近红外靶向分子示踪剂及产品纯化过程；
步骤C、将新制备的ZW800-bi-cRGDyK分子进行细胞及动物层面的转移淋巴结靶向验证；
步骤D、将ZW800-bi-cRGDyK分子对分期转移淋巴结鉴定。
2.根据权利要求1所述的一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，其特征在于，所述的步骤A具体包括：
A1、搅拌下将称量的ZW800-1加入二甲基亚砜（DMSO）中，加热到40-45℃，搅拌溶解，形成溶液；A2、向上述溶液中加入称量的六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBop)和丁二酰亚胺，保温反应2-3小时，制得具有特殊活化形式的ZW800-Bop-NHS混合溶液；A3、向步骤A2所制得溶液缓慢滴加到乙酸乙酯与乙醇的混合溶液中，反应体系为浑浊液，滴加完毕，过滤出固体物，用少量乙醇淋洗除杂，得到ZW800-Bop-NHS蓝绿色粉末产品；
ZW800-Bop-NHS的分子式：
3.根据权利要求1所述的一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，其特征在于，所述的步骤B具体包括：
B1、搅拌下将称量的ZW800-Bop-NHS加入150ml二甲基亚砜中，常温搅拌30-60min，制得溶液；B2、称取NH2-glu-acp-{cRGDyK}2，苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐加入称量的DMF中，将所制得溶液滴加入步骤B1所制得的溶液中，维持搅拌速度200-400r/min，常温反应2-6h，制得含ZW800-bi-cRGDyK产品的混合液；B3、将上述混合液冰冻冷却，过滤固体物，得到ZW800-bi-cRGDyK粗品，将粗品加入甲醇中打浆，所得溶液冷却至-10℃～20℃，过滤，用少量冰冻甲醇洗涤，再用冰乙醚洗涤，将固体物干燥，得到绿色粉末产品；
ZW800-bi-cRGDyK的分子式：
4.根据权利要求1所述的一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，其特征在于，所述的步骤C具体包括：
C1、ZW800-bi-cRGDyK分子对肿瘤细胞灵敏度响应：为检测ZW800-bi-cRGDyK对转移淋巴结鉴定的灵敏度，用1×10-5～1×10-9mol·L-1浓度的ZW800-bi-cRGDyK、CW800-bi-cRGDyK、ZW800-cRGDyK等荧光小分子与整合素高表达的乳腺癌细胞4T1；
C2、利用活体成像仪收集荧光信号并比较荧光强度，同时利用荧光显微镜进行细胞成像，比较成像结果的差异；C3、使用术中导航设备检测方法对ZW800-bi-cRGDyK、CW800-bi-cRGDyK、ZW800-cRGDyK等荧光小分子与转移淋巴结的成像做对比。
5.根据权利要求1所述的一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，其特征在于，所述的步骤D具体包括：
D1、在小鼠乳头注射4T1细胞构建淋巴结转移模型，分别尾静脉注射10nmol 的ZW800-bi-cRGDyK、CW800-bi-cRGDyK、ZW800-cRGDyK分子；D2、使用活体成像仪和术中荧光导航设备对各种小分子进行诊断转移淋巴结的数量和效果。
6.根据权利要求1或2所述的一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，其特征在于，所述步骤A中，所述ZW800-1与六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBop)的摩尔比为1:1-1:2。
7.根据权利要求1或2所述的一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，其特征在于，所述步骤A中，所述ZW800-1与丁二酰亚胺的摩尔比为1:1-1:2。
8.根据权利要求1或2或3所述的一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，其特征在于，所述步骤B中，所述NH2-glu-acp-{cRGDyK}2与ZW800-Bop-NHS的摩尔比为1:1-1.5:1。
9.根据权利要求1或2或3所述的一种诊断转移淋巴结近红外荧光示踪剂的合成方法，其特征在于，所述步骤B中，所述NH2-glu-acp-{cRGDyK}2与苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐的摩尔比为1:1-1.5:1。
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