CN103146220A - 对称五甲川菁染料及其在分子影像中的应用 - Google Patents
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Description
技术领域
本发明涉及有机化合物及其制备方法领域,进一步涉及这类有机化合物在光学分子影像技术领域中的应用,具体是一类对称五甲川菁染料及其制备方法以及将对称五甲川菁染料作为荧光探针,在活细胞成像研究及其在光学分子影像中的应用。
背景技术
分子影像技术具有高灵敏、无辐射等优点,可以在细胞分子水平上实现生物有机体生理、病理变化的实时、无创、动态成像,是疾病早期诊断、疗效预测及评估的有效方法。利用灵敏的光学检测仪器,观测活体内疾病、肿瘤的发生发展、转移、基因的表达等生物学过程,成为近几年光学分子影像领域的研究热点。然而,荧光分子探针是活体内光学分子成像的先决条件,其实现了目标组织的可视化示踪检测。目前应用于光学分子影像学中的探针标记方法有多种,如绿色荧光蛋白(GFP)、量子点(QDs)、荧光素酶、吖啶、罗丹明等。除此外,还有一类具有特殊“吸-拉”结构的有机小分子功能染料----菁染料,它具有波长可调范围广,几乎可以覆盖从可见到近红外的所有波段;立体位阻小,不干扰细胞的正常生理功能,较强的膜通透性,在活体中易于被排泄,毒性小等优点,被广泛应用于凝胶成像、活细胞成像、活体成像、流式细胞术以及肿瘤的光动力疗法(PDT)等生物医学领域中。
一般菁染料不具备特异选择性,必须与生物特异性活性载体相连接,利用两者的相互作用来实现肿瘤的靶向检测。通常在探针上连接有活性反应基团(如羧基-COOH、异硫氰酸酯R-N=C=S、氨基-NH2等),使其与抗体、多肽、蛋白质、核酸的氨基或羧基发生反应形成稳定的共价键,其中羧基活性基团应用最为广泛。目前带活性羧基的菁染料的合成通常采用不对称合成法,使活性羧基位于分子两端的杂环上(如商品化探针Cy3、Cy5系列),首先将卤代烷羧基和吲哚杂环生成N-羧基吲哚盐,其再与缩合剂反应生成半菁,半菁再和另一份吲哚碘盐反应生成菁染料,此合成路线复杂、副产物多、目标产物产率低、难分离,从而导致其价格昂贵。
近年来据文献报道[Lee,H.,Akers,W.,Bhushan,K.,Bloch,S.,Sudlow,G.,Tang,R.,and Achilefu,S.Near-infrared pH-activatable fluorescent probes for imaging primary andmetastatic breast tumors.Bioconjugate Chemistry 2011,22,777-784.Ying,L.Q.,andBranchaud,B.P.Facile synthesis of symmetric,monofunctional cyanine dyes for imagingapplications.Bioconjugate Chemistry 2011,22,865-869],在菁染料甲川链上链接活性羧基合成主要有两种方法:一种为巯基取代甲川链上的氯原子,常用于七甲川菁染料合成中;另一种将甲川链上的叔氮反应成季铵盐,常应用于五甲川菁染料中。对于巯基取代甲川链上氯原子在七甲川菁染料中的应用,前人已经做了优秀的工作,并且在甲川链上引入六元环以增强其稳定性。然而,采用巯基取代甲川链上氯原子在五甲川菁染料的合成及其在细胞成像和光学分子影像研究中的应用还未见文献报道,并且现有应用于分子影像中的菁染料荧光探针具有合成路线复杂、副产物多、难纯化、光稳定性差等缺点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有五甲川菁染料存在的上述不足,提供一类具有对称性结构、新型的五甲川菁染料。
本发明的另一个目的提供一种易于合成的五甲川菁染料的制备方法。
本发明的进一步目的是将制备的五对称甲川菁染料作为荧光探针,根据靶分子的不同,用于不同生物医学靶向荧光标记。
本发明制备的对称五甲川菁荧光探针具有通式I的结构:
其中:
X为氯或S(CH2)nCOOH或II;
R1为C1-6烷基、(CH2)pOR3或(CH2)pC6H5;
R2为氢、甲基、羟基、卤素、硝基、苄氧基、烷氧基或水溶性基团SO3R4;
R3为氢或C1-6烷基;
水溶性基团SO3R4中R4为氢或钠离子或钾离子;
Y-为卤素离子、PF6 -或TsO-;
S(CH2)nCOOH和II中n、m为2~6的整数;
(CH2)pC6H5中p为1~6的整数;
上述化合物的R1为C1-6烷基;
上述化合物的R1最优选为CH3、CH2CH3或CH2CH2CH3;
上述化合物的R2为水溶性基团SO3R4;
上述化合物中水溶性基团SO3R4中R4为钾离子K+。
本发明主要在前人工作基础上设计合成了一类对称五甲川菁染料,通过对称合成法得到共轭链中位带氯的对称五甲川菁染料,再通过巯基取代氯制备出了中位带活性羧基的五甲川菁染料。具体包括以下步骤:
(1)将烷基化试剂R1Y与吲哚杂环A在水热合成反应釜中反应制得吲哚季铵盐B;其中R1Y过量,反应温度70~120℃,反应时间24小时,反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈或反应物R1Y本身;
(2)二氯代丁烯醛与苯胺反应生成中位带有氯取代基的五甲川缩合剂C,二氯代丁烯醛与苯胺的投料摩尔比为1:1.2,反应溶剂为乙醇或甲醇,反应温度70~85℃;
(3)将步骤(1)制得的吲哚季铵盐B和步骤(2)制得的带有氯取代基的五甲川缩合剂C在冰醋酸与醋酸酐中反应回流1~2小时,制得桥链中位氯取代的对称五甲川菁染料CyI;吲哚季铵盐B和带有氯取代基的五甲川缩合剂C的投料摩尔比为2:1;
(4)将步骤(3)中制得化合物CyI与巯基烷基酸HS(CH2)nCOOH在水热合成反应釜中反应得中位带活性羧基五甲川菁染料CyIC,反应原料CyI与HS(CH2)nCOOH投料摩尔比为1:4,反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺DMF,反应温度70~120℃,反应时间24~48小时;
(5)将步骤(4)制得的五甲川菁染料CyIC与2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯TSTU在三乙胺的催化条件下反应制得中位带活性琥珀酰亚胺五甲川菁染料CyIC-NHS,反应溶剂是二甲基亚砜DMSO,反应温度常温,反应时间1小时,五甲川菁染料CyIC与TSTU的投料摩尔比为1:4;
(6)步骤(5)制得的化合物CyIC-NHS与氨基酸序列为CGNSNPKSC的胃癌血管内皮细胞特异性结合短肽GX1,在三乙胺的催化条件下反应制得胃癌靶向性荧光探针CyIC-GX1,反应溶剂为二甲基亚砜,反应条件为常温避光反应12小时,CyIC-NHS与短肽GX1的投料摩尔比为1:1。
用本发明的制备方法合成的对称五甲川菁染料CyI、CyIC和CyIC-GX1作为生物荧光探针应用于活体分子影像及活细胞成像中。
本发明与现有技术相比较所具有的有益效果:
本发明的带活性羧基的对称五甲川菁染料的制备方法与现有菁染料的不对称合成法比较,具有合成步骤简化、易于纯化和产率较高的特点。
本发明的五甲川菁染料是一类结构新型的共轭链中位带单氯原子、单巯基丙酸的对称五甲川菁染料,此类新型五甲川菁染料光稳定性显著优于现有花菁荧光探针,对活细胞毒性较小,具有活细胞膜通透性,可用于活细胞荧光成像和小动物在体成像。
本发明的新型胃癌靶向性花菁探针CyIC-GX1与现有胃癌靶向探针相比较,具有分子量小、膜通透能力强、在活体中易于被排泄和肿瘤靶向特异性高的特点。
附图说明
图1为胃癌靶向探针CyIC-GX1质谱分析图;
图2为染料CyIC的紫外吸收和荧光发射图谱;
图3为染料CyIC与商品级染料Cy5.5的光稳定性研究;
图4为染料CyIC对不同胃癌细胞系GES、MKN28、AGS、SGC7901、MKN45的MTT检测结果图4(A)及其在不同浓度和时间对胃癌细胞MKN45的MTT检测结果图4(B);
图5为染料CyIC对SGC7901细胞标记的荧光成像(放大400倍,染料浓度为5μM);
图6为染料CyIC应用于小鼠胃癌在体光学分子成像;
图7为胃癌靶向探针CyIC-GX1的特异结合性研究,图7(A)图为激光共聚焦细胞成像图,图7(B)图为流式细胞术图;
图8为胃癌靶向探针CyIC-GX1的在体成像,图8(A)图为实验组和对照组在体成像,图8(B)图为实验组24小时连续观测荧光强度变化图,图8(C)图为实验组在体连续观测图;
图9为实验组和对照组的离体器官荧光图像和强度,图9(A)为离体器官荧光图像,其中离体器官1为肿瘤,2为肝脏,3为肾脏,4为脾脏,5为肺,6为心脏,7为胃;图9(B)为离体器官荧光强度对比图。
具体实施方式
实施例1
化合物B1和化合物B2的制备:
(1)碘化N-甲基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚季铵盐(化合物B1)的合成
将2.8g(10mmol)2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚A和2.8g(20mmol)碘甲烷加入到含40mL甲醇的密封反应釜中,加热至75℃反应24h;若用乙醇代替甲醇做反应溶剂时,反应温度为85℃;若直接采用碘甲烷作为反应溶剂,反应温度为70℃,冷却后真空旋转蒸去部分甲醇至瓶底出现固体,抽滤粗产物用乙醚洗涤,得到黄棕色固体季铵盐3.3g,产率80%。
(2)碘化N-乙基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚季铵盐(化合物B2)的合成
将2.8g(10mmol)2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H-吲哚和10mL碘乙烷加入到密封反应釜中,加热至70℃反应24h,冷却后固体用乙醚洗涤,得到棕色固体季铵盐3.7g,产率85%。
实施例2
五甲川缩合剂化合物C的制备:
将5g(30mmol)二氯代丁烯醛溶于15mL无水乙醇中,加入溶有5.8g(60mmol)苯胺的20mL无水乙醇中,加热80~85℃回流反应30min;或者采用甲醇作为反应溶剂,加热70~75℃回流反应30min,有橙色固体析出,抽滤用乙醚洗涤,无水乙醇重结晶,得到亮橙色固体7.6g,产率为86%。
实施例3
染料CyI-1和染料CyI-2的合成:
将7mmol吲哚季铵盐B1或B2和0.0035mmol五甲川缩合剂C在45mL冰醋酸与45mL醋酸酐中,反应回流1~2小时,吲哚季铵盐B和五甲川缩合剂C的投料摩尔比严格按2:1,当投料摩尔比小于2:1时,会生成五甲川半菁染料副产物。反应后粗产物用甲醇:水=5:1重结晶,得到亮墨绿色固体,染料CyI-1和染料CyI-2的产率约为50%。产物结构鉴定的核磁和质谱数据如下:
CyI-1:1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1.73(s,12H,C(CH3)2),3.68(s,6H,NCH3),6.29(d,2H,J=13.6 Hz,-CH=),7.43(d,2H,J=8.0 Hz,ArH),7.67(d,2H,J=8.0 Hz,ArH),7.88(s,2H,ArH),8.47(d,2H,J=13.6 Hz,-CH=).13C NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):26.04,66.93,99.72,110.30,119.52,121.90,125.57,128.22,131.24,142.09,145.45,166.54,174.44.MS(ESI,positive mode):calcd.Mr=576.10 forC27H28N2O6S2C1,found m/z=577([M+H+]).
CyI-2:1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1.316(t,6H,J=6.8 Hz,N-β-CH3),1.73(s,12H,C(CH3)2),4.22(q,4H,J=6.8 Hz,N-α-CH2),6.32(d,2H,J=13.6 Hz,-CH=),7.45(d,2H,J=8.4 Hz,ArH),7.69(d,2H,J=8.4 Hz,ArH),7.90(s,2H,ArH),8.49(d,2H,J=13.6 Hz,-CH=).13C NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.60,26.07,48.15,49.01,99.18,110.24,119.66,121.86,125.71,140.53,140.84,145.48,147.21,173.58.MS(ESI,positive mode):calcd.Mr=604.16 for C29H32N2O6S2Cl,found m/z=605([M+H+]).
此步反应的可能机理为:形成吲哚季铵盐B的2位上的活性甲基在碱性条件下转变成具有亲核活性的碳负离子,然后与五甲川缩合剂C发生亲核加成反应生成中间体,再继续与另一分子的吲哚季铵盐发生亲核加成消除反应,生成对称的五甲川菁染料CyI。其可能机理如下:
实施例4
染料CyIC-1和染料CyIC-2的合成:
将1mmol染料CyI与4mmol巯基烷基酸HS(CH2)2COOH加入30mLDMF的密封反应釜中,85℃反应24小时,得到中位带活性羧基五甲川菁染料CyIC。反应液冷却至室温,减压蒸干溶剂,C18-OPN反相色谱层析分离纯化,用甲醇:水=1:2~3为展开剂,CyIC首先流出为蓝色组分,产率约为51%。产物结构鉴定的核磁和质谱数据如下:
CyIC-1:1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1.73(s,12H,CH3),2.87-2.90(m,4H,CH2),3.67(s,6H,NCH3),6.74(d,2H,J=13.6 Hz,-CH=),7.41(d,2H,J=8.4 Hz,ArH),7.66(d,2H,J=8.4 Hz,ArH),7.86(s,2H,ArH),8.56(d,2H,J=13.6 Hz,-CH=),12.33(s,1H,COOH).13C NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.21,26.28,45.26,48.78,101.63,110.07,119.48,122.32,125.52,140.26,142.10,145.27,155.70,172.57,174.54.MS(ESI,positive mode):calcd.Mr=645.79 for C30H33N2O8S3,found m/z=647([M+H+]).
CyIC-2:1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):1.05(t,6H,J=6.8 Hz,N-β-CH3),1.73(s,12H,C(CH3)2),2.73-2.78(m,4H,SCH2CH2),4.21(q,4H,J=6.8 Hz,N-α-CH2),6.79(d,2H,J=13.6 Hz,-CH=),7.43(d,2H,J=8.0 Hz,ArH),7.68(d,2H,J=8.0Hz,ArH),7.88(s,2H,ArH),8.58(d,2H,J=13.6 Hz,-CH=),12.33(s,1H,COOH).13C NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ(ppm):9.58,11.71,26.34,45.03,48.90,101.26,110.01,119.65,123.10,125.70,140.50,140.93,145.24,155.92,161.88,173.58.MS(ESI,positive mode):calcd.Mr=673.84 for C32H37N2O8S3,found m/z=675([M+H+]).
实施例5
化合物CyIC-GX1的制备:
(1)将0.01mmol化合物CyIC与0.04mmol2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU)加入2mL的DMSO中,再加入0.02mmol催化剂三乙胺,常温避光反应1h,得到中位带活性琥珀酰亚胺五甲川荧光探针CyIC-NHS,由于CyIC-NHS易水解,直接用于下步反应。
(2)将含有1mg CyIC-NHS的400uL DMSO加入含有1mg短肽GX1的400uLDMSO中,再加入15uL三乙胺,常温搅拌避光反应过夜。采用HPLC分离,分离条件Prep-HPLC C18 150×19mm column,10mM NH4HCO3,5%~40%(15min) ofACN。产物CyIC-1-GX1和CyIC-2-GX1的结构鉴定质谱图显示于图1(A)和图1(B)中,数据分析如下:
CyIC-1-GX1:calculated Mr=1534 for C63H86N15O20S5,found m/z=769([Mr/2+2H+]).
CyIC-2-GX1:calculated Mr=1562 for C65H90N15O20S5,found m/z=783([Mr/2+2H+]).
实施例6
化合物CyI和CyIC的光谱特性和光稳定性检测:
首先配置化合物CyI和CyIC的二甲基亚砜(DMSO)母液,浓度为10mM;然后使用甲醇、水分别进行稀释得到测试液,浓度为1μM,室温下测试其紫外吸收和荧光发射光谱(见图2和表1)。再将化合物CyI和CyIC的二甲基亚砜(DMSO)母液用水稀释到2μM,常温不避光保存,每10天检测其紫外光谱,连续检测2个月,并与商品级Cy5.5相比较,研究其光稳定性(见图3)。
CyI和CyIC其紫外吸收光谱具有两个吸收峰,最大吸收峰在634~644nm,荧光发射峰在665~675nm(见图2),紫外吸收光谱和荧光发射光谱不成镜像对称,其斯托克斯位移值较小,CyI和CyIC的斯托克位移大约为20nm和25nm左右,染料的摩尔消光系数较大均达到105。与商品及染料Cy5.5相比较,染料CyIC具有良好的光稳定性,如图3,通过连续2个月测定其吸光度,染料CyIC-1和CyIC-2的吸光度保留值仍可达到90%和91%,Cy5.5的吸光度保留值仅为70%;常温不避光保存4个月后,Cy5.5的吸光度保留值仅为62%,CyIC的吸光度保留值仍可达约87%左右。
表1.染料CyI和CyIC在甲醇和水中的光谱性质
实施例7
染料CyIC对活细胞的毒性研究:
将1×10-3M染料储存液,以RPMI1640培养液稀释成工作液,阴性对照为含0.1%DMSO的RPMI1640培养液,采用MTT法分析染料对细胞的毒性。取对数生长期的细胞,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液稀释成2.5×104/mL的单细胞悬液,以200μL/孔加入96孔培养板内,置于37℃5%的CO2的培养箱隔夜培养。将工作浓度为0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM的花菁染料溶液以及阴性对照的溶液分别加入96孔板,另设不加染料和细胞的空白对照组。分别培养24、48、72h后每孔加入20μL(5mg/mL)的MTT溶液,将其放回培养箱继续培养4h,结束培养后,用移液器小心吸取上清,每孔加入150μL DMSO,在微量振荡器上振荡10~15min使甲瓒结晶充分溶解,随后在酶标仪490nm处读出各孔的OD值,计算细胞存活率。细胞存活率=(OD(实验组值)-OD(空白对照组)/OD(阴性对照组值)-OD(空白对照组))×100%。
如图4所示,研究了染料CyIC对GES、MKN28、AGS、SGC7901和MKN45胃癌细胞增殖的影响,MTT检测结果显示,在1.25μM浓度下,连续培养72h后,染料CyIC对GES、MKN28、AGS、SGC7901和MKN45的细胞活性百分比在90%以上(图4(A));考察了染料浓度递增对细胞的活性影响,以MKN45细胞为例(图4(B)),结果显示随着染料浓度的增加和时间的延长,染料对胃癌细胞的抑制作用稍有增强,但影响较小,此类化合物是一类毒性较小的活细胞标记染料。
实施例8
染料CyIC体外活细胞荧光成像实验:
将浓度为1×10-3M的染料CyIC-1储存液,以RPMI1640培养液稀释成工作液。待培养细胞系SGC7901处对数生长期时,常规消化,用含10%的胎牛血清的RPMI1640培养液将其稀释成1×106/mL的单细胞悬液,加入EP管中;再将染料加入其中,使染料的终浓度为5μM,在37℃5%的CO2的培养箱中继续培养24小时后,用培养液清洗两次,采用荧光显微镜观察,由于染料的发射波长位于660nm左右,荧光成像采用650nm红色荧光通道,见图5。此类染料具有活细胞膜通透性,染料能穿过细胞膜对细胞质进行选择性染色,细胞质发出红色荧光,细胞核几乎无荧光,可作为活细胞标记染料。
实施例9
染料CyIC在小鼠活体的分子影像实验:
胃癌裸鼠荷瘤模型的建立:调整带有荧光素酶的SGC7901-1uc人胃癌细胞为对数生长期后用0.25%胰蛋白酶消化,含10%的胎牛血清的RPMI1640培养液重悬,PBS溶液洗涤两次后,用PBS溶液制备成单细胞悬液,稀释成细胞密度为1×107/mL,用1mL注射器抽取肿瘤细胞悬液(2×106)接种于裸鼠前肢背部外侧皮下,每组6只裸鼠,待肿瘤体积长至200mm3左右进行光学成像检测。
在西安电子科技大学生命科学技术学院分子影像中心自行搭建的系统基础上,在上述建立的胃癌裸鼠荷瘤模型上,将CyIC-1染料以1μM/100μL/mouse瘤旁注射到已建立的雌性BALB/c裸鼠(重量约22g)的胃癌模型中,注射30分钟后,以2~3%异氟烷吸入麻醉小鼠,采用FMT光学成像系统利用650nm激光器对裸鼠进行荧光成像(图6(A)、图6(B)、图6(C)、图6(D)),其总荧光强度值分别为2.82×109、2.66×109、2.64×109、2.72×109/intensity,最大的荧光信号值分别为26773、11600、23594、18627/intensity,表现出优越的在体荧光信号,该荧光染料可作为一种光稳定性良好、低毒的在活体多模态光学分子影像探针。
实施例10
胃癌靶向探针CyIC-GX1的特异结合研究:
采用激光共聚焦显微成像和流式细胞仪研究了胃癌靶向探针CyIC-GX1的特异性,细胞染色如实施例8所述,在此采用人胃粘膜细胞GES和内皮细胞/胃癌细胞体外共培养模型Co-HUVEC,胃癌靶向探针CyIC-GX1的终浓度为5μM。如图7(A),与GES细胞相比较,Co-HUVEC细胞的细胞质和细胞核检测到更加明亮的荧光信号。图7(B)所示的荧光探针和细胞结合的百分比,CyIC-GX1对Co-HUVEC的靶向结合性是与GES细胞结合的两倍以上,(高浓度时85.9%比39.1%,低浓度时57.8%比26%)。结果均表明,胃癌靶向探针CyIC-GX1对胃癌细胞具有较高的特异结合性。
实施例11
胃癌靶向探针CyIC-GX1在体分子成像研究:
实验组:将胃癌靶向探针CyIC-GX1以5μM/200μL/mouse通过尾静脉注射到到上述实例9中所建立的胃癌裸鼠荷瘤模型上,以2~3%异氟烷吸入麻醉小鼠,采用FMT光学成像系统对裸鼠进行荧光成像,连续观测24小时。
对照组:首先将GX1以20mg/kg通过尾静脉注射到上述实例9中所建立的胃癌裸鼠荷瘤模型上,30分钟后再注射5μM/200μL/mouse的胃癌靶向探针CyIC-GX1,以2~3%异氟烷吸入麻醉小鼠,采用FMT光学成像系统对裸鼠进行荧光成像,连续观测24小时。
如图8(A)、图8(B)所示,与对照组相比较,实验组的荧光探针在胃癌组织明显聚集,通过连续24小时观测,其荧光信号在注射探针后16~18小时达到最大值(图8(C)),离体器官的荧光图像也表明探针CyIC-GX1主要聚集在肿瘤和肾脏部位(图9),表现出优异的肿瘤靶向特异性,并且在活体中易于被排泄。CyIC-GX1是一类良好的胃癌肿瘤靶向荧光探针,并可能应用于胃肿肿瘤的转移检测和抗肿瘤血管新生治疗的靶向分子成像。
Claims (8)
2.根据权利要求1所述的对称五甲川菁染料,其特征在于R1为C1-6烷基。
3.根据权利要求2所述的对称五甲川菁染料,其特征在于C1-6烷基为CH3、CH2CH3或CH2CH2CH3。
4.根据权利要求1所述的对称五甲川菁染料,其特征在于R2为水溶性基团SO3R4。
5.根据权利要求1所述的对称五甲川菁染料,其特征在于水溶性基团SO3R4的R4为钾离子K+。
6.一种如权利要求1所述的对称五甲川菁染料的制备方法,包括以下步骤:
(1)将烷基化试剂R1Y与吲哚杂环A在水热合成反应釜中反应制得吲哚季铵盐B;其中R1Y过量,反应温度70~120℃,反应时间24小时,反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈或反应物R1Y本身;
(2)二氯代丁烯醛与苯胺反应生成中位带有氯取代基的五甲川缩合剂C,二氯代丁烯醛与苯胺的投料摩尔比为1:1.2,反应溶剂为乙醇或甲醇,反应温度70~85℃;
(3)将步骤(1)制得的吲哚季铵盐B和步骤(2)制得的带有氯取代基的五甲川缩合剂C在冰醋酸与醋酸酐中反应回流1~2小时,制得桥链中位氯取代的对称五甲川菁染料CyI;吲哚季铵盐B和带有氯取代基的五甲川缩合剂C的投料摩尔比为2:1;
(4)将步骤(3)中制得的对称五甲川菁染料CyI与巯基烷基酸HS(CH2)nCOOH在水热合成反应釜中反应得中位带活性羧基对称五甲川菁染料CyIC,反应原料CyI与HS(CH2)nCOOH投料摩尔比为1:4,反应溶剂为N,N-二甲基甲酰胺DMF,反应温度70~120℃,反应时间24~48小时;
(5)将步骤(4)制得的对称五甲川菁染料CyIC与2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯“TSTU”在三乙胺的催化条件下反应制得中位带活性琥珀酰亚胺的对称五甲川菁染料CyIC-NHS,反应溶剂是二甲基亚砜DMSO,反应温度常温,反应时间1小时,对称五甲川菁染料CyIC与TSTU的投料摩尔比为1:4;
(6)将步骤(5)制得的化合物CyIC-NHS与氨基酸序列为CGNSNPKSC的胃癌血管内皮细胞特异性结合短肽GX1,在三乙胺的催化条件下反应制得胃癌靶向性荧光探针CyIC-GX1,反应溶剂为二甲基亚砜,反应条件为常温避光反应12小时,CyIC-NHS与短肽GX1的投料摩尔比为1:1。
7.根据权利要求6所述的对称五甲川菁染料的制备方法,其特征在于所述步骤(1)的烷基化试剂R1Y中,Y为碘离子I-。
8.如权利要求6步骤(3)-(6)所制备的对称五甲川菁染料CyI、CyIC和CyIC-GX1作为生物荧光探针在分子影像及活细胞成像的应用。
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