CN103911016A - 一种制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法，包括：α-溴-β-苯胺丙烯醛缩苯胺与HSX在弱碱性条件下反应生成共轭桥链中位取代的五甲川缩合剂；杂环季铵盐与共轭桥链中位取代五甲川缩合剂在醋酸酐中回流反应，制得所需的水溶性或脂溶性菁染料；反应若得到水溶性五甲川菁染料用乙醇：水：二氯甲烷=1～2：0.1～0.5：1.5～3为洗脱剂进行柱色谱分离纯化，若得到脂溶性五甲川菁染料用甲醇：乙酸乙酯=1～4：1为洗脱剂进行柱色谱分离纯化。本发明通过对称合成法，利用缩合剂与杂环季铵盐反应一步得到共轭桥链中位取代花菁染料，反应步骤简单、产率高、易于分离提纯，缩短了生产周期，简化了操作流程，降低了荧光染料的成本。

Description

一种制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法

技术领域

本发明属于有机化合物及制备技术领域，尤其涉及一种制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法。

背景技术

花菁类染料的摩尔吸收系数大，荧光发射波长范围宽，一般在600～1000nm的近红外区，可大大避免生物自身的荧光背景干扰，与成本较低的激发光源如半导体激光器匹配，用于DNA自动测序、聚合酶链反应检测及抗体免疫分析等生物领域中。现今己开发出一类多甲川类花菁染料，当中间的共轭双键数n是l、2、3时，分别为Cy3、Cy5、Cy7系列菁染料。一般生物分子在紫外区有弱荧光，为避免生物分子的自荧光，开发近红外荧光染料成为热点。特别在荧光标记时，荧光染料分子中最好只含有一个单一的活性反应基团，如羧基基团，用于与生物分子相偶联。

通常采用不对称合成方法，将活性反应基团位设计于花菁染料分子两端的杂环上，首先杂环季铵盐与花菁缩合剂反应生成半菁，半菁再与另一份杂环季铵盐反应生成菁染料，此不对称合成方法需要严格控制反应物摩尔比，而且路线复杂、副产物多、难分离提纯。

专利CN1702118A为了改进花菁染料的合成方法，采用对称合成方法将单一活性反应基团设计于花菁荧光染料的共轭桥链上，首先杂环季铵盐与花菁缩合剂反应直接生成花菁染料，再将含有单一活性反应基团的亲核试剂（如巯基或氨基）与共轭桥链上的卤素（如氯原子）反应，通过亲核取代反应获得具有单一的荧光标记活性基团的花菁染料。相比较对称合成方法和不对称合成方法，此对称合成方法简化了合成步骤，提高了目标产物的产率。但是亲核取代反应后，反应液中存在反应和未反应的两种花菁染料，此两种染料分子极性相近，柱色谱分离相对较繁琐。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法，旨在解决现有的花菁染料合成方法存在的方法复杂、副产物多、难分离提纯的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法，该制备共轭桥链中位花菁染料的方法包括：

步骤一，α-溴-β-苯胺丙烯醛缩苯胺与HSX在弱碱性条件下反应生成共轭桥链中位取代的五甲川缩合剂，α-溴-β-苯胺丙烯醛缩苯胺与HSX的摩尔比为1：5，反应溶剂为甲醇、乙醇、DMSO、DMF，反应温度60～120℃，反应时间4～12小时；

步骤二，杂环季铵盐与共轭桥链中位取代五甲川缩合剂在醋酸酐中回流反应，制得所需的水溶性或脂溶性菁染料，反应时间0.5～1小时，反应温度120℃，季铵盐与五甲川缩合剂的投料摩尔比为2：1；

步骤三，反应若得到水溶性五甲川菁染料用乙醇：水：二氯甲烷=1～2：0.1～0.5：1.5～3为洗脱剂进行柱色谱分离纯化，若得到脂溶性五甲川菁染料用甲醇：乙酸乙酯=1～4：1为洗脱剂进行柱色谱分离纯化。

进一步，步骤一中的反应方程式为：

进一步，步骤一中的五甲川缩合剂的结构为：

其中：

X=(CH₂)_nCOOH、(CH₂)_m R₁、(CH₂)_pOR₂、(CH₂)_qNR₃R₄、(CH₂)_rC₆H₅R₅；

R₁=H、NH₂、SH；

R₂=H、C1～C18烷基、环戊烷或环己烷；

R₃、R₄=H、C1～C18烷基；

R₅=H、间位或对位的卤素、间位或对位的C1～C18烷基、间位或对位的COOH、间位或对位的NH₂；

n、m、p、q=1～18；

r=0～18；

X为(CH₂)_nCOOH；n为2。

进一步，步骤二的方程式为：

反应化合物中Z为C(CH₃)₂、NCH₃、O、S、Se、CH=CH；反应化合物中R₆为C_1-6烷基；Y-为卤素离子；R₇为H、SO₃R₈、OH或卤素；R₈为Na或K。

进一步，反应化合物中Z优选为C(CH₃)₂。

进一步，反应化合物中R₆优选为C₂H₅；Y-优选为I-；R₇优选为H和SO₃R₈；R₈优选为K。

进一步，制备水溶性或脂溶性菁染料的方法为：

步骤一，五甲川缩合剂α-巯基丙酸-β-苯胺丙烯醛缩苯胺的制备：

将2.016g NaHCO₃、5mL水和3.18g巯基丙酸加入到50mL圆底烧瓶，60℃搅拌15分钟，1.806gα-溴-β-苯胺丙烯醛缩苯胺溶于15mL甲醇后加到反应瓶中，60℃反应5小时，液质监测；实验结束后，呈黄色浑浊液态，浓缩，残留物加甲醇全溶再浓缩2次，把残留的水分尽量带干，再用3mL甲醇全溶，呈红褐色溶液；慢慢加无水乙醚，有固体析出，起初呈褐色粘稠状，静置片刻呈黄色浑浊液，过滤，滤饼烘干，产率为45%；

步骤二，水溶性菁染料的制备：

将碘化N-乙基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H吲哚季铵盐与五甲川缩合剂α-巯基丙酸-β-苯胺丙烯醛缩苯胺加入圆底烧瓶中，吲哚季铵盐与缩合剂的投料摩尔比为2：1，再加入醋酸酐，120℃加热回流反应0.5～1小时；待反应溶液冷却至室温，旋干醋酸酐，用乙醇：水：二氯甲烷=1.6：0.3：1.9～2.2为洗脱剂对粗产物进行柱色谱分离纯化；

步骤三，脂溶性菁染料的制备：

将制备的碘化N-乙基-2,3,3-三甲基-苯并吲哚季铵盐与五甲川缩合剂α-巯基丙酸-β-苯胺丙烯醛缩苯胺以摩尔比为2：1的比例加入圆底烧瓶中，再加入醋酸酐作为催化剂，120℃回流反应0.5～1小时，得墨绿色溶液，65℃旋蒸，待其呈粘稠状后停止，立刻加入提前预热至65℃的甲醇：水为5:1的混合溶液，可见瓶壁上立刻析出颗粒状固体；静置冷却，抽滤得粗产物；用甲醇：乙酸乙酯=1：1为洗脱剂对粗产物进行柱色谱分离纯化。

本发明提供的制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法，通过对称合成法，利用缩合剂与杂环季铵盐反应一步得到共轭桥链中位取代花菁染料，反应步骤简单、产率高、易于分离提纯。本发明的方法耗时短，操作流程简化，降低此类荧光染料的成本，易实现产业化，可进一步促进荧光菁染料在生物医学领域的发展。此外，本发明缩短了生产周期，简化了操作流程，降低了荧光染料的成本，进一步促进了荧光菁染料在各个领域的发展。

附图说明

图1是本发明实施例提供的制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

如图1所示，本发明实施例的制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法包括以下步骤：

本发明制备的共轭桥链中位取代五甲川菁染料的缩合剂具有以下通式的结构：

其中：

X=(CH₂)_nCOOH、(CH₂)m R₁、(CH₂)_pOR₂、(CH₂)_qNR₃R₄、(CH₂)_rC₆H₅R₅；

R₁=H、NH₂、SH；

R₂=H、C1～C18烷基、环戊烷或环己烷；

R₃、R₄=H、C1～C18烷基；

R₅=H、间位或对位的卤素、间位或对位的C1～C18烷基、间位或对位的COOH、间位或对位的NH₂；

n、m、p、q=1～18；

r=0～18；

X为(CH₂)_nCOOH；n为2。

本发明主要在前人工作基础上设计合成了一类共轭桥链中位取代的五甲川菁染料缩合剂，通过对称合成法，利用此缩合剂与杂环季铵盐反应一步得到共轭桥链中位取代的五甲川菁染料，具有反应步骤简单、产率高、易于分离提纯的有点。具体包括以下步骤：

（1）α-溴-β-苯胺丙烯醛缩苯胺与HSX在弱碱性条件下反应生成共轭桥链中位取代的五甲川缩合剂，α-溴-β-苯胺丙烯醛缩苯胺与HSX的摩尔比为1：5，反应溶剂为甲醇、乙醇、DMSO、DMF等、反应温度60～120℃，反应时间4～12小时。

（2）杂环季铵盐与共轭桥链中位取代五甲川缩合剂在醋酸酐中回流反应，制得所需的水溶性菁染料1和脂溶性菁染料2，反应时间0.5～1小时，反应温度120℃，季铵盐与五甲川缩合剂的投料摩尔比为2：1。

反应化合物中Z为C(CH₃)₂、NCH₃、O、S、Se、CH=CH；反应化合物中R₆为C_1-6烷基；Y-为卤素离子；R₇为H、SO₃R₈、OH或卤素；R₈为Na或K。

反应若得到水溶性五甲川菁染料用乙醇：水：二氯甲烷=1～2：0.1～0.5：1.5～3为洗脱剂进行柱色谱分离纯化，若得到脂溶性五甲川菁染料用甲醇：乙酸乙酯=1～4：1为洗脱剂进行柱色谱分离纯化。

反应化合物中Z可为C(CH₃)₂、NCH₃、O、S、Se、CH=CH，优选为C(CH₃)₂。

上述反应化合物中R₆为C_1-6烷基，优选为C₂H₅；Y-为卤素离子，优选为I-；R₇为H、SO₃R₈、OH或卤素，优选为H和SO₃R₈；R₈为Na或K，优选为K。

结合以下的具体实施例对本发明做进一步的说明：

实施例1

五甲川缩合剂（α-巯基丙酸-β-苯胺丙烯醛缩苯胺）的制备：

反应方程为：

将2.016g（0.024mol）NaHCO₃、5mL水和3.18g（0.03mol）巯基丙酸加入到50mL圆底烧瓶，60℃搅拌15分钟，1.806g（0.006mol）α-溴-β-苯胺丙烯醛缩苯胺溶于15mL甲醇后加到反应瓶中，60℃反应5小时，液质监测。实验结束后，呈黄色浑浊液态，浓缩，残留物加甲醇全溶再浓缩2次，把残留的水分尽量带干，再用3mL甲醇全溶，呈红褐色溶液。慢慢加无水乙醚，有固体析出，起初呈褐色粘稠状，静置片刻呈黄色浑浊液，过滤，滤饼烘干，产率约为45%。

实施例2

水溶性菁染料CyIC-2的制备：

将碘化N-乙基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H吲哚季铵盐与五甲川缩合剂（α-巯基丙酸-β-苯胺丙烯醛缩苯胺）加入圆底烧瓶中，吲哚季铵盐与缩合剂的投料摩尔比为2：1，再加入醋酸酐，120℃加热回流反应0.5～1小时。待反应溶液冷却至室温，旋干醋酸酐，用乙醇：水：二氯甲烷=1.6：0.3：1.9～2.2为洗脱剂对粗产物进行柱色谱分离纯化。

实施例3

脂溶性菁染料CyBC-2的制备：

将制备的碘化N-乙基-2,3,3-三甲基-苯并吲哚季铵盐与五甲川缩合剂（α-巯基丙酸-β-苯胺丙烯醛缩苯胺）以摩尔比为2：1的比例加入圆底烧瓶中，再加入醋酸酐作为催化剂，120℃回流反应0.5～1小时，得墨绿色溶液，65℃旋蒸，待其呈粘稠状后停止，立刻加入提前预热至65℃的甲醇：水为5:1的混合溶液，可见瓶壁上立刻析出颗粒状固体；静置冷却，抽滤得粗产物；用甲醇：乙酸乙酯=1：1为洗脱剂对粗产物进行柱色谱分离纯化。

本发明的方法可以缩短生产周期，简化操作流程，降低此类荧光染料的成本，进一步促进荧光菁染料在各个领域的发展。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法，其特征在于，该制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法包括：

步骤一，α-溴-β-苯胺丙烯醛缩苯胺与HSX在弱碱性条件下反应生成共轭桥链中位取代的五甲川缩合剂，α-溴-β-苯胺丙烯醛缩苯胺与HSX的摩尔比为1：5，反应溶剂为甲醇、乙醇、DMSO、DMF，反应温度60～120℃，反应时间4～12小时；

步骤二，杂环季铵盐与共轭桥链中位取代五甲川缩合剂在醋酸酐中回流反应，制得所需的水溶性或脂溶性菁染料，反应时间0.5～1小时，反应温度120℃，季铵盐与五甲川缩合剂的投料摩尔比为2：1；

步骤三，反应若得到水溶性五甲川菁染料用乙醇：水：二氯甲烷=1～2：0.1～0.5：1.5～3为洗脱剂进行柱色谱分离纯化，若得到脂溶性五甲川菁染料用甲醇：乙酸乙酯=1～4：1为洗脱剂进行柱色谱分离纯化。

2.如权利要求1所述的制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法，其特征在于，步骤一中的反应方程式为：

3.如权利要求1所述的制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法，其特征在于，步骤一中的五甲川缩合剂的结构为：

其中：

X=(CH₂)_nCOOH、(CH₂)m R₁、(CH2)_pOR₂、(CH₂)_qNR₃R₄、(CH₂)_rC₆H₅R₅；

R₁=H、NH₂、SH；

R₂=H、C1～C18烷基、环戊烷或环己烷；

R₃、R₄=H、C1～C18烷基；

R₅=H、间位或对位的卤素、间位或对位的C1～C18烷基、间位或对位的COOH、间位或对位的NH₂；

n、m、p、q=1～18；

r=0～18；

X为(CH₂)_nCOOH；n为2。

4.如权利要求1所述的制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法，其特征在于，步骤二的方程式为：

反应化合物中Z为C(CH₃)₂、NCH₃、O、S、Se、CH=CH；反应化合物中R₆为C_1-6烷基；Y-为卤素离子；R₇为H、SO₃R₈、OH或卤素；R₈为Na或K。

5.如权利要求4所述的制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法，其特征在于，反应化合物中Z优选为C(CH₃)₂。

6.如权利要求4所述的制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法，其特征在于，反应化合物中R₆优选为C₂H₅；Y^-优选为I^-；R₇优选为H和SO₃R₈；R₈优选为K。

7.如权利要求1所述的制备共轭桥链中位取代花菁染料的方法，其特征在于，制备水溶性或脂溶性菁染料的方法为：

步骤一，五甲川缩合剂α-巯基丙酸-β-苯胺丙烯醛缩苯胺的制备：

将2.016g NaHCO₃、5ml水和3.18g巯基丙酸加入到50mL圆底烧瓶，60℃搅拌15分钟，1.806gα-溴-β-苯胺丙烯醛缩苯胺溶于15mL甲醇后加到反应瓶中，60℃反应5小时，液质监测；实验结束后，呈黄色浑浊液态，浓缩，残留物加甲醇全溶再浓缩2次，把残留的水分尽量带干，再用3mL甲醇全溶，呈红褐色溶液；慢慢加无水乙醚，有固体析出，起初呈褐色粘稠状，静置片刻呈黄色浑浊液，过滤，滤饼烘干，产率为45%；

步骤二，水溶性菁染料的制备：

将碘化N-乙基-2,3,3-三甲基-5-磺酸基-3H吲哚季铵盐与五甲川缩合剂α-巯基丙酸-β-苯胺丙烯醛缩苯胺加入圆底烧瓶中，吲哚季铵盐与缩合剂的投料摩尔比为2：1，再加入醋酸酐，120℃加热回流反应0.5～1小时；待反应溶液冷却至室温，旋干醋酸酐，用乙醇：水：二氯甲烷=1.6：0.3：1.9～2.2为洗脱剂对粗产物进行柱色谱分离纯化；

步骤三，脂溶性菁染料的制备：

将制备的碘化N-乙基-2,3,3-三甲基-苯并吲哚季铵盐与五甲川缩合剂α-巯基丙酸-β-苯胺丙烯醛缩苯胺以摩尔比为2：1的比例加入圆底烧瓶中，再加入醋酸酐作为催化剂，120℃回流反应0.5～1小时，得墨绿色溶液，65℃旋蒸，待其呈粘稠状后停止，立刻加入提前预热至65℃的甲醇：水为5:1的混合溶液，可见瓶壁上立刻析出颗粒状固体；静置冷却，抽滤得粗产物；用甲醇：乙酸乙酯=1：1为洗脱剂对粗产物进行柱色谱分离纯化。