CN103952143A - 一种用于蛋白质标记的三甲川菁类荧光探针及合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型的运用于蛋白质标记的荧光探针及其合成方法。该化合物是由两种水溶性的吲哚类的化合物缩合而成，通过化合物中的碘乙酰胺基团与蛋白质的巯基反应，从而实现蛋白质的定点荧光标记。该化合物具有良好的水溶性、高摩尔吸光系数，较长的激发波长，同时具有合成简便，蛋白标记条件温和等优点。此探针可以用于蛋白质的定点荧光标记，对研究蛋白质的结构、功能以及动态学的特征有着重要的帮助。该探针的激发发射波长在500-600nm的范围内，有较短的连接基团，可以对蛋白质的结构、动态学特征及生物学功能进行更精确的描述。
Description
技术领域
本发明涉及生物大分子标记，更具体涉及用于蛋白质标记的水溶性近红外荧光探针。
背景技术
蛋白质的结构、运动和功能对生命体的运动有着十分重要的意义。研究蛋白质的结构及动态学的手段包括荧光光谱、核磁共振、电子显微镜、X射线晶体衍射等。蛋白质的荧光分析法具有灵敏度高、检测方法简便等优势得到广泛应用。其方法是在相应的位点标记上荧光探针，通过对其荧光特性的观察来描述蛋白质的结构、运动和功能等特征。
三甲川花菁类的化合物是一种近红外的荧光染料，激发、发射波长一般在500-600nm，量子产率较高，可以有效避免生物体的背景干扰，提高检测的灵敏度，水溶性的花菁类探针的标记更有利于生理条件下的荧光检测。
近期作为蛋白质定点标记使用的激发波长在500-600nm范围内的三甲川菁类化合物的发展非常迅速，Alexei Toutchkine等人发展了一类Cy3.2-IA及neo-Cy3化合物如下式所示，由于其前体的合成成本较高，前体合成步骤复杂且涉及到浓硫酸浓硝酸等危险品，影响了其推广。而目前市售的三甲川花菁类蛋白探针如Cyanine3-NHS-ester、Cy3-Maleimide这类化合物由于其结构的原因导致其水溶性较差，且不够刚性，难以对蛋白的结构以及动态学 的特征进行精确的描述。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于蛋白质标记的三甲川菁类荧光探针，该探针将吲哚三甲川花菁素类的化合物引入了亲水性的磺酸基团，提高了水溶性；减少了连接位点与荧光基团的距离，提高了探针的刚性；从而解决了目前蛋白质荧光探针水溶性差、连接基团较长的问题。
本发明的另一目的是提供一种上述探针的合成方法，该方法在合成过程中不使用浓硫酸、浓硝酸等危险管控试剂。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于蛋白质标记的三甲川菁类荧光探针，该探针的结构如下式所示：
上述一种用于蛋白质标记的三甲川菁类荧光探针的合成方法分为两步反应，第一步反应1是将化合物I和化合物II在氯乙酸酐和醋酸盐在有机溶剂1中缩合而成，获得中间产物III；第二步反应2是将所得相应的化合物III与碘盐在有机溶剂2中加热反应得到目标产物IV；如下式所示：
所述的化合物I其对应的阳离子为钾离子或钠离子；R=H、-COCH3
所述的化合物II中，X=Cl，Br，其对应的阳离子为钾离子或
钠离子。
所述的有机溶剂1为N，N-二甲基甲酰胺、乙腈或氯仿等。
所述的有机溶剂2为甲醇与氯仿的混合溶剂或甲醇与二氯甲
烷的混合溶剂。
所述的醋酸盐为醋酸钾或醋酸钠等。
所述的碘盐为碘化钾或碘化钠等。
本发明的优点是：本发明的探针将吲哚三甲川花菁素类的化合物引入了亲水性的磺酸基团，提高了水溶性；减少了连接位点与荧光基团的距离，提高了探针的刚性；从而解决了目前蛋白质荧光探针水溶性差、连接基团较长的问题。由于激发和发射光谱位于近红外区域，作为一种蛋白质定点标记的探针，可以有效降低背景荧光干扰，提高信噪比。同时，该荧光探针的柔性较小，有利于对生物大分子的结构和动态学特征的精确描述。本发明探针的合成方法在合成过程中不使用浓硫酸、浓硝酸等危险管控试剂，减少了合成过程中的危险性，易于推广应用。
附图说明
图1为本发明的探针与Ub-LBT-CW蛋白在pH=7.420mMHEPES的体系中混合2小时后，过脱盐柱除去小分子后收集的Ub-LBT-CW的蛋白的激发发射图谱。
其中：实线表示激发光谱，虚线表示发射光谱。激发波长为：553nm 发射波长为：566nm。说明本发明的探针已经成功连接到了蛋白上。
具体实施方式
以下结合附图，对本发明作进一步的说明。
一种用于蛋白质标记的三甲川菁类荧光探针的具体结构如下：
上述一种用于蛋白质标记的水溶性近红外荧光探针的合成方法分为两步，第一步反应一是将1.2-1.5当量的化合物I和1当量的化合物II在1.5-3.5当量的氯乙酸酐和1.5-3.5当量的醋酸盐在有机溶剂1中室温搅拌0.5-1.5小时，得到中间产物III；第二步反应二是将1当量的中间产物III与1.1-1.5当量的碘盐在有机溶剂2中加热至40-70℃回流12-24小时，得到目标产物IV，即三甲川菁类荧光探针；如下式所示：
上述一种用于蛋白质标记的三甲川菁类荧光探针的合成方法分为两步反应，第一步反应1是将化合物I和化合物II在氯乙酸酐和醋酸盐在有机溶剂1中缩合而成，获得中间产物III；第二步反应2是将所得相应的化合物III与碘盐在有机溶剂2中加热反应得到目标产物IV；如下式所示：
所述的化合物I其对应的阳离子为钾离子或钠离子；R=H、-COCH3
所述的化合物II中，X=Cl，Br，其对应的阳离子为钾离子或钠离子。
所述的有机溶剂1为N，N-二甲基甲酰胺、乙腈或氯仿等。
所述的有机溶剂2为甲醇与氯仿的混合溶剂或甲醇与二氯甲烷的混合溶剂。
所述的醋酸盐为醋酸钾或醋酸钠等。
所述的碘盐为碘化钾或碘化钠等。
实施例1：
一种用于蛋白质标记的三甲川菁类荧光探针的合成方法，该方法按下列步骤进行：
取1当量R=H的化合物I的钾盐与1.2当量X=Cl的化合物II的钠盐，溶于乙腈中，加入1.5当量的醋酸钠和1.5当量的氯乙酸酐，室温搅拌1小时。旋蒸除去溶剂，柱层析，用甲醇：丙酮=1:7洗脱，得到相应的化合物III。将所得到的1当量的化合物III与1.1当量的碘化钾在甲醇：氯仿=1：1的溶剂中60℃反应24小时，过滤，旋蒸除去溶剂，得到对应的最终的产物IV。经核磁谱确认与目标产物吻合。
实施例2：
一种用于蛋白质标记的三甲川菁类荧光探针的合成方法，该方法按下列步骤进行：
取1当量R=H的化合物I的钠盐与1.2当量X=Br的化合 物II的钠盐，溶于氯仿中，加入2当量的醋酸钠和2当量的氯乙酸酐，室温搅拌1.2小时。旋蒸除去溶剂，柱层析，用甲醇：丙酮=1:5洗脱，得到相应的化合物III。将所得到的1当量的化合物III与1.5当量的碘化钠在甲醇：氯仿=1：2的溶剂中70℃反应20小时，过滤，旋蒸除去溶剂，得到对应的最终的产物IV。经核磁显示与目标产物吻合。
实施例3：
一种用于蛋白质标记的三甲川菁类荧光探针的合成方法，该方法按下列步骤进行：
取R=-COCH3的的化合物I的钾盐0.7g与0.38g的X=Br的化合物II的钾盐，溶于10ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.43g的氯乙酸酐和0.2g的醋酸钠，室温搅拌1小时。旋蒸除去溶剂，柱层析，用甲醇：丙酮=1:5洗脱，得到相应的化合物III。将所得到的0.30g的化合物III与1g的碘化钠在甲醇：氯仿=1：1的溶剂中65℃反应24小时，过滤，旋蒸除去溶剂，得到对应的最终的产物IV0.32g。经核磁显示与目标产物吻合。
Claims (2)
1.一种用于蛋白质标记的三甲川菁类荧光探针，其特征在于，该探针的结构如下式所示：
2.制备权利要求1所述的一种用于蛋白质标记的三甲川菁类荧光探针的合成方法，其特征在于，该方法分为两步反应，第一步反应1是将化合物I和化合物II在氯乙酸酐和醋酸盐在有机溶剂1中缩合而成，获得中间产物III；第二步反应2是将所得相应的化合物III与碘盐在有机溶剂2中加热反应得到目标产物IV；如下式所示：
其中，化合物I其对应的阳离子为钾离子或钠离子；R＝H、 -COCH3；化合物II中，X＝Cl，Br，其对应的阳离子为钾离子或钠离子；有机溶剂1为N，N-二甲基甲酰胺、乙腈或氯仿；
有机溶剂2为甲醇与氯仿的混合溶剂或甲醇与二氯甲烷的混合溶剂；醋酸盐为醋酸钾或醋酸钠；碘盐为碘化钾或碘化钠。
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