JP2008502681A - 蛍光標識としての置換アザポルフィン - Google Patents

Abstract

本発明は、マーカー成分、蛍光プローブ、オリゴヌクレオチド、ハイブリダイゼーションアッセイ、およびこのような生成物を使用するイムノアッセイ、ならびにこのような生成物を製造する方法に関する。本発明によれば、該分子平面の両側に１つずつ、２つの小さい可溶化基に結合した蛍光部分を含む検出可能に標識されたマーカー成分であって、前記蛍光部分は、溶媒感受性および非特異的結合の問題を軽減または除去するように正味電荷を制御するための置換基を有する、マーカー成分が提供される。

Description

本願は一般に、蛍光写真法、蛍光定量測定および蛍光プローブに関する。

本明細書で言及されている出版物および他の参考資料は、参照により本書に援用される。以下の、発明の背景に関する以下の記述は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明を説明したり、先行技術を本発明に組み入れるものではない。

プロフィリン類、フタロシアニン類および他のアザポルフィリンならびにある種の他の芳香族窒素含有大環状分子は、その近赤外吸収および発光のため、当分の間、蛍光標識として使用するための魅力的な候補者であった。

フタロシアニン類は、特に近赤外吸収が強く（モル吸光係数約２００，０００）、量子収率が高くまた一般的な金属フタロシアニン色素の退色に抵抗するため、それらを蛍光標識として利用するために多くの努力が払われてきた。しかし、フタロシアニンは、殊に向かい合った集合体状でスタッキングすることによって会合したり、様々な他の分子表面に強く結合したり（非特異的結合）する傾向が異常に強いため、この線に沿った当初の努力は、完全に申し分ない成果をもたらしはしなかった。

分子内スタッキンッグの結果として、未置換のフタロシアニンは、有機溶媒中でも、水性溶媒中でも、非常に低い溶解性を有する。今では周知の通り、スタッキングする傾向は、荷電基、たとえばスルホネートの導入により、低減させることができる。このような置換基を有するフタロシアニンは、水中および電解質の水溶液中で高い溶解性を有する可能性はあるが、非特異的に結合する傾向は、大部分が存続する。蛍光標識に対する科学的興味の多くは、生体試料たとえば組織切片、細胞、細胞片、グリコールタンパク質およびリポタンパク質を含むタンパク質、ペプチド類、オリゴ糖、多糖類、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび脂質を含む用途に集中している。こうした試料を含む蛍光測定で非特異的に結合する傾向は、当該の特異的相互作用を部分的にマスキングすることにより妨げることが可能である。該非特異的結合ならびにスタッキング傾向は、該フタロシアニン色素を、１以上のポリオキシヒドロカルビル基、一般的にメトキシ末端ポリ（エチレングリコール）、（ＰＥＧ）にカップリングすることにより、治療薬物の測定で無視できるレベルまで低減させることができる。同時に、このような基の付着は、望ましい吸収特性および発光特性を持続する。同テクノロジーはまた、多種多様な他の近赤外色素にも有効である。米国特許第５，４０３，９２８号明細書を参照されたい。

イムノアッセイで関連パラメーターを測定する能力は、さらに著しく進歩した。たとえば、「過渡状態発光測定装置（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｓｔａｔｅ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｓｓａｙ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）」と題する、ダンドライカー（Ｄａｎｄｌｉｋｅｒ）らに付与された米国特許第５，３０２，３４９号明細書（あらゆる図面を含め、全体として、参照により本明細書に援用する）に記載の技術を使用することにより、均一アッセイ形式で、すなわち結合形と遊離形の分離を必要とせずに、成分の結合形および遊離形の濃度を決定することが可能になる。

蛍光標識の分野およびデータ分析面で顕著かつ有望な改良がなされたにもかかわらず、本質的な利点を有するのみならず、調製が容易でかつより高い化学的安定性を有するさらなる色素が、当技術分野で依然として必要である。他の研究者による、密接な関係がある先行技術は、米国特許第５，１３５，７１７号明細書、米国特許第５，３４６，６７０号明細書、および米国特許第５，４９４，７９３号明細書で見つけられる。

本発明
本発明は、ある種のフタロシアニンは、蛍光性プローブの作製に有用な蛍光色素に変換できるという結果の発見および適用として、特徴づけ、説明することができる。これは、数原子しか持たない軸配位子を担持する適切な金属原子を有するフタロシアニンを提供すること、および必要な付加として、通常は負の、イオン電荷を提供するための環置換により、実行することができる。こうした変化は、分子スタッキンッグ（向かい合った集合体）および同符号の電荷を担持する他分子表面への非特異的結合も、大部分排除する。

本発明は、−ＯＨのような、非常に小さい基でさえも、このような２個の基が、分子平面の両側に１個ずつ存在し、かつ該分子全体の正味電荷が十分に大きければ、平面分子の非特異的結合およびスタッキンッグを効果的に防御できるという予期せぬ結果に端を発する。

したがって、本発明の一態様は、ポリオキシヒドロカルビル基にカップリングすることによってフタロシアニン類および他の蛍光色素を工作することの望ましい効果を、該色素上の正味電荷が十分に大きいという条件で、代わりに２つの非常に小さい軸配位子（たとえば−ＯＨ等）によって得られることである。生理的ｐＨ範囲で、タンパク質およびＤＮＡを包含するほとんどの生体試料も、負の正味電荷を担持するため、たいていの場合、この正味電荷は、好ましくは負である。したがって、抗体を標識するために使用するとき、ある種のスルホン化ジヒドロキシシリコンジカルボキシフタロシアニン、特にラホヤブルー３（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｂｌｕｅ−３）（ＬＪＢ−３）は、高い活性および特異性を有する複合物をもたらすことを、本発明者らは発見した。ＬＪＢ−３は、軸ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を担持する色素／フルオロフォアより調製がはるかに容易であり、加えて、ＬＪＢ−３は、化学的にはるかに安定している。図１は、（ＬＪＢ−３）の推定される構造を示す。スルホ基の位置は不確実であり、他の未置換のベンゾ環のいずれか１つにあると考えられる。ＬＪＢ−３に関する近赤外吸光度は、６７９ｎｍで最大である。

フルオロフォア（蛍光部分）の性能は、遊離色素（すなわち完成した蛍光プローブ状ではない）を用いた測定で、ある程度評価することができる。この種のテストで重要なパラメーターとしては、該フルオロフォアが、異なるイオン強度、特定のイオンまたは血清中に存在するような生体分子に暴露されるとき通常変化する、蛍光強度および偏光／異方性などがある。こうした作用は、「溶媒効果」と考えられ、凝集の状態を変えるための該フルオロフォアの分子間の相互作用またはフルオロフォア分子と溶媒成分との相互作用（非特異的結合、ＮＳＢ）の変化のいずれかによって生じる可能性がある。

本発明の色素構造とフタロシアニン類（Ｐｃ）を蛍光プローブ用標識として使用しようとする以前の試みの構造との際立った相違は、遊離色素を血清に添加し、結果として生じる偏光または異方性を測定する、ＮＳＢ用のテスト形式で判断することができる。結合したときの分子量の増加は、回転ブラウン運動の速度低下を招くため、非特異的結合が生じれば、偏光が増加する。

表１で、表の端から端まで水平に進むと、いずれか１つの色素の性能を、蛍光強度の変化（Ｉ）、および／または偏光の変化（ｍｐ、ミリ偏光単位）によって判断することができる。「完璧な」蛍光標識であれば、溶媒組成と関係なく、これらの各パラメーターは同じ値を有するであろう。

正常なヒト血清中での挙動と、グリセロール中での挙動との比較は、血清の存在下での、ＮＳＢによる潜在的偏光変化の損失の尺度となるため、有益である。列挙した５つの色素では、グリセロール中での偏光と、正常なヒト血清中での偏光との差の値は、６０．４、７３．６、１０３、１２、６１および４４．１である。これらの差は、中心原子としてのＳｉの劇的な有益な効果を示し、またＬＪＢ−３を群の最良の選択として提示する。グリセロール中での強度を、正常なヒト血清中での強度で割った比率もまた、指標となる。表を下に下がると、これらは、１．４６、１．２７、１．５１、２．９１、４．８２および０．４２であり、またＳｉがＡｌより著しく優れていること、およびＬＪＢ−３の極めて満足のいく性能を示す。

加えて、ＬＪＢ−３は、カルボキシル基およびスルホン酸基の両者を有し、多くの方法で「活性化」することができる、すなわち、自発的に反応して、生理的ｐＨおよび環境温度で、標識すべき生体分子上の基（通常はアミノ）と共有結合する構造に変換することができる。本発明者らは、抗体、ｖｉｚ．を標識するために、カルボニルジイミダゾールおよびスクシンイミジルテトラメチルウロニウム・テトラフルオロボレート（ＳＴＵＴ）という２つの異なる活性化試薬を使用した。後者の試薬は、取り扱い易さという点でも、結果の再現性という点でも、好ましいことが分かった。これは、ＳＴＵＴを使用するとき、中間体である、該色素のＮＨＳエステルの安定性が高いためであろう。加えて、ＳＴＵＴで活性化するための最良の溶媒は、ＤＭＳＯであることが分かった。ＤＭＦを使用してもよいが、避けられない微量のアミン類に悩まされる公算が高い。

フルオロフォアの、所与の用途への適合性に関する最も信頼できるテストは、該色素を、完成したプローブに組み入れて、該プローブをテストすることである。該遊離色素を用いた上記血清試験は有用な指標であるが、特異的プローブを用いて行われるテストに完全に取って代わることはできない。

表２および表３は、ＬＪＢ−３標識抗ヒトＩｇＧをＡＮＡ（抗核抗体）用プローブとして使用した、説明に役立つ結果を示す。性能の質は、ＦＩＵ（正／負）（またはＦＩＵ［＋／−］）値、すなわち陰性（正常）コントロールからのシグナルと比較した、陽性サンプルからのシグナルの比率によって評価することができる。７以上の値は、有用である；これらの表中のデータは、該テクノロジーが開発されようとしている時に得られた；日常的な使用で、ＦＩＵ（＋／−）のより高い値は、一様な結果となることが予期されるであろう。

全般的論考
本発明は、−ＯＨのような非常に小さい基でさえも、このような２個の基が、分子平面の両側に１個ずつ存在し、かつ正味電荷が十分に大きければ、平面分子における非特異的結合およびスタッキンッグを、水溶液中で効果的に防御できるという予期せぬ結果に端を発する。

したがって、本発明の一態様は、ポリオキシヒドロカルビル基にカップリングすることによってフタロシアニンおよび他の蛍光色素を工作することの望ましい効果を、該色素上の正味電荷が十分に大きいという条件で、代わりに２つの非常に小さい軸配位子（たとえば−ＯＨ等）によって得られることである。生理的ｐＨ範囲で、タンパク質およびＤＮＡを包含するほとんどの生体試料も、負の正味電荷を担持するため、たいていの場合、この正味電荷は、好ましくは負である。したがって、抗体を標識するために使用するとき、ある種のスルホン化ジヒドロキシシリコンジカルボキシフタロシアニン類（特にＬＪＢ−３、図１）は、ＰＥＧ−複合非スルホン化色素とほぼ同じ位低い、血清タンパク質への非特異的結合性を有することを、本発明者らは発見した。

加えて、ＰＥＧによるミセル形成がないという点において、利点が現れる。１０^-4Ｍ以上の色素濃度で、ＰＥＧ工作色素は、３０Ｋダルトン以上の分子の通過を妨害するようにデザインされた膜の通過が非常に妨げられるという点で、概して巨大分子のように行動する。また、該色素は、巨大分子を小分子と分離するためにデザインされたゲル浸透クロマトグラフィーにおいて空隙容量内で移動する。対照的に、ＬＪＢ−３は、その式量を有する分子について予想される通りに行動する。

蛍光偏光および強度の変化によって測定されるような非特異的結合に関して、該色素が、たとえば、希釈したヒト血清ＬＪＢ−３に暴露されたとき、ＰＥＧ結合した色素とほぼ同様に行動する。これに関連して、非スルホン化ジヒドロキシジカルボキシシリコンフタロシアニンが、かなりの非特異的結合を示すことを考えると、負電荷それ自体が、非特異的結合の減少に著明な影響を及ぼすことに注目することは重要である。ヒドロキシアルミニウムフタロシアニントリスルホネートは、イオン強度に対する強い感受性を示し、また強い非特異的結合も有する。該フタロシアニン分子は、分子平面の両側に軸配位子を有するに違いないが、該正味電荷が十分に高ければ、−ＯＨ基は、非特異的結合を事実上排除できるほど十分に大きいと思われる。

本発明のもう１つの利点は、標識されようとしている分子、たとえばタンパク質およびオリゴヌクレオチドが、それ自体、負に帯電していても、高電荷とともに、−ＯＨまたは他の小さい可溶化軸配位子によって工作された色素は、（標識反応で）化学的にはるかに反応しやすいと思われることである。このことから、ＰＥＧ配位子は、巨大分子の標識に干渉するが、ハプテンおよび他の小分子の標識は通常、容易に進行することが示唆される。

より小さい負の正味電荷を有するジヒドロキシジカルボキシシリコンフタロシアニンは、アルミニウム色素よりさらに強い非特異的結合を示すであろうと推測される可能性がある、ヒドロキシアルミニウムフタロシアニントリスルホネートの強い非特異的結合を考慮すると、本発明は全く予想外である。本発明は、正反対を示す結果に、ある程度基づいている。他の小さい軸配位子たとえば−ＯＣＨ₃、−Ｏ−ＣＨ₂ＯＨ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−Ｆの作用もまた有用であろう。−ＯＰＯ₃Ｈ₂ ^-の挙動もまた重要であり、他の潜在的に有用な配位子、たとえばボレートおよびサルフェート等が示唆される。

多くの他の窒素含有大環状分子は、１４族原子でメタレートすることができ、類似した結果が得られる。このような大環状分子は、ポルフィリン類、アザポルフィリン類、コロール類、サフィリン類（ｓａｐｐｈｙｒｉｎｓ）、ペンタフィリン類、ポルフィセン類、および広範囲にわたって非局在化したπ電子系を有する他の類した大環状分子の誘導体および構造的変異形を包含する。このような大環状分子は、多くの望ましい性質を組み入れることを考慮すると、殊に好ましいクラスの大環状分子は、アザポルフィリン誘導体および構造的変異形を含む。アザポルフィリン誘導体は、モノ−、ジ−、およびトリアザポルフィリンおよびプロフィラジン（ｐｒｏｐｈｙｒａｚｉｎｅ）の誘導体を包含する。これらの大環状分子はいずれも、任意に縮合芳香族環も有してもよい。このようなアザポルフィリン誘導体および変異形は、フタロシアニン、ベンゾトリアザポルフィリンおよびナフタロイアニン（ｎａｐｈｔｈａｌｏｙａｎｉｎｅ）およびそれらの誘導体ならびにそれらのオキサ−、チア−、またはアザ−構造的変異形を包含する。ある種の非大環状芳香族構造、たとえばキサンテン誘導体もまた、上記クラスの必要な蛍光特性を有する可能性がある（ドールトロッツォ（Ｄａｌｔｒｏｚｚｏ）ら、米国特許第６，５５２，１９９号明細書、２００３年４月２３日）。

したがって、本発明は、マーカー成分、蛍光プローブ、天然および合成の治療薬物、抗原、ハプテン、抗体、オリゴヌクレオチド、ハイブリダイゼーション・アッセイ、およびこのような生成物を使用するイムノアッセイならびにこのような生成物を製造する方法に関する。本発明によれば、通常は軸上の２つ以上の小さい可溶化配位子に結合したフルオロフォア部分を含み、該軸は、中心金属原子により形成される錯体の八面体形状によって画定される、検出可能に標識されたマーカー成分が提供され、これによって、溶媒感受性および非特異的結合という問題が好ましく軽減または除去される。

このような検出可能な標識またはマーカー成分をアッセイで使用することは、こうした標識が、血清等の生体試料の存在下および非存在下で、実質的に同じ強度の、蛍光発光の平行成分および垂直成分を有する点で有利である。したがって、こうした標識を使用する検定方法は、組織サンプルまたは培養細胞等の、体液中または生体表面上の低濃度の分析物、標的分析物またはその類似物を検出することができる。用語「分析物」は、少なくとも１つの共通のエピトープ部位または受容体を共有する、モノエピトープ性または多エピトープ性である、抗原性またはハプテン性の、１以上の化合物である、その受容体が天然に存在する任意の化合物であってもよく、または調製することができる、アッセイで測定しようとしている化合物を指す。用語「標的分析物」は、少なくとも１つの共通のエピトープ部位または受容体を共有する、モノエピトープ性または多エピトープ性である、抗原性またはハプテン性の、１以上の化合物である、その受容体が天然に存在する任意の化合物であってもよく、または調製することができる、アッセイで測定しようとしている化合物を指す。標的分析物の「類似物」は、受容体への結合に関して、標的分析物と競合することができる化合物を意味する。用語「受容体」は、標的分析物またはその類似物を特異的に認識することができるか、または標的分析物またはその類似物により認識される分子複合体を指す。抗体は、抗原にとって受容体であろう。

これらのマーカー成分は、分析物、抗原、抗体または他の分子を標識するための標識として使用することが可能である。該マーカー成分が、該分析物、抗原、抗体または他の分子に結合できるようにするリンカー・アームを含むように、こうしたマーカー成分を場合により機能的なものにすることがある。この目的に適している様々なリンカー・アームは、記述されている。Ｋｒｉｃｋａ，Ｊ．Ｊ．；Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｅｒ Ａｓｓａｙｓ：Ｌａｂｅｌｓ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ；１５５１ページ；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８５）。該マーカー成分は、従来の技術を使用して、分析物、抗原、抗体または他の分子に結合される。

一態様において、本発明は、（１）好ましくは、少なくとも約５５０ｎｍの励起波長を有する、発光性の実質的に平面分子の構造を含む蛍光部分、および（２）それに結合した２つ以上の小さい可溶化軸配位子、および（３）十分に大きい負の正味電荷を有すること、を含む検出可能に標識されたマーカー成分を提供する。好ましいフルオロフォア、小さい可溶化軸配位子、および該二者の連結の例を、本書に詳述する。加えて、溶媒感受性および非特異的結合の低減における、該軸配位子および該正味電荷の有効性を証明する証拠を提示する。

用語「溶媒感受性」は、使用される溶媒系による、分子の蛍光挙動の変化を指し、特に、有機溶媒（ＤＭＦ等）と比較した、水溶液中での蛍光挙動の違いを指す。ＤＭＦ等の有機溶媒中で高い蛍光強度を示す多くのフルオロフォアは、水溶液中で、大幅に低下した蛍光強度を示す。蛍光強度は、サンプル濃度および該励起放射線の強度に関係している。ある特定の色素の蛍光強度を、その特有の光吸収率（吸光係数）および蛍光量子効率、ならびに環境因子に相関させることができる。こうしたマーカー成分はまた、それらの放射寿命または非消光寿命に匹敵する増大した減衰時間を示す。本発明者らは、用語「減衰時間」を、励起された分子の濃度が、その初期濃度からその値の１／ｅに低下するために経過しなければならない時間を表すために総称的に使用する。たとえば、Ｄｅｍｏｓ，Ｊ．Ｎ．，Ｅｘｃｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ．Ｌｉｆｅｔｉｍｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８３）、１０、３５、４４、１５８ページの、寿命に関する用語の使用は、様々である。

フルオロフォアの性能は、遊離色素（すなわち、完成した蛍光プローブ状ではない）を用いた測定で、ある程度評価することができる。この種のテストで重要なパラメーターとしては、該フルオロフォアが、異なるイオン強度、特定のイオンまたは血清中に存在するような生体分子に暴露されるとき通常変化する、蛍光強度および偏光／異方性などがある。こうした作用は、「溶媒効果」と考えられ、凝集の状態を変えるための該フルオロフォアの分子間の相互作用またはフルオロフォア分子と溶媒成分との相互作用（非特異的結合、ＮＳＢ）の変化のいずれかによって生じる可能性がある。

本発明の色素構造とフタロシアニン類（Ｐｃ）を蛍光プローブ用標識として使用しようとした以前の試みの構造との際立った相違は、遊離色素を血清に添加し、結果として生じる偏光または異方性を測定する、ＮＳＢ用の上記モデルで理解することができる。結合したときの分子量の増加は、回転ブラウン運動の速度低下を招くため、非特異的結合が生じれば、偏光が増加する。

表１で、表の端から端まで水平に進むと、いずれか１つの色素の性能を、蛍光強度の変化（Ｉ）、および／または偏光の変化（ｍｐ、ミリ偏光単位）によって判断することができる。「完璧な」蛍光標識であれば、溶媒組成と関係なく、こうしたパラメーターのそれぞれで、同じ値を有するであろう。

正常なヒト血清中での挙動と、グリセロール中での挙動との比較は、血清の存在下での、ＮＳＢによる潜在的偏光変化の損失の尺度となるため、有益である。列挙した５つの色素では、グリセロール中での偏光と、正常なヒト血清中での偏光との差の値は、６０．４、７３．６、１０３、１２、６１および４４．１である。これらの差は、中心原子としてのＳｉの劇的な有益な効果を示し、またＬＪＢ−３を群の最良の選択として提示する。グリセロール中での強度を、正常なヒト血清中での強度で割った比率もまた、指標となる。表を下に下がると、これらは、１．４６、１．２７、１．５１、２．９１、４．８２および０．４２であり、またＳｉがＡｌより著しく優れていること、およびＬＪＢ−３（図１に示す構造）の極めて満足のいく性能を示す。

加えて、ＬＪＢ−３は、カルボキシル基およびスルホン酸基の両者を有し、多くの方法で「活性化」することができる、すなわち、自発的に反応して、生理的ｐＨおよび環境温度で、標識すべき生体分子上の基（通常はアミノ）と共有結合する構造に変換することができる。本発明者らは、抗体、ｖｉｚ．を標識するために、カルボニルジイミダゾールおよびスクシンイミジルテトラメチルウロニウム・テトラフルオロボレート（ＳＴＵＴ）という２つの異なる活性化試薬を使用した。後者の試薬は、取り扱い易さという点でも、結果の再現性という点でも、好ましいことが分かった。これは、ＳＴＵＴを使用するとき、中間体である、該色素のＮＨＳエステルの安定性が高いためであろう。加えて、ＳＴＵＴで活性化するための最良の溶媒は、ＤＭＳＯであることが分かった。ＤＭＦを使用してもよいが、避けられない微量のアミン類に悩まされる公算が高い。

実験結果
フルオロフォアの、所与の用途への適合性に関する最も信頼できるテストは、該色素を、完成したプローブに組み入れて、該プローブをテストすることである。該遊離色素を用いた上記血清試験は有用なガイドであるが、特異的プローブを用いて行われるテストに完全に取って代わることはできない。

表２および表３は、ＬＪＢ−３標識抗ヒトＩｇＧをＡＮＡ（抗核抗体）用プローブとして使用した、説明に役立つ結果を示す。性能の質は、ＦＩＵ（正／負）（またはＦＩＵ［＋／−］）値、すなわち陰性（正常）コントロールからのシグナルと比較した、陽性サンプルからのシグナルの比率によって評価することができる。７以上の値は、有用である；これらの表中のデータは、該テクノロジーが開発されようとしている時に得られた；日常的な使用で、ＦＩＵ（＋／−）のより高い値は、一様な結果となることが予期されるであろう。

略語：ｍｐ：１０³（偏光）；ＴＤ_x緩衝液：蛍光偏光測定法で使用される市販の緩衝溶液；Ｐｃ：フタロシアニン；ＢＢＳ：ホウ酸緩衝食塩水（０．２５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２３２Ｍホウ酸および０．００１７９Ｍ四ホウ酸ナトリウム。ｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨで８．０＋／−０．０５に最終調整する）。血清をテストするとき、全血清２５μｌを、ＢＢＳ １ｍｌ（既に添加された色素２５μｌを含有する）を加えた。水平方向に進むときにのみ、蛍光強度の比較が意味あるように、様々なフルオロフォアの相対濃度は、不明であることに注目されたい。水溶液中でＬＪＢ−３を操作するためのＢＢＳに代わるものは、０．７０Ｍホウ酸３３．１ｍｌ、０．５０Ｍ Ｋ₂Ｂ₄Ｏ₇ ４．０ｍｌ、４．０Ｍ ＫＣｌ ７５ｍｌおよび水を混合して１リットルにすることにより作られるホウ酸緩衝ＫＣｌ（ＢＢＫＣｌ）（ｐＨ約８．１）である。

蛍光測定：これらの測定は、過渡状態偏光蛍光計（ＦＡＳＴ−１、フロリダ州マイアミ州のヒペリオン有限会社（Ｈｙｐｅｒｉｏｎ，Ｉｎｃ））で行われる。

（１）各標識中にタンパク質１ｍｇ（クマシー・ブルー（Ｃｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）による）
（２）ＦＩＵ：ＡＮＡテストで確認された蛍光強度の比；コントラストの尺度：サンプル／陰性対照
（３）２つの異なる抗体調製物：ＤおよびＪ

^*スクシンイミジルテトラメチルウロニウム・テトラフルオロボレート

詳細な背景および範囲
これらのマーカー成分は、蛍光プローブに組み入れるための蛍光標識として有用である。用語「蛍光プローブ」は、当該物質の存在を判定し、かつ／または定量化するするためのフルオロイムノアッセイ等のアッセイで使用される分析物、抗原、ハプテン、抗体または他の分子に、結合されているか、あるいは直接またはリンカー・アームを介して配位結合させる、フルオロフォア部分を含むマーカー成分を指す。これらのマーカー成分の幾つかは、リン光性標識として有用である。本発明の成分はまた、ｉｎ ｖｉｖｏ画像法用標識としても、またｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍治療で使用される薬剤用標識としても、有用である。

これらのマーカー成分は、体液のサンプルを使用するアッセイで特に有用であるため、使用する者にとって好ましいのは、他のサンプル成分の環境蛍光からの干渉が最小限に抑えられる近赤外領域内に励起波長および／または発光波長を有するフルオロフォアである。５００ｎｍ未満の励起波長が使用されるとき、血清等の一部のサンプルは、フラビン類、フラボプロテイリ（ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｒｉ）類、ＮＡＤＨ等々から、かなりの干渉バックグラウンド蛍光性を示す可能性がある。

ある種の用途、たとえば蛍光偏光イムノアッセイ等にとって、好ましいフルオロフォアは、結合した形であるとき、高度の、好ましくは、観測可能な偏光に関する理論的最大値の約１０％超の、蛍光偏光も示す可能性がある。語「結合した」は、分子と、その特異的結合との間に結合相互作用が形成されている状態を指す。ある種の用途、たとえば蛍光過渡状態アッセイ等にとって、好ましいフルオロフォアはまた、約１ナノ秒〜約５０ナノ秒の範囲内、好ましくは約５〜約２０ナノ秒の範囲内の、蛍光減衰時間測定値により特性決定される。他の用途、たとえばリン光性標識には、いっそう長い減衰時間を有するフルオロフォアを使用することが可能である。

好ましい小さい可溶化軸配位子は、−ＯＨ、−Ｏ−ｔ−ブチル（有機溶媒の存在下でたぶん有用である）、−ＯＣＨ₂ＯＨ、−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、ＯＣＨ₂ＣＨＯＨＣＨ₂ＯＨ、−ＯＣＨ₂ＣＨ₂−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、−ＯＣＨ₂ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、−ＯＰＯ₃Ｈ₂、−ＯＢ（ＯＨ）₂、Ｃｌ、ＢｒおよびＦを包含する。

好ましい実施形態では、該フルオロフォア部分は、２つの小さい可溶化軸配位子と配位結合することができる中心原子に配位結合した実質的に平面の、多座大環状配位子を有する。蛍光結合アッセイでマーカー成分として使用するために、適当な中心原子は、該中心原子に、２つの軸配位子を配位結合させることが可能であり、かつ三重項状態への遷移によって蛍光消光を引き起こせるほど十分に大きい原子番号を持たないのものである。該中心原子に好ましい元素は、ケイ素、ゲルマニウム、およびスズを包含し、殊に好ましいのは、ケイ素およびゲルマニウムである。

本発明のこのような検出可能標識またはマーカー成分の、イムノアッセイにおける使用は、これらの標識が、血清等の体液の存在下および非存在下で、実質的に同じ強度の、蛍光発光の平行成分および垂直成分を有するという点で、有利である。したがって、これらの標識を使用するアッセイ方法は、体液中の低濃度の標的分析物を検出することができる。

本発明の方法は、「蛍光計検出システム（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）」と題する、同一出願人による米国特許第５，３２３，００８号明細書に記載の改良された蛍光検出システムとともに使用するのに特に適する。

蛍光標識を利用する競合阻害アッセイ手順で、本発明は、標的分析物を含むと思われるサンプルを、十分に高い負の正味電荷と一緒に平面分子構造の両側に１つずつある、２つの小さい可溶化軸配位子に結合した発光性の実質的に平面な分子構造を含む蛍光部分で構成されている、検出可能に標識されたマーカー成分を含む蛍光プローブに連結された、添加された標的分析物またはその類似物の既知量と接触させ、該混合物を、該標的構造を特異的に認識することができる受容体と接触させ、受容体に結合しているかまたは遊離の蛍光プローブの量を測定することにより、標的分析物量の存在を決定する方法に関する。ブランク・サンプルおよび既知量の標的分析物を含有するサンプルの測定値から、未知のサンプル中の分析物の量を推定することが可能である。

別の態様で、本発明は、（ａ）標的分析物を含むと思われるサンプルを、該標的分析物を特異的に認識することができる第１の受容体と接触させて、該標的分析物および該第１の受容体の複合体体を形成する工程であって、該第１の受容体は、十分に高い負の正味電荷と一緒に、該平面分子構造の両側に１つずつある２つの小さい可溶化軸配位子に結合した発光性の実質的に平面な分子構造を有するフルオロフォア部分を有する蛍光プローブで標識される工程；（ｂ）該複合体を、該標的分析物または該第１の受容体を特異的に認識することができる第２の受容体と接触させる工程であって、該第２の受容体は、固体担体に結合されて、該第１の標識された受容体、該標的分析物および該固体担体に結合された第２の受容体の複合体を形成する工程；および（ｃ）該固体担体と結合した、標識された第１の受容体の量または未反応の標識された第１の受容体の量のいずれかを測定する工程；を有する、「サンドイッチ」または「２部位」イムノアッセイを実施する方法を提供する。

別の実施形態で、該アッセイは、未知のサンプル中の、標識された第１の受容体の量を、該標的分析物のないコントロールサンプル中の、測定された標識された第１の受容体の量、または既知量の標的分析物を含むサンプル中の、測定された標識された第１の受容体の量と関連づけるという、さらなる工程を組み入れることが可能である。

別の態様において、本発明は、相互干渉なしに、独立して該分析物により認識されることができる２つの異なる受容体を利用できる、標的分析物の測定に有用なサンドイッチ型蛍光イムノアッセイ法を提供する。各受容体は、異なる色素で標識されている。たとえば、一方の受容体は、それぞれ６８０ｎｍおよび６９０ｎｍの吸収最大および発光最大を有する第１の色素で標識されており、他方の受容体は、それぞれ６９５ｎｍおよび７０５ｎｍの吸収最大および発光最大を有する第２の色素で標識されている。該分析物の検出および定量化定量化は、定常状態測定または過渡状態測定のいずれかを使用して行うことができる。いずれにしても、所与の例では、励起は６８０ｎｍで、検出は７０５ｎｍであろう。この種のアッセイは、エネルギー移動に基づいており、均質であるという利点を有する。

好ましい実施形態で、本発明のマーカーおよびプローブは、スペクトルの近赤外領域内の過渡状態偏光蛍光を用いてモニターされる、均一に混合して測定するアッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ｍｉｘ ａｎｄ ｒｅａｄ ａｓｓａｙ)で最も有利に利用される。この形式の組み合わせは、大量で容易に実施することができ、かつ数値で示される読取値を与えるように容易に自動化することができる、非常に迅速な手順をもたらす。このようなアッセイは、近赤外波長（低い副蛍光（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ））および過渡状態テクノロジー（レイリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）散乱およびラマン（Ｒａｍａｎ）散乱を回避する）の両者によって生じるバックグラウンド干渉が低いため、精度および確度に好都合な、固有の特徴を有する。

本発明は、血清、血漿、全血、尿および無処理の細胞を含む体液に対して、後者は、たとえば懸濁液として、または蛍光顕微鏡法に関しては、固体表面上に付着させて、実施するイムノアッセイに関する。全血を用いた測定では、アッセイの前に、ステアロイル−リゾレシチン、パルミトイル−リゾレシチンまたはミリストイルリゾレシチン等の溶解剤で赤血球を溶解させることが、通常は有利である。

一実施形態で、該標的分析物は、薬物または薬物の代謝産物である。該薬物は、ステロイド、ホルモン、抗生物質、免疫抑制剤、抗喘息薬、抗悪性腫瘍薬、抗不整脈薬、抗痙攣薬、抗関節炎薬、抗うつ薬、または強心配糖体であってもよい。このような薬物の例としては、ジゴキシン、ジギトキシン、テオフィリン、フェノバルビタール、チロキシン、Ｎ−アセチルプロカインアミド、プリミドン、アミカシン、ゲンタマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、カルバマゼピン、エトスクシミド、バルプロ酸、ジソピラミド、リドカイン、プロカインアミド、キニジン、メトトレキサート、アミトリプチリン、モートリプチリン（ｍｏｒｔｒｉｐｔｙｌｉｎｅ）、イミプラミン、デシピラミン、バンコマイシン、およびシクロスポリンなどがある。

別の実施形態で、該標的分析物は、ペプチド生体分子またはその断片である。このようなペプチド生体分子としては、たとえば、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、プロラクチン、インスリン等のペプチドホルモン、癌胎児性抗原等の腫瘍マーカー、または風疹ウイルス等のウイルスなどがある。

本発明の方法は、約１０^-5Ｍ〜約１０^-13Ｍの濃度、特に約１０^-9Ｍ〜約１０^-12Ｍの濃度範囲の標的分析物を測定する方法を提供する。こうした測定は、サンプル中または受容体調製物中の副蛍光の量にも、蛍光発光の強度にも、非常に敏感である。概して、該波長を、近赤外線に移し、過渡状態検出を利用することは、有利であるが、各種サンプル中に存在する不純物が違うため、アッセイ開発中に、アッセイのタイプごとに最適化を行う必要があると言って間違いないであろう。

本発明の主な目的は、信頼性および利便性が大幅に増大した、改良された蛍光に基づくアッセイを提供することである。本発明のまた別の目的は、多くの場合わずか数分で、迅速かつ正確な測定ができる方法を提供することである。本発明の目的は、極めて低濃度の蛍光標識またはマーカーを測定することができる方法を提供することである。本発明の目的は、迅速かつ正確であり、比較的低費用で、また未修正の生体サンプル、たとえば全血等とともに使用することができるという点で、臨床状況に有用な方法を提供することである。これらの目的は、１）該蛍光マーカーの光学特性の最適化、２）該検出システムの高感度および安定性、３）レイリー（Ｒａｙｌｅｉｇｈ）およびラマン（Ｒａｍａｎ）散乱を排除する、過渡状態検出の使用、４）分離を撤廃し、簡単な、混合して測定するだけの手順を提供するために、該アッセイを均一にすること、および５）機器およびサンプルサイズを小型化することにより、最もよく実現される。

本発明はまた、該フルオロフォア部分を、該可溶化軸配位子の反応形と反応させることにより、マーカー成分を合成する方法も提供する。本発明はまた、特異的結合ペアの一方のメンバーまたは類似物の標的分析物に連結された、本発明のマーカー成分を有する蛍光プローブも、特徴とする。用語「特異的結合ペア」は、一方の分子が表面上または空洞内に、他方の分子（または他の分子を含む分子複合体）のある特定の空間構造および極構造を特異的に認識して結合する領域を有する、２つの異なる分子（または組成物）を指す。

本発明の蛍光色素は、ＤＮＡテクノロジーおよび研究の幾つかの分野に用途がある。一般的に、これらの用途は、処理過程またはテストで、１本鎖ＤＮＡ配列の活性を追跡して可視化できるようにするために、該配列を標識しなければならないというものである。たとえば、ＤＮＡ配列決定のためのサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）法では、プライマー分子（鋳型の３’末端の短い部分に相補的な、ＤＮＡの短い配列）を末端標識する（上記プライマーの５’末端上）。次いで、該該鋳型に相補的な新しい鎖を生成して、プライマー配列の３’末端を、該鋳型の５’末端方向に延長するために、４つのヌクレオチド三リン酸を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する。反応がずっと進行する前に、反応混合物を、４つに等分し、４つのジデオキシヌクレオチド三リン酸（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）の１つでそれぞれを別々に処理して、鎖延長を無作為に止め、使用したジデオキシヌクレオチド三リン酸中に含まれる同一塩基（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）で終わる様々な長さの新しい配列の混合物を作る。この、様々な長さの新しい鎖の混合物を、鎖長に従って分離するＰＡＧＥ電気泳動で分離させ、これを、観察のためにバンドのパターンを「ブロッティング」によりニトロセルロース膜に転写するサザンブロットで可視化することができる。

サザンブロットが使用される他の場合には、該ＤＮＡは通常、高いｐＨで変性されており、したがって１本鎖である。こうした状況で、本発明の蛍光標識を担持する相補的プローブとのハイブリダイゼーションは、サザンブロットからＤＮＡを可視化するための、高感度および特異性を有する方法を提供する。

ＤＮＡ指紋法は、重要性が高まることが予期されるもう１つの分野である。１つの指紋法では、同定すべきサンプルからの制限酵素消化ＤＮＡのサザンブロットにおける一本鎖材料と、テスト・プローブ（標識された一本鎖配列）を、ハイブリダイズさせる。この方法を使用することにより、蛍光標識は、高感度と視覚的検出を併せて提供する。

本発明の蛍光色素の無類の特性は全体として新しいタイプの、微量ＤＮＡ用アッセイを生むことができるであろう。こうしたアッセイであれば、過渡状態蛍光偏光（ＴＳＦＰ）とともに数値で示される読取値を使用する。このようなアッセイの卓越した利点は、分離を必要とせずに、マイクロリットルの規模で行われる、混合して測定するだけの簡単なアッセイであり得ることである。ＤＮＡを検出および同定するための基本型アッセイは、以下の通りに進めることが可能であろう：
１．検出しようとしているＤＮＡを含んでいる可能性があるサンプルを採集する。
２．該サンプルをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅する。
３．本発明の蛍光色素で標識された１本鎖ＤＮＡを、増幅混合物に加え、ＴＳＰＦを経時的に追跡する（たぶん数分）。標識されたＤＮＡプローブに相補的なＤＮＡがテストサンプル中に存在する場合、ハイブリダイゼーションが起こり、時間とともに偏光が増加する。

本発明はまた、新規な色素−オリゴヌクレオチド複合物、それらを合成する方法、およびそれらの使用方法にも関する。こうした複合物またはプローブの使用方法は、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法および核酸配列決定法を含むであろう。色素−オリゴヌクレオチド複合物の色素部分は、本発明の蛍光マーカーである。これらのマーカーは、ＤＮＡまたはＲＮＡにカップリングするために付いている様々な官能基を有してもよい。こうした官能基としては、カルボキシル、アミノおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳエステル）などがある。

「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド残基の比較的短い鎖を意味する。一般的に、本発明で有用なオリゴヌクレオチドは、５〜５０ヌクレオチドの長さを有する。本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドプローブでは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸配列にハイブリダイズできる他のあらゆる種類の配列のポリヌクレオチドを包含する。このような核酸配列が、塩基類縁体ならびに天然の塩基シトシン、アデニン、グアニン、チミンおよびウラシルを含んでもよいことは、十分に理解されるであろう。このような塩基類縁体は、ヒポキサンチン、２．６−ジアミノプリンおよび８−アズグアニン（ａｚｇｕａｎｉｎｅ）を包含する。該プローブは、二本鎖形であっても１本鎖形であってもよいが、好ましくは１本鎖形である。該プローブは、直接合成、ポリメラーゼ介在延長反応で、あるいはクローニングまたは任意の他の都合のよい方法で調製してもよい。「連結された」は、両部分を接続する中間分子で化学的に結合されていることを意味する。

該マーカーへの、該オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの連結は、たとえばアミド結合、エステル結合、ヒドラゾン結合、セミカルバゾン結合、チオセミカルバゾン結合、尿素結合、およびチオ尿素結合の形成につながる縮合反応を使用して実施することが可能である。たとえば、リンカーは、アミノ基、好ましくは第一級アミノ基で終わってもよい。他のリンカーは、カルボキシル基で終わってもよい。

別の態様において、本発明は、ある種の色素−複合オリゴヌクレオチドを調製するための方法を提供する。一実施形態では、このような方法は、（ａ）アミノ基で終わるリンカーが付いたオリゴヌクレオチドを、該平面分子構造の両側に１つずつある２つの小さい可溶化軸配位子に結合した発光性の実質的に平面の分子構造を含み、かつ凝集および非特異的結合の両者を抑制するために十分なさらなる負電荷を有する、フルオロフォア部分を含む検出可能に標識されたマーカー成分のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはイミダゾライドと反応させて、複合物を形成する工程；および工程（ａ）で形成された複合物を、未反応のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよび未反応の色素と分離する工程を含む。オリゴヌクレオチドへのリンカーの結合は、ジアミンまたはアミノアルコールを使用して実施することができる。好ましくは、該検出可能に標識されたマーカー成分は、ケージドジカルボキシ・シリコン・フタロシアニン色素を含む。

あるいは、該色素複合オリゴヌクレオチドの調製は、ヒドロキシベンゾトリアゾールが存在し、かつオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが存在する中で、マーカー成分を、カルボジイミドと反応させて、複合物を形成すること；および結果として生じた複合物を、反応混合物の他成分と分離すること；によって実施することが可能である。

別の態様で、本発明は、サンプル核酸を、本発明の蛍光マーカーで標識されたオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、上記オリゴヌクレオチドは、均質な溶液中で上記標的核酸配列とハイブリダイズすることができる工程と、このようなハイブリダイゼーションの存在または量を、過渡状態（または定常状態）偏光蛍光により検出する工程とを含む、サンプル中の標的核酸配列を検出するための方法に関する。

さらなる態様で、本発明は、標的核酸を検出または定量化する方法であって、該標的核酸は、核酸増幅の産物である方法に関する。核酸増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、自立配列複製（３ＳＲ）および転写物に基づく増幅システム（ＴＡＳ）などがある。

本発明の方法は、「蛍光計検出システム（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）」と題する、同一出願人による、スタッドホーム（Ｓｔｕｄｈｏｌｍｅ）ら、米国特許第５，３２３，００８号明細書に記載の、時間相関過渡状態検出システムとともに使用するとき、特に有用である。そのシステムは、サンプルの時間依存的偏光の直接読み取りを可能にする過渡状態検出を特徴とする。該システムは、非常に高い周波数、たとえば、ＭＨｚの速度で、変調することができるレーザー・ダイオードを使用し、また高い出力を示す。一般的に、レーザー「オン」の時間は、約２〜３ナノ秒である。該溶液からの光子は、単一光子計数モードで作動している光電子増倍管を使用して検出する。光子イベントを、レーザーパルス時間と比較した、該光子イベントの相対的時間と一緒に測定する。個々の光子イベント時間を記憶することにより、時間の関数としての、光子の周波数のヒストグラムを作成する。

別の態様で、本発明は、核酸増幅プロセスの反応速度をモニタリングし、かつ／または標的サンプル中の核酸を定量化する方法を提供する。たとえば、ＰＣＲによる増幅中に、「キャッピング」し、併せて本発明の蛍光色素で標識しておいたオリゴヌクレオチドからなるプローブを、ＰＣＲ反応に直接加えてもよい。「キャッピング」は、３’末端を、ジデオキシヌクレオチド三リン酸と反応させておいたことを意味する。次いで、反応が進むにつれて、反応を追跡するために、蛍光の時間依存性の過渡状態検出を使用することができる。

各冷却期に、増幅産物とのハイブリダイゼーションを、速度論敵に追跡することが可能である。増幅産物の濃度が上昇するにつれて、プローブと増幅産物との結合速度が上昇し、増幅産物の濃度を定量する。この情報はサイクル数と一緒に、増幅前に、サンプル中に当初存在していたＤＮＡの量を定量する。

本発明の別の態様は、蛍光計のデザイン、変更または改良への広範囲におよぶ適用である。この適用性の広さは、下記の、専門の機器の例で十分に例証される。非吸収性媒体では、より低い屈折率を有する第２の媒体Ｂで取り囲まれた媒体Ａ内を横行する光波は、入射角が臨界角より大きければ、媒体Ａの境界で全内部反射を受ける。しかし、該全反射した光の電磁界は、境界を短い距離、突破し、ＡとＢの界面付近にある蛍光分子の励起等の、物理作用を生じさせることができる。

この作用は、媒体Ａの表面上、したがって蛍光の励起が起こり得る唯一の位置である界面に、固定された分子との特異的反応が起こる、均一な、蛍光に基づくアッセイを可能にする。単純なガラスまたはプラスチックのプレートは、入射光線用の光導波路および該表面上の機知の位置に前もって置かれた特異的受容体用の担体の両者の役割をする。この方法論は、「エバネセント光フルオロイムノアッセイ（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ ｌｉｇｈｔ ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」（ヘロン（Ｈｅｒｒｏｎ）ら、米国特許第５，５１２，４９２号明細書）と呼ばれる。

好都合なことに、本発明は、一般に近紫外励起領域を有し、スペクトルの近赤外領域内で発光するＮ含有大環状分子（以下に列挙したクラス）に基づく蛍光色素を使用する、非常に大きいストローク・シフト（Ｓｔｒｏｋｅｓ’ ｓｈｉｆｔ）の特徴を含む。このような色素は、定常状態モードまたは過渡状態モードの免疫／受容体アッセイに適用できる。励起光源としては、水銀アーク、窒素レーザーおよび窒素レーザー励起色素レーザーなどがある。あるいは、ダイオードレーザーを用いて、これらの同色素を近赤外で励起し、パルス励起および過渡状態検出を用いて優れた結果を与えることができる。光源の選択は、件の個々の色素の吸収バンドの位置、励起および検出の好ましいモード、定常状態か過渡状態か、および所要空間によって異なる。

こうした特長を、「エバネセント光フルオロイムノアッセイ」に関する化学および機器のデザインに含めることは、非常に低いバックグラウンドと一緒に高いシグナルレベルをもたらし、したがって高いアッセイ感度を与える。

上述の発明の概要は非限定的であり、本発明の他の特徴および利点は、以下の、好ましい実施形態の説明、および特許請求の範囲から明白になるであろう。

好ましいマーカー成分の吸光度および偏光挙動
２つの小さい可溶化軸配位子に結合した中心原子（たとえば、ケイ素）を含むこれらのマーカー成分は、過渡状態蛍光の測定に特徴づけられるであろう。このような測定では、励起パルスの偏光の方向に平行または垂直な、偏光した２成分の強度を、該マーカー成分の減衰時間の約３倍に相当する時間、モニターする。このような曲線は、吸光係数、量子収率、減衰時間および偏光の状態を反映し、また該マーカー成分の化学的状態および物理的状態に関する繊細な示唆を与える。たとえば、該励起状態が不活化されるか、または三重項状態に変換されると、総体的な強度は低下し、減衰時間は短縮される。粘度上昇によって、または大きい分子に結合されることによって、該分子の回転ブラウン運動が変化すると、平行成分と垂直成分の強度比は上昇する。

本発明の幾つかのマーカー成分は、約５％の実験誤差内で、ＤＭＦ（有機溶媒）中で、ＳＡＰ（食塩リン酸アジド（ｓａｌｉｎｅ ａｚｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、水性中性緩衝溶液）中と同じ強度、減衰時間および偏光を示す。ある程度まで、こうした特性を、他のマーカー成分調製物も共有する。本発明のマーカー成分の示差的で重要な特性は、血清中の成分に対する感度（および血清中の成分に結合しないこと）であり、強度、減衰時間または該蛍光の偏光成分の相対的な大きさに対して、有意な測定される血清の作用がないことから明らかである。この特性は、生体試料を使用するアッセイ等の用途に使用しようとしているマーカー成分に極めて重要である。

好ましいマーカー成分の調製
本発明の好ましいマーカー成分の一調製方法によれば、一般的な反応スキーム：
Ｍｃｌ−−ＣＡ−（Ｘ）₂＋２（ＳＭ） Ｍｃｌ、−ＣＡ−（ＳＭ）₂＋２Ｘ
（ここで、Ｍｃｌは、大環状配位子を示し、ＣＡは、中心原子を、Ｘは、置き換えられた配位子を、ＳＭは、可溶化部分を示す）による配位子交換反応で、軸配位子としてヒドロキシ基またはハライド基を有する適当なフルオロフォア部分を、可溶化部分の反応形と反応させる。この反応は、ニートで実行してもよく、あるいは必要に応じて、溶媒中で実行してもよい。適当な溶媒としては、キノリン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、イミダゾール（他の列挙した溶媒の１つに溶解されるとき）等々がある。適当な反応温度は、該大環状の出発材料および該可溶化基の性質μによって異なるであろう。該反応は一般的に、約２分〜約２４時間で完了する。該反応混合物は、還流させながら、または砂浴等の方法で、便利に加熱することができる。利便性のため、該反応を環境気圧で実行することが可能である。この反応は、２段階で行われ、一度に１つのポリオキシヒドロカルビル基が軸配位子として配位結合する。

蛍光イムノアッセイで蛍光標識として使用されるとき、これらのマーカー成分は、特異的結合ペア（「標識された結合パートナー」）の一方のメンバーまたはこのようなメンバーの類似物に連結されていてもよい。用語「結合パートナー」は、ある特定の分子または分子複合体を特異的に認識することができる、またはある特定の分子または分子複合体により特異的に認識されることができる、分子または分子複合体を指す。該マーカー成分は、それに直接付着または結合されていてもよく、またはリンカー・アームを介して付着または結合されていてもよい。

利用性
本発明のマーカー成分は、蛍光プローブ用および蛍光結合アッセイにおける蛍光標識として有用であり、ｉｎ ｖｉｖｏ画像法用標識としても、またｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍治療用標識としても有用である。

これらのマーカー成分は、蛍光偏光イムノアッセイを含む、従来の蛍光結合アッセイで、蛍光標識として有利に使用することができる。そのように使用するとき、これらのマーカー成分は、特異的結合ペア（「標識された結合パートナー」）の一方のメンバーまたはこのようなメンバーの類似体に連結されていてもよい。該マーカー成分は、それに直接付着または結合されていてもよく、またはリンカー・アームを介して付着または結合されていてもよい。

これらの標識された結合パートナーは、様々な形式を有するアッセイ、たとえば分析物または分析物結合パートナー（使用されるような標識された分析物または分析物類似物であれば）に関して競合を含むアッセイで有用であり、均一アッセイまたは不均一アッセイのいずれでも使用することが可能である。

それらは、都合よく、水溶液中で凝集が存在しないこと、および溶媒感受性がないこと（検出可能な凝集を示さない）、併せて血清成分および他の生物学的巨大分子への非特異的結合がないことを考慮すると、これらのマーカーは、生物学的流体、たとえば血清等を含むサンプル中の分析物を検出するためのアッセイでの使用に特に適している。このように、これらのマーカー成分は、血清成分による非特異的結合が、アッセイの感度をひどく落とし、その確度および精度の両者に影響を及ぼすであろう、溶液中の分析物を検出するための蛍光プローブ用の標識として使用することが可能である。

あるいは、これらのマーカー成分は、ｉｎ ｖｉｖｏ画像法用造影剤として使用することが可能である。造影剤として使用されるとき、これらのマーカー成分は、特異的結合ペアの一方のメンバーに結合されて、標識された結合パートナーを与える。該標識された結合パートナーは、動物に導入される。該特異的結合ペアの他方のメンバーが存在すれば、該標識された結合パートナーはそれに結合し、該マーカー成分によって生じたシグナルを測定し、その局在位置を同定することが可能である。

これらのマーカー成分はまた、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍治療でも使用することが可能である。たとえば、光線力学治療は、該マーカー成分を感光剤として使用することを含む。該マーカー成分（蛍光標識）は、腫瘍細胞の成分を特異的に認識して結合することが可能な、結合パートナーに結合される。

本発明は、核酸プローブならびに該プローブの製造方法および使用方法を提供する。該新規な核酸プローブの使用方法は、現在既知の、またはその後開発される様々な核酸ハイブリダイゼーション配列決定技術、および現在既知の、またはその後開発される様々な核酸増幅技術を含む。該プローブ（本明細書では、複合物とも言う）および本発明の方法は、均一なハイブリダイゼーションアッセイで１ ｆｍｏｌ感度の達成を可能にし；この感度は、現行の不均一ハイブリダイゼーション測定技術で達成される感度に匹敵する。しかし、上記の通り、現行の不均一アッセイには、汚染のリスク増大および該アッセイの実施に要する時間増加を含む、幾つかの不都合があるが、それらは該アッセイに含まれる多くの段階に起因する。該本発明の組成物および方法の他の利点は、本明細書に提供されている実施例を再検討するとき、当業者に明白になるであろう。

本発明の理解を助けるために、一連の実験結果を説明する以下の実施例を含める。本発明に関連する下記の実施例は、もちろん、本発明を具体的に限定すると解釈されてはならず、また、現在既知のまたはその後開発される、当業者の権限内であろう、本発明のこのような変更は、本明細書に記載の通り、および下文に特許請求する通り、本発明の範囲に入ると考えられる。

実施例１：１，２，４，５−テトラシアノベンゼン（ＴＣＮＢ）からの、テトラジイミノピロメリット酸ジイミドの合成
１リットル用三つ口フラスコ内のＴＣＮＢ、２０．０ｇ（０．１１２モル）を、真空で約１時間乾燥させた。該フラスコに、遅い、高トルク、テフロン（登録商標）羽根スターラー、アンモニア中で泡立たせるためまたは液体を加えるための入口、および水冷コンデンサーを取り付けた。装置全体に窒素をどっと流した後、メタノール４００ｍｌを加え、室温で撹拌を開始し、アンモニアをゆっくり泡立てた。

アンモニアの吸収は非常に効率よく、数分後、該懸濁液は、澄んだ淡緑色の溶液になる。数分後（アンモニアを絶えず加えながら）、該溶液は濁り、温度はわずかに上昇する。アンモニアの添加開始から４０分後、該反応混合物は、撹拌することが難しくなるため、撹拌しながらさらに２００ｍｌのメタノールを加え、アンモニア添加を続けた。該懸濁液の表面から現れる泡がないことから明らかなように、この時点で、アンモニア吸収は依然として非常に効率がよかった。１００分後、撹拌を可能にするために、さらに１７５ｍｌのメタノールを加えることが必要であった。１２５分後、コンデンサーからの出口に大量のアンモニアが現れ始めたので反応混合物を４５℃の水浴に入れ、混合、加熱およびアンモニア添加をさらに２４０分続けた。冷却後、該反応混合物を＋４℃で２４時間、保存した。次いで、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）＃４２ペーパーを用いて固形物を吸引濾過し、真空乾燥した。収量２３．２ｇ（０．１０９モル）。

実施例２：ビス−クロロ（２；３ジカルボキシフタロシアニノ）ケイ素（ＩＶ）の合成
ジイミノイソインドリン（３０．０ｇ；０．２０７モル）およびテトラジイミノピロメリット酸ジイミド（１０．５ｇ；０．０５０モル）を一緒に粉砕し、１リットル用三つ口フラスコ内で、真空で一晩乾燥させた。該フラスコに、テフロン（登録商標）羽根ミキサー、隔壁、温度計およびシリカゲル乾燥管付き還流コンデンサーを取り付けた。撹拌された反応物質が入った該装置に、窒素条件下で乾いた窒素をどっと流し、窒素流れ下でキノリン６００ｍｌを加えて３０分間混合した。一様な流体懸濁液が結果として生じた。その後、５分間にわたり、隔壁を通して四塩化ケイ素６０ｍｌを徐々に加えた。該溶液は黒ずみ、そして加熱せずに撹拌を１５分間、続けた。

次いで、連続的に撹拌しながら、１９５℃に予熱した油浴の位置を上げて、フラスコを、その内容物より上のレベルまで沈める。５分後、該油浴の温度は、１７５℃まで下がっていたが、さらに１５分後には、元の１８５〜１９０℃で安定し、この温度でさらに６０分間維持した。次いで、該油浴を下げ、反応混合物を約１５分間、冷却させた。次いで、コンデンサー出口の湿ったｐＨ試験紙で検出される、未反応の四塩化ケイ素を除去するために、窒素流を開始した。約４５分間の換気後、今度は１００℃の油浴を置き換えて、約１３０℃まで徐々に加熱を続けて四塩化ケイ素の除去を促進し、キノリン臭のみが明白であった、さらに７０分後、上記テストにより終わらせた。

次いで、該油浴を取り除き、該反応混合物が約８０℃まで冷めたとき、水４２４ｍｌおよび濃塩酸４２４ｍｌの混合物を、混合しながら加えた。熱が発生し、最終混合物は酸性であった。反応生成物を、室温で一晩静置した。翌日、さらに水４２４ｍｌおよび濃塩酸４２４ｍｌを混合しながら加え、混合物を室温で一晩、沈降させた。

次いで、該反応混合物をブフナーロート（Ｂｕｃｈｎｅｒ ｆｕｎｎｅｌ）（２４ｃｍ濾紙）で濾過し、水で洗浄し、フード内で一晩、風乾した。濡れた濾過ケーキを、アセトン１リットル中で撹拌し、濾過した。洗浄した材料をフード内で２日間、乾燥させた。乾燥した材料（５０ｇ）を、アセトンの入った乳鉢内で粉砕し、該混合物を撹拌し、濾過して真空で乾燥させたとき、暗色の微粉化した固形物４７．９ｇが残った。

実施例３：ビス−クロロ（２；３−ジカルボキシフタロシアニノ）ケイ素（ＩＶ）、（ジカルボキシジクロロ色素）の加水分解
フラスコの口を濡らさないために長脚ロートを使用して、濃硫酸（９８ｍｌ）を、２５０ｍｌ用丸底フラスコに入れた。短脚ロートを介して、マグネット・スターラーとともに、ジカルボキシジクロロ色素１６．３ｇを少しずつ加えた。添加は約１時間にわたり、色素塊を分散させてから、追加の固形物を加えた。乾燥管を該フラスコに取り付け、混合物を油浴中で加熱して、５０℃で２４時間、維持した。

該反応フラスコを油浴から取り出して氷中で冷却した。水（７５ｍｌ）を少しずつ冷却せずに、注意深く加え、８０℃の油浴中で２０時間、該混合物を撹拌しながら加熱した。冷却後、該混合物を１リットル用ビーカー中の氷に注ぎ入れて撹拌した。

該混合物を、室温で、２０００×ｇで３０分間、遠心分離した。沈殿を水（約２５０ｍｌ）中に懸濁し、再度、遠心分離した。この洗浄をもう一度繰り返し、沈殿を回収し、１Ｍ Ｋ₂ＣＯ₃ ３００ｍｌ中に懸濁した。時計皿で覆ったビーカー内で、該混合物を撹拌しながら加熱した。１０分で、温度は９０℃に達し、加熱を、約９３℃で５０分間、続けた。まだ熱い間に、該混合物を濃ＨＣｌで酸性化し、冷却させ、室温で２日間、放置した。

次いで、固形物を、１１ｃｍのブフナー（Ｂｕｃｈｎｅｒ）ロートとワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）＃４２濾紙で回収し、濾過には約１時間を要した。ロート上の固形物を３×１００ｍｌの水で洗浄し、フード内で風乾させた。次いで、該固形物を１５分割して、Ｐ₂Ｏ₅およびＫＯＨ上、真空で乾燥させた。収量１３．３ｇ（８７％）。

実施例４：シリカを用いた吸着クロマトグラフィによるビス−ヒドロキシ（２，３ジカルボキシフタロシアニノ）ケイ素ＩＶ（ジカルボキシ色素）の精製
実施例３で生成した、未精製のジカルボキシ色素３．０ｇを、２５０ｍｌ用のビンに入れ、２％（ｖ／ｖ）エチルジイソプロピルアミン（ＤＩＥＡ）を含有するＭｅＯＨ １００ｍｌを加え、該混合物を３０分間、撹拌した。この後、シリカ（ＥＭサイエンス（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ））４３ｇを加え、混合物を手で振り、暗色のペーストを生じた。２０分後、２％ＤＩＥＡを含む追加のＭｅＯＨ １００ｍｌを加え、底を数回、逆さにし、内容物を２０分間、撹拌した。ＭｅＯＨおよびＤＩＥＡの他にもＥｔＯＨを加えて溶媒特性を調整することにより、抽出される色素の組成が変わり、単一成分の抽出が可能になる。次いで、減圧条件下、焼結ガラスロート（微孔性、直径６．５ｃｍ）で固形物を濾過した。ＭｅＯＨの多大な損失を防止するために、ある程度真空を生じさせたタンクに接続することにより、減圧を維持した。一晩、濾過した後、残留物を２×５０ｍｌのＭｅＯＨ＋ＤＩＥＡで洗浄し、約３０時間を要した。濾液（２３０ｍｌ）を回転蒸発器でほぼ乾固するまで濃縮した。残留物をＭｅＯＨ＋ＤＩＥＡ １４ｍｌに溶解し、溶液を等分して、２本の４０ｍｌ円錐形遠沈管に入れた。

各遠沈管の内容物を濃ＨＣｌ ２００ｕｌで酸性化し、管をほぼ満たすまで水を加えた。内容物を、数回、逆さにしたり振ったりすることによって混合し、約６５０×ｇで３０分間、遠心分離した。褐色の上澄液を傾瀉し、沈殿を０．０１Ｍ ＨＣ１で３回洗浄した。沈殿を１００ｍｌ用丸底フラスコに移し、該混合物を回転蒸発で乾燥させ、次いでＨ₂ＳＯ₄およびＫＯＨ上、真空で乾燥させた。乾燥重量は３０４ｍｇであった（精製ジカルボキシ色素）。

実施例５：クロロスルホン酸による精製ジカルボキシ色素のスルホン化
精製したジカルボキシ色素（実施例４）１６１ｍｇを、マグネティック・ミキサー付き５０ｍｌ用首長丸底フラスコに計り入れた。Ｎ₂条件下、室温で、ＣｌＳＯ₃Ｈ ３．４ｍｌを加えた。Ｎ₂バルーン付きの小さい空冷コンデンサーを取り付け、フラスコおよび内容物を、１１０℃の油浴中で約３．７時間加熱し、その時点で、１μｌサンプルを試験用に採取した。次いで１１０℃でさらに３．３時間、加熱を続け、すぐに加熱をやめて第２のサンプルを採取した。両サンプルに氷を加え、それぞれを重量３９０ｍｇまで、水で希釈した。次いで、１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ ２ｍｌを各サンプルに加え、希釈したサンプル１０μｌを、中性緩衝溶液２ｍｌで希釈して測定を行うことによって、それぞれの吸光度を測定した。両サンプルともＡ_maxは、６９０ｎｍであり、３．７時間のサンプル測定値は０．６５０で、７時間のサンプル測定値は０．４９０であり、最後の３．３時間の加熱期に、色素の約２５％が破壊されたことが分かる。あるいは、精製ジカルボキシ色素をＣｌＳＯ₃Ｈ中、７０℃で３６時間、加熱することにより、スルホン化を実行してもよい。

主反応混合物を、ビーカー内の氷に少しずつ加え、該冷混合物を約７００×ｇで３０分間、遠心分離した。かすかに着色した上澄液を傾瀉した。沈殿を、氷冷水３０ｍｌ中に懸濁させ、水と一緒に２５０ｎｍエルレンマイヤー・フラスコに移し、１Ｍ ＫＨＣＯ₃約４０ｍｌで塩基性にし、室温で一晩撹拌した。該反応混合物をビーカーに移し、濃ＨＣｌで酸性化し、室温で６時間、撹拌し、室温で４８時間、保存した。

該混合物を約７００×ｇで遠心分離し；色の上澄流体はそのままにしておき、沈殿を１Ｍ ＮａＨＣＯ₃に溶解して２時間撹拌した。暗緑色の溶液を、セプ・パック（Ｓｅｐ Ｐａｋ）（２ｇサイズ、レイニン（Ｒａｉｎｉｎ）２５）を通過させ、酸性化後の濾液を、遠心分離からの上澄流体と併せた。全量は約４００ｍｌであった。暗青色の酸性溶液を、セプ・パック（Ｓｅｐ Ｐａｋ）上に吸着させ、３Ｎ ＨＣｌでカラムを洗浄し、およびＭｅＯＨで溶出させた。セプ・パック（Ｓｅｐ Ｐａｋ）は、ＭｅＯＨおよび３Ｎ ＨＣｌで洗浄後、何度も繰り返し使用できる。該色素を含有するＭｅＯＨ溶出液を、回転蒸発、ならびにＨ₂ＳＯ₄およびＫＯＨ真空で乾燥させた。収量は１５８ｍｇであった。シリカを用いたクロマトグラフィによる、この材料の精製で、ラホヤブルー（Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｂｌｕｅ）−３（ＬＪＢ−３）を生じた。

結果を表１および表２に示し、また蛍光強度および偏光測定で評価した、３色素の非特異的結合および溶媒感受性を特性決定した。強度に関して、所望の特性は、溶媒成分と無関係な不変性とともに高い蛍光出力である。一方、偏光は、理想的には低粘度の媒体中で低いままで、かつグリセロール等の粘性の溶媒中で可能な限り高いことが望ましい。

表１は、アルミニウムフタロシアニントリスルホネートからの蛍光強度は、非常に溶媒に敏感なことを示す。比較すると、ジヒドロキシジカルボキシシリコンフタロシアニンスルホネートは、緩衝溶液中、緩衝溶液と血清中、またはグリセロール単独中で、ほぼ同じ蛍光出力を有する、劇的に改良された性能を示す。この改良の一部は、それ自体、血清および溶媒に対する感受性がＡｌ化合物より低い、ジヒドロキシ−ジカルボキシ−シリコン−フタロシアニン（スルホン酸基なし）との比較により、スルホン化に起因すると思われる。

表２は、中心原子としてのＡｌと比較するとき、中心のＳｉ原子の単なる存在が、環境に対する感受性を低下させることを、いっそう強く示す。この違いは、Ｓｉは２つの軸配位子を有し、したがって、該分子平面の両側に「保護基」が存在するため、色素の平面構造を、溶媒効果から「守る」という事実にたぶん起因するであろう。Ａｌの場合には、軸配位子が１つだけ存在し、したがって分子平面の片側は、溶媒効果に自由に影響される。図２では、該色素を、グリセロールに入れることにより（回転運動がほとんど停止すると、該偏光の近似限界を示す）、ほぼ到達可能な最大まで、Ａｌ色素の偏光が非常に大幅に増加する点に、この相互作用の結果がはっきり見える。

結論
本発明に関連した上記の代表的な用途は、本発明の範囲を制限するもとの考えてはならない。当業者の権限の範囲に含まれるであろう、現在既知の、または後で開発される、本発明のこのような変更は、下文に特許請求する通り、本発明の範囲に含まれると考えるべきである。

本明細書で言及した全ての特許および出版物は、本発明が関係する技術分野における熟練者の水準を示す。各出版物を具体的かつ個別に示したのと同程度まで、全ての特許および出版物を、参照により本明細書に援用する。

本明細書で実例を挙げて適切に説明されている本発明は、本明細書で具体的に開示されていない、要素または制限の非存在下で実施することが可能である：したがって、たとえば、本明細書のどの場合にも、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」のいずれも、他の２つの用語のいずれとも置き換えることができる。使用されてきた用語および表現は、制限の用語としてではなく、説明の用語として使用されており、このような用語および表現を使用する際に、示され、説明された、特徴の等価物またはその一部を排除する意図はないが、特許請求された発明の範囲内で、様々な修飾が可能なことは理解されるであろう。したがって、好ましい実施形態および任意の特徴によって本発明を具体的に開示してきたが、本明細書に開示されている概念の修飾および変更は、当業者によって使われること、およびこのような修飾および変更は、添付の特許請求の範囲によって規定される、本発明の範囲内であると考えられることを、理解すべきである。

Claims (18)

1. 中心金属原子を有する大環状の蛍光性配位子であって、前記原子は２つの軸配位子を大環状分子の両側に１つずつ有し、前記軸配位子は、アルコキシ基、ハライド基、ヒドロキシ基、ホウ酸基、硫酸基またはリン酸基から独立に選択され、前記大環状分子は、１以上のベンゾ基、および１つのベンゾ環上の環置換基として、２つのオルトカルボキシ基または１つのカルボキシ基とともに、カルボキシではない、水溶液中、ｐＨ５以上で負に帯電している１つの他の基、および前記大環状分子上の任意の他の可能な位置における他の環置換基として、カルボキシではない、水溶液中、ｐＨ５以上で、負に帯電している１以上の基を有する、大環状の蛍光性配位子。
2. 前記大環状分子は、フタロシアニンであり、前記中心金属原子は、ＳｉまたはＧｅであり、前記軸配位子はヒドロキシルであり、前記環置換基は、１つの環上の２つのオルトカルボキシ基、および他の環の１つの上の、１つのスルホ基である、請求項１に記載の大環状の蛍光性配位子。
3. 平面部分の両側に１つずつある２つの可溶化基に結合した発光性の実質的に平面の部分とともに、マーカー成分の正味電荷を制御し、また前記マーカー成分の他分子へのカップリングを可能にするために必要に応じて前記実質的に平面の部分の置換基を含む、マーカー成分。
4. 前記発光性の実質的に平面の部分が、１〜４個のベンゾ基を有するトリアザポルフィリンである、請求項３に記載のマーカー成分。
5. 前記発光性の実質的に平面の部分が、１〜４個のベンゾ基を有するジアザポルフィリンである、請求項３に記載のマーカー成分。
6. 前記発光性の実質的に平面の部分が、１〜４個のベンゾ基を有するモノアザポルフィリンである、請求項３に記載のマーカー成分。
7. 生体分子、たとえば抗原、ハプテン、抗体、オリゴペプチドまたはオリゴヌクレオチドに結合した、または天然もしくは合成の治療薬に結合した、請求項４、５または６に記載の発光性の部分を含む蛍光プローブ。
8. 過渡状態蛍光偏光／異方性の測定により実施されるアッセイで使用するのに適切な蛍光強度、偏光および減衰時間のような特性を有する、請求項７に記載の蛍光プローブ。
9. 平面部分の両側に１つずつある２つの可溶化基に結合した発光性の実質的に平面の部分とともに、マーカー成分の正味電荷を制御し、また前記マーカー成分の他分子へのカップリングを可能にするために必要に応じて前記実質的に平面の部分の置換基からなる、マーカー成分。
10. 中心金属原子を有する大環状の蛍光性配位子であって、前記原子は２つの軸配位子を前記大環状分子の両側に１つずつ有し、前記軸配位子は、アルコキシ基、ハライド基、ヒドロキシ基、ホウ酸基、硫酸基またはリン酸基から独立に選択され、前記大環状分子は、カップリングおよび正味電荷の制御を可能にするための置換基を担持する１以上のベンゾ基を有するモノアザポルフィリンである、大環状の蛍光性配位子。
11. 中心金属原子を有する大環状の蛍光性配位子であって、前記原子は２つの軸配位子を前記大環状分子の両側に１つずつ有し、前記軸配位子は、アルコキシ基、ハライド基、ヒドロキシ基、ホウ酸基、硫酸基またはリン酸基から独立に選択され、前記大環状分子は、カップリングおよび正味電荷の制御を可能にするための置換基を有する、コリン、サフィリン、ポルフィセンまたはナフタロシアニン誘導体である、大環状の蛍光性配位子。
12. 中心金属原子を有する大環状の蛍光性配位子であって、前記原子は２つの軸配位子を前記大環状分子の両側に１つずつ有し、前記軸配位子は、アルコキシ基、ハライド基、ヒドロキシ基、ホウ酸基、硫酸基またはリン酸基から独立に選択され、前記大環状分子は、カップリングおよび正味電荷の制御を可能にするための置換基を有する、２７−フェニルテトラベンゾトリアザポルフィリンまたは２７−（ｐ−メチルフェニル）テトラベンゾトリアザポルフィリン誘導体である、大環状の蛍光性配位子。
13. 本明細書に開示されている蛍光性マーカーまたは蛍光プローブを利用する、蛍光に基づくアッセイ。
14. 本明細書に開示されている蛍光性マーカーまたはプローブを利用する核酸ハイブリダイゼーションを含む、均一に混合して測定するアッセイ。
15. 前記蛍光部分が、（１）キノイド色素（２）インダンスレン色素（３）１，４−ジアミノアントラキノン−２，３−ジカルボキサミド類（４）テトラアミノアントラキノン類（５）アジン色素（６）ピリリウムまたはチオピリリウム色素および（７）ナフトキノンメチド類からなる群から選択される、マーカー成分。
16. 非特異的結合および平面分子のスタッキンッグを効果的に防御する方法であって、
    ａ）少なくとも２つの小さい軸配位子を提供する工程、
    ｂ）前記配位子の１以上を、前記分子によって画定される前記分子平面の反対側に置く工程、及び
    ｃ）前記分子全体の正味電荷が、前記防御がもたらされるのに十分であることを保証する工程、
    を含む、方法。
17. 前記軸配位子が、−ＯＨからなる、請求項１６に記載の方法。
18. 前記配位子が、−ＯＨ、−Ｏ−ｔ−ブチル、−ＯＣＨ₂ＯＨ、−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、ＯＣＨ₂ＣＨＯＨＣＨ₂ＯＨ、−ＯＣＨ₂ＣＨ₂−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、−ＯＣＨ₂ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＨ、−ＯＰＯ₃Ｈ₂、−ＯＢ（ＯＨ）₂、Ｃｌ、ＢｒおよびＦを含む群から選択される、請求項１６に記載の方法。