CN101035800A - 取代的氮杂卟啉作为荧光标记 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及标记组分,荧光探针,寡核苷酸,杂交分析和利用这种产物进行的免疫测定,以及制备这种产物的方法。根据本发明,所提供的可检测性标记的标记组分包含与两个小的增溶基结合的荧光部分,一个在分子平面的各侧面上,所述荧光部分具有调控净电荷的取代基以便减少或消除溶剂敏感性和非特异性结合的问题。
Description
发明领域
本申请涉及荧光照相术,荧光测定方法和荧光探针。
发明背景
本文引用的出版物及其它参考资料在这里引入作为参考。以下对本发明背景技术的描述目的在于帮助对本发明进行理解,但是并不等于承认其描述或构成了本发明的现有技术。
卟啉,酞菁及其它氮杂卟啉以及特定的其它含氮的大环芳香烃的近红外吸收和发射有时候使得这些化合物可用作荧光标记的有前景的候选物。
酞菁,尤其基于它们强烈地近红外吸收(摩尔消光系数约200,000)它们的高量子产率以及对常见金属酞青色素退色的抗性,使得人们进行了许多的努力来利用它们作为荧光标记。然而,按此方式的早期研究并没有产生完全合格的产品,很大程度上是因为酞菁异乎寻常地强烈倾向于相互结合,尤其是通过堆积面对面聚集,以及强烈地结合到各种其它分子表面(非特异性的结合)。
由于分子内堆积未取代的酞菁在有机的和水性的溶剂中具有非常低的溶解度。众所周知,通过导入电荷基团,诸如磺酸酯可降低堆积的倾向。
而具有这种取代基的酞菁可能在水中以及电解质的水溶液中具有高溶解度,非特异性结合的倾向基本上仍持续。大部分荧光标记的科学意义集中在与生物材料诸如组织切片,细胞,细胞片段,蛋白,包括乙二醇-和脂-蛋白,肽,寡-和聚-糖,寡-和聚-核苷酸以及脂类有关的应用。可能通过目的特异性相互作用的部分屏蔽来干扰在涉及这些材料的荧光分析中的结合非特异性的倾向。在治疗药物的分析中,可通过将酞菁染料连接到一或多种聚氧烃基,典型地为端甲氧基-聚(乙二醇),(PEG)的将非特异性的结合以及堆积倾向降低到可忽略的水平。同时,这种基团的连接保持了理想的吸收和发射特性。相同的技术对各种其它的近红外色素也是有效的。参见,美国专利5,403,928。
对免疫分析相关参数的测定已经取得了显著的进步。例如,利用描述在Dandliker等,美国专利5,302,349,名称为″Transient StateLuminescence Assay Apparatus″中的技术(在这里全文引入作为参考,包括所有的附图),可以均一分析的形式实现对结合以及游离形式的组分的浓度进行测定,即不需要对结合的以及游离的形式进行分离。
尽管在荧光标记领域以及数据分析方面取得了显著的和有希望的改进,但本领域仍需要其他具有必要的优点但也很容易制备并且具有更高化学稳定性的色素。其他人公开的密切相关的现有技术参见美国专利5,135,717,5,346,670和5,494,793。
发明内容
本发明详细说明并描述了对于某些酞菁可被转化成用于制备荧光探针的荧光染料的发现和应用。这些可通过提供具有合适的携带仅具有几个原子的轴向配体的金属原子的酞菁。这些变化大大地消除了分子堆积(面对面聚集)并非特异性结合于其它携带相同信号的电荷的分子表面。
发明简述
本发明基于如果平面分子的两个这种基团之一存在于分子平面的一侧,并且如果整个分子的净电荷足够地大,即使非常小的基团诸如-OH也可产生针对非特异性结合以及平面分子堆积的有效保护的出乎意料的结果。
因此,本发明的一个方面是通过与聚氧烃基结合而非通过两个非常小的轴向配体(诸如-OH)可以实现所设计的酞菁及其它荧光染料所希望的效果,条件是染料上的净电荷足够多。在大多数情况下,净电荷优选为负电荷,因为在生理pH范围中大多数生物材料包括蛋白以及DNA也将携带负净电荷。因此,我们发现某些磺化的二羟基硅二羧基酞菁,尤其是La Jolla蓝-3(LJB-3)当用于标记抗体时将提供高活性以及特异性的结合物。LJB-3比携带轴向聚乙二醇(PEG)的染料/荧光团更容易制备,此外,LJB-3在化学性质上更稳定。图1显示了(LJB-3)推测的结构。磺基的位置不确定,但是可以想像在任一未取代的苯环上。LJB-3的最大近红外吸光度是在679nm处。
通过量测游离染料,即不是在完整荧光探针中的染料可以部分评价荧光团(荧光部分)的性能。这种检验中有意义的参数包括荧光强度和偏振/向异性,当荧光团暴露于诸如存在于血清中的不同离子强度的特异性离子或生物分子时这些参数通常改变。这些效果可以被认为是“溶剂效应”,并且可通过荧光团的分子之间相互作用的改变从而改变聚集状态或者在荧光团分子之间以及溶剂组成的改变(非特异性结合,NSB)产生。
本发明的染料结构以及先前试图使用酞菁(Pc′S)作为荧光探针的标记的染料结构之间的比较可以通过NSB的检验形式得以认识,在NSB的检验形式中向血清中添加游离的染料并测定所产生的偏振或向异性。如果发生非特异性结合将产生偏振增加,因为结合后分子量的增加引起转动布朗运动速率的下降。
表1中,可以通过荧光强度(I)的改变,和/或水平穿过表进行的偏振的改变(mp,毫偏振单位)判断任一染料的性能。无论溶剂组成如何,“理想的”荧光标记对于这些参数将具有相同的值。
正常人血清中与甘油中性能的比较可以提供有益的信息,因为在血清存在下由NSB将提供对可能的偏振变化损失的测定。对于所列举的5种染料而言,甘油中和正常人血清中偏振之间的差异值分别为:60.4,73.6,103,12,61和44.1。这些差异显示Si作为中心原子显著的有益效果并且还指出LJB-3为基团的最佳选择。甘油中的强度除以正常人血清中的强度的比值也是有象征性的。显示在表中为:1.46,1.27,1.51,2.91,4.82和0.42,再次显示Si相比Al显著的优越性以及LJB-3非常优秀的性能。
另外,LJB-3兼具羧基和磺酸酯基团并且可以多种方式被“激活”,即转化为在生理pH以及室温下与待标记的生物分子上的基团(通常氨基)自发反应从而共价连接的结构。我们使用了两种用于标记抗体的活化试剂,即羰基二咪唑以及琥珀酰亚胺基四甲基脲四氟硼酸酯(STUT)。我们发现后者在容易处理以及结果的再现性方面都是优选的。这可能是由于当使用STUT时,中间体染料的UHS酯的较强的稳定性。另外,用STUT激活的最佳溶剂是DMSO。可以使用DMF但是可能会受不可避免的痕量胺的困扰。
对于给定应用荧光团的最明确的合格性试验是将染料掺入完整的探针并测试探针。以上对游离染料的血清试验可以作为有用的指导,但还不能完全代替对特异性探针的试验。
表2和3显示了利用LJB-3标记的抗-人IgG作为ANA(抗核抗体)的探针的说明性结果。可以通过FIU(阳性/阴性)(或FIU[+/-])值,即来自阳性样品的信号与来自阴性对照(正常的)的比值测定性能的质量。7或更高的值是有用的;随着技术的发展获得了这些表中的数据;在常规应用中可以预见将一致地产生较高的FIU(+/-)值。
发明详述
一般讨论
本发明基于如果平面分子在两个这种基团之一存在于分子平面在一侧,并且净电荷足够多的话,即使非常小的基团诸如-OH也可在水溶液中产生针对非特异性结合以及平面分子堆积的有效保护的出乎意料的结果。
因此,本发明的一个方面是通过与聚氧烃基结合而非通过两个非常小的轴向配体(诸如-OH)可以实现所设计的酞菁及其它荧光染料所希望的效果,条件是染料上的净电荷足够多。在大多数情况下,净电荷优选为负电荷,因为在生理pH范围中大多数生物材料包括蛋白以及DNA也将携带负净电荷。因此,我们发现某些磺化的二羟基硅二羧基酞菁(尤其是LJB-3,图1)对血清蛋白具有如PEG-结合的未磺化染料一样低的非特异性结合。
此外,存在的一个优点在于不存在由PEG形成的胶束。
在10-4以及以上的染料浓度的PEG工程化染料的表现很像大分子,因为其通过设计用于阻止30K道尔顿以上或更大的分子通过的膜受到很大的限制。并且,染料在设计用于从小分子分离大分子的凝胶渗透层析的空隙体积中移动。相比之下,LJB-3的表现就像所希望的其分子量的分子一样。
当染料暴露于例如稀释的人血清LJB-3时,通过荧光偏振和强度改变测定的非特异性结合的表现与PEG结合的染料几乎相同。在这方面,重要的是要注意到负电荷本身对非特异性结合的减少有显著的影响,因为未磺化的二羟基二羟基二羧基硅酞菁显示明显的非特异性结合。羟基铝酞菁三磺酸酯不仅对离子强度显示强烈的敏感性而且具有强烈的非特异性结合。似乎酞菁分子在分子平面的两侧必须具有轴向的配体,但是如果净电荷足够多的话-OH基团足够大到全部消除非特异性的结合。
本发明的另一个优点是由-OH或其它小的可溶性轴向配体连同高电荷工程化的染料在化学性质上更具活性(在标记反应中),尽管被标记的分子,例如蛋白和寡核苷酸本身带负电荷。这就意味着PEG配体参与分子的标记,尽管通常很容易进行半抗原及其它小分子的标记。
本发明在羟基铝酞菁三磺酸酯的强烈非特异性结合方面本发明是非常出乎意料的,由此,可以设想具有较少负净电荷的二羟基二羧基硅酞菁将比铝染料显示更强的非特异性结合。本发明部分上是基于显示正好相反的发现。其它小轴向配体诸如:-OCH3,-O-CH2OH,Cl,-Br和-F的效果也是有用的。OPO3H2 -的特性也是显著的并暗示了其它可能有用的配体诸如硼酸酯和硫酸酯。
许多其他的含氮大环可以用具有类似结果的基团14的原子金属化。这种大环包括卟啉,氮杂卟啉,corroles,sapphyrins,pentaphyrins,porphycenes及其它具有广泛的离域π电子系统的类似大环的衍生物以及结构变体。鉴于它们包括许多所希望的特性,大环特别优选的类型含有氮杂卟啉衍生物以及结构变体:氮杂卟啉衍生物包括单,二以及三氮杂卟啉和prophyrazine。任一的这些大环可以任选具有稠合芳烃环。这种氮杂卟啉衍生物以及变体包括酞菁,苯并三氮杂卟啉以及naphthaloyanine及其衍生物和其氧杂,硫代,或氮杂结构变体。某些非-大环芳族结构,例如氧杂蒽衍生物也可以具有上述列举的类型的必要的荧光特性(Daltrozzo等,美国专利6,552,199,4月,22,2003)。
因此本发明涉及标记组分,荧光探针,天然以及合成的治疗药物,抗原,半抗原,抗体,寡核苷酸,利用这种产物的杂交分析以及免疫测定以及这种产物的制造方法。根据本发明,提供了可检测性标记的标记,组分,其包含结合于两个或更多通常轴向的小的可溶性配体的荧光团部分,所述轴向被定义为由中心金属原子形式的八面体几何形状的复合物,所述中心金属原子优选减少或解决了溶剂敏感性以及非特异性结合的问题。
在分析中使用这种可检测的标记或标记组分是有益的,因为这些标记在诸如血清的生物材料存在以及缺少的条件下具有大体上相同强度的平行以及垂直的荧光发射组分。因此,利用这些标记的测定法能够检测生物流体中或生物表面诸如组织样品或培养细胞上低浓度的分析物,靶分析物或其类似物。术语“分析物”是指分析中的化合物或待测定的化合物,可以是天然存在受体或可以制备的任何一种化合物,为单或多表位的,抗原的或半抗原的单个或多种化合物,其至少共享通用的表位位点或受体。术语“靶分析物”是指分析中的化合物或待测定的化合物,可以是天然存在受体或者可以制备的任何一种化合物,为单或多表位的,抗原的或半抗原的,单个或多种化合物,其共享至少一个通用的表位或受体。靶分析物的“类似物”是指能与靶分析物竞争结合受体的化合物。术语“受体”是指能够特异性识别或由靶分析物或其类似物识别的分子复合物。例如,抗体可以是抗原的受体。
这些标记组分可以用作标记分析物,抗原,抗体或者其它分子的标记。这些标记组分可以被任选地功能化以便包括使标记组分与分析物,抗原,抗体或者其它分子连接的连接臂。适于这个目的的多种连接臂描述在Kricka,J.J.;Ligand Binder Assays,Labels and AnalyticalStrategies;1551页;Marcel Dekker,Inc.,New York,NY(1985)。利用传统方法将标记组分连接于分析物,抗原,抗体或者其它分子。
在本发明的一个方面提供了可检测性标记的标记组分,其包括:
(1)含有大体上呈平面分子结构的发光结构的荧光部分,优选具有至少约550nm的激发波长以及(2)连接的两个或更多小的溶解性轴向配体以及(3)具有足够多的负净电荷。优选的荧光团,小的溶解性轴向配体以及二者的键合的实例详细描述于此。此外,提供了证明轴向配体以及净电荷在减少溶剂敏感性以及非特异性结合的有效性方面的证据。
术语“溶剂敏感性”是指取决于所使用的溶剂系统分子荧光特性方面的改变,最显著的是指与有机溶剂(诸如DMF)相比在水溶液中荧光特性的差异。许多在诸如DMF的有机溶剂中表现出高荧光强度的荧光团在在水溶液中显示出显著降低的荧光强度。荧光强度与样品浓度以及激发辐射的强度有关。特定染料的荧光强度可以与其特征吸光度(消光系数)以及荧光量子效率以及环境因素有关。这些标记组分也显示出加强的衰减时间,接近于其放射或者未淬灭的寿命。我们使用的术语“衰减时间”是指为了使受激分子的浓度从其起始浓度降低到l/e的值必须消耗的时间。有关寿命的术语的用法会有所改变,参见例如,Demos,J.N.,Excited State.Lifetime Measurements,Academic Press,纽约,N.Y..(1983),10,35,44,158页。
通过量测游离染料,即不是在完整荧光探针中的染料可以部分评价荧光团(荧光部分)的性能。这种检验中有意义的参数包括荧光强度和偏振/向异性,当荧光团暴露于诸如存在于血清中的不同离子强度的特异性离子或生物分子时这些参数通常改变。这些效果可以被认为是“溶剂效应”,并且可通过荧光团的分子之间相互作用的改变从而改变聚集状态牛生物分子在荧光团分子之间以及溶剂组成的改变(非特异性结合,NSB)产生。
本发明染料结构以及先前的使用酞菁(Pc’S)作为荧光探针的标记的染料结构之间的比较可以通过上述NSB的模型得以认识,其中向血清中添加游离染料并测定了所产生的偏振或者向异性。如果发生非特异性结合就会产生偏振的增加,因为结合后分子量的增加引起转动布朗运动速率的下降。
表1中,可以通过荧光强度(I)的改变,和/或水平穿过表进行的偏振的改变(mp,毫偏振单位)判断任一染料的性能。无论溶剂组成如何,“理想的”荧光标记对这些参数的每一个具有相同的值。
正常人血清中与甘油中性能的比较可以提供有益的信息,因为在血清存在下由NSB将提供对可能的偏振变化损失的测定。对于所列举的5种染料而言,甘油中和正常人血清中偏振之间的差异值分别为:60.4,73.6,103,12,61和44.1。这些差异显示Si作为中心原子显著的有益效果并且还指出LJB-3为基团的最佳选择。甘油中的强度除以正常人血清中的强度的比值也是有象征性的。显示在表中为:1.46,1.27,1.51,2.91,4.82和0.42,再次显示Si相比Al显著的优越性以及LJB-3(结构显示于图1)非常优秀的性能。
另外,LJB-3兼具羧基和磺酸酯基团并且可以多种方式被“激活”,即转化为在生理pH以及室温下与待标记的生物分子上的基团(通常氨基)自发反应从而共价连接的结构。我们使用了两种用于标记抗体的活化试剂,即羰基二咪唑以及琥珀酰亚胺基四甲基脲四氟硼酸酯(STUT)。我们发现后者在容易处理以及结果的再现性方面都是优选的。这可能是由于当使用STUT时,中间体染料的UHS酯的较强的稳定性。另外,用STUT激活的最佳溶剂是DMSO。可以使用DMF但是可能会受不可避免的痕量胺的困扰。
试验结果
对于给定应用荧光团的最明确的合格性试验是将染料掺入完整的探针并测试探针。以上对游离染料的血清试验可以作为有用的指导,但还不能完全代替对特异性探针的试验。
表2和3显示了利用LJB-3标记的抗-人IgG作为ANA(抗核抗体)的探针的说明性结果。可以通过FIU(阳性/阴性)(或FIU[+/-])值,即来自阳性样品的信号与来自阴性对照(正常的)的比值测定性能的质量。7或更高的值是有用的;随着技术的发展获得了这些表中的数据;在常规应用中可以预见将一致地产生较高的FIU(+/-)值。
表1.
通过测定取代的酞菁对溶剂组成改变的敏感性确定荧光强度(I)和偏振(mp)的改变
荧光团 | TDx缓冲液 | BBS | 胎牛血清 | 正常人血清 | 甘油 | |||||
I | mp | I | mp | I | mp | I | mp | I | mp | |
Si Pc单磺酸酯 | 1762 | -1.5 | 1040 | 0 | 867 | 69.7 | 1133 | 82.6 | 1657 | 143 |
Si Pc三/四磺酸酯 | 2337 | -1.0 | 1411 | 3.9 | 1080 | 2.6 | 1420 | 13.1 | 1798 | 86.7 |
Si二羧基 Pc单磺酸酯(LjB-3)(图1) | 1230 | -0.3 | 741 | 2.0 | 716 | 38.7 | 896 | 95.7 | 1351 | 199 |
Al Pc三磺酸酯 | 1108 | 1.7 | 520 | 3.4 | 533 | 60.7 | 1086 | 224 | 3155 | 236 |
Al Pc四磺酸酯 | 370 | 5.9 | 165 | 5.0 | 170 | 40.3 | 259 | 141 | 1249 | 202 |
二磷酸根络硅二羧基酞菁 | 1069 | 6.7 | 1078 | 2.4 | 1020 | 64.9 | 1083 | 60.9 | 454 | 105 |
缩写:mp:103(偏振);TDx缓冲液:用于荧光偏振分析的商用缓冲液;Pc:酞菁;BBS:硼酸盐缓冲盐水(0.25M NaCl,0.0232M硼酸和0.00179M四硼酸钠。pH最终用1M NaOH调节至8.0+/-0.05。当试验血清时,将25μl的全血清添加到1ml的BBS(含有已经添加的25μl的染料)。注意不同荧光团的相对浓度是未知的,因此只有当在水平方向进行时荧光强度的比较才是有意义的。在水溶液中操作LJB-3的BBS可以用硼酸盐缓冲液KCl(BBKCl)代替,通过混合33.1ml的0.70M硼酸,4.0ml的0.50M K2B4O7,75ml的4.0M KCl和水制备1升:pH ca.8.1。
荧光测定:在瞬态偏光荧光计(FAST-1,Hyperion,Inc.Miami,FL)中进行。
表2.LJB-3-标记的山羊抗-人IgG与患者抗核血清抗体(ANA)的特异性结合。
A:染料制备:由羰基二咪唑激活的LJB-3(1)
Lot# | n摩尔LJB-3 | 产物中染料/蛋白的摩尔比 | FIU(2)(+/-) |
211-45-70J(3)211-49-70D(3) | 7070 | 4.13.4 | 11.72.4 |
211-45-100J211-49-100D | 100100 | 2.0 1511.8 | 2.111.9 |
211-45-140J211-51J | 140140 | 3.16.3 | 9.27.1 |
(1)每一标记中1mg的蛋白(Comassie Blue)。
(2)FIU:ANA检验中观察到的荧光强度的比率;反差测量:样品/阴性对照。
(3)两种不同的抗体制备:D和J。
B:染料制备:由STUT*激活的LJB-3
ID标记的抗体 | 染料/蛋白的摩尔比 | FIUPos/Neg |
6th对照 | 5.60 | 14.04 |
211-184 | 3.44 | 5.86 |
211-186 | 1.16 | 5.06 |
211-187 | 1.63 | 6.91 |
211-190E | 2.09 | 8.87 |
6th对照 | 5.60 | 14.30 |
211-191 | 0.95 | 13.54 |
211-192 | 2.65 | 6.48 |
*琥珀酰亚胺基四甲基脲四氟硼酸酯
详细的背景和范围
这些标记组分可用作用于掺入荧光探针的荧光标记。术语“荧光探针”是指含有荧光团部分的标记组分,直接或者经连接臂键合或者配位到分析中使用的分析物,抗原,半抗原,抗体或者其它分子,所述分析诸如为荧光免疫分析从而测定目的物质的存在和/或量。这些标记组分的一些可用作磷光标记,本发明的组分也可用作用于体内显影的试剂的标记以及用作体内肿瘤治疗中使用的试剂的标记。
因为这些标记组分尤其适用于利用生物流体样品的分析,优选使用的是具有近红外区激发和/或发射波长的荧光团,从而使来自其它样品组分的周围环境荧光的干扰最小化。当使用的激发波长小于500nm时,诸如血清的一些样品可以显示出来自黄素,flavoproteiris,NADH等相当大的干扰背景荧光。
对于某些应用而言,诸如荧光偏振免疫测定,优选的荧光团当为结合形式时也可以显示出高水平的荧光偏振,优选大于约10%的可见偏振理论最大值。术语“结合的”是指在分子及其特异性结合伴侣酯键已经形成结合相互作用的条件。无疑,诸如荧光瞬态分析的应用,优选荧光团的特征在于在约1毫微秒到约50毫微秒范围内测定的荧光衰减时间,优选在约5到约20毫微秒的范围内。对于其它应用,诸如磷光标记,可以使用甚至具有更长衰减时间的荧光团。
优选的小可溶的轴向配体包括-OH,-O-叔-丁基(可用于存在有机溶剂时),-OCH2OH,-OCH2CH2OH,OCH2CHOHCH2OH,-OCH2CH2-OCH2CH2OH,-OCH2CH2-CH2-O-CH2-CH2CH2OH,-OPO3H2,-OB(OH)2,Cl,Br和F。
在优选的实施方案中,荧光团部分具有一个平面,多齿的大环配体配位于能够与两个小的可溶的轴向配体配位的中心原子。为用作荧光结合分析中的标记组分,合适的中心原子为那些可配位两个轴向配体且其没有充分高的原子序数来通过跃迁为三重态引起广泛荧光猝火。对于中心原子而言,优选的成分包括硅,锗以及锡,尤其优选的是硅和锗。
本发明的这些可检测标记或标记组分在免疫测定中的应用是有益的,因为这些标记在存在和缺少生物液体诸如血清时具有大体上相同的平行和垂直组分的荧光发射强度。因此,利用这些标记的测定方法能够检测生物液体中低浓度的靶分析物。
本发明的方法尤其适用于发明名称为“荧光计检测系统”的美国专利5,323,008中描述的改进的荧光检测系统。
在利用本发明的荧光标记的竞争性抑制分析方法中,目的在于提供一种通过将含有靶分析物的待测样品与已知量的添加的靶分析物或其类似物接触来测定靶分析物存在量的方法,所述的靶分析物或其类似物连接于包括由荧光部分组成的可检测标记组分的荧光探针,其中荧光部分包括结合于两个小的可溶的轴向配体的发光平面分子结构,一个位于平面分子结构的任一侧且具有足够的负净电荷,将混合物与能够特异性识别目标结构的受体接触并且测定结合于受体或者游离的荧光探针的量。未知样品中分析物的量可由空白样品以及含有已知量的靶分析物的读数来推断。
在另一方面,本发明提供了进行“夹心”或“二-位点”免疫测定的方法,包括步骤:(a)将含有靶分析物的待测样品与能够特异性识别目标的受体接触来形成靶分析物和第一受体的复合物,第一受体用具有荧光团部分的荧光探针标记,其中荧光团部分具有一个与两个小的可溶的轴向配体结合的发光的基本上呈平面的分子结构,可溶的轴向配体中的一个位于平面分子结构的任一侧面上同时具有足够高的负净电荷;(b)将复合物与能够特异性识别目标-分析物或第一受体的第二受体接触,第二受体结合于固体载体,来形成第一标记受体,目标-分析物和结合于固体载体的第二受体的复合物;和(c)测定标记的与固体载体结合的第一受体的量或测定未反应的标记的第一受体的量。
在另一个实施方案中,分析可包括额外的步骤:使在未知样品中测定的标记第一受体的量与在不含靶分析物的对照样品中测定的标记的第一受体的量相关联,或与在含有已知的靶分析物的量的样品中测定的标记的第一受体的量相关联。
在另一个方面,本发明提供了可用于测定靶分析物的夹层式荧光免疫测定方法,其中可使用能够被分析物独立地识别而不互相干扰的两种不同受体。各受体用不同的染料标记。例如,一个受体是用分别具有最大680nm和690nm的吸收和发射的第一染料标记的受体,且其它受体用分别具有最大695和705nm的吸收和发射的第二染料标记。可利用稳态或瞬态测定来检测和定量分析分析物。在两种情况下,对于所给的实例而言,激发应在680nm处并且检测应在705nm处。这种类型的分析基于能量转移并且具有一致性的优点。
在优选的实施方案中,本发明的标记和探针最有益地用于通过谱近红外区的瞬态,光偏振荧光监控的均一混合和读数分析中。这些组合形式产生了非常迅速的方法,其可以容易地大量进行并且容易自动操作来产生读数。这些分析具有固有的特征,因为通过近红外波长(低偶发的荧光)和瞬态技术(避免瑞利和拉曼散射)提供的低背景干扰,使得这些分析具有精确性和准确性。
本发明目的在于提供对生物液体的免疫测定,生物液体包括血清,血浆,全血,尿液和完整细胞,后者,例如,作为悬浮液或置于固体表面上用于荧光显微术。在测定全血时,通常在通过赖氨酸试剂诸如硬脂酰-溶血卵磷脂,棕榈酰溶血卵磷脂或十四酰溶血卵磷脂分析之前溶解红血球是有益的。
在一个实施方案中,靶分析物是药物或药物的代谢产物:药物可以是类固醇,激素,抗生素,免疫抑制剂,止喘药,抗肿瘤药,抗心律失常药,抗惊厥药,治风湿药,抗抑郁药或强心苷。这些药物的实例包括地高辛,毛地黄毒苷,茶碱,苯巴比妥,甲状腺素,N-acetulprocainamide,麦苏林,氨丁卡霉素,庆大霉素,netilmicin,托普霉素,酰胺咪嗪,乙琥胺,丙戊酸,达舒平,利多卡因,普鲁卡因酰胺,奎尼丁,氨甲喋呤,阿米替林,mortriptyline,丙咪嗪,去郁敏,万古霉素和环孢素。
在另一个实施方案中,靶分析物是肽生物分子或其片段。这些肽生物分子包括,例如,肽类激素诸如促黄体生成激素,促卵泡激素,人绒毛膜促性腺激素,促甲状腺激素,血管紧张素I,血管紧张素II,催乳激素胰岛素,肿瘤标记物诸如癌胚抗原或病毒诸如风疹病毒。
本发明的方法提供了测定由约10-5M到约10-13M浓度的靶分析物的方式,并且尤其在约10-9M到约10-12M的浓度范围内。这些测定对样品或受体制剂中的偶发荧光的量以及对荧光发射的强度是非常敏感的。通常,可以肯定地说,将波长移成近红外以及利用瞬态检测是有益的,但是各种样品存在杂质的差异要求在分析过程中优化每一种的分析。
本发明的主要目的是提供具有大大加强的可靠性以及便利性的改进的基于荧光的分析。本发明的另一目的是提供快速以及精确测定的方法,常常在几分钟内解决问题。本发明的一个目的是提供能够测定非常低浓度的荧光标记或标志的方法。本发明的一个目的是提供因为快速和准确,相对低成本以及能够使用未修饰的生物样品诸如全血所以可用于临床的方法。这些目的通过如下手段得以实现:1)优化荧光标志的光学特性,2)检测系统的高灵敏性以及稳定性,3)使用除去瑞利以及拉曼散射的瞬态检测,4)使分析均一消除分离以及提供简单的混合物以及读出过程以及5)使设备以及样品大小小型化。
本发明还提供了通过将荧光团部分与活性形式的可溶的轴向配体反应合成标志组分的方法。本发明还表征了具有本发明的标志组分的荧光探针,所述标志组分与特异性结合对或类似物的靶分析物的一个成员相连。术语“特异性结合对”是指两个不同的分子(或成分),其中一个分子具有表面上或腔中的区域,其特异性识别以及结合于其它分子(或包括其它分子的分子复合物)的特定的空间以及极性构成。
本发明的荧光染料可应用于DNA技术的若干领域以及研究。大体上,这些应用是那些其中必须标记单链DNA以便能够在加工或检验中示踪以及观察的应用。例如,在DNA序列测定的双脱氧测序法中,引物分子(互补于模板的3’末端的短的部分的短序列DNA)被末端标记(在所述引物的5’末端上)。具有4个核苷酸三磷酸的DNA聚合酶用于向模板的5’端延伸引物序列的3’端产生互补于模板的新链。反应进行很远之前,将反应混合物分成4个相等的部分,每一部分分别用4(A,T,G或C)种二脱氧核苷酸三磷酸处理随机终止链延伸以及由此产生新的不同长度序列的混合物,所述不同长度的序列终止于在所使用的二脱氧核苷酸三磷酸的相同的碱基(A,T,G或C)。通过根据链长进行分离的PAGE电泳分离新的不同长度的链的混合物,所述PAGE电泳可以通过Southern印迹进行观察,在Southern印迹中通过“印迹”将条带谱转移到硝化纤维膜上用于观察。
在其它使用Southern印迹的情况中,通常通过高pH对DNA进行变性因此是单链的。在任一这些情况,与携带本发明的荧光标记的互补探针杂交提供了从Southern印迹观察DNA的高灵敏性以及特异性的方式。DNA指纹分析是另一个预计越来越重要的领域。在一个指纹方法中,测试探针(标记的单链序列)与来自待鉴定样品的限制酶降解的DNA的Southern印迹中的单链材料杂交。在所应用的这些方法中,荧光标记提供了与目测结合的高灵敏性。
本发明荧光染料的独特特性可产生完全新型的对微量DNA的分析。这些分析将利用具有数字读数的瞬态荧光偏振(TSFP)。这些分析的突出的优点是它们可以简单的混合和通过微升等级的读数分析来进行而不需必须分离。用于检测和识别DNA的标准分析如下:
1.收集可能含有待测DNA的样品。
2.通过PCR(聚合酶链式反应)扩增样品。
3.将用本发明的荧光染料标记的单链DNA添加到扩增混合物中并随时间进行TSPF(也许几分钟)。如果互补于标记DNA探针的DNA存在于试验样品中,则将发生杂交并且偏振将随时间而增加。
本发明的目的也在于提供新的染料-寡核苷酸结合物以及它们的合成和使用方法。使用这些结合物或探针的方法可能涉及核酸杂交,核酸扩增以及核酸测序的方法。染料-寡核苷酸共轭物的染料部分是本发明的荧光标记。这些标记可能具有各种与DNA或RNA结合的功能性基团。这些功能性基团包括羧基,氨基和N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)。
“寡核苷酸”是指相对短链的核苷酸残基。典型地,本发明使用的寡核苷酸具有5到50个核苷酸的长度。用于本发明方法寡核苷酸探针包括DNA,RNA或任意其他种类可与核酸序列杂交的序列的多核苷酸。可以理解这样的核酸序列可包括碱基类似物以及自然存在的碱基胞嘧啶,腺嘌呤,鸟嘌呤,胸腺嘧啶和尿嘧啶。这样的碱基类似物包括次黄嘌呤,2.6-,二氨基嘌呤和8-azguanine。探针可以是双链的或单链的形式,但优选为单链形式。它们可通过直接合成,聚合酶介导的延伸反应或通过克隆或任意其他方便的方法来制备。“连接的”是指通过与两个部分连接的中间分子进行的化学结合。
可利用缩合反应导致例如形成酰胺,酯,腙,缩氨基脲,缩氨基硫脲,尿素和硫脲键来实现将寡核苷酸或多核苷酸与标记相连接。例如,接头可以氨基,优选初级氨基终止。其他的接头可以羧基终止。
在另一个方面,本发明提供了制备特定的染料-共轭的寡核苷酸的方法。在一个实施方案中,这样的方法包括步骤:(a)将具有以氨基终止的结合接头的寡核苷酸与可检测标记的标记组分的N-羟基琥珀酰亚胺酯或咪唑化物(imidazolide)反应,其中标记组分包括一个含有与两个小的可溶的轴向配体结合实质上发射荧光的平面分子结构的荧光团部分,一个位于平面分子结构的各侧面并具有足够的额外的负电荷以降低两者的聚集和非特异性结合,来形成共轭物;以及由未反应的寡核苷酸或多核苷酸以及由未反应的染料分离步骤(a)中形成的共轭物。可利用二胺或氨基醇来完成接头与寡核苷酸的连接。优选地,可检测的标记组分包括隔离的(caged)二羧基硅酞菁染料。
或者,可通过下述反应;来制备染料-共轭物寡核苷酸:在羟基苯并三唑和寡核苷酸或多核苷酸存在下,将标记组分与碳二亚胺反应来形成共轭物以及由反应混合物的其他组分分离产生的共轭物。
在另一个方面,本发明提供了检测样品中靶核酸序列的方法,该方法包括步骤:将样品核酸与具有用本发明的荧光标记标记的寡核苷酸接触,所述的寡核苷酸能够与所述的靶核酸序列在均质溶液中杂交,以及通过瞬态(或稳态)偏振荧光检测此种杂交的存在或量。
在另一个方面,本发明的目的在于提供一种检测或定量测定靶核酸的方法,其中靶核酸是核酸扩增的产物。核酸扩增方法聚合酶链式反应(PCR),连接酶链式反应(LCR),自主序列复制(3SR)以及基于转录的扩增系统(TAS)。
当与时间-相关的瞬态检测系统一起使用时,本发明的方法是尤其有用的,如Studholme等,发明名称为“荧光检测系统”的美国专利5,323,008所描述的,该系统的特征在于瞬态检测实现了直接阅读样品的时间依赖的偏振作用。该系统利用了可以非常高的频率例如兆赫调节的激光二极管,并且显示出高的输出功率。典型地,激光“接通”时间大约是2-3纳秒。使用以单光子计数模式运行的光电倍增管检测溶液的光子。与激光脉冲时间比较,测定了光子现象以及光子现象的相对时间。通过存储个体的光子现象次数,产生作为时间函数的光子的频率的柱状图。
在另一个方面,本发明提供了一种用于监控核酸扩增过程的动力学,和/或定量测定目标样品中核酸的方法。例如,在PCR扩增过程中,由已被加帽并用本发明的荧光染料标记的寡核苷酸组成的探针可直接添加到PCR反应中。“加帽”是指3′末端已与二脱氧核苷酸三磷酸反应。因此荧光随时间变化的瞬态检测可用于跟踪反应的发展。
在每个冷却阶段,可动态跟踪与扩增产物的杂交。因为扩增产物的浓度增加,探针与扩增产物的结合率也增加以及定量测定扩增产物的浓度。循环数相关的信息定量显示了扩增前样品中原先存在的DNA的量。
发明的另一个方面是对荧光计的任何构思、变化或修改的宽泛的应用范围。在下文中的特定类型装置的实例中对适用性的范围进行了较好的说明。在非吸收性介质中,光波穿越由较低折射率的第二介质B包围的介质A时,如果入射角大于临界角则光波在介质A的边缘全部内反射。然而,全反射光的穿透边缘短的距离并且在那里可以产生物理作用诸如激发位于邻近A与B之间接触面的荧光分子。
这些作用能够同质,基于荧光的分析其中特异性反应发生在固定于介质A表面上的分子上且因此可发生在激发荧光唯一位置的接触面处。普通玻璃或塑料板充当入射光的光波导管并且作为特异性受体的载体预先放置在表面上的已知位置处。此方法已被命名为“瞬逝光荧光免疫分析”(Herron等美国专利5,512,492)。
有益地,本发明包括利用基于含有N的大环(下面所列举的类型)的荧光染料的非常大的Strokes位移的特征,其中大环通常具有近UV激发区域以及在光谱的近红外区发射。这些染料适用于稳态或瞬态方式的免疫/受体分析。激发源包括水银弧光,氮激光器和氮激光器泵激的染料激光器。或者,这些相同的染料可在近红外用二极管激光器激发来实现用脉冲式激发和瞬态检测得到的优异结果。放射源的选择取决于对于所讨论的特定染料而言的吸收谱带的位置,优选的激发和检测方式,是否稳态或瞬态以及是否依赖于空间需要。
这些在化学作用中的特征的内含以及为“瞬态光荧光免疫分析″而设计的装置应具有非常低的背景以及高的信号水平且因此有助于-高含量敏感性。
本发明上面描述的概述是非限制性的,且本发明的其他和优点可从下面的优选方案以及权利要求的描述中很容易看出。
优选标记组分的吸光度和偏振特性
这些包括中心原子(例如,硅)与两个小的可溶的轴向配体结合的标记组分可通过测定瞬态荧光来表征。在这些测定中,在约3倍标记组分衰减时间的时间内,监控极化的或者平行或垂直于激发脉冲的极化方向的两个组分的强度。这些曲线反映消光系数,量子产率,衰减时间以及偏振态并且提供关于标记组分的化学和物理状态的敏感性指示。例如,如果激发态被减活或转变为三重态,则总体强度降低了并且衰减时间缩短了。如果分子的转动布朗运动被通过增加粘度或者通过结合于大分子而改变,则平行于垂直部分的强度的比率增加了。
本发明的某些标记组分显示,在约5%的实验误差范围内,在DMF(有机溶剂)中与在SAP(盐叠氮化物磷酸酯,水化的中性缓冲液)中具有相同的强度,衰减时间和偏振。在某种程度,与其它的标记组分制剂共用这些特性。本发明标记组分的与众不同的和重要的特性是对血清中组分的敏感性(以及缺少结合于),其通过缺少任意显著的血清对荧光的极化组分的强度,衰减时间或相对值的测定作用而被证明。这些特性对于用于利用生物材料的应用诸如分析的标记组分是至关重要的。
优选标记组分的制备
根据本发明的制备优选标记组分的一种方法,按照常规的反应方案在配体交换反应中将具有羟基-或卤化物基团的适当的荧光团部分作为轴向配体与增溶部分的活性形式反应:
Mcl--CA-(X)2+2(SM) Mcl-CA-(SM)2+2X
其中Mcl表示大环配体,CA为中心原子,X为取代的配体以及SM为增溶部分。如需要,这些反应可在溶剂中进行。适当的溶剂包括喹啉,THF,DMF,咪唑(当溶于其他所列举的溶剂之一中时)等等。适当的反应温度可取决于大环原材料以及增溶基的特性来变化。反应通常在大约2分钟到大约24小时内完成。反应混合物可以方便地通过回流通过例如沙浴的方式来加热。为方便起见,反应可以在环境压力下进行。确信此反应分两步骤进行,每次用一个聚氧烃基配位作为轴向配体。
当在荧光免疫测定中用作荧光时,这些标记组分可连接于特异性结合对(“标记的结合对”)的一个成员或此成员的类似物。术语“结合对”是指能够或特异性识别或被特异性分子或分子复合物识别的分子或分子复合物。标记组分可直接地结合或连接或通过连接臂结合或连接。
实用性
本发明的标记组分可用作荧光标记用于荧光探针和用于荧光结合分析以及用作活体内显影和活体内肿瘤治疗的标记。
这些标记组分可有利地用作传统荧光结合分析中的荧光标记,包括荧光偏振免疫测定分析。当如此使用时,这些标记组分可连接于特异性结合对(“标记的结合对”)的一个成员或此成员的类似物。标记组分可直接地结合或连接或通过连接臂结合或连接。
这些标记结合对用于各种形式的分析,例如涉及分析物或分析物结合对竞争的分析(如果使用了标记分析物或分析物-类似物)并且可用于同源或异源分析。
考虑到它们在水溶液中有益的避免了聚集和缺少溶剂敏感性(表明不可检测的聚集)以及缺少与血清组分及其它生物学大分子非特异性的结合,这些标记尤其适用于分析检测含有生物液体诸如血清的样品中的分析物。因此,这些标记组分可用作检测溶液中分析物的荧光探针的标记,其中溶液中血清组分的非特异性结合会严重地影响分析的敏感性,影响其准确性和精确性。
或者,这些标记组分可用作活体内显影的试剂。当用作显影剂时,将这些标记组分连接到标记结合部分的特异性结合对的一个成员上。标记结合对被导入到动物中。如果存在特异性结合对的其他成员,标记结合部分会与其结合并且可测定和定位识别通过标记组分产生的信号。
这些标记组分可同时用于活体内肿瘤治疗。例如,光动力学治疗包括使用标记组分作为光敏感性药物。将标记组分(荧光标记)连接到可特异性识别的结合部分并结合于肿瘤细胞的组分。
本发明提供了核酸探针以及制备与使用该探针的方法。新核酸探针的使用方法包括现在已知的或随后发展的不同核酸杂交序列技术,以及已知的或随后发展的各种核酸扩增技术。本发明的探针(在这里也称为结合物)和方法使得在同源杂交分析中实现了1fmole的灵敏度;这个灵敏度相当于通过电流同源杂交测定技术获得的灵敏度。如上所述,然而,目前的异源分析具有一些缺点,其是由分析中涉及的许多步骤导致的,包括增加的污染危险和实施分析要求增加的次数。对于本领域的技术人员而言,通过参见在这里提供的实施例很容易理解本发明组合物和方法的其他优点。
实施例
为有助于本发明,下列实施例包括了描述一系列实验结果的实施例。下列关于本发明的实施例不应被理解为是对本发明的特异性限制,本发明现在已知的或随后发展的在本领域技术人员理解范围内的变化应被理解为落在本发明在这里描述的以及在后面的权利要求的范围内。
实施例1:由1,2,4,5-四氰基苯(TCNB)合成四二亚氨基均苯四甲酸(tetradiiminopyromellitic)酸二酰亚胺。
将3-颈,11细颈瓶中的TCNB,20.0g(0.112摩尔)在真空中干燥约1hr。长颈瓶配置缓慢的高转矩,聚四氟乙烯叶片搅拌器,用于在氨水中起泡或添加液体的进口,以及一个水冷式冷凝器。用氮气冲洗整个装置后,添加400ml的甲醇,在室温开始搅拌并且慢慢地使氨水起泡。
氨水吸收是非常有效的并且几分钟后悬浮液变成澄清的浅绿色溶液。几分钟后(伴随恒定添加氨水)溶液变的浑浊且温度微微升高。由开始添加氨水40分钟后,反应混合物变得难以搅动并在搅拌下添加200ml的甲醇并且继续添加氨水。此时通过悬浮液的表面缺少气泡浮起可表明氨水吸收仍然非常的有效。100分钟后必须添加另外175ml的甲醇来进行搅拌。125min后,大量氨水开始从冷凝器溢出,并在持续搅拌和加热下将反应混合物置于45℃的水浴中并添加氨水另外240分钟。冷却后,将反应混合物在4℃储存24小时。然后通过Whatman #_42纸吸收过滤并真空干燥。产率23.2g(0.109moles)。
实施例2:双-氯代(2;3二羧基酞菁)硅(IV)的合成
将二亚氨基异二氢吲哚(30.0g;0.207摩尔)和四二亚氨基均苯四甲酸二酰亚胺(10.5g;0.050摩尔)一起研磨并在1升的3颈长颈瓶中真空干燥。长颈瓶装有聚四氟乙烯叶片混合器,隔膜,温度计和具有硅胶干燥管的回流冷凝器。用干燥氮气冲洗装有搅拌反应物的装置,并且在氮气中添加600ml喹啉并在氮气流中混合30分钟。获得了均一的液体悬浮液。其后,在5分钟时间内通过隔膜慢慢添加60ml的四氯化硅。溶液颜色变深并在不加热情况下继续搅拌15分钟。
然后,连续地搅拌,将预热到195℃的油浴增加到使长颈瓶沉浸到其容量以上的水平的位置。5分钟后,油浴温度降低到175摄氏度并且在15分钟后稳定在185-190摄氏度并维持另外60分钟。油浴然后下降并且使反应混合物冷却大约15分钟。然后通过氮气流除去通过湿润的pH试纸在冷凝器出口检测到的未反应的四氯化硅。通风大约45分钟后,将现在为100℃的浴器继续慢慢加热到大约130℃以促进四氯化硅的去除,当仅仅喹啉烟明显时,在额外70分钟后进行上述测定时显示四氯化硅被完全除去。
然后除去油浴并且当反应混合物冷却到大约80℃时在搅拌下添加424ml水和424ml浓盐酸的混合物。热被放出且最终的混合物是酸性的。将反应产物在室温下放置过夜。第二天搅拌下添加另外的424水和424ml浓盐酸,并且将混合物在室温下澄清过夜。
然后通过Buchner漏斗(24cm纸)过滤反应混合物,用水冲洗并且在遮光板中空气干燥隔夜。将湿润的过滤滤饼在一升的丙酮中搅拌并过滤。将冲洗物质在遮光板中干燥2天时间。在岩钵中用丙酮研磨干燥物质(50g)并且搅拌混合物,过滤和真空干燥后留下47.9g的黑色精细分离的固体。
实施例3:双-氯代(2;3-二羧基酞菁)硅(IV),(二羧基二氯代染料)的水解。
利用长茎漏斗将浓硫酸(98ml)置入250ml的圆底烧瓶中以避免润湿长颈瓶的颈部。磁力搅拌下通过较短茎的漏斗添加16.3g的二羧基二氯代染料。添加延续大约一小时时间来在添加固体前实现分散染料的块。将干燥管连接于长颈瓶且在油浴中加热混合物并在50℃维持24小时。
从油浴中移开反应烧瓶并在冰中冷却。小心地添加小部分的水(75ml)并且不冷却,在80℃油浴中搅拌加热混合物20小时。冷却后,将混合物倾入一升烧杯中的冰中并搅拌。
在室温下2000×g离心混合物30分钟。将沉淀物悬浮在水(大约250ml)中并再次离心。再次重复冲洗,收集沉淀物并悬浮在300ml 1MK2CO3中。在覆盖表玻璃的烧杯中搅拌加热混合物。在10分钟内,温度达到90℃并且继续在大约93℃继续加热50分钟。用浓HCl酸化仍然很热的混合物并允许冷却以及在室温下放置2天。
然后通过11cm带有Whatman#_42纸的Buchner漏斗收集固体,过滤花费大约1小时。通过用3×100ml的水冲洗漏斗上的固体并且在遮光板中空气干燥。然后打碎固体并且在真空中通过P2O5和KOH干燥。产量13.3g(87%)。
实施例4:通过硅土吸附色谱法纯化双-羟基(2,3二羧基酞菁)硅IV(二羧基染料)。
将实施例3制备的粗二羧基染料,3.0g置于250ml瓶中,向其中添加100ml包含2%(v/v)乙基二异丙基胺(DIEA)的甲醇并且搅拌混合物30分钟。此后添加43g硅土(EM Science)并且手工振荡混合物来形成黑色浆糊。20分钟后,添加具有2%DIEA的100ml MeOH,将瓶子反转几次并且搅拌内容物20分钟。通过添加EtOH和MeOH与DIEA调节溶剂特性改变了所提取的染料的成分并实现了单一组分的提取。然后通过烧结玻璃漏斗(微孔性,6.5cm直径)在减压下过滤固体。为防止MeOH的巨大损失,通过连接到部分排气的柜中保持减压。过夜过滤后,用2×50ml的MeOH+DIEA冲洗残余物大约30hr。将滤液(230ml)置于旋转蒸发器中浓缩至接近干燥。将残余物溶于14ml MeOH+DIEA,将溶液均分并置入两个40ml的尖底离心管中。
用200ul浓缩的HCl酸化各管中的内容物,并添加水至几乎装满管。通过反转混合内容物并摇动数次,以及约650×g离心30分钟。丢弃褐色清液层并且用0.01M HCl冲洗沉淀物三次。将沉淀物转入100圆底烧瓶并通过循环蒸发干燥,然后通过H2SO4和KOH在真空中干燥。干重是304mg(纯净的二羧基染料)。
实施例5:通过氯磺酸磺化纯化的二羧基染料。
称取161mg的纯净二羧基染料(实施例4)置入50ml具有磁力混合器的长颈烧瓶中。室温在N2下添加3.4ml的ClSO3H。连接具有N2气瓶的小空气冷凝器并且在110℃油浴中加热长颈瓶和内容物大约3.7小时,在该时间点取出μl样品用于分析。然后继续在110℃加热另外3.3小时,停止加热并取出第二个样品。向两个样品中添加冰并且分别用390mg的水稀释。然后向各样品中添加2ml 1M的NaHCO3并且通过测定用2ml的中性缓冲液烯释10μl的烯释样品来测定各样品的吸光度。两样品的Amax为690nm,3.7小时样品的读数为0.650以及7小时样品的读数为0.490显示在最后3.3小时加热时间内有大约25%的染料被破坏。或者,可通过在ClSO3H中70℃加热纯化的二羧基染料36小时进行磺化。
以小部分向烧杯中的冰上添加主要的反应混合物;并以约700×g离心冷混合物30分钟。丢弃非常微弱颜色的上层液体。将沉淀物悬浮在30ml的冰水中,与水一起转入到250nm锥形瓶中,用大约40ml的1M KHCO3使其碱性化并在室温下搅拌过夜。将反应混合物转入烧杯中,用浓缩的HCl酸化并且在室温下搅拌6小时以及在室温下储存48小时。
以约700×g离心混合物;保留有色的上清液并将沉淀物溶于1MNaHCO3中以及搅拌2小时。将暗绿色溶液通过Sep Pak(2g大小,Rainin25)并将酸化后的滤液与离心获得的上清液合并。总体积约为400ml。深蓝色酸性溶液吸附在Sep Pak上,通过3N HCl冲洗柱并用MeOH洗脱。用MeOH和3N HCl冲洗后的Sep Pak可以反复使用。通过循环蒸发和通过H2SO4和KOH在真空中干燥含有染料的MeOH洗脱物。产量158mg。通过硅土色谱法纯化这些物质产生La Jolla Blue-3(LJB-3)。
结果显示于表1和2中,且表明了通过荧光强度和偏振尺寸来评价的三种染料的非特异性结合和溶剂敏感性,关于强度,特性要求为溶剂组分与高荧光产量无关。另一方面,偏振理想地应在低粘度的介质中保持低并且在粘性溶剂例如甘油中是尽可能的高。
表1表明酞菁三磺酸铝的荧光强度是极其溶剂-敏感性的。不可比较地,二羟二羧基硅酞菁磺酸酯显示出与在缓冲液,缓冲液加血清或单独甘油中的荧光产量几乎相同的显著提高的特性。通过和二羟-二羧基-硅-酞菁(没有磺化基团)比较这些提高可被注意到应取决于磺化,其中二羟-二羧基-硅-酞菁本身与铝化合物相比对血清和溶剂具有较小的敏感性。
表2更强烈地表明仅仅存在中心硅原子导致当与铝作为中心原子比较时对环境的敏感性降低了。这些差异很可能由于硅具有两个轴向配体并可以因此“保护”染料的平面结构不受溶剂效应的影响,因为“保护基团”存在于分子平面的各侧面上。铝仅仅存在一个轴向配体且因此分子平面的一侧易受溶剂效应的影响。在图2中,由这些相互作用的结果可清楚地看出铝染料的偏振有非常大的增加,几乎增加到通过将染料置于甘油中可得到的最大值(其表明如果自转几乎终止则对偏振有相应的限制)。
结论
上述关于本发明的示例性应用不应被为对本发明范围的限制。现在已知的或以后发展的落入本领域技术人员理解的范围中的本发明的这些变化,应被理解为落在下文中权利要求的本发明的范围内。
说明书中提及的所有专利和出版物是本发明所属领域技术人员的水平的表现。所有的专利和出版物在这里引入作为参考,其与各个体出版物被特异性和分别地引入作为参考是相同的。
本发明在这里说明性地适当的描述可在缺乏任意元件或一些元件的情况下来实施,局限性没有在这里特异性地公开。因此,例如,在这里的各实例中任意术语“含有”,“基本上包含”和“包含”可被任何其它两个术语替换。已使用的术语与措辞用作说明性的术语但并非限制,且并非意欲在使用这些术语与措辞时排除所显示的和描述的特征或其部分的任意等价物,但是应能理解各种修饰落在本发明权利要求所述的范围内。因此,应能理解尽管本发明已通过优选的实施方案和任选的特征特定地公开,在这里公开的概念的修饰和变化可被本领域技术人员利用,且这些修饰和变化被认为落在所附权利要求所限定的本发明的范围内。
(按照条约第19条的修改)
1.具有中心金属原子的大环荧光配体,所述原子具有两个轴向配体在大环的每一侧各有一个,所述轴向配体独立地选自烷氧基,卤化物,羟基,硼酸酯,硫酸酯或磷酸酯,所述大环具有一或多个苯并基团并且作为苯环上的环取代基的两个邻羧基或者一个羧基连同一个其它的不是羧基但是在pH 5或以上的水溶液中带负电荷的基团,以及作为在大环的任意其它可能位置的其它的环取代基的一或多个不是羧基但是在pH 5或以上的水溶液中带负电荷的基团。
2.权利要求1的大环荧光配体,其中大环是酞菁,中心金属原子是Si或Ge,轴向配体是羟基,环取代基是两个在一个环上的邻-羧基,以及在其它环中之一上的一个磺基。
3.标记组分,含有结合于两个增溶基的发光的、大体上呈平面的部分,根据需要一个增溶基连同所述大体上呈平面部分的取代基位于平面部分的一侧来控制标志组分的净电荷以及将标志组分结合于其它分子。
4.权利要求3的标志组分,其中发光的、大体上呈平面的部分是具有1到4个苯并基团的三氮杂卟啉。
5.权利要求3的标志组分,其中发光的、大体上呈平面的部分是具有1到4个苯并基团的二氮杂卟啉。
6.根据权利要求3的标志组分,其中发光的、大体上呈平面的部分是具有1到4个苯并基团的单氮杂卟啉。
7.荧光探针,含有权利要求4,5或6的结合于诸如抗原,半抗原,抗体,寡肽或寡核苷酸或天然或合成药物的生物分子的发光部分。
8.权利要求7的荧光探针,具有诸如适于通过测定瞬态荧光偏振/向异性进行的分析中的荧光强度,偏振以及衰减时间的特性。
9.标志组分,根据需要由结合于两个增溶基的发光的、大体上呈平面的部分连同所述大体上呈平面的部分的取代基构成来控制标志组分的净电荷以及将标志组分与其它分子结合,所述两个增溶基之一位于平面部分的一侧。
10.具有中心金属原子的大环荧光配体,所述原子具有两个轴向配体在大环的每一侧各有一个,所述轴向配体独立地选自烷氧基,卤化物,羟基,硼酸酯,硫酸酯或磷酸酯,所述大环为具有一或多个携带能够结合以及控制净电荷的取代基的单氮杂卟啉。
11.具有中心金属原子的大环荧光配体,所述原子具有两个轴向配体在大环的每一侧各有一个,所述轴向配体独立地选自烷氧基,卤化物,羟基,硼酸酯,硫酸酯或磷酸酯,所述大环是具有能够结合以及控制净电荷的取代基的咕啉,sapphyrin,porphycene或者naphthalocyanine衍生物。
12.具有中心金属原子的大环荧光配体,所述原子具有两个轴向配体在大环的每一侧各有一个,所述轴向配体独立地选自烷氧基,卤化物,羟基,硼酸酯,硫酸酯或磷酸酯,所述大环是具有能够结合以及控制净电荷的取代基的27-苯基四苯并三氮杂卟啉或27-(对-甲基苯基)四苯并三氮杂卟啉衍生物。
13.对样品中的靶分析物进行定量的测定法,含有如下步骤:
a)将样品与权利要求1的荧光配体接触,其中所述荧光配体进一步包括结合于靶分析物的配体;
b)使荧光配体结合于靶分析物;
c)用具有荧光配体的激发波长的波长的电磁辐射照射样品;
d)检测从样品发出的荧光配体的发射波长的电磁辐射的量;以及
e)对样品中分析物的存在或量进行测定。
14.检测多核苷酸中靶序列的方法,其中的方法含有:
(a)将权利要求1的成分与含有寡核苷酸的样品合并,其中成分的寡核苷酸部分含有杂交于靶序列的序列形成杂交混合物;
(b)在产生特异性杂交的条件下温育杂交混合物;以及
(c)此后测定杂交混合物的荧光,其中荧光显示靶序列的存在。
15.标志组分,其中荧光部分选自(1)醌型染料(2)阴丹士林染料(3)1,4-二氨基蒽醌-2,3-二羧酰胺(4)四氨基蒽醌(5)吖嗪染料(6)吡喃翁或硫代吡喃翁染料以及(7)萘醌甲基化物。
16.产生抗非特异性结合以及平面分子堆积的有效保护的方法,包括:
a)提供至少两个小的轴向配体,
b)将一个或多个所述配体置于由所述分子限定的分子平面的对侧,以及
c)确保整个分子的净电荷足以产生所述的保护。
17.权利要求16的方法,其中所述轴向配体由-OH组成。
18.权利要求16的方法,其中所述配体选自:-OH,-O-叔丁基,-OCH2OH,-OCH2CH2OH,OCH2CHOHCH2OH,-OCH2CH2-OCH2CH2OH,-OCH2CH2-CH2-O-CH2CH2OH,-OPO3H2,-OB(OH)2,Cl,Br以及F。
19.进行治疗性过程的方法,包括给个体施用有效量的含有如下成分的组和物:
(a)具有单或二羧基以及单或二磺酸酯基团的二羟基硅酞菁分子;
(b)结合于靶分析物的配体;
(c)其中所述二羟基硅酞菁分子连接于所述配体;以及此后,
进行所述过程。
20.权利要求19的方法,其中所述治疗性过程是光动力治疗。
21.权利要求19的方法,其中所述治疗性过程是体内显影。
22.权利要求19的方法,其中所述治疗性过程选自吸收,光散射,光声以及声荧光。
23.权利要求19的方法,其中所述成分是二氢硅单羧基酞菁单磺酸酯。
24.权利要求19的方法,其中所述成分是二氢硅二羧基酞菁单磺酸酯。
25.权利要求19的方法,其中所述成分是二氢硅单羧基酞菁二磺酸酯。
26.权利要求19的方法,其中所述成分是二氢硅二羧基酞菁二磺酸酯。
27.权利要求19的方法,其中所述配体是生物活性分子。
28.权利要求27的方法,其中所述生物活性分子选自:含有2到30个氨基酸单位的肽,蛋白,抗体,抗体片段,半抗原,凝集素以及单以及寡聚糖。
29.进行治疗性过程的方法,包括:给个体施用有效量的包括具有单或二羧基以及单或二磺酸酯基团的二羟基硅酞菁分子的组和物,以及此后进行所述过程。
30.权利要求29的方法,其中所述治疗性过程是光动力治疗。
31.权利要求29的方法,其中所述治疗性过程是体内显影。
32.权利要求29的方法,其中所述治疗性过程选自吸收,光散射,光声以及声荧光。
33.权利要求29的方法,其中所述组和物是二氢硅单羧基酞菁单磺酸酯。
34.权利要求29的方法,其中所述成分是二氢硅二羧基酞菁单磺酸酯。
35.权利要求29的方法,其中所述成分是二氢硅单羧基酞菁二磺酸酯。
36.权利要求29的方法,其中所述成分是二氢硅二羧基酞菁二磺酸酯。
Claims (18)
1.具有中心金属原子的大环荧光配体,所述原子具有两个轴向配体在大环的每一侧各有一个,所述轴向配体独立地选自烷氧基,卤化物,羟基,硼酸酯,硫酸酯或磷酸酯,所述大环具有一或多个苯并基团并且作为苯环上的环取代基的两个邻羧基或者一个羧基连同一个其它的不是羧基但是在pH 5或以上的水溶液中带负电荷的基团,以及作为在大环的任意其它可能位置的其它的环取代基的一或多个不是羧基但是在pH 5或以上的水溶液中带负电荷的基团。
2.权利要求1的大环荧光配体,其中大环是酞菁,中心金属原子是Si或Ge,轴向配体是羟基,环取代基是两个在一个环上的邻-羧基,以及在其它环中之一上的一个磺基。
3.标记组分,含有结合于两个增溶基的发光的、大体上呈平面的部分,根据需要一个增溶基连同所述大体上呈平面部分的取代基位于平面部分的一侧来控制标志组分的净电荷以及将标志组分结合于其它分子。
4.权利要求3的标志组分,其中发光的、大体上呈平面的部分是具有1到4个苯并基团的三氮杂卟啉。
5.权利要求3的标志组分,其中发光的、大体上呈平面的部分是具有1到4个苯并基团的二氮杂卟啉。
6.根据权利要求3的标志组分,其中发光的、大体上呈平面的部分是具有1到4个苯并基团的单氮杂卟啉。
7.荧光探针,含有权利要求4,5或6的结合于诸如抗原,半抗原,抗体,寡肽或寡核苷酸或天然或合成药物的生物分子的发光部分。
8.权利要求7的荧光探针,具有诸如适于通过测定瞬态荧光偏振/向异性进行的分析中的荧光强度,偏振以及衰减时间的特性。
9.标志组分,根据需要由结合于两个增溶基的发光的、大体上呈平面的部分连同所述大体上呈平面的部分的取代基构成来控制标志组分的净电荷以及将标志组分与其它分子结合,所述两个增溶基之一位于平面部分的一侧。
10.具有中心金属原子的大环荧光配体,所述原子具有两个轴向配体在大环的每一侧各有一个,所述轴向配体独立地选自烷氧基,卤化物,羟基,硼酸酯,硫酸酯或磷酸酯,所述大环为具有一或多个携带能够结合以及控制净电荷的取代基的单氮杂卟啉。
11.具有中心金属原子的大环荧光配体,所述原子具有两个轴向配体在大环的每一侧各有一个,所述轴向配体独立地选自烷氧基,卤化物,羟基,硼酸酯,硫酸酯或磷酸酯,所述大环是具有能够结合以及控制净电荷的取代基的咕啉,sapphyrin,porphycene或者naphthalocyanine衍生物。
12.具有中心金属原子的大环荧光配体,所述原子具有两个轴向配体在大环的每一侧各有一个,所述轴向配体独立地选自烷氧基,卤化物,羟基,硼酸酯,硫酸酯或磷酸酯,所述大环是具有能够结合以及控制净电荷的取代基的27-苯基四苯并三氮杂卟啉或27-(对-甲基苯基)四苯并三氮杂卟啉衍生物。
13.基于荧光的分析,利用本文公开的荧光标志或荧光探针。
14.匀质混合物以及包括利用在本文公开的荧光标志或探针的核酸杂交的读数分析。
15.标志组分,其中荧光部分选自(1)醌型染料(2)阴丹士林染料(3)1,4-二氨基蒽醌-2,3-二羧酰胺(4)四氨基蒽醌(5)吖嗪染料(6)吡喃翁或硫代吡喃翁染料以及(7)萘醌甲基化物。
16.产生抗非特异性结合以及平面分子堆积的有效保护的方法,包括:
a)提供至少两个小的轴向配体,
b)将一个或多个所述配体置于由所述分子限定的分子平面的对侧,
c)确保整个分子的净电荷足以产生所述的保护。
17.权利要求16的方法,其中所述轴向配体由-OH组成。
18.权利要求16的方法,其中所述配体选自:-OH,-O-叔丁基,-OCH2OH,-OCH2CH2OH,OCH2CHOHCH2OH,-OCH2CH2-OCH2CH2OH,-OCH2CH2-CH2-O-CH2CH2OH,-OPO3H2,-OB(OH)2,Cl,Br以及F。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20070912 |