JPH10512751A - 分光学的に検出可能な核酸リガンド - Google Patents

分光学的に検出可能な核酸リガンド

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JPH10512751A
JPH10512751A JP8522232A JP52223296A JPH10512751A JP H10512751 A JPH10512751 A JP H10512751A JP 8522232 A JP8522232 A JP 8522232A JP 52223296 A JP52223296 A JP 52223296A JP H10512751 A JPH10512751 A JP H10512751A
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JP
Japan
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nucleic acid
acid ligand
compound
target compound
spectroscopically detectable
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JP8522232A
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ビー． ピットナー，ジェームズ
ピー． マリノウスキー，ダグラス
ピー． ボンク，グレン
ゴールド，ラリー
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ネクスター ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド
ベクトン ディキンソン アンド カンパニー
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本願発明は、サンプル中の標的化合物の存在又は不存在を決定するために、分光学的に検出可能な標識化レセプター分子を使用する方法に関する。ひとつの態様では、生物学的なサンプル中の興味のある生物学的標的の存在又は不存在を決定するために、分光学的に検出可能な標識化核酸リガンドが使用される。

Description

【発明の詳細な説明】 分光学的に検出可能な核酸リガンド 発明の分野 本発明は蛍光偏光及び蛍光異方性のような分光学的技術による核酸リガンドへ の標的分子の結合の検出に関する。 発明の背景 蛍光偏光イムノアッセイ技術は以下の文献により明らかなように当業界では周 知である： （１） Dnadliker，W．B．及び Feigen，G．A.，Biochem．Biophys．Res．Commu n．，５，２９９（１９６１） （２） Jolley，M．E.，J．Anal．Toxicol．，５，２３６（１９８１） （３） Lakowicz，J．R.，“Principles of Fluorescence Spectroscopy ”，Pl enum Press，NY，（１９８３） （４）“Immunoassay，a Practical Guide”，Chan，D．W．及び Perlstein，N ．T.，Eds．Academic Press，NY，（１９８７）； （５）“Principles and Practice of Immunoassay”，C．P．Price 及び D．J ．Newman，Eds.，MacMillan，NY（１９９１）の Price，C． 及び Newman，D.， Chapter １４（“Homogeneous Fluoroimmunoassay”）；及び （６） Wei，A-P． 及び Herron，J．N.，Anal．Chem.， ６５，３３７２（１９ ９３） 蛍光偏光イムノアッセイは典型的には蛍光で標識された分子を用いている。こ れらの標識された標的分子は抗体結合部位に対して関心のある標的分子と競合す る。Wei 及びHerron（上掲）によって知られているように、蛍光偏光イムノアッ セイはヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈｃｇ）のような大きなマクロモレキュール の検出に適用しても首尾よい結果は得られていない。 均一な蛍光イムノアッセイの基礎は抗原に結合したフルオロホアの発光を調節 する抗体の結合に依拠している。蛍光で標識された抗原の励起によって生じる低 レベルの蛍光偏光は、抗原の回転が抗体の結合により減少するにつれて増大する 。したがって、低濃度の抗原試料では蛍光偏光は最大となり、抗原試料が抗体か らフルオロホアを置き換えるに従い減少する。 蛍光偏光は蛍光分子の時間平均回転運動の一つの尺度なので、抗原抗体結合を 検出するための抗体の蛍光標識は抗原と抗体との大きさの相違のために非常に非 効果的であることがわかっている。一般的に、抗体は抗原よりもずっと大きいた めに抗原が抗体に結合するときの回転運動の差は実質的には検出できないもので ある。そのため、従来の蛍光偏光イムノアッセイ技術は抗体又はレセプター分子 に対する抗原又は標的分子の蛍光標識に限られていた。 発明の概要 上述の従来の蛍光偏光イムノアッセイ技術に対して、本発明は標的分子のイム ノアッセイタイプの検出系において分光学的に検出可能な標識レセプター分子の 使用を可能にするものである。一つの実施態様において、本発明は標的分子に結 合することができる分光学的に検出可能な標識核酸リガンドに関する。検出系で 使用すると、この分光学的に検出可能な標識核酸リガンドは、検出可能な発光の 差を定量的かつ定性的に測定して試料中の特異的な標的分子の存在又は非存在を 決定することを可能にする。 図面の簡単な説明 発明の様々な目的、利点及び新規な特徴は、添付した図とともに以下の詳細な 説明を読めばさらに容易に理解されるであろう。添付した図において： 図１は様々な分光学的に検出可能な核酸リガンドの構造式を示し； 図２はフルオレセイン標識核酸リガンドを、対照としてのヒト血清アルブミン とともに用いたトロンビンのための検定の結果のグラフであり； 図３はフルオレセイン標識核酸リガンドを、対照としてのヒト血清アルブミン とともに用いたトロンビンのための検定の結果のグラフであり； 図４はチアゾールオレンジ標識核酸リガンドを、対照としてのヒト血清アルブ ミンとともに用いたトロンビンのための検定の結果のグラフであり； 図５はフルオレセイン標識核酸リガンドを用いたエラスターゼのための検定の 結果のグラフであり；そして 図６はフルオレセインで内部的に標識された核酸リガンドを、対照としてのヒ ト血清アルブミンとともに用いたトロンビンのための検定の結果のグラフである 。 発明の詳細な説明 従来、抗体はサンプル中の標的分子（例えば、抗原）に結合して、その検出を 可能にするレセプター分子として用いられている。しかし、サンプル中の伝統的 な標的分子とも結合する新規な種類のレセプター分子が最近同定されている。こ れらの新規な種類のレセプター分子の幾つかは米国特許第５，２７０，１６３号 に記載されている核酸リガンドと、同時係属米国特許出願第０８／２５２，０７ １号（１９９４年５月３１日出願）に記載されている二方向性核酸リガンドとを 包含する。 分光検出法のための、これらの新規な種類のレセプター分子の利点の１つは、 これらが従来のレセプター分子（即ち、抗体）に比べて比較的小さいサイズであ ることである。これらの新規なレセプター分子が小さいサイズであるために、こ れらに付着させた分光検出可能なラベルは、レセプター分子に結合した標的が存 在しない場合とは対照的に、標的分子が標識レセプター分子に結合する場合に有 意に異なるエネルギー特徴を示す。これらの新規なレセプター分子が小さいサイ ズであるために、比較的小さい標的としてもそれらに加えられる付加的体積又は 重量は標識レセプター分子の重量又は体積を有意に高め、それ故、このような比 較的大きい差異の検出を可能にする。本発明に用いられるのは、この原理である 。 本発明の１実施態様では、検出系は、サンプル中の標的分子の存在を定量的及 び／又は定性的に測定するために分光的に検出可能な標識核酸リガンドを用いる 。本発明の他の同様な実施態様では、例えば成長因子のような標的化合物のそれ らのレセプターへの結合をモニターするために、分光的に検出可能な標識核酸リ ガンドを競合に基づく分析に用いる。競合に基づく分析の原理と方法は競合に基 づくイムノアッセイに用いられる原理と方法に同じであり、当業者に周知であり 、例えば、Ekins，R．“Immunoassays”，Encyclopedia of Immunology，７７９ 〜７８２頁（Academic Press，１９９２）のような参考文献に教示されている。 標的分子を結合する非常に多くの核酸リガンドが同定されている。これらの標 的はタンパク質例えば酵素、細胞表面マーカー、アミノ酸及び染料を包含する。 例えば、（１）バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Tuerk，C．とGpld ，L．Science, ２４９，５０５（１９９０））；（２）Ｒ１７コートタンパク質 （Schneider，D．等，J ．Mol．Biol．２２８，８６２（１９９２））；（３）ヒ ト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素（Tuerk，C．等，Proc ．Natl．Acad ． Sci．USA ，８９，６９８８（１９９２））；（４）ＨＩＶｒｅｖタンパク質（Ba rrel，D.等，Cell，６７，５２９（１９９１））；（５）基本繊維芽細胞増殖因 子（Jellineck，D．等，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，９０，１１２２７（１９ ９３））；（６）アデノシン三リン酸（Sassanfar，M．と Szostak，J．W．Natu re ，３６４，５５０（１９９３））；（７）テオフィリン（Jenison，R,．D．等 ，Science, ２６３，１４２５（１９９４））；及び（８）幾つかのアミノ酸（F armulok，M.とSzostak，J．W.，J ．Am．Chem．Soc．１１４，３９９０（１９９ ２）及び Connell，G．J．等，Biochemistry，３２，５４９７（１９９３））に 対して高いアフィニティと特異性とを有するＲＮＡ核酸リガンドが同定されてい る。同様に、有機染料に結合するＤＮＡ及びＲＮＡ核酸リガンドも同定されてい る（Ellington，A．と Szostak，J.，Nature，３４６，６１８（１９９０）及び Ellington，A．と Szostak，J.，Nature，３５５，８５０（１９９２））。さら に、他のタンパク質と小分子標的とを結合する核酸リガンドも、ＰＣＴ国際公報 第ＷＯ９１／１９８１３号と米国特許第５，２７０，１６３号のような刊行物に 教示されているＳＥＬＥＸ方法を用いて同定され続けている。標的分子、トロン ビンを結合する二方向性核酸リガンドも米国特許出願第０８／２５２，０７１号 （１９９４年５月３１日出願）において同定され、記載されている。他のグルー プの適当なレセプター分子はリボース環に２’−フルオロ又は２’−アミノ置換 基を有する誘導体を含めて、核酸リガンドの化学的に修飾された誘導体である。 これらの置換基はリボヌクレアーゼによる分解(degradation)を減ずる。この他 の可能な化学的修飾は２’−Ｏ−メチル誘導体、炭素環状(carbocyclic)リボー ス類似体、チオホスフェート、及びピリミジン又はプリン塩基の修飾を包含する 。核酸リガンド、化学的修飾核酸リガンド誘導体及び二方向性核酸リガンド化合 物は５〜１００ヌクレオチド長さであり、好ましくは１５〜４０ヌクレオチド長 さである。 本発明に用いるためにこれらの新規な種類のレセプター分子に取り付けること ができる分光検出可能なラベルは、蛍光ラベル、エネルギー転移ラベル、発光ラ ベル及び近ＩＲラベルを包含する。適当な蛍光ラベルはフルオレセイン、例えば エオシンのようなフルオレセイン誘導体、例えば Texas Redとテトラメチルロー ダミンのようなローダミン、例えばチアゾールオレンジ、チアゾールイエロー及 び米国特許第４，９５７，８７０号と第４，８８３，８６７号に開示される関連 染料のようなシアニン染料、ピレン、ポルフィリン染料（例えば、LaJolla Blue ）、及び当業者に周知の他の染料を包含する。 適当なエネルギー転移ラベルは、充分なエネルギー転移のための適当に適合し た励起及び発光スペクトルを有する上記蛍光ラベルの組合bせ(pair)を包含する 。適当な染料組合せの選択に関する他の適当な例と基準とは、例えば Morrison ，L．E.，Nonisotopic DNA Probe Techniques（Kricka，L．J．編集，Academic Press，１９９２）の１３章のような参考文献によって当業者に周知である。適 当な発光ラベルはジオキセタン類、アクリジニウムエステル及びルシフェリンを 包含する。 適当な近ＩＲラベルは LaJolla Blue 染料、ＢＯＤＩＰＹ染料（Molecular P robes社から商業的に入手可能）及びジシアニン染料を包含する。 典型的に、分光検出可能なラベルはレセプター分子に、例えば商業的に入手可 能なアミノヘキシル及びアミノプロピル結合アーム(linking arm)のような、適 当なリンカー又はテザー（Applied Biosystems，Clotttech，Glen Research及び 他の企業から入手可能）への、ラベルの適当な反応性誘導体の化学的カップリン グによって取り付けられる。 反応性染料ラベルはレセプター分子に、ピリミジンのＣ−５又はプリン環のＣ −８に確立されたリンカー方法によっても取り付けられる。適当な確立されたリ ンカー方法は例えば Goodchild，J.，Bioconjugate Chem.，１，１６５（１９９ ０）のような参考文献に教示されている。レセプター分子のこのような直接内部 ラベリングの１例は、核酸リガンドのヨードアセトアミドアルキル化によって製 造されるフルオレセイン核酸リガンドである。簡単には、ＰＣＴ公報第ＷＯ９４ ／０２６４０号、McLaughlin等，Nuc ．Acids Res．２０，５２０５（１９９２） 及びMcLaughlin等，J ．Am．Chem．Soc．１１４，５５０９（１９９２）に教示さ れる方法を用いて、ホスホールチオエート化(phosphorathioated)核酸リガンド を標準固相オリゴヌクレオチド合成方法によってホスホラミジト試薬を用いて構 成し、次に、５−ヨードアセトアミドフルオレセインと反応させて、特定の内部 位置にフルオレセインを有する核酸リガンドを得る。 本発明の分光検出可能な標識レセプター分子によって結合される標的分子は問 題の任意の化合物を包含しうる。適当な標的分子はタンパク質、ペプチド、細胞 表面マーカー、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、レセプター、抗原、 抗体、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、成長因子等を非限定的に包含する 。 標的分子に関して試験されうる適当なサンプルは、生物学的物質、食品、例え ば液体廃棄物のような環境放出物、並びに血液、血漿、血清、痰、尿、精液、脳 脊髄液、気管支アスピレート及びマセレーテッド(macerated)組織を含めた生物 学的物質を包含する。 本発明の分光検出可能な標識レセプター化合物によって使用可能な、適当な分 光検出方法は蛍光偏光(polarization)、赤外（ＩＲ）、近ＩＲ、発光、ライフタ イム(lifetime)、及びエネルギー転移方法を包含する。分光検出可能な標識レセ プター化合物によるこれらの方法の使用は、特異的分析物又は標的分子の結合を 測定する敏感で簡単な方法を提供する。これらの方法は核酸リガンドと他のレセ プター分子の定性的及び定量的結合測定の両方への使用を可能にする。さらに、 分光的に標識された核酸リガンドと他のレセプター分子の使用は、遊離(free)標 識リガンドから結合標識リガンドを分離する必要なく、直接のシグナル発生を可 能にする。従来の抗体とは対照的に、分光的に標識された新規な種類のレセプタ ー分子を用いることの特別な利点は、（１）抗体を産生するために必要な動物の 免疫処置のないこと；（２）高い特異性を有する新規なレセプター分子の１個以 上の位置に分光的染料及び他のラベルを比較的容易に共有結合させる能力、これ らの全ては抗体によって容易に達成されることができない；（３）非抗原的若し くは弱抗原的な分析物又は標的分子を検出可能であること；（４）新規なレセプ ター分子、特に核酸リガンドの合成又は産生が抗体の産生よりも非常に簡単であ ること；及び（５）上記で詳述したように、標的分子に比べて新規なレセプター 分子のサイズが小さいために、標的分子の結合時のシグナルの変化が蛍光偏光及 び異方性実験において大きいことを包含する。 蛍光偏光と異方性方法では、蛍光分子を偏光(polarization)によって励起させ 、それらの発光も偏光させる。発光の偏光の検出は、励起偏光の面に平行な発光 （Ｉｐａ）と垂直な発光（Ｉｐｃ）の相対的な強度の測定によって達成される。 典型的に、発光の偏光解消度は蛍光分子と溶液の溶媒拡散(solvent diffusion) とタンブリングとに依存する、したがって、励起光の面に対するその関係を変化 させる。定常状態の測定では、偏光と異方性とは下記式によって定義される： Ｐ（偏光）＝（Ｉｐａ−Ｉｐｃ）／（Ｉｐａ＋Ｉｐｃ） ｒ（異方性）＝（Ｉｐａ−Ｉｐｃ）／（Ｉｐａ＋２Ｉｐｃ） 蛍光標識された新規なレセプター分子のタンブリング運動及び／又は環境が変 化するときに、偏光と異方性との変化を検出することができる。このような変化 は、蛍光標識レセプター分子の有効サイズを増加させ、そのタンブリングを緩慢 にする標的への結合時に起こりうる。 蛍光標識レセプター分子挙動に関するさらなる情報は、異方性又は偏光の減衰 (decay)速度を測定する動力学的偏光(dynamic polarization)方法によって得る ことができる。これらは、時間分解(time-resolved)方法又は位相分解（phase-r esolved）方法によって得ることができ、総合的な定常状態挙動に１種類より多 くの回転プロセスが寄与することを示唆する。動力学的異方性とライフタイムと の測定は蛍光強度の減衰を分析することによってなされる。これらは時間ドメイ ン（パルス方法）又は周波数(frequency)ドメイン（位相修正方法）でおこなわ れることができる。動力学的異方性測定を用いて、回転相関時間(rotational co rrelation time)を測定することができる。一般に、この値は回転拡散が緩慢に なるにつれて大きくなる。この増加は標的分子への一本鎖オリゴヌクレオチド染 料コンジュゲートの結合に相関づけることができる。 上述したように、本発明の分光検出可能な標識レセプター分子は生物学的サン プル中の標的の存在を検出するため、及び競合に基づく分析において例えば成長 因子のような標的化合物がそれらのレセプターに結合するのをモニターするため に有用であり、このようなものとして、診断分析に有用である。血液中の標的の 有無を検出するために用いる場合は、分光検出可能な標識レセプター分子を固体 又は液体形で、例えばＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲTMブランド採血管のような採血デバ イス中に入れることができる。次に血液サンプルを採血デバイス中に導入すると 、分光検出可能な標識レセプター分子が血液中に分散して、存在する標的分析物 に結合する。この結合は標的の存在の診断に役立つ蛍光ラベルの強度、偏光又は ライフタイムの分光的変化を生じる。 これは一段階診断系を表し、この系ではサンプル採取が光学デバイスによって 読み取り可能である診断応答の発生を生じる。適当な読み取り器(readour)の例 は、血液、血清又は血漿中に存在する標的の量を示唆するシグナルを抽出する蛍 光偏光異方性と蛍光ライフタイム分光法を包含する。さらに、この一段階診断系 は蛍光に必ずしも限定されない。さらに、結合時に生じる化学変化が蛍光性の変 化を誘発する可能性もある。それ故、標本中で吸光しないか又は蛍光を発しない 波長範囲の赤外（ＩＲ）蛍光染料の使用も非常に有用である可能性がある。 抗体試薬を用いて均質な分析をおこなうための今までの試みは、蛍光ラベルの 付着部位を制御することの困難さのために限られた成功を収めていたにすぎない 。蛍光ラベルを抗体結合部位に密接して配置すべきであることは、技術上周知で ある。抗体は生物学的ソースに由来するので、蛍光ラベルを導入する部位を制御 することは困難である。したがって、これらの試薬の性能は不良であった。これ に反して、核酸リガンドと新規なレセプター分子の他のリガンドは合成的に誘導 される。それ故、蛍光ラベルはこれらの試薬の合成中に任意の部位に導入するこ とができる。付着部位を制御できるこの可能性は、均質な蛍光検出方法の有意に 容易な実施を請け合う。 さらに、分光検出可能な標識核酸リガンドは、米国特許出願第０８／２３４， ９９７号（１９９４年４月２８日出願）（この開示は本明細書に特に援用される ）に教示されるブレンド(blended)ＳＥＬＥＸとして知られる方法によっても製 造することができる。 ブレンドＳＥＬＥＸ方法の好ましい１実施態様では、初期候補混合物を用いて ＳＥＬＥＸ方法を実施して、候補混合物の各核酸配列を分光検出可能なラベルに 取り付けることによって、分光検出可能な核酸リガンドが製造される。この混合 物は“ブレンド候補混合物”と呼ばれる。これは、候補混合物の各核酸配列が（ １）核酸配列の５’末端又は３’末端に付着した単一分光検出可能なラベル；（ ２）核酸配列の５’末端と３’末端の両方に付着した分光検出可能なラベル；（ ３）個々の核酸残基に加えられた分光検出可能なラベル；（４）全てのピリミジ ン又はプリン残基の全体又は一部に付着した分光検出可能なラベル；又は（５） 一定タイプの全てのヌクレオチドの全体又は一部に付着した分光検出可能なラベ ルを有する候補混合物を用いて達成されることができる。分光検出可能なラベル を候補混合物の各核酸配列の一定領域に又はランダム化領域のみに取り付けるこ ともできる。 本発明を下記実施例によってさらに説明するが、これらの実施例は例示のため に提供するものであり、本発明を何らかの意味でも限定しようとは意図しないも のである。これらの実施例において、全ての％は固体に対しては重量によるもの であり、液体に対して容量によるものである、又は反応収率を意味するために用 いられる、また全ての温度は、他に指定しないかぎり、摂氏度である。 実施例１分光学的に検出可能な標識した、トロンビンを結合する核酸リガンドの製造 フルオレセイン標識した核酸リガンドとチアゾールオレンジ標識した核酸リガ ンドとの両方を、分光学的に検出可能に標識した核酸リガンドの例として製造し た。 トロンビンを結合するフルオレセイン標識した核酸リガンドを、製造業者によ って供給された標準試薬及びＡＢＩ６−ＦＡＭアミダイト(amidite)（Ｃ６に結 合したフルオレセイン）を用いて、ＡＢＩ３８０Ｂシンセサイザー（Applied Bi osystems，Inc.、カルフォルニア州、Foster市）によって合成した。次に、フル オレセイン標識した核酸リガンドを、特に断らない限りは標準ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法によって精製した。チアゾールオレンジ（“ＴＯ”）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造 ３−（１−（４−メチル−キノリニウム））プロピオン酸（１） レピジン (２．９５mg、Aldrich)を４．１３mgのヨードプロピオン酸(Aldrich )ニートと混合した。この混合物を油浴中でアルゴン下８０℃において ３時間加熱した。形成した固体をジクロロメタンを加えて磨砕し、濾過によって 回収し、１を５．２mgの黄色固体として得た（７３％）。1 Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：ｐｐｍ ３．０１（ｓ，３Ｈ），３．０８（ｔ ，２Ｈ），５．２１（ｔ，２Ｈ），８．０７（ｍ，２Ｈ），８．２８（ｔ，１Ｈ ），８．５７（ｄｄ，２Ｈ），９．４３（ｄ，１Ｈ），１２．５（ｂｒ ｓ，１ Ｈ），13Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）：ｐｐｍ １９．８，３３．３，５２． ８，１１９．２，１２２．４，１２７．２，１２８．９，１２９．５，１３５． ２，１３６．７，１４９．３，１５９．０，１７１．４；ＬＲＭＳ（ＦＡＢ+， グリセロール）Ｍ+ ＝２１６ｍ／ｚ．（４−［３−メチル−２，３−ジヒドロ−（ベンゾ−１，３−チアゾール）−２ −メチリデン］−１−キノリニウム）−３−プロピオン酸（２） １−（４−メチル−キノリン）プロピオン酸（１．０ｇ）と１．０ｇのＮ−メ チルベンゾチアゾールチオメチルトシレート(Bader)とを５０mLの丸底フラスコ において、１５mlエタノ−ル中で共に混合した。トリエチルアミン（０．１mL） を加えた。ほぼ直後に、反応混合物は鮮赤色になった。反応混合物を２時間還流 加熱し、室温に冷却した。赤色固体を、生じた（及びひどい匂いの）溶液から単 離した。この物質の収量は、９００mg（４７％）であり、薄層クロマトグラフィ ー（シリカゲル、９：１ジクロロメタン／メタノール）上に、オリジナルの近く に１スポットを示すにすぎなかった。 ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）1Ｈ ｐｐｍ：１．３１（ｔ，２Ｈ），２．８６（ｔ，２Ｈ ），３．２０（ｔ，２Ｈ），３．３１（ｓ，２Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），４ ．７６（ｔ，１Ｈ），６．７４（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｍ，２Ｈ），７．７３ （ｍ，７Ｈ），８．４７（ｄｄ，２Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）ｐｐｍ： ８．９，２０．０，３３．７，３８．０，５１．０，８８．８，１０９．２，１ １３．３，１１８．６，１２５．５，１２６．３，１２６．７，１２７．７，１ ２９．０，１２９．４，１３４．１，１４１．６，１４５．４，１８０．７，１ ８９．８，１９４．０；ＬＲＭＳ（ＦＡＢ+，グリセロール）Ｍ+ ＝３６３ｍ／ ｚ（Ｃ21Ｈ19Ｎ2Ｏ2Ｓ）．（４−［３−メチル−２，３−ジヒドロ−（ベンゾ−１，３−チアゾール）−２ −メチリデン］−１−キノリニウム）−３−プロピオン酸 Ｎ−ヒドロキシスク シンイミドエステル（３） ２（１００mg）と１２５mgの１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣ Ｃ、Fluka)を、ジクロロメタンと、テトラヒドロフランと、Ｎ，Ｎ−ジメチルホ ルアミドとの乾燥混合物に加え、アルゴン下室温において１時間撹拌した。１時 間後、６５mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを加え、撹拌を一晩続けた。暗赤 色溶液を濾過し、所望のＮＨＳエステルを溶液中に残した。溶媒を高真空条件下 で除去し、光沢のある固体を得た。この固体をジクロロメタン及び２−プロパノ ール中に溶解し、冷蔵庫に貯蔵した。２つの分画を５０mg（〜４０％）の総回収 のために単離した。両分画をグリセロール中で、低分離質量分析法（ＬＲＭＳ） 及び高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ+）によって分析した。第１分画はより純 粋であったが、両分画は、Ｍ+４６０を示した。第２分画は、５６９ｍ／ｚのピ ークによって示唆される高分子量の不純物を含有した。高分解ＦＡＢ+ＭＡＳに よって、第１分画の分子イオンの同定を確認した：４６０．１３２９６ｍ／ｚ、 Ｃ25Ｈ22Ｎ3Ｏ4Ｓとしての計算値：４６０．１３２７６。ＴＯ−オリゴヌクレオチド抱合体の製造 次に、チアゾールオレンジ標識した核酸リガンドを、第１に、ＡＢＩ３８０Ｂ シンセサイザー及び Glen Research（バージニア州、Sterling）からの保護した ホスホルアミダイト試薬によって、アミノプロピル（Ｃ３）リンカーアームにカ ップルした非標識核酸リガンド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を製造することによ って製造した。Ｃ３リンカーアームを有する核酸リガンドの精製及び脱保護は、 濃水酸化アンモニウムによって、５５℃において６時間処理することによって達 成された。生成物の混合物を濾過し、溶媒を高真空において蒸発させた後、Ｃ３ リンカーアームを有する核酸リガンドをエタノール沈殿させた。次に、核酸リガ ンドのリンカーアーム上の反応性の第１アミノをチアゾールオレンジＮ−プロピ オン酸ＮＨＳエステル（３）と反応させた。特に、チアゾールオレンジＮ−プロ ピオン酸ＮＨＳエステル（“ＴＯＮＨＳ”）溶液（５．９mg ＴＯ／１５０μg ＤＭＳＯ（ｄ６）（８５．５mM））の１０μl アリコートを希釈（０．１２５μ M）核酸リガンド溶液（５０μl 緩衝溶液Ｎａ2ＣＯ3／ＮａＨ2Ｏ ２５０ mMで希釈した水中５０μl の核酸リガンド（０．２５μM））に加えた。混合物 をアルミニウムホイルでカバーしたエッペンドルフ管中でボルテックスし、室温 おいて１５時間放置した。次に、粗染色標識した核酸リガンドを、ＰＤ−１０カ ラム(Pharmacia)を通すことによって精製して、未反応染色を除去し、ＯＰＣカ ートリッジ（ＡＢＩ）によって精製して、非標識核酸リガンドを除去した。ＯＰ Ｃカートリッジ精製法は、McBride，L．J．等、 BioTechniques ６巻、３６２ 頁（１９８８）のような文献から当業者に周知である。チアゾールオレンジ標識 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、化合物３として参照された（図１参照）。標識され た特異なトロンビン結合核酸リガンドの配列は、以下のものであった： （１）５’−ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’（配列番号１）；及び （２）５’−ＣＡＧＴＣＣＧＴＧＧＴＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＣＴ ＴＣＧＴＧＧＡＡ−３’（配列番号２） フルオレセイン標識配列番号１は、化合物１として参照され、フルオレセイン 標識配列番号２は、化合物２として参照された（図１参照）。 同様に、コントロールの分光学的に検出可能に標識した核酸リガンド（化合物 ４）を、同じ方法を用いて製造した。このコントロールの配列は、配列番号１の スクランブルバージョン、特に、５’−ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴ−３’ （配列番号３）であり、Ｃ６リンカーアームを通して、フルオレセインによって 標識された。 実施例２ 分光学的に検出可能に標識した、エステラーゼを結合する核酸リガンドの製造 フルオレセイン標識した、エステラーゼを結合する核酸リガンドを、実施例１ で用いた方法と同じ方法を用いて合成した。このフルオレセインは、Ｃ６リンカ ーアームを通して、次の核酸リガンド配列に付着した。 エステラーゼ結合核酸リガンドの配列： ５’−ＴＡＧＣＧＡＴＡＣＴＧＣＧＴＧＧＧＴＴＧＧＧＧＣＧＧＧＴＡＧＧＧＣ ＣＡＧＣＡＧＴＣＴＣＧＴ−３’（配列番号４） フルオレセイン標識配列番号４は、化合物５として参照された（図１参照）。 実施例１と同じ方法は、分光学的に検出可能に標識した、他の核酸リガンド、 例えば、細胞表面マーカーＣＤ４と結合する核酸リガンド、塩基性繊維芽細胞成 長因子、血管性内皮細胞成長因子及びヒトの絨毛性ゴナドトロピンにも用いるこ とができる。 例３ 分光学的に検出可能な標識核酸リガンドを用いる蛍光偏光検定 例１および２で調製した化合物を以下に記載のごとく蛍光偏光検定において試 験した。 化合物１ ヒトα−トロンビン（American Diagnostics）から、１４０mM ＮａＣｌ、２ ０mM トリスアセテート、１mM ＣａＣｌ2 、５mM ＫＣｌ、１mM ＭｇＣｌ2 の緩衝液（pH７．４）中トロンビンの最高濃度１００nMのトロンビン溶液をつく った。次いで、この溶液の連続希釈溶液を０．０１５nM〜１００nMの濃度範囲で 調製した。同様にして、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）(Sigma) 溶液を同じ緩衝 液を用いて最高濃度２４７nMで調製し、次いで、連続的に希釈して、０．３９nM までの濃度範囲の溶液を調製した。 化合物１を６．４nMの濃度となるようにトロンビン溶液およびＨＳＡ溶液の各 希釈溶液サンプルに加え、次いでうず状にかくはんし、室温に１５分間放置し、 そして以下のごとく蛍光測定を行なった。蛍光検定の結果はFig.２のとおりであ り、化合物１のトロンビンへの検出できる結合を示すが、ＨＳＡに対して示さな い。 化合物２ 化合物１について用いたものと同じ緩衝液を用いて、最高濃度１００nMのトロ ンビン溶液を調製した。次いで、この溶液を連続希釈して、０．００５１nM〜１ ００nMの濃度範囲の溶液を調製した。同様にして、最高濃度１５０nMのＨＳＡ溶 液をつくり、トロンビン溶液と同じ緩衝液で連続希釈して、１．２nMまでの溶液 を調製した。 次いで、化合物２を０．６２nMの濃度になるようにトロンビン溶液およびＨＳ Ａ溶液の各希釈溶液のサンプルに加え、次いでうず状にかくはんし、室温に１５ 分間放置し、以下のごとく蛍光測定を行なった。蛍光検定の結果はFig.３のとお りであり、化合物２がトロンビンには検出できる結合を示すが、ＨＳＡにはそう ではないことを示す。 化合物３ 化合物１に対して用いたのと同じ緩衝液を用い、最高濃度６６０nMのトロンビ ン溶液をつくった。この溶液の連続希釈溶液を０．１４nM〜６６０nMの濃度範囲 となるように調製した。同様にして、トロンビン溶液の場合と同じ緩衝液を用い て、最高濃度６６０nMのＨＳＡ溶液をつくり、さらに１１．１nMまでの連続希釈 溶液をつくった。 次いで、化合物３を８nMの濃度になるようにトロンビン溶液およびＨＳＡ溶液 の各希釈溶液サンプルに加え、うず状にかくはんし、室温に１５分間放置し、以 下のごとく蛍光測定を行なった。蛍光検定の結果はFig.４のとおりであり、化合 物３はトロンビンに検出できる結合を示すが、ＨＳＡにはそうではないことを示 す。 化合物４ 化合物４は例１で調製した対照化合物であり、上記化合物１，２および３のそ れぞれと同じ濃度で同じようにしてトロンビン希釈溶液およびＨＳＡ希釈溶液に 加えた。同様にして、化合物４を化合物１，２および３の場合と同じ条件とし、 ＳＬＭ測定器で分析し、以下例４に記載のごとく、異方性（anisotropy）値を測 定した。化合物４は蛍光異方性検定においてトロンビンまたはＨＳＡに検出でき る結合を示さなかった。 化合物５ ヒト好中球エラスターゼ（Athens Research Technology）から、１５０mM Ｎ ａＣｌ、２mM ＭｇＣｌ2、６mM ＫＣｌ、１０mM トリスの緩衝液（pH７．０ ）中最高濃度１８０nMのエラスターゼ溶液をつくった。次いで、この溶液の連続 希釈溶液を０．０２７nM〜１８０nMの濃度範囲でつくった。 次いで、化合物５を１．５nMの濃度となるようにエラスターゼ溶液の各希釈溶 液サンプルに加え、うず状にかくはんし、室温に１５分間放置し、以下のごとく 蛍光測定を行なった。蛍光検定の結果はFig.５のとおりであり、化合物５のトロ ンビンへの検出できる結合を示す。 蛍光測定 トロンビン希釈溶液およびＨＳＡ希釈溶液中の化合物１，２および３の調製液 ならびにエラスターゼ希釈溶液中の化合物５の調製液を次いでJolley ＦＰＭ− １蛍光測定器で分析した。蛍光測定器はＬ−フォーマットを用い、フルオレセイ ンの放射と励起極大に適した標準干渉フィルターをそなえている。同じフィルタ ーを化合物３調製液について用いた（たとえ、それがチアゾールオレンジラベル をもっていたとしても）。 反応混合物の蛍光ポーラリゼーションは１２×７５mmボロシリケートグラス試 験管を用いて直接測定した。蛍光ポーラリゼーションにおける最大の変化はΔmP （ミリポーラリゼーション単位）として報告された。以下、表１に記載のごとく 、このデータは環境温度での三回の測定の平均を表わす。 表１の値は、ターゲットに対する分光学的に検出できる標識した核酸リガンド の結合（Kd）に相関する蛍光偏光（ΔmP）における有意な変化を示す。蛍光偏光 における同様の変化が、リガンド単独と比較してリガンド／ターゲットコンプレ ックスの大きさにおける差異に基づく同様に標識した核酸リガンドから期待でき る。 例４ 分光学的に検出可能な標識核酸リガンドを用いた異方性検定 例３で得られた調製物について、ＳＬＭ機器を用いて分析して異方性値を測定 した。得られた異方性値は以下の表２に示した。 表２に示した異方性値は、フリー核酸リガンド（上記化合物１）とターゲット に結合した核酸リガンド複合体（化合物１＋トロンビン溶液）との間の異方性に おける検出可能な相違を示している。表１（化合物３）における蛍光分極値に関 して、ターゲットに結合した他の分光学的に検出可能な標識化核酸リガンドにつ いても、非結合の異方性値と比較した場合に異方性値において同様の相違が期待 できる。 例５ トロンビンに結合するフェニトロチオン−フルオレセイン標識核酸の調製 ホスホルアミド試薬を用いた標準固相オリゴヌクレオチド技術を用いて、Ｇ６ とＴ７の間にフェニトロチオン基が導入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列（ ５’−ＧＧＴＴＧＧxＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’．ここでＸはフェニトロチオン の位置を示す）を調製した。フェニトロチオンを調製するための技術は、Eckste in，F，Annul．Rev．Biochem．５４，３６７（１９８５）などの文献から当業者 に良く知られている。 次いで、粗フェニトロチオンオリゴマーをエタノール沈殿に付し５０mMリン酸 カリウム（pH７．０）に再溶解した。５−ヨードアセトアミドフルオレセイン溶 液（１００μL ，ＤＭＦ中１０mg／mL）を、フェニトロチオンオリゴマー溶液（ ５０mMリン酸カリウムバッファー２００μL 中３００μg ）に加えておだやかに 混合した。得られる溶液を室温で２４時間放置し、その間、新たに調製した５− ヨードアセトアミドフルオレセイン溶液（１００μL ，ＤＭＦ中１０mg／mL）を 再び加えた。３時間後、得られる溶液を、精製するまで、３日間−２０℃で保存 した。 更に５０mMリン酸カリウムバッファー（７００μL ）を加えて、得られる混合 物を、ＴＲＩＳ−ＥＤＴＡバッファーで平衡化したＮＡＰ−２５サイズ排除カラ ム(Pharmacia)を用いて分離した。空間容積(void volume)に溶出した蛍光フラク ション（全１．４mL）を集めて、真空下に１００μL に濃縮した。配列決定ゲル サンプルバッファーを加えて、サンプルを８％配列決定ゲルで分離した。この精 製相は、ゲルの前面に塩とともにそのオリゴマー移動したため、あまり有効では なかった。蛍光バンドを切り出し、ゲルから溶出してエタノール沈殿に付した。 得られるペレットを、０．１Ｍ ＴＥＡＡバッファ−１mL中に取り、ＯＰＣカラ ム（Applied Biosystems）で製造業者のプロトコールに従って精製した。 このような技術は、細胞表面マーカーＣＤ４、塩基性繊維芽細胞成長因子、血 管内皮細胞成長因子及びヒト絨毛性ゴナドトロピンに結合する核酸リガンドなど の他の核酸リガンドを内部的分光学的に検出可能なように標識化するのに用いる ことができる。 例３の化合物１について用いたと同様のバッファーで最も高い濃度について、 ６００nMのトロンビン溶液を調製した。次いで、この溶液について、０．０４５ mMから６００nMの濃度範囲の一連の希釈液を調製した。同様に、ＨＳＡ溶液につ いても、最も高い濃度として１０８０nMの溶液を調製し、トロンビン溶液と同じ バッファーで１．５nMより低い濃度の一連の希釈液を調製した。 次いで、トロンビン溶液の希釈液及びＨＳＡ溶液の希釈液のそれぞれのサンプ ルに化合物６を加えて２．３nM濃度にし、次いで攪拌し、例３に記載した蛍光測 定を行う前に１５分間室温で放置した。測定によって得られるデータを、室温で の３回の実測値の平均値として以下に示した。このアッセイの結果を図６にも示 した。図６には、ＨＳＡではなくトロンビンへの化合物６の検出可能な結合が示 されている。 蛍光分極における同様の変化が、リガンド／ターゲット複合体とリガンドのみ との大きさおける相違に基づき、同様に内部的に標識化した核酸リガンドからも 期待できる。 本明細書に記載した発明は、本明細書に記載した態様の範囲に限定されるもの ではない。本明細書に記載した技術を個々のケースに適用するための適当な修正 、応用及び省略は、以下にクレームされる本発明の範囲内で当業者によって用い ることができまた理解される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ピットナー，ジェームズ ビー. アメリカ合衆国27704 ノースカロライナ 州 ダーラム，ボックス 92，ルート ５ (72)発明者 マリノウスキー，ダグラス ピー. アメリカ合衆国27278 ノースカロライナ 州 ヒルズボロー，ディモックス ミル ロード 1005 (72)発明者 ボンク，グレン ピー. アメリカ合衆国27527 ノースカロライナ 州 フクアイ−バリナ，ピニィ グローブ −ウィルボン ロード 2717 (72)発明者 ゴールド，ラリー アメリカ合衆国80302 コロラド州 ボー ルダー，フィフス ストリート 1033

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）分光学的に検出可能な標識化レセプター分子をサンプルに加え；及 び （ｂ）（ｉ）分光学的に検出可能な標識化レセプター分子とサンプルとの 混合物と（ii）分光学的に検出可能な標識化レセプター分子のみとの間に分光学 的な発光の違いがあるかどうかを決定することを含む、サンプル中の標的化合物 の存在又は不存在を検出する方法。 ２．レセプター分子が核酸リガンドである請求項１記載の方法。 ３．核酸リガンドがフルオレセインによって標識化されている請求項２記載の 方法。 ４．フルオレセインによる標識が核酸リガンドにその３’末端において連結し ている請求項３記載の方法。 ５．フルオレセインによる標識が核酸リガンドにその５’末端において連結し ている請求項３記載の方法。 ６．核酸リガンドがトロンビンを結合する請求項５記載の方法。 ７．分光学的に検出可能な標識化核酸リガンドが化合物１の式を有する請求項 ６記載の方法。 ８．分光学的に検出可能な標識化核酸リガンドが化合物２の式を有する請求項 ６記載の方法。 ９．フルオレセインによる標識が核酸リガンドの内部の位置に連結している請 求項３記載の方法。 10．核酸リガンドがトロンビンを結合する請求項９記載の方法。 11．分光学的に検出可能な核酸リガンドが化合物６の式を有する請求項１０記 載の方法。 12．核酸リガンドがチアゾールオレンジによって標識化されている請求項２に 記載の方法。 13．チアゾールオレンジによる標識が核酸リガンドにその３’末端において連 結している請求項１２記載の方法。 14．チアゾールオレンジによる標識が核酸リガンドの内部の位置に連結してい る請求項１２記載の方法。 15．チアゾールオレンジによる標識が核酸リガンドにその５’末端において連 結している請求項１２記載の方法。 16．分光学的に検出可能な標識化核酸リガンドが化合物３の式を有する請求項 １５記載の方法。 17．核酸リガンドがエラスターゼを結合する請求項５記載の方法。 18．分光学的に検出可能な標識化核酸リガンドが化合物５の式を有する請求項 １７記載の方法。 19．レセプター分子が２方向性核酸リガンドである請求項１記載の方法。 20．ステップ（ｂ）に記載された決定を、（ｉ）と（ii）の蛍光偏光の値の比 較によって行う請求項１記載の方法。 21．ステップ（ｂ）に記載された決定を、（ｉ）と（ii）の異方性の値の比較 によって行う請求項１記載の方法。 22．ステップ（ｂ）に記載された決定を、（ｉ）と（ii）の回転相関時間の比 較によって行う請求項１記載の方法。 23．サンプルが生物学的なサンプルである請求項１記載の方法。 24．サンプルが血液である請求項２３記載の方法。 25．標的化合物がトロンビンである請求項１記載の方法。 26．標的化合物がエラスターゼである請求項１記載の方法。 27．標的化合物が細胞表面マーカー(a cell surface marker)である請求項１ 記載の方法。 28．標的化合物が成長因子である請求項１記載の方法。 29．標的化合物が塩基性繊維芽細胞成長因子である請求項２８記載の方法。 30．標的化合物が血管内皮細胞成長因子である請求項２８記載の方法。 31．標的化合物が成長因子レセプターである請求項１記載の方法。 32．標的化合物がヒト絨毛性ゴナドトロピンである請求項１記載の方法。 33．標的化合物が完全な細胞(a whole cell)である請求項１記載の方法。 34．完全な細胞がバクテリアの細胞である請求項３３記載の方法。 35．標的化合物がウィルス粒子である請求項１記載の方法。 36．（ａ）標的レセプターに結合する分光学的に検出可能な標識化核酸リガン ドをサンプルに加え； （ｂ）分光学的に検出可能な標識化核酸リガンドの標的レセプターへの結 合の程度を決定し；及び （ｃ）標的化合物のレセプターへの結合の程度をステップ（ｂ）の決定か ら計算することを含む、サンプル中での標的化合物のレセプターへの結合をモニ ターする方法。 37．標的化合物が成長因子である請求項３６記載の方法。
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