JP4527080B2 - ラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法 - Google Patents
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Description
FP = {IVV − IVHG}/{IVV + IVHG}
IVV : 垂直蛍光強度
IVH : 水平蛍光強度
G : G要素 (= I VVO /I VHO )
のように計算され、励起から放射までの間に分子が回転した程度を示す。
本発明は、ラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法を提供する。
1)蛍光プローブ分子及び生分子を準備する工程、
2)ラボオンアチップのマイクロチャンネルに蛍光プローブ分子及び生分子を注入して複合体を形成させる工程、
3)前記複合体に偏光を照射して蛍光偏光を測定する工程、及び
4)前記蛍光偏光を定量化して蛍光偏光度を決定する工程を含む。
1)蛍光プローブ分子及び生分子を準備する工程、
2)ラボオンアチップのマイクロチャンネルに蛍光プローブ分子及び生分子を注入して複合体を形成させる工程、
3)前記複合体と試験物質を反応させる工程、
4)前記試験物質と応じた複合体に偏光を照射して蛍光偏光を測定する工程、及び
5)前記蛍光偏光を定量化して蛍光偏光度を決定する工程を含む。
まず、偏光発生部は、レーザー光源、該レーザー光源から放出されるレーザー光をろ過する第一フィルター(フィルター 1)、前記第一フィルターを通過したレーザー光の方向を制御する第一ミラー(ミラー1)と第二ミラー(ミラー2)、前記第二ミラーで反射したレーザー光を偏光させる偏光器、該偏光器を通過した偏光されたレーザー光を分離する光線分離器、及び分離した偏光を平行光に変換して試料に引き入れるレンズを含む。
1)蛍光プローブ分子及び生分子を準備する工程、
2)ラボオンアチップのマイクロチャンネルに蛍光プローブ分子及び生分子を注入して複合体を形成させる工程、
3)前記複合体に偏光を照射して蛍光偏光を測定する工程、及び
4)前記蛍光偏光を定量化して蛍光偏光度を決定する工程を含むことを特徴とする、ラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法である。
本発明(2)は、前記ラボオンアチップが、幅が10〜100μmであるマイクロチャンネルを含み、硝子材質を使用して写真蝕刻方法で製造されることを特徴とする、本発明(1)のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法である。
本発明(3)は、前記工程2)で、前記生分子及び前記蛍光プローブ分子を反応物質の貯蔵所1、2に連結された真空ポンプ6を使用した圧力差によって微細流体制御を通じて主チャンネルで出合うようにすることを特徴とする、本発明(1)のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法である。
本発明(4)は、前記工程3)で、偏光器を外した状態で前記マイクロチャンネルの特定蛍光プローブに対する光源及び測定機の補正値であるG要素値を求めた後、偏光器を付着して前記ラボオンアチップのマイクロチャンネル内の蛍光プローブ分子−生分子複合体に偏光を照射して励起された蛍光を垂直、水平光倍率器を通過させて測定値を得て、前記工程4)で、前記G要素値と前記測定値から蛍光偏光度を決定することを特徴とする、本発明(1)のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法である。
本発明(5)は、信号対雑音比を改善するための光学チョッパーを使用することを特徴とする、本発明(1)のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法である。
本発明(6)は、前記ラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法が、生分子の間の相互作用の定量的測定に利用されることを特徴とする、本発明(1)のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法である。
本発明(7)は、
1)蛍光プローブ分子及び生分子を準備する工程、
2)ラボオンアチップのマイクロチャンネルに蛍光プローブ分子及び生分子を注入して複合体を形成させる工程、
3)前記複合体と試験物質を反応させる工程、
4)前記試験物質と反応した複合体に偏光を照射して蛍光偏光を測定する工程、及び
5)前記蛍光偏光を定量化して蛍光偏光度を決定する工程を含むラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法である。
本発明(8)は、前記ラボオンアチップが、幅が10〜100μmであるマイクロチャンネルを含み、蛍光プローブ分子の供給貯蔵所1、蛍光プローブ分子と結合する生分子の貯蔵所2、試験物質を含むウェルプレート3、チップへの試料流入のための毛細管のような供給装置4、蛍光偏光感知点5、試料を主チャンネルに流入させるための真空ポンプ6を含み、硝子材質を使用して写真蝕刻方法で製造されることを特徴とする、本発明(7)のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法である。
本発明(9)は、前記ラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法において、試験物質に検索対象物質を使用し、生分子の間の複合体形成を誘導または阻害する物質の検索に使用することを特徴とする、本発明(7)のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法である。
本発明(10)は、前記ラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法において、試験物質に酵素を使用し、生分子に酵素に対応する基質を使用して酵素の活性または濃度測定に使用することを特徴とする、本発明(7)のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法である。
本発明(11)は、前記酵素がプロテアーゼで、基質がカゼインであることを特徴とする、本発明(10)のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法である。
本発明(12)は、偏光発生部、蛍光偏光分離部及び蛍光偏光測定部を含むマイクロチャンネルのための蛍光偏光測定装置である。
本発明(13)は、前記偏光発生部が、レーザー光源、該レーザー光源から放出されるレーザー光をろ過する第一フィルター、該第一フィルターを通過したレーザー光の方向を制御する第一ミラーと第二ミラー、該第二ミラーで反射したレーザー光を偏光させる偏光器、該偏光器を通過した偏光されたレーザー光を分離する光線分離器、及び分離した偏光を平行光に変換してマイクロチャンネル内の試料に引き入れるレンズを含むことを特徴とする、本発明(12)のマイクロチャンネルのための蛍光偏光測定装置である。
本発明(14)は、前記レーザー光をオン/オフして信号対雑音比を改善するために前記第一フィルターと前記第一ミラーの間に光学チョッパーが介在することを特徴とする、本発明(13)のマイクロチャンネルのための蛍光偏光測定装置である。
本発明(15)は、前記蛍光偏光分離部が、前記偏光発生部の偏光の照射を受けて励起した蛍光プローブ分子により放出される蛍光を集めるレンズ、該レンズを通過した蛍光方向を制御する第三ミラー、該第三ミラーで反射した前記蛍光をろ過する第二フィルター、及び該第二フィルターを通過した前記蛍光の偏光を分離する偏光光線分離器を含むことを特徴とする、本発明(12)のマイクロチャンネルのための蛍光偏光測定装置である。
本発明(16)は、前記蛍光偏光測定部が、前記偏光光線分離器を通過した前記蛍光の整流のための第三フィルター、該第三フィルターを通過した前記放出された光の垂直または水平な両平面で蛍光信号を測定する垂直方向光倍率器(PMT1)と偏光器を含んだ水平方向光倍率器(PMT2)、及び前記光倍率器を通過した蛍光の偏光度を測定するオシロスコープを含むことを特徴とする、本発明(12)のマイクロチャンネルのための蛍光偏光測定装置である。
本発明(17)は、前記マイクロチャンネルが、幅が10〜100μmであることを特徴とする、本発明(12)のマイクロチャンネルのための蛍光偏光測定装置である。
本発明(18)は、前記マイクロチャンネルが、ラボオンアチップに含まれたマイクロチャンネルで、前記ラボオンアチップが、蛍光プローブ分子の供給貯蔵所1、蛍光プローブ分子と結合する生分子の貯蔵所2、試験物質を含むウェルプレート3、チップへの試料流入のための毛細管のような供給装置4、蛍光偏光感知点5、試料をチップの主チャンネルに流入させるための真空ポンプ6を含むことを特徴とする、本発明(17)のマイクロチャンネルのための蛍光偏光測定装置である。
本発明(19)は、本発明(12)または(18)いずれか1項記載の蛍光偏光測定装置を利用した生分子間の複合体形成を誘導または阻害する物質の検索方法である。
本発明(20)は、本発明(12)または(18)いずれか1項記載の蛍光偏光測定装置を利用した酵素の活性または濃度の測定方法である。
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
常用蛍光分光分析機(Perkin Elmer)を使用して100μlキュベットにあるテトラメチルローダミン(TMR, tetramethylrodamine)−ビオチン(biotin)とストレプトアビジン(streptavidin)の複合体形成の蛍光偏光度を測定した。
本発明の光学チョッパーが付着しない図2の蛍光偏光測定装置を使用して、100μlキュベットでビオチンとストレプトアビジンの複合体形成の蛍光偏光を測定した。
本発明の光学チョッパーが付着していない図2の蛍光偏光測定装置を使用して、ラボオンアチップのビオチンとストレプトアビジンの複合体形成の蛍光偏光を測定した。但し、本実施例2では深さ12μm、幅79μmのマイクロチャンネルで構成されたガラス材質のラボオンアチップを100μlキュベットの代わりに使用した。まず、前記ラボオンアチップのマイクロチャンネルに真空ポンプを使用して100nMテトラメチルローダミン溶液を満たして実施例1で説明した方法でG要素値を求めた後、ラボオンアチップ(図3)の貯蔵所1に1.25μMテトラメチルローダミンを入れた場合(A)、ラボオンアチップの貯蔵所1に1.25μMテトラメチルローダミン−ビオチンを入れた場合(B)、ラボオンアチップの貯蔵所1に10μMテトラメチルローダミン−ビオチンを入れてラボオンアチップの生分子供給貯蔵所2に2.5μMストレプトアビジンを入れた場合(C、DとE)に分けて、ラボオンアチップの真空ポンプ6で真空ポンプを稼動してマイクロチャンネルに試料を注入させた後、ラボオンアチップ(図3)の蛍光偏光感知点5で蛍光偏光を測定した。
本発明の光学チョッパーが付着した図2の蛍光偏光測定装置を使用して、ラボオンアチップにあるビオチンとストレプトアビジンの複合体形成の蛍光偏光を測定した。
本発明の蛍光偏光測定方法及び装置を利用して、蛍光プローブとしてテトラメチルローダミンと生分子として汎用タンパク質基質であるα−カゼインの複合体(TMR−α−casein)を基質にしてさまざまなプロテアーゼとの反応をさせた後に蛍光偏光の変化を測定した。
Claims (11)
- 1)蛍光プローブ分子及び生分子を準備する工程、
2)ラボオンアチップ(Lab−on−a−chip)のマイクロチャンネルに蛍光プローブ分子及び生分子を注入して複合体を形成させる工程、
3)信号対雑音比を改善させるための光学チョッパーを使用して、レーザー光源から特定周波数信号のみを分離する工程、
4)偏光器を外した状態で垂直、水平光倍率器でIVVOとIVHOを測定して特定蛍光プローブに対する光源及び測定器の補正値であるG要素値(=IVVO/IVHO)を求めた後、偏光器を付着して前記ラボオンアチップのマイクロチャンネル内の蛍光プローブ分子−生分子複合体に偏光を照射して励起された蛍光偏光を垂直、水平光倍率器を通過させて測定値を得る工程、および
5)前記G要素値と前記測定値から蛍光偏光を定量化して蛍光偏光度を決定する工程を含むことを特徴とする、ラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法。 - 前記ラボオンアチップが、幅が10〜100μmであるマイクロチャンネルを含み、硝子材質を使用して写真蝕刻方法で製造されることを特徴とする、請求項1に記載のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法。
- 前記工程2)で、前記生分子及び前記蛍光プローブ分子を反応物質の貯蔵所1、2に連結された真空ポンプ6を使用した圧力差によって微細流体制御を通じて主チャンネルで出合うようにすることを特徴とする、請求項1に記載のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法。
- 前記ラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法が、生分子の間の複合体形成の程度の定量的測定に利用されることを特徴とする、請求項1に記載のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法。
- 1)蛍光プローブ分子及び生分子を準備する工程、
2)ラボオンアチップのマイクロチャンネルに蛍光プローブ分子及び生分子を注入して複合体を形成させる工程、
3)前記複合体と試験物質を反応させる工程、
4)信号対雑音比を改善させるための光学チョッパーを使用して、レーザー光源から特定周波数信号のみを分離する工程、
5)偏光器を外した状態で垂直、水平光倍率器でIVVOとIVHOを測定して特定蛍光プローブに対する光源及び測定器の補正値であるG要素値(=IVVO/IVHO)を求めた後、偏光器を付着して前記ラボオンアチップのマイクロチャンネル内の蛍光プローブ分子−生分子複合体に偏光を照射して励起された蛍光偏光を垂直、水平光倍率器を通過させて測定値を得る工程、および
6)前記G要素値と前記測定値から前記蛍光偏光を定量化して蛍光偏光度を決定する工程を含むことを特徴とする、ラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法。 - 前記ラボオンアチップが、幅が10〜100μmであるマイクロチャンネルを含み、蛍光プローブ分子の供給貯蔵所1、蛍光プローブ分子と結合する生分子の貯蔵所2、試験物質を含むウェルプレート3、チップへの試料流入のための毛細管のような供給装置4、蛍光偏光感知点5、試料を主チャンネルに流入させるための真空ポンプ6を含み、硝子材質を使用して写真蝕刻方法で製造されることを特徴とする、請求項5に記載のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法。
- 前記ラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法において、試験物質に検索対象物質を使用し、生分子の間の複合体形成を誘導または阻害する物質の検索に使用することを特徴とする、請求項5に記載のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法。
- 前記ラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法において、試験物質に酵素を使用し、生分子に酵素に対応する基質を使用して酵素の活性または濃度測定に使用することを特徴とする、請求項5に記載のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法。
- 前記酵素がプロテアーゼで、基質がカゼインであることを特徴とする、請求項8に記載のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法。
- 前記ラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法において、
前記3)工程では、試験物質に検索対象物質を使用して、
前記4)〜6)工程では、
1)レーザー光源、該レーザー光源から放出されるレーザー光をろ過する第一フィルター、該第一フィルターを通過したレーザー光をオン・オフして、信号対雑音比を改善する光学チョッパー、該光学チョッパーを通過したレーザー光の方向を制御する第一ミラーと第二ミラー、該第二ミラーで反射したレーザー光を偏光させる偏光器、該偏光器を通過した偏光されたレーザー光を分離する光線分離器、及び分離した偏光を平行光に変換してマイクロチャンネル内の試料に引き入れるレンズを含むレーザー光源から偏光を発生させる偏光発生部、
2)偏光発生部の偏光を照射を受けて蛍光励起して放出される蛍光の偏光を分離させる蛍光偏光分離部及び、
3)蛍光偏光分離部を通過した蛍光偏光の偏光度を測定する蛍光偏光測定部を含むラボオンアチップのマイクロチャンネル内で流れる物質の蛍光偏光測定装置を使用する
ことを特徴とする、複合体形成を誘導または阻害する物質の検索に使用される請求項5に記載のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法。 - 前記ラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法において、
前記3)工程では、試験物質に酵素を使用して、
前記4)〜6)工程では、
1)レーザー光源、該レーザー光源から放出されるレーザー光をろ過する第一フィルター、該第一フィルターを通過したレーザー光をオン・オフして、信号対雑音比を改善する光学チョッパー、該光学チョッパーを通過したレーザー光の方向を制御する第一ミラーと第二ミラー、該第二ミラーで反射したレーザー光を偏光させる偏光器、該偏光器を通過した偏光されたレーザー光を分離する光線分離器、及び分離した偏光を平行光に変換してマイクロチャンネル内の試料に引き入れるレンズを含むレーザー光源から偏光を発生させる偏光発生部、
2)偏光発生部の偏光を照射を受けて蛍光励起して放出される蛍光の偏光を分離させる蛍光偏光分離部及び、
3)蛍光偏光分離部を通過した蛍光偏光の偏光度を測定する蛍光偏光測定部を含むラボオンアチップのマイクロチャンネル内で流れる物質の蛍光偏光測定装置を使用する
ことを特徴とする、酵素の活性または濃度の測定に使用される請求項5に記載のラボオンアチップでの蛍光偏光測定方法。
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