KR100822810B1 - 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법 및 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법 및 장치에 관한 것으로서, 구체적으로 랩온어칩에서 형광 편광 측정을 이용하여 생분자와 형광탐침분자간의 상호작용을 정량적으로 측정하고, 효소의 활성을 빠르게 분석하는 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법과 그 장치에 관한 것이다. 본 발명의 측정 방법과 그 장치는 기존의 방법에 비해 1/100 정도의 적은 양의 시료를 사용하여 분석이 가능하고, 전자동된 장치에 의해 고속 분석이 가능하므로 생분자 물질 간의 상호작용 검색과 효소, 특히 기질로서 범용 단백질인 카세인을 사용하는 프로테아제 분석에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
도 1은 일반적인 형광 편광 측정 개념도로서, 저장고에서 섞은 물질을 플라스틱 채널로 유입시킨 후 형광 편광을 측정하는 도면이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 유리 재질의 랩온어칩상의 마이크로 채널에서의 지속적으로 흐르는 물질들에 대한 형광 편광 측정 장치의 구성도이며,
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 랩온어칩의 마이크로 채널의 구조도이고, 도 3b는 마이크로 채널의 형광 편광 감지점에서의 측정 신호 예상도이고,
도 4는 본 발명의 비교예에 따른 테트라메틸로다민 (TMR, tetramethylrodamine)-바이오틴(biotin)과 스트렙타비딘(streptavidin)의 결합에 대하여 상용 형광 분광 분석기(Perkin Elmer)를 사용하여 형광 편광을 측정한 그래프이며,
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따른 큐벳에서 생분자와 형광탐침분자의 결합을 광학 쵸퍼가 부착되지 않은 도 2의 장치를 이용하여 형광 편광으로 측정한 그래프이고,
도 6a는 본 발명의 실시예 2에 따른 유리 재질 랩온어칩의 마이크로 채널상 에서 생분자와 형광탐침분자의 결합을 광학 쵸퍼가 부착되지 않은 도 2의 측정 장치를 이용한 형광 편광으로 측정한 그래프이다. 도 6b는 도 6a의 측정값에서 옵셋(offset)값을 제거한 그래프이며,
도 7a는 본 발명의 실시예 3에 따른 유리 재질 랩온어칩의 마이크로 채널상에서 생분자와 형광탐침분자의 결합을 광학 쵸퍼를 부착시킨 도 2의 측정 장치를 이용한 형광 편광으로 측정한 그래프이다. 도 7b는 도 7a의 테트라메틸로다민(TMR, tetramethylrodamine)-바이오틴(biotin)과 스트렙타비딘(streptavidin)의 반응물에 디-바이오틴(D-biotin) 농도를 증가시키면서 첨가하여 형광 편광의 변화를 측정한 그래프이며,
도 8은 프로테아제의 활성을 분석하는 랩온어칩의 마이크로채널 구성과 형광 편광 감지 부분에서의 프로테아제의 농도에 따른 기질 단백질의 형광 편광 예상도를 표시한 모식도이며,
도 9는 테트라메틸로다민(TMR)이 부착된 알파-카세인 (TMR-alpha-casein)을 기질로 이용하여 효소인 (a) 프로테이나제 K, (b) 트립신, (c) 파파인, (d) 엘라스타제의 농도를 증가시키면서 시간에 따른 기질의 형광 편광의 변화를 상용 형광 분광 분석기(Perkin Elmer)를 사용하여 측정한 그래프이며,
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 도 8의 랩온어칩의 마이크로 채널 상에서 (a) 프로테이나제 K, (b) 트립신, (c) 파파인, (d) 엘라스타제의 효소 작용에 의한 TMR-알파-카세인의 형광 편광의 변화를 광학 쵸퍼(chopper)를 부착시킨 도 2의 측정 장치로 측정한 그래프이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
1 : 형광탐침분자 공급 저장소 2 : 생분자 공급 저장소
3 : 웰 플레이트 4 : 시료 공급 모세관
5 : 형광 편광 감지점 6 : 진공 펌프
본 발명은 랩온어칩(Lab-on-a-chip)에서의 형광 편광 측정 시스템에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 극미량의 생분자 물질간의 상호작용을 형광 편광으로 측정하는 검색용 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법과 그 장치, 그리고 검색 방법에 관한 것이다.
형광 측정법은 바이오 관련 분석 기술의 중요한 방법으로서, 그 기술로는 형광 세기, 형광량 변동의 통계적 분석, 형광 이미징, 형광공명에너지전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET), 형광 편광 등이 있으며, 방사성 동위원소를 이용한 분석법을 계속해서 대체하고 있다.
이 중, 형광 편광을 이용하는 형광 편광도(Florescence Polarization, FP) 측정법은 페린(Perrin)에 의해 고안되었고, 상기 방법은 편광으로 용액내의 형광분자를 여기시킬 때 발생하는 형광 편광을 측정하는 방법이다. 상기 형광분자가 여기되어 안정된 상태를 유지하고 있는 경우에는 형광 편광을 발생하고, 상기 형광분자가 여기될 때 들뜬 경우에서는 브라운 운동에 의해 회전하여 여기 평면과 다른 평면으로 형광을 방사하게 되어 형광 편광이 소실되는 원리를 이용한다.
이러한 상기 형광 편광도 측정법은 분자간 상호작용의 해석에 강력하고 독특한 방법으로 인정받아 왔다. 상기 방법은 고체상 분리가 필요없는 직접적인 분석법으로 분자의 크기에 따라 형광 편광도가 다른 원리를 이용하여 형광표식한 생체물질의 분자간 상호작용을 고감도로 측정할 수 있다. 그러므로 생체물질간의 결합에 의해 분자량이 증가하면 형광 편광도도 증가하고, 해리나 분해에 의해 분자량이 감소하면 형광 편광도도 감소하므로, 이 원리를 이용하여 생체물질간의 상호작용을 해석할 수 있다.
이러한 현광편광도는 분자의 회전 시간에 반비례하고, 분자의 점도, 절대온도, 분자 크기에 영향을 받으며, 온도와 점도를 일정하게 유지시키면 형광 편광도는 분자 크기에 비례하는 관계를 보인다.
상기 형광 편광도를 측정하는 형광 편광도 측정시스템은 일반적으로 단색광이 편광 필터를 통과하여 시료 튜브 중의 형광성 분자를 여기하면, 같은 편광면에 배향하고 있는 분자만이 빛을 흡수하여 여기되고, 그 후 빛을 방사하면 이 방사광을 여기광에 대해 수직 및 수평한 양평면에서 측정하는 방식으로 구성된다.
상기 형광 편광도는 이 측정치를 이용하여
FP = {IVV - IVHG}/{IVV + IVHG}
IVV : 수직 형광세기
IVH : 수평 형광세기
G : G-요소 (= IVV/IVH)
와 같이 계산되어 여기에서 방사까지의 사이에 분자가 회전한 정도를 나타낸다.
상기 형광 편광도 측정법을 대량 분석에 이용하기 위해서는 웰 플레이트(well plate)에서 처리한 시료들의 형광 편광을 형광현미경의 원리를 이용하여 주사(scanning) 방식으로 측정하는 방법이 널리 쓰이고 있다. 이때 소모되는 시료의 양은 96 웰 플레이트의 경우는 100 ㎕, 384 웰 플레이트의 경우는 40 ㎕ 정도이다.
종래의 모세관 전기영동으로 복합체를 분리한 후 형광 편광을 측정하는 시스템은 분리한 물질을 육면체 모양의 큐벳 셀(cuvette cell)로 포집하여 수직 및 수평한 양평면에서 형광 세기를 측정하여 형광 편광을 구하는 것이다. 상기 시스템은 전기영동 모세관에서 생분자 물질들을 분리한 후 측정하는 두 단계로 구성되며 비교적 큰 큐벳 셀(0.2 ㎜ × 0.2 ㎜)을 이용하므로, 상당량의 분리된 복합체를 포집하여 사용해야 하는 문제점이 있다[Anal. Chem. 72(2000) pp. 5583-5589].
또 다른 종래의 형광 편광 측정 시스템으로 플라스틱 채널을 사용하는 방법이 있다[Anal. Chim. Acta 506 (2004) pp. 123-128].
상기 플라스틱 채널을 사용한 시스템은 분석 용액을 형광표지된 항체/효소와 섞어 복합체를 형성시키고, 상기 복합체를 300-500 ㎛ 지름의 플라스틱 채널(PDMS Block, Poly Dimethyl Siloxane Block)로 유입시킨 후 상용 형광 측정 시스템의 편광 여기광을 조사한 후 형광 편광을 광검출기로 방출시켜 측정하는 것이다(도 1 참조).
여기서, 상기 일회용 플라스틱 채널은 저장고에서 물질을 미리 섞은 후 300-500 ㎛ 지름의 크기가 큰 채널로 유입한 후 종래 방식의 형광 편광 시스템으로 측정하는 것으로, 쉽게 측정이 되나 미리 반응 물질을 섞어야 하므로 시료가 약 10 ㎕의 부피와 10-40 nmol의 많은 양이 소모되고 지속적으로 흐르는 시료들의 반응 양상을 관찰하는데 문제가 있다. 또한, 소형화된 마이크로 채널에서는 후면 신호가 커서 형광신호 측정이 어려운 문제점이 있다.
한편, 랩온어칩(Lab-on-a-chip)은 반도체 제작 공정에서 사용되는 사진식각(photolithography) 기술을 이용하여 유리, 실리콘, 또는 플라스틱으로 된 수 제곱센티미터(㎠) 크기의 기판위에 여러 가지 장치(시료전처리, 반응, 시료주입, 분리, 측정 등을 위한 각 장치)들을 집적시킨 바이오 칩의 일종으로, '하나의 칩 위에 실험실을 올려놓았다'는 뜻의 물리, 화학, 생물 마이크로프로세서이다. 보통 '칩 속의 실험실' 또는 '칩 위의 실험실'로 통한다. 플라스틱·유리·규소(실리콘) 등의 소재를 사용해 나노(10억 분의 1) 리터 이하의 미세 채널을 만들고, 이를 통해 극미량의 샘플이나 시료만으로 기존의 실험실에서 할 수 있는 실험이나 연구 과정을 신속하게 대체할 수 있도록 만들어, 고속, 고효율, 저비용의 자동화된 실험이 가능 하다.
특히, 차세대 진단장치로 주목받고 있는데, 이 칩을 이용하면 한 방울의 피로도 각종 암 진단이나 적혈구·백혈구의 세포 수 측정이 가능하다. 또한, 축산이나 환경 등 다양한 분야로까지 응용 분야를 확장할 수 있는 고부가가치 상품으로, 2000년 이후 바이오 기술이 급속도로 발달하면서 주목받기 시작하였다.
그러나 검색용 랩온어칩에서 형광 편광도를 측정하는 시스템은 아직 알려진 바가 없으며, 이 시스템을 이용하면 고감도로 극소량의 시료를 이용하여 상호분석이 가능하다.
단백질 분해 효소(proteolytic enzyme)의 활성을 확인하고 측정하기 위해 다양한 방법들이 있는데 대체로 침전 분석(precipitation assay)을 이용하여 상등액에 방출되는 형광 또는 흡광을 측정하는 방법과 균일 형광측정 분석(homogeneous fluorometric assay) 방법이 있다. 후자의 방법으로는 과량의 형광 물질이 부착된(fluorescence-quenched, hyperconjugated) 단백질 기질을 이용하여 프로테아제(protease)가 작용하면 형광 세기가 커지는 것을 측정하거나, 형광 물질이 소량 부착되어 형광 세기의 변화는 없으나 프로테아제의 작용에 의해 기질 단백질이 분해됨에 따라 나타나는 형광 편광의 감소를 측정하게 된다. 이 중에서도 형광 세기의 변화에 무관하여 안정적으로 측정 가능한 형광 편광 방법 및 범용 단백질 기질을 이용하면 다양한 프로테아제의 활성을 민감하게 특정할 수 있다. 현재까지 랩온어칩에서 프로테아제의 활성을 분석하는 방법은 특정 프로테아제에 대한 형광 물질이 부착된 펩타이드 기질을 이용하는 것으로 각각의 프로테아제에 대해 특이적인 기질을 공급해야 하는 단점이 있다. 따라서 본 발명의 실시예에서 보인, 형광 편광 및 범용 단백질 기질을 이용한 랩온어칩에서의 프로테아제 활성 분석 시스템은 다양한 프로테아제에 대해 범용으로 이용 가능한 분석 시스템이라 할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 다양한 검색에 유리하도록 시약 소모량이 수 pmol ∼ 수십 fmol 정도인 형광 편광 측정 시스템을 개발하기 위해 노력하던 중, 검색용 랩온어칩에서의 생분자와 형광탐침분자의 형광 편광을 측정하는 형광 편광 측정 방법 및 형광 편광 측정 장치를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 생분자와 형광탐침분자 간의 상호작용을 정량적으로 측정하는 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법을 제공함에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 형광 편광 측정 방법을 이용하여 생분자 간의 복합체 형성을 유도 또는 저해하는 화합물을 검색하는 방법, 또는 효소의 활성 또는 농도를 측정하는 방법을 제공함에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 마이크로 채널에서의 형광 편광 측정 장치를 제공함에 있다.
본 발명은 생분자와 형광탐침분자 간의 상호작용을 정량적으로 측정하는 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형광 편광 측정 방법을 이용하여 생분자 간의 복합체 형성을 유도 또는 저해하는 화합물을 검색하는 방법, 또는 효소의 활성 또는 농도를 측정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로 채널을 위한 형광 편광 측정 장치를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법을 제공한다.
상기 방법에서는 형광을 인가하는 편광된 광원을 측정하고자 하는 시료가 흐르는 마이크로 채널에 비추면 형광물질이 여기되어 형광이 발생하고, 이 형광을 조사한 빛과 같은 방향, 조사한 빛과 수직한 방향으로 나누어서 측정한 후 형광 편광을 계산, 측정하여 물질간의 결합 양상을 분석한다. 상기 형광 편광 측정 방법은 생분자와 형광탐침분자 간의, 또한 생분자 간의 상호작용을 정량적으로 측정하는 데 사용될 수 있다.
상기, 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법은
i) 형광탐침분자 및 생분자를 준비하는 단계;
ii) 랩온어칩의 마이크로 채널로 형광탐침분자 및 생분자를 주입하여 복합체를 형성시키는 단계;
iii) 상기 복합체에 편광을 조사하여 형광 편광을 측정하는 단계; 및
iv) 상기 형광 편광을 정량화하여 형광 편광도를 결정하는 단계를 포함한다.
상기 랩온어칩은 반도체 제작 공정에서 사용되는 사진식각(photolithography) 기술을 유리 재질에 적용하여 만든 칩으로 그 규격은 가로 1-10 cm, 세로 1-10 cm이고 마이크로 채널의 규격은 깊이 5-150 ㎛, 폭 10-300 ㎛, 길이 10-100 mm이다. 본 발명에서는 폭이 10-100 ㎛ 사이인 마이크로 채널을 사용하는 것이 바람직하다. 여기서, 유리재질의 칩은 흡착문제가 상대적으로 적기 때문에 연속주입 분석이 가능하여 고감도로 형광 편광을 측정하는데 적합하다.
상기 랩온어칩은 박막의 마이크로 채널을 포함하고 상기 마이크로 채널의 양 끝단과 내부에서 반응물질의 물리, 화학, 생물적인 실험이 이루어져 원하는 결과를 얻도록 설계된다(도 3a 참조).
상기 랩온어칩은 형광탐침분자의 공급 저장소(1); 형광탐침분자와 결합하는 생분자의 공급 저장소(2); 시험물질을 포함하는 웰 플레이트(3); 칩으로의 시료유입을 위한 모세관과 같은 공급장치(4); 형광 편광 감지점(5); 시료를 칩의 주채널로 유입시키기 위한 진공 펌프(6)로 구성될 수 있다. 이 때 두 개의 저장소에서 나오는 채널들은 칩의 중앙에 있는 주채널과 만나게 되며, 주채널의 한쪽 끝부분으로는 모세관을 통하여 시험물질이 주입될 수 있고, 다른 끝부분에는 진공펌프를 이용한 압력차에 의해 반응한 물질들이 모이는 저장소가 존재하게 된다.
세부적으로 본 측정방법을 살펴보면 상기 i) 단계에서는 형광이 부착된 표지분자인 형광탐침분자를 형광탐침분자 공급 저장소(1)에 저장하고, 상기 형광탐침분자와 결합하는 생분자를 생분자 공급 저장소(2)에 저장한다(도 3a 참조). 여기서, 생분자는 일반적으로 형광탐침분자보다 분자량이 크고 단백질, 핵산 등 다양한 종류의 생분자가 사용될 수 있으며, 형광탐침분자는 형광 프로브로 표지된 물질로서 상기 생분자보다 분자량이 작고, 형광프로브로는 테트라메틸로다민(tetramethylrodamine) 등이 사용될 수 있다.
상기 ii) 단계에서는 상기 생분자 및 상기 형광탐침분자를 반응 물질의 저장소에 연결된 진공 펌프(6)를 사용한 압력차에 의해 미세유체제어를 통해 주채널에서 만나도록 한다. 이 때, 유체 이동 속도는 약 1 nl/sec가 바람직하다. 상기 주채널 상에는 형광 편광 감지점(5)이 존재하여 형광 편광을 감지하게 된다. 여기서 생분자와 형광탐침분자의 복합체는 형광 편광 측정 전에 그 형성이 완료된다. 상기 생분자-형광탐침분자 복합체의 형성은 복합체 구성 분자, 완충 용액의 종류와 그 농도에 따라 달라질 수 있고, 또한 산염기도인 pH 값에 따라 안정적인 복합체를 형성하거나 배척하는 것으로 나타난다.
상기 복합체에 편광을 조사하여 형광 편광을 측정하는 iii) 단계에서는 상기 랩온어칩의 상기 마이크로 채널에 있는 형광탐침분자-생분자 복합체에 편광을 조사하여 여기된 형광 편광을 수직, 수평 광배율기를 통과시켜 형광 편광 측정치를 얻는다.
이 때, 형광탐침분자에 이용되는 특정 형광프로브에 대한 광원 및 측정기의 보정값인 G-요소를 구하기 위하여 먼저 편광기를 뺀 상태에서 형광프로브의 묽은 용액을 상기 랩온어칩의 상기 마이크로 채널에 채우고 광을 조사하여 여기된 형광을 수직, 수평 광배율기를 통과시킨 형광세기 값으로부터 G-요소를 구한 후, 편광기를 부착하여 상기 마이크로 채널에 있는 형광탐침분자-생분자 복합체에 편광을 조사하여 여기된 형광을 수직, 수평 광배율기를 통과시킨 수직, 수평 성분의 형광세기를 측정한다.
또한, 랩온어칩의 마이크로 채널상의 미량의 물질에 대한 형광 편광의 측정이 가능하게 하기 위해서는 편광 조사를 위한 광원을 편광기를 통과시키기 전에 특정 주파수 신호만을 분리하여 신호대 잡음비를 개선하는 것이 필요할 수 있다. 이를 위하여 슬롯 회전 디스크(slotted rotating disc)로 이루어진 광학쵸퍼를 이용하여 특정 주파수 신호만을 분리한다.
상기 형광 편광을 정량화하여 형광 편광도를 결정하는 iv) 단계에서는 광배율기(Photo Multiplier Tube, PMT)를 통과하여 광신호가 전류신호로 바뀐 수직, 수평 형광 편광 측정치와 상기 G-요소로부터 결정된 형광 편광도를 오실로스코프에서 전류 신호로 검출하여 형광 편광도를 결정한다.
또한, 본 발명은 상기 형광 편광 측정 방법을 이용한 생분자 간의 복합체 형성을 유도 또는 저해하는 물질의 검색 방법, 또는 효소의 활성 또는 농도를 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 검색 방법은 생분자간의 복합체 형성에 대한 경쟁 반응에 의한 형광 편광도의 감소 정도를 관찰함으로써 생분자간의 복합체 형성을 저해하는 물질을 검색하거나, 생분자간의 복합체 형성을 유도하는 물질의 첨가에 의한 형광 편광도의 증가 정도를 관찰함으로써 생분자 간의 복합체 형성을 유도하는 물질을 검색하는 방법을 의미한다. 또한, 형광함침물질과 결합된 생분자인 기질을 시험물질인 효소와 반응시킨 후 형광 편광도의 변화를 관찰함으로써 효소의 활성 또는 농도를 측정할 수 있다. 상기 효소는 바람직하게는 프로테아제, 보다 바람직하게는 프로테이나제 K, 트립신, 파파인 또는 엘라스타제이며, 이를 분석할 때 생분자인 기질로서 범용 단백질 기질인 카세인이 바람직하다. 카세인을 기질로 사용할 경우, 각각의 프로테아제에 대해 기질을 바꿔 줄 필요가 없으므로 빠르게 프로테아제를 분석할 수 있다.
본 발명의 검색방법은
i) 형광탐침분자 및 생분자를 준비하는 단계;
ii) 랩온어칩의 마이크로 채널로 형광탐침분자 및 생분자를 주입하여 복합체를 형성시키는 단계;
iii) 상기 복합체와 시험물질을 반응시키는 단계;
iv) 상기 시험물질과 반응한 복합체에 편광을 조사하여 형광 편광을 측정하는 단계; 및
v) 상기 형광 편광을 정량화하여 형광 편광도를 결정하는 단계를 포함한다.
상기 랩온어칩은 형광탐침분자의 공급 저장소(1); 형광탐침분자와 결합하는 생분자의 공급 저장소(2); 시험물질을 포함하는 웰 플레이트(3); 칩으로의 시료유입을 위한 모세관과 같은 공급장치(4); 형광 편광 감지점(5); 시료를 칩의 주채널로 유입시키기 위한 진공 펌프(6)를 포함할 수 있다. 이 때 두개의 저장소에서 나오는 채널들은 칩의 중앙에 있는 주채널과 만나고 주채널의 한쪽 끝부분으로는 모세관을 통하여 시험물질이 주입되고, 다른 끝부분에는 진공펌프를 이용한 압력차에 의해 반응한 물질들이 모이는 저장소가 존재하게 된다.
상기 i), ii) 단계는 앞에서 설명한 형광 편광 측정 방법에서와 같고, 상기 iii)에서는 검색 대상 물질을 웰 플레이트(3)에 넣고, 랩온어칩으로 상기 시험물질을 유입하기 위한 모세관과 같은 공급 장치(4)를 이용하여 순차적으로 또는 병렬적으로 검색 대상 물질을 상기 복합체와 반응시킨다.
상기 iii) 단계에서 시험물질은 검색대상물질 또는 효소를 의미할 수 있다.
상기 iv), v)에서는 시험물질에 변화된 상기 복합체의 형광 편광도를 앞에서 설명한 바와 같이 결정하여 시험물질의 복합체에 대한 결합 유도 정도 또는 저해 정도를 결정하거나, 효소의 활성 또는 농도를 측정할 수 있다.
도 3b은 마이크로 채널의 형광 편광 감지점에서의 측정 신호 예상도이다. A는 형광탐침분자만이 주채널에 유입되어 형광 편광도가 작게 나타나는 경우이고, B 는 형광탐침분자와 생분자가 주채널에 유입되어 복합체를 형성하여 형광 편광도가 크게 나타나는 경우이며, C는 경쟁반응에 의해 형광탐침분자를 밀어내고 생분자와 결합하는 저해제가 작용하여 다시 형광 편광도가 작아지는 것을 나타낸 경우이다.
본 발명의 형광 편광 측정 방법, 이를 이용한 검색 방법 및 활성 또는 농도 측정 방법은 측정하고자 하는 두 물질을 랩온어칩의 저장소에 넣고 압력차를 이용하여 마이크로 채널로 유입시킴으로써 즉석에서 결합 여부를 확인할 수 있고, 시험물질에 의한 결합 유도 또는 저해 여부를 역시 즉석에서 확인이 가능하므로 생분자 간의 복합체 형성을 유도 또는 저해하는 물질을 검색하거나 효소의 활성 또는 농도를 측정하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 랩온어칩에 형광체 반응물을 주입하고 편광을 인가하여 생분자와 형광탐침분자 간의 상호작용 및 생분자 간의 상호작용을 정량적으로 측정할 수 있는 마이크로 채널을 위한 형광 편광 측정 장치를 제공한다.
상기 마이크로 채널을 위한 형광 편광 측정 장치는 편광 발생부, 형광 편광 분리부 및 형광 편광 측정부로 구성된다.
상기 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 장치의 세부적인 구성은 다음과 같다(도 2 참조).
우선 편광 발생부는
i) 레이저 광원;
상기 레이저 광원으로부터 방출되는 레이저광을 여과시키는 첫 번째 필터(필터 1);
상기 첫 번째 필터를 통과한 레이저광의 방향을 제어하는 첫 번째 거울(거울 1)과 두 번째 거울(거울 2);
상기 두 번째 거울에서 반사된 레이저광을 편광시키는 편광기;
상기 편광기를 통과한 편광된 레이저광을 분리하는 편광 광선 분리기; 및
분리된 편광을 평행광으로 변환시켜 시료에 인입시키는 렌즈를 포함한다.
형광 편광 분리부는,
ii) i)의 상기 편광 발생부의 편광을 조사받아 형광 여기되어 방출되는 형광의 편광을 모아주는 렌즈;
상기 렌즈를 통과한 형광의 편광 방향을 제어하는 세 번째 거울(거울 3);
상기 세 번째 거울로 반사된 상기 형광의 편광을 여과시키는 두 번째 필터(필터 2); 및
상기 두 번째 필터를 통과한 상기 형광의 편광을 분리하는 편광 광선 분리기를 포함한다.
형광 편광 측정부는
iii) 상기 편광 광선 분리기를 통과한 상기 형광의 편광(여기광)의 정류를 위한 세 번째 필터(필터 3);
상기 세 번째 필터를 통과한 상기 여기광의 수직 또는 수평한 양평면에서 형광 신호를 측정하는 수직 방향 광배율기(Photo Multiplier Tube, PMT1)와 편광기를 포함한 수평 방향 광배율기(Photo Multiplier Tube, PMT2); 및 상기 광배율기를 통과한 형광의 편광도를 측정하는 오실로스코프를 포함한다.
상기 PMT1로는 수직 형광 신호가 들어가고 PMT2로는 수평형광신호가 들어간다. PMT1에는 수직형광신호가 99%이상이 들어가는 데 반하여, PMT2에는 수직형광신호가 10% 섞여 들어가므로, PMT2 앞에 편광기를 설치하여 신호에 섞인 수직 성분을 최소화하고 수평한 형광값을 높일 수 있다.
또한, 필터 1과 거울 1사이에 광선을 주기적으로 온/오프할 수 있는 광학 쵸퍼(slotted rotating disc)를 설치하여 특정 주파수 신호만을 분리하여 신호:잡음 비를 개선함으로써 크기가 작은 마이크로 채널에서 적은 양의 시료를 이용한 형광 신호 검출이 가능하다.
본 발명의 마이크로 채널을 위한 형광 편광 측정 장치는 앞에서 설명한 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법과 결합되어 생분자 간의 복합체 형성을 유도 또는 저해하는 물질을 검색하거나 효소의 활성 또는 농도를 측정하는 데 유용하게 사용될 수 있다
본 발명의 마이크로 채널을 위한 장치는 검색 속도를 한 물질당 20초로 가정하면, 소모되는 형광탐침분자와 생분자의 양은 대략 수십 fmol 정도로 이는 종래의 플라스틱 칩용 형광 편광 측정 방법의 경우에 비해 월등하게 시료 소모량이 적다. 또한, 현재 가장 시료 소모량이 적은 고속 대용량 분석 방법인 384 웰 플레이트(well plate)를 이용할 경우 시료당 4pmol 이상이 소모되는 것을 고려하면, 상당한 경비가 경감된다.
따라서, 본 발명의 형광 편광 측정 방법 및 형광 편광 측정 장치는 신호:잡음 비를 개선하고, 측정의 민감도와 정확도를 높이도록 설계되어 적은 양의 시료를 사용하여 저비용 고효율로 빠른 시간 내에 생분자 간의 상호작용을 해석하고 이를 표적으로 하는 초고속 검색에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<비교예>
상용 형광 분광 분석기(Perkin Elmer)를 사용하여 100 ㎕ 큐벳에 있는 테트라메틸로다민(TMR, tetramethylrodamine)-바이오틴(biotin)과 스트렙타비딘(streptavidin)의 결합의 형광 편광도를 측정하였다.
본 측정에서는 포스페이트-버퍼드-살린(PBS, phosphate-buffered-saline)을 완충 용액으로 사용하여 1.25 μM 테트라메틸로다민(TMR, tetramethylrodamine)-바이오틴(biotin)만 넣은 경우(A), 10 μM 테트라메틸로다민(TMR, tetramethylrodamine)-바이오틴(biotin)과 2.5 μM 스트렙타비딘(streptavidin)을 함께 넣은 경우(B)로 나누어 형광 편광을 측정하였다.
측정한 A의 형광 편광도는 0.086이고 B의 형광 편광도는 0.209이다. 이때 슬릿폭(slit width)은 2.5nm이고 적분 시간(integration time)은 1초였다. 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 물질들이 결합하여 복합체 형성시 높은 형광 편광도의 증가가 관찰되었다(도 4 참조).
그리고, 테트라메틸로다민-바이오틴이 스트렙타비딘과 결합하면 형광세기가 꺼짐(quenching)에 의해 감소하는 경향이 있으므로 복합체가 형성된 시료에서 비슷한 정도의 형광 세기를 얻기 위해 A의 경우보다 B의 경우의 농도를 8배 높도록 하였다. 형광 편광 측정시 칩에서 이용될 시료들의 농도를 고려하여 같은 농도의 형광 물질을 이용하기 위해 슬릿폭(slit with)을 2.5nm로, 적분 시간(integration time)을 1초로 조절하였다.
<실시예1>
본 발명의 광학 쵸퍼가 부착되지 않은 도 2의 형광 편광 측정 장치를 사용하여 100 ㎕ 큐벳에서 바이오틴과 스트렙타비딘의 결합의 형광 편광을 측정하였다.
본 실시예1에서는 생분자-형광탐지분자 복합체를 위해 사용한 각 반응물질로서 1.25 μM 테트라메틸로다민(TMR, tetramethylrodamine)을 넣은 경우(A와 B), 1.25 μM 테트라메틸로다민-바이오틴을 넣은 경우(C와 D), 10 μM 테트라메틸로다민-바이오틴과 2.5 μM 스트렙타비딘을 넣은 경우(E와 F)로 나누어 측정하였다.
우선 형광탐침분자에 사용될 형광프로브인 100 nM 테트라메틸로다민을 상기 100 ㎕ 큐벳에 채우고 편광기를 뺀 상태에서 광을 조사하여 여기된 형광을 수직, 수평 광배율기를 통과시킨 형광세기 값으로 부터 형광탐침분자에 이용되는 특정 형광프로브에 대한 광원 및 측정기의 보정값인 G-요소치를 구한 후, 편광기를 부착하여 상기 마이크로 채널에 있는 형광탐침분자-생분자 복합체에 편광을 조사하여 여기된 형광을 수직, 수평 광배율기를 통과시킨 수직, 수평 성분의 형광세기를 측정하여 이 측정치와 앞서 구한 G-요소치로부터 형광 편광도를 구하였다.
상기 장치는 편광 발생부, 형광 편광 분리부 및 형광 편광 측정부로 구성되었고, 상기 편광 발생부는 543.5nm 레이저광원(5mW maximum at 543.5nm, 상품명:Green Cylindrical Helium-Neon Laser, 제조회사:Coherent), 필터 1(파장 543.5nm, 직경 12.5mm, 상품명:Mounted Interference Filter, 제조회사:Melles Griot), 거울 1, 2(직경 1인치, 두께 3/8인치, 상품명:Enhanced Aluminum Mirror, 제조회사:CVI), 편광기(상품명:Broadband Polarizing Beamsplitter Cubes, 제조회사:CVI), 광선 분리기(상품명:Spectrally Neutral Cube Beamsplitter, 제조회사:CVI) 및 렌즈(도면 2의 렌즈는 거울 1,2와 동일한 거울 3과 포커싱 렌즈(상품명:Precision Optimized Achromats, 제조회사:Melles Griot)로 이루어짐)를 포함하였다. 광학 쵸퍼(rotating disc optical chopper, 상품명:300D4/7, 제조회사:SCITEC Instruments)는 외부 7 슬롯(slots)과 내부 4 슬롯(slots)으로 구성된 것을 이용하였다.
또한, 상기 형광 편광 분리부는 테트라메틸로다민 형광체에 의해 발생되는 형광의 편광을 모아주는 포커싱 렌즈(focusing lens, 직경 10mm, 상품명:Precision Optimized Achromats, 제조회사:Melles Griot), 거울 3(거울 1, 2와 동일), 필터 2(파장 580nm, 직경 50mm, 상품명:Mounted Interference Filter, 제조회사:Melles Griot), 편광 광선 분리기(상품명:Broadband Polarizing Beamsplitter Cube, 제조회사:CVI)를 포함하였다.
그리고, 상기 형광 편광 측정부는 필터 3(파장 580nm, 직경 1인치, 상품명:BK7 A Coated Plano Convex Lens, 제조회사:Thorlab), 여기광에 대해 수직 및 수평한 양평면에서 형광신호를 측정하는 두개의 PMT(Photo Multiplier Tube, 상품명:H5784-01, 제조회사:HAMAMATSU), 오실로스코프(상품명:Agilent 54642A 2Channel 500MHz oscilloscope, 제조회사:Agilent), 수평 PMT 앞에 설치한 편광기를 포함하였다.
이때 광배율기 이득(PMT gain)은 0.6 V이었다.
여기서, 측정된 A의 형광 편광도는 0.007이고, B의 형광 편광도는 0.020이고, C의 형광 편광도는 0.043이고, D의 형광 편광도는 0.036이고, E의 형광 편광도는 0.197이고, F의 형광 편광도는 0.213으로 테트라메틸로다민-바이오틴과 스트렙타비딘의 복합체 형성에 따라 형광 편광도가 증가하였다(도 5 참조).
<실시예2>
본 발명의 광학 쵸퍼가 부착되지 않은 도 2의 형광 편광 측정 장치를 사용하여 랩온어칩내의 바이오틴과 스트렙타비딘의 결합의 형광 편광을 측정하였다. 다만, 본 실시예2에서는 깊이 12 ㎛, 폭 79 ㎛의 마이크로 채널로 구성된 유리 재질 랩온어칩을 100 ㎕ 큐벳대신 사용하였다. 우선 상기 랩온어칩의 마이크로 채널에 진공 펌프를 사용하여 100 nM 테트라메틸로다민 용액을 채우고 실시예1에서 설명한 방법으로 G-요소치를 구한 후, 랩온어칩(도 3a)의 형광탐침분자 저장소(1)에 1.25 μM 테트라메틸로다민(A)을 넣은 경우, 랩온어칩의 형광탐침분자 저장소(1)에 1.25 μM 테트라메틸로다민-바이오틴(B)을 넣은 경우, 랩온어칩의 형광탐침분자 저장소(1)에 10 μM 테트라메틸로다민-바이오틴을 넣고 랩온어칩의 생분자 공급 저장소(2)에 2.5 μM 스트렙타비딘(C, D와 E)을 넣은 경우로 나누어, 랩온어칩의 진공 펌프(6)에서 진공 펌프를 가동하여 마이크로 채널에 시료를 주입시킨 후, 랩온어칩(도 3a)의 형광 편광 감지점(5)에서 형광 편광을 측정하였다.
측정결과 A의 형광 편광도는 0.085이고, B의 형광 편광도는 0.097이고, C의 형광 편광도는 0.036이고, D의 형광 편광도는 0.040이고, E의 형광 편광도는 0.064로 복합체 형성에 따른 형광 편광의 증가가 나타나지 않았다(도 6a 참조).
이러한 측정값에서 완충액만이 흐르는 마이크로 채널상에서 발생하는 옵셋을 제거한 형광값을 이용하여 형광 편광도를 계산하면 A의 형광 편광도는 0.020이고, B의 형광 편광도는 0.087이고, C의 형광 편광도는 0.223이고, D의 형광 편광도는 0.212이고, E의 형광 편광도는 0.241로 큐벳에서 측정한 형광 편광도와 비슷한 수치를 보였다(도 6b). 이러한 측정은 반복 실험을 통해 재현성이 있음을 확인하였다.
옵셋을 제거한 본 실시예2의 측정 결과(도 6b 참조)는 상기 비교예 및 상기 실시예1과 같은 유형을 나타내므로 본 실시예2의 랩온어칩을 사용하는 형광 편광 측정 방법과 그 장치의 적합성을 나타내었다.
<실시예3>
본 발명의 광학 쵸퍼가 부착된 도 2의 형광 편광 측정 장치를 사용하여 랩온어칩에 있는 바이오틴과 스트렙타비딘의 결합의 형광 편광을 측정하였다.
본 실시예3의 깊이 12 ㎛, 폭 79 ㎛의 마이크로 채널로 구성된 유리 재질 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법(도 3a 참조)의 생분자-형광탐지분자 복합체를 사용한 각 반응물질과 그 농도는 다음과 같다.
4 μM 테트라메틸로다민(A)을 넣은 경우, 4 μM 테트라메틸로다민-바이오틴(B)을 넣은 경우 및 4 μM 테트라메틸로다민-바이오틴과 1 μM 스트렙타비딘(C)을 넣은 경우로 나누어 상기 실시예2에서 설명한 방법으로 측정하였다.
상기 반응물을 깊이 12 ㎛, 폭 79 ㎛인 유리 재질 랩온어칩의 마이크로 채널상에서 생분자와 형광탐침분자의 복합체를 광학 쵸퍼를 부착시킨 도 2의 측정 장치를 이용한 형광 편광을 측정하였다.
여기서, A의 형광 편광도는 0.047이고, B의 형광 편광도는 0.062이고, C의 형광 편광도는 0.240으로, 복합체 형성에 따른 형광 편광도의 증가를 관찰할 수 있었다(도 7a 참조).
즉 옵셋 신호를 제거하여 신호대 잡음비를 개선하는 광학 쵸퍼를 사용하면 복합체 형성에 따른 형광 편광도의 증가를 관찰할 수 있었다.
또한, 랩온어칩(도 3a)의 웰 플레이트(3)에 경쟁 반응을 일으키는 저해제 디-바이오틴(D-biotin)을 넣고 랩온어칩(도 3a)의 시료 공급 모세관(4)을 통해서 마이크로 채널의 복합체 C에 넣어주면 디-바이오틴(D-biotin)의 농도가 클수록 저해 반응이 커져 형광 편광도가 감소하는 것을 알 수 있었다(도 7b).
옵셋을 제거하지 않도록 광학쵸퍼를 설치한 본 실시예3의 측정 결과(도 7a 참조)는 상기 비교예, 상기 실시예1 및 상기 실시예2과 같은 유형을 나타내므로 상기 실시예3의 랩온어칩을 사용하는 형광 편광 측정 방법과 그 장치의 적합성을 나타낸다. 그리고, 본 실시예의 측정 결과(도 7b 참조)는 저해제에 의해서 복합체의 형성이 방해되는 경우에 본 발명의 형광 편광 측정 방법과 그 장치에 의해서 형광 편광도의 감소를 감지하여 저해물질을 검색하는 것이 가능함을 보여주었다.
<실시예4>
본 발명의 형광 편광 측정 방법 및 장치를 이용하여, 형광탐침분자로서 테트라메틸로다민과 생분자로서 범용 단백질 기질인 α-카세인의 복합체(TMR-alpha-casein)를 기질로 하여 여러 가지 프로테아제(protease)와의 반응시킨 후에 형광 편광의 변화를 측정하였다.
먼저 프로테아제의 기질인 TMR-α-카세인은 기존에 보고된 방법 [Analytical Biochemistry (1996) 243, 1-7]을 응용하여 아래의 방법으로 합성하였다.
α-카세인 (시그마) 10 ㎎/㎖, 5-카복시데트라메틸로다민 숙신이미딜 에스테르((5-carboxytetramethylrhodamine succinimidyl ester) 5 ㎎/㎖을 0.1 M 소듐 바이카보네이트(sodium bicarbonate), pH 9.0의 완충액에 섞어서 상온에서 2시간 반응시켰다. 합성된 TMR-α-카세인은 하이트랩 디설팅 컬럼(HiTrap desalting column; Sephadex G-25, Amersham Bioscience)를 이용하여 정제하여 단백질 양과 형광량을 정량하여 사용하였다.
프로테아제로서 프로테이나제 K(proteinase K), 트립신(trypsin), 파파인(papain) 및 엘라스타제(elastase)를 사용했으며, 농도를 증가시키면서 반응시켰다. 우선, 비교예로서 합성된 TMR-α-카세인 기질이 프로테아제에 의해 분해되는 양상을 상용 형광 분광 분석기(Perkin Elmer)를 사용하여 분석하였다. 프로테이나제 K는 0.001, 0.01, 0.1 unit/㎖에서, 트립신은 0.1, 0.8, 4.0 unit/㎖에서, 파파인은 0.1, 0.8, 4.0 unit/㎖에서 엘라스타제는 0.8, 4.0, 8.0 unit/㎖에서 측정하였으며, 결과는 도 9 (a) ~ 9 (d)에 나타내었다.
다음으로, 본 발명의 광학 쵸퍼가 부착된 도 2의 형광 편광 측정 장치, 및 도 8과 같이 깊이 12 ㎛, 폭 79 ㎛의 마이크로 채널이 기질 또는 효소가 유입되는 채널 1 및 이들의 반응이 일어나는 채널 2를 구성하는 유리 재질 랩온어칩을 사용하여 분석하였다.
랩온어칩에서 프로테아제 분석을 수행하기 전에 반응이 잘 일어나게 하기 위해서는 기질과 효소가 혼합되어야 한다. 이에, TMR-α-카세인이 칩의 유체 흐름에 직각인 방향으로 확산되는 시간을 측정한 결과, 7.4초 안에 완전히 혼합되는 것을 확인하였다. 또한, 랩온어칩에서의 분석을 위해 이용한 진공 압력은 -20 kPa이고, 이러한 조건에서 반응이 일어나는 채널의 접합점(junction)에서 형광 편광 감지점 까지 유체가 도달하는 시간은 12.5초로 측정되었다. 따라서 기질과 효소가 혼합된 후, 5.1초의 반응 시간이 있는 것을 확인하였다.
다음으로 랩온어칩에서 프로테아제 분석을 수행하기 위하여, TMR-α-카세인 2μM (반응이 일어나는 채널에서의 최종 농도는 1μM)를 기질 저장소에 넣고, 각각의 프로테아제는 비교예에서와 같이 농도를 증가시키면서 효소 저장소에 넣은 후, 주 채널인 C2로 두 물질을 유입시켜 일어나는 반응을 감지점(detection point)에서 형광 편광을 측정하였다. 이 때 형광 편광의 감지점은 기질과 효소가 유입되는 부분(junction)에서 32 ㎜에 위치하게 하였다. 결과는 도 10 (a) ~ 10 (b)에 나타내었다.
도 9 에 나타난 바와 같이, (a) 프로테이나제 K, (b) 트립신, (c) 파파인, (d) 엘라스타제의 모든 경우에서 반응이 진행됨에 따라 형광 편광이 감소하는 것으로 나타났으며, 효소의 농도가 증가함에 따라 형광 편광이 비례하여 감소하다가 일정 효소 농도 이상에서 일정해지는 경향을 나타내었다. 이는 반응이 진행됨에 따라 TMR-α-카세인이 분해되어 크기가 작아져 형광 편광이 감소하고, 효소의 농도가 증가함에 따라 일정 시간의 반응량이 커지므로 형광 편광이 낮게 나타나는 것으로 판단되었다.
또한, 도 10에 나타난 바와 같이, 도 9에서와 마찬가지로 (a) 프로테이나제 K, (b) 트립신, (c) 파파인, (d) 엘라스타제의 모든 경우에서 프로테아제의 농도가 증가함에 따라 형광 편광이 비례하여 감소하다가 일정 효소 농도 이상에서 일정해지는 경향을 나타내었다.
또한, 상기 4가지 프로테아제의 기질로서 범용 단백질 기질인 카세인을 사용함으로써, 각각의 프로테아제에 대해서 기질을 바꾸지 않고 빠르게 분석할 수 있었다.
본 발명의 형광 편광 측정 장치 및 방법은 신호:잡음 비를 개선하여 측정의 민감도 및 정확도를 높이고 랩온어칩을 이용하여 자동화된 분석이 가능하도록 하므로, 기존의 방법에 비하여 적은 양의 시료를 사용하여 경제적이고 신속하게 생분자 물질간의 상호작용을 분석하고 이에 대한 경쟁반응을 이용한 유도제 또는 저해제를 검색하거나 효소의 활성 또는 농도를 측정하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 효소 중 프로테아제를 분석하는 데 있어서 범용 단백질 기질인 카세인을 사용함으로써 프로테아제의 분석을 빠르게 진행할 수 있다.
Claims (20)
- i) 형광탐침분자 및 생분자를 준비하는 단계;ii) 랩온어칩의 마이크로 채널로 형광탐침분자 및 생분자를 주입하여 복합체를 형성시키는 단계;ⅲ) 신호:잡음 비를 개선시키도록 광학 쵸퍼를 사용하는 것을 특징으로 하여 레이저 광원으로부터 편광을 발생시키는 단계;ⅳ) 상기 ⅱ) 단계에서 형성된 복합체에 상기 ⅲ) 단계에서 발생된 편광을 조사하여 형광 편광을 측정할 때, 편광기를 뺀 상태에서 수직, 수평 광배율기에서 IVV와 IVH를 측정하여 특정 형광프로브에 대한 광원 및 측정기의 보정값인 G-요소치(=IVV/IVH)를 구한 후, 편광기를 부착하여 상기 랩온어칩의 마이크로 채널 내의 형광탐침분자-생분자 복합체에 편광을 조사하여 여기된 형광 편광을 수직, 수평 광배율기를 통과시켜 측정치를 얻는 단계; 및v) 상기 G-요소치와 상기 측정치로부터 형광 편광을 정량화하여 형광 편광도를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 랩온어칩은 폭이 10-100 ㎛인 마이크로 채널을 포함하고 유리 재질을 사용하여 사진식각방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 ii) 단계에서는 상기 생분자 및 상기 형광탐침분자를 반응 물질의 저장소(1, 2)에 연결된 진공 펌프(6)를 사용한 압력차에 의해 미세유체제어를 통해 주채널에서 만나도록 하는 것을 특징으로 하는 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법은 생분자 간의 복합체 형성의 정도의 정량적 측정에 이용되는 것을 특징으로 하는 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법.
- i) 형광탐침분자 및 생분자를 준비하는 단계;ⅱ) 랩온어칩의 마이크로 채널로 형광탐침분자 및 생분자를 주입하여 복합체를 형성시키는 단계;ⅲ) 상기 복합체와 시험물질을 반응시키는 단계;ⅳ) 신호:잡음 비를 개선시키도록 광학 쵸퍼를 사용하는 것을 특징으로 하여 레이저 광원으로부터 편광을 발생시키는 단계;ⅴ) 상기 ⅲ) 단계에서 반응된 복합체와 시험물질에 상기 ⅳ) 단계에서 발생된 편광을 조사하여 형광 편광을 측정할 때, 편광기를 뺀 상태에서 수직, 수평 광배율기에서 IVV와 IVH를 측정하여 특정 형광프로브에 대한 광원 및 측정기의 보정값인 G-요소치(=IVV/IVH)를 구한 후, 편광기를 부착하여 상기 랩온어칩의 마이크로 채널 내의 형광탐침분자-생분자 복합체에 편광을 조사하여 여기된 형광 편광을 수직, 수평 광배율기를 통과시켜 측정치를 얻는 단계; 및ⅵ) 상기 G-요소치와 상기 측정치로부터 형광 편광을 정량화하여 형광 편광도를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 랩온어칩은 폭이 10-100 ㎛인 마이크로 채널을 포함하고, 형광탐침분자의 공급 저장소(1); 형광탐침분자와 결합하는 생분자의 저장소(2); 시험물질을 포함하는 웰플레이트(3); 칩으로의 시료유입을 위한 모세관과 같은 공급장치(4); 형광 편광 감지점(5); 시료를 주채널로 유입시키기 위한 진공 펌프(6)를 포함하고, 유리 재질을 사용하여 사진식각방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법에서 시험물질로 검색대상물질을 사용하여 생분자 간의 복합체 형성체 형성을 유도 또는 저해하는 물질의 검색에 사용되는 것을 특징으로 하는 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법에서 시험물질로 효소를 사용하고, 생분자로 효소에 대응되는 기질을 사용하여 효소의 활성 또는 농도 측정에 사용되는 것을 특징으로 하는 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 효소가 프로테아제이고, 기질이 카세인인 것을 특징으로 하는 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법.
- ⅰ) 레이저 광원;상기 레이저 광원으로부터 방출되는 레이저광을 여과시키는 첫 번째 필터;상기 첫 번째 필터를 통과한 레이저광의 방향을 제어하는 첫 번째 거울과 두 번째 거울;상기 두 번째 거울에서 반사된 레이저광을 편광시키는 편광기;상기 편광기를 통과한 편광된 레이저광을 분리하는 편광 광선 분리기; 및분리된 편광을 평행광으로 변환시켜 시료에 인입시키는 렌즈를 포함하는 레이저 광원으로부터 편광을 발생시키는 편광 발생부;ⅱ) 편광 발생부의 편광을 조사받아 형광 여기되어 방출되는 형광과 편광을 분리시키는 형광 편광 분리부; 및ⅲ) 형광 편광 분리부를 통과한 형광 편광의 편광도를 측정하는 형광 편광 측정부를 포함하는 랩온어칩의 마이크로 채널 안에서 흐르는 물질의 형광 편광을 측정하는 장치.
- 삭제
- 제 12항에 있어서, 상기 레이저 광을 온/오프하여 신호:잡음 비를 개선시키도록 상기 첫 번째 필터와 상기 첫 번째 거울 사이에 광학 쵸퍼가 개재되는 것을 특징으로 하는 랩온어칩의 마이크로 채널 안에서 흐르는 물질의 형광 편광을 측정하는 장치.
- 제 12항에 있어서, 상기 형광 편광 분리부는상기 편광 발생부의 편광을 조사받아 형광 여기되어 방출되는 형광의 편광을 모아주는 렌즈;상기 렌즈를 통과한 형광의 편광 방향을 제어하는 세 번째 거울;상기 세 번째 거울로 반사된 상기 형광의 편광을 여과시키는 두 번째 필터; 및상기 두 번째 필터를 통과한 상기 형광의 편광을 분리하도록 편광 광선 분리기를 포함하는 것을 특징으로 하는 랩온어칩의 마이크로 채널 안에서 흐르는 물질의 형광 편광을 측정하는 장치.
- 제 12항에 있어서, 상기 형광 편광 측정부는상기 편광 광선 분리기를 통과한 상기 형광의 편광(여기광)의 정류를 위한 세 번째 필터;상기 세 번째 필터를 통과한 상기 여기광의 수직 또는 수평한 양평면에서 형광 신호를 측정하는 수직 방향 광배율기(PMT1)와 편광기를 포함한 수평 방향 광배율기(PMT2); 및상기 수직 방향 광배율기 및 수평 방향 광배율기를 통과한 형광의 편광도를 측정하는 오실로스코프로를 포함하는 것을 특징으로 하는 랩온어칩의 마이크로 채널 안에서 흐르는 물질의 형광 편광을 측정하는 장치.
- 제 12항에 있어서,상기 마이크로 채널은 폭이 10-100 ㎛인 것을 특징으로 하는 랩온어칩의 마이크로 채널 안에서 흐르는 물질의 형광 편광을 측정하는 장치.
- 제 17항에 있어서, 상기 마이크로 채널은 랩온어칩에 포함된 마이크로채널이고, 상기 랩온어칩은 형광탐침분자의 공급 저장소(1); 형광탐침분자와 결합하는 생분자의 저장소(2); 시험물질을 포함하는 웰플레이트(3); 칩으로의 시료유입을 위한 모세관과 같은 공급장치(4); 형광 편광 감지점(5); 시료를 칩의 주채널로 유입시키기 위한 진공 펌프(6)를 포함하는 것을 특징으로 하는 랩온어칩의 마이크로 채널 안에서 흐르는 물질의 형광 편광을 측정하는 장치.
- 제7항에 있어서, 상기 랩온어칩에서의 형광 편광 측정방법에서 상기 ⅲ) 단계의 시험물질로 검색대상물질을 사용하고, 상기 ⅵ) 단계의 형광 편광도를 결정하는 단계는 제 12항 및 제14항 내지 제18항 중 어느 하나의 항의 형광 편광을 측정하는 장치를 이용하는 것을 특징으로 하는 복합체 형성을 유도 또는 저해하는 물질의 검색에 사용되는 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 랩온어칩에서의 형광 편광 측정방법에서 상기 ⅲ) 단계의 시험물질로 효소를 사용하고, 상기 ⅵ) 단계의 형광 편광도를 결정하는 단계는 제 12항 및 제14항 내지 제18항 중 어느 하나의 항의 형광 편광을 측정하는 장치를 이용하는 것을 특징으로 하는 효소의 활성 또는 농도의 측정에 사용되는 랩온어칩에서의 형광 편광 측정 방법.
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|---|---|---|---|---|
| KR100902093B1 (ko) * | 2007-05-23 | 2009-06-09 | 인하대학교 산학협력단 | 미세채널 내에서 가시광선의 투과도 측정을 이용한 액체의Ｄｒｏｐｌｅｔ／Ｐｌｕｇ 및 미세입자 크기와 개수측정장치 및 측정방법 |
| KR100912626B1 (ko) * | 2007-10-16 | 2009-08-24 | 충청북도 | 현장진단용 멀티챔버 형광 측정용 광학 장치 및 이를이용한 멀티챔버 형광 측정 방법 |
| KR101022769B1 (ko) | 2008-10-20 | 2011-03-17 | 삼성전자주식회사 | 바이오칩용 광검출 장치 |
| KR101356279B1 (ko) * | 2011-04-21 | 2014-01-28 | 충북대학교 산학협력단 | 생체분자 상호작용 검출 시스템 및 이를 이용한 검출 방법 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20000068915A (ko) * | 1997-09-05 | 2000-11-25 | 마쓰시다 일렉트릭 인더스트리얼 컴패니 리미티드 | 형광 편광법 |
| KR20030008340A (ko) * | 2001-07-20 | 2003-01-25 | 학교법인 포항공과대학교 | 아민 화합물 분석용 랩온어칩 |
-
2005
- 2005-11-23 KR KR1020050112165A patent/KR100822810B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20000068915A (ko) * | 1997-09-05 | 2000-11-25 | 마쓰시다 일렉트릭 인더스트리얼 컴패니 리미티드 | 형광 편광법 |
| KR20030008340A (ko) * | 2001-07-20 | 2003-01-25 | 학교법인 포항공과대학교 | 아민 화합물 분석용 랩온어칩 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| J. Royal Society of Chemistry 128, pp.313-316 (2003.12.31.)* |
| 공개특허 2000-0068915(2000.11.25.)* |
| 공개특허 2003-0008340(2003.01.25.)* |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101037790B1 (ko) | 2010-04-23 | 2011-05-27 | 나노바이오시스 주식회사 | 듀얼 광원을 포함하는 형광 편광 분석 장치 |
| WO2014059281A1 (en) * | 2012-10-11 | 2014-04-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Fluorescence polarization assay for detecting high molecular weight molecules in biological fluids |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20060058638A (ko) | 2006-05-30 |
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