CN103038640A - 通过多路复用fret分析和试剂盒检测样品中分析物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过多路复用FRET(福斯特共振能量转移)分析来检测样品中的分析物的方法，所述方法包括下列步骤：提供样品，该样品含有能量转移供体、若干在光谱学上不同的量子点物质、以及分析物，其中将分析物配置成在由能量转移供体和第一量子点物质所提供的第一能量转移供体-受体对内介导能量转移，将能量转移供体配置成在第一能量转移供体-受体对中用作能量转移供体，并将第一量子点物质配置成在第一能量转移供体-受体对中用作能量转移受体，用来自激发光源的激发光照射样品，在第一能量转移供体-受体对中，将来自通过激发光激发的能量转移供体的激发能量转移至第一量子点物质，所述能量转移通过分析物来介导，并检测第一量子点物质在接收到激发能量后发出的发射光。

Description

通过多路复用FRET分析和试剂盒检测样品中分析物的方法
技术领域
本发明涉及通过多路复用(multiplexing)FRET(福斯特共振能量转移)分析来检测样品中分析物的方法，以及用于在多路复用FRET分析中检测一种或多种分析物的试剂盒。
背景技术
FRET(福斯特共振能量转移)理论定义了依赖于1/r6距离的、从激发供体(D)至受体分子(A)的非辐射性能量转移。易获得的光谱学数据与理论方程式之间的关联是Theodor
Figure BPA00001407217800011
的成就，因此使FRET在各种各样的自然科学中的许多应用成为可能。FRET理论的细节是公知的。
对于成功的FRET应用来说，光谱学性质的根本因素是所谓
Figure BPA00001407217800012
半径R0，即在能量转移是50％有效的情况下D和A之间的距离。R0可以通过供体发光和受体吸收的光谱数据来计算，所述二者都相对易于测量。它主要取决于供体的发光光谱和受体的吸收光谱的重叠，以及供体的发光量子产率(被发射光子和被吸收光子的比率)。R0越大则FRET越有效(在固定的距离下)或D-A距离越大(在固定的FRET效率下)。
FRET已在1至10nm的等级内用于生物化学应用(K.E.Sapsford等，Angew.Chem.Int.编辑，45，4562，2006)(例如蛋白-蛋白结合、蛋白质折叠、在细胞膜处和细胞膜内的分子间相互作用、DNA杂交和测序、抗原和抗体的免疫反应)。这种FRET测量的结果是在约1至20nm之间的距离或具体物质的浓度。由于FRET可以在含有无数D和A的溶液中通过时间分辨发光技术来分析，因此纳米级方法可变得易于应用于宏观世界中。而且，共焦显微镜技术可以在单分子水平上分析FRET，以便测量参数分布而不是整体平均化。
迄今为止，用于通常使用的D-A对的R0值很少大于6nm(在273个FRET对中仅有4对的R0在6至7nm之间)(B.W.Van der Meer等《共振能量转移：理论和数据》(Resoncance Energy Transfer：Theory and Data)，Wiley-VCH，纽约)。在生物化学FRET应用中，将作为供体的镧系元素复合物(LC)与作为受体的量子点组合，可以发现大于10nm的
Figure BPA00001407217800021
半径。因此打破10nm的通常限制是可能的。对于LC来说FRET相对好理解(P.R.Selvin，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.，31，275，2002)，但是缺乏对于基于QD的FRET(尤其是将QD用作A)的深入理解。
量子点(QD)是具有独特的光学和光物理性质的、被充分地表征和确立的纳米粒子(尤其是CdSe/ZnS核/壳点)。QD由经常以由较大的能带隙半导体(bandgap semiconductor)组成的钝化壳包覆的纳米尺寸的半导体材料核、以及用于水溶性和生物相容性的外部包衣壳构成。根据半导体材料和纳米晶体的尺寸这二者，(I.L.Medintz等，Nat.Mater.，4，435，2005)吸收和发射性质在几乎所有的谱域中都可从UV转变成接近红外线的。QD显示了极大的一个或两个光子吸收截面、在激发和发射之间大的光谱分离的可能性、以及窄的发射带。QD也可商购(例如Invitrogen、Evident Technologies)。
QD经常显示出卓越的发光量子产率，且远比有机染料能够抵抗光致漂白(X.Y.Wu，Nat.Biotechnol.2003，21，41)。另外，许多D和A都能够附着在单个QD大的表面上，因此允许具有增加的总效率的多分子FRET。
已显示了在与作为D的普通的有机荧光团组合时，QD几乎不能是有效的A，这可能是由于这些荧光团短暂的激发态(纳秒)所致(A.R.Clapp等，J.Am.Chem.Soc.，1271242，2005)。与这些结果相反，在最近的出版物中，Zhao等声称已获得了从FITC(FITC＝异硫氰酸荧光素)至CdSe/ZnS核/壳QD的FRET(J.H.Wang等，Colloids Surf.A，302，168，2007)。遗憾的是，几乎没有什么光谱学数据(仅有稳态光谱)来证实这一FRET，所以这是否是真实FRET还很有疑问。其它文献将QD论述为D和A这二者，例如Y.B.Li等，《发光》(Luminescence)，22，60，2007。然而，短暂激发态的缺点可以通过使用作为D的LC来克服，所述LC通常具有非常长久的发光(长达毫秒)。除了论述生物发光共振能量转移(BRET)的出版物之外，还发现了能量转移至QD的有效可能性牵涉作为D的LC：(a)L.J.Charbonnière等，J.Am.Chem.Soc.，128，12800，b)2006，N.Hildebrandt等，Angew.Chem.Int.编辑，44，7612，2005，c)N.Hildebrandt等，J.Biomed.Biotechnol.，文章ID 79169，6页，2007，d)H.
Figure BPA00001407217800031
等，Anal Chim.Acta，604，177，2008；e)N.Hildebrandt，Dissertation Thesis，波茨坦大学(波茨坦)，2006；f)N.Hildebrant等，Curr.Chem.Biol.，1，167，2007.)。
迄今为止还没有获得通过对来自和到达QD(用作D和A)的能量转移的详细研究而对FRET过程的深刻理解。这表示尚不清楚是否从LC至QD的能量转移是真正的
Figure BPA00001407217800032
类型能量转移。另一种不确定性涉及尺寸和稳定性。在QD周围的大保护壳产生了良好的稳定性但是导致D和A之间的间距大(FRET变得不太有效)。消除保护壳可产生小的D-A距离但是导致稳定性较低。而且，保护壳对发光量子产率有影响，这当在FRET系统内从一个QC更换至另一个时会导致另外的不确定性。
而且FRET已被用作多路复用分析。多路复用这个词描述了在一份和相同的样品内对于几种参数的测量，例如在病人的一份血液/血清/血浆样品内同时检测若干肿瘤标记物。迄今为止，使用QD的光学多路复用FRET测量仅在使用QD作为FRET供体时实现过。在最近的研究(A.R.Clapp等，J.Am.Chem.Soc.2005，127，18212)中设计了一系列实验以在多路复用FRET系统的帧内分析QD的使用。通过使用与两个能量受体(发荧光Cy3和非荧光QSY-7)联合的单个QD供体以及一组与Cy3或QSY-7联合的最多四个的QD供体(分别在510、555、570、以及590nm处发射)，他们精密地量化和分析了所述多路复用系统。
还证实了分别在605nm和655nm处发射的两个不同的QD可以在相同的生物分析类型内与相同的LC供体一起使用，所述生物分析类型是生物素(附着在QD的表面上)与链霉亲和素(streptavidin)(使用LC标记)的结合。在不同的样品中实现了这些结果。它提供了在生物分析内可以将两种不同的QD用作FRET受体的证明。
发明内容
本发明的目的是通过多路复用FRET(福斯特共振能量转移)分析来检测样品中的分析物的改进的方法，以及用于在多路复用FRET分析中对一种或多种分析物进行光学检测的试剂盒。
根据本发明，提供了通过如在权利要求1中定义的多路复用FRET分析以及如在权利要求13中定义的试剂盒来对样品中的分析物进行光学检测的方法。在从属的权利要求书中提供了本发明的有利的改进。
根据本发明的一个方面，提供了通过多路复用FRET(福斯特共振能量转移)分析来检测样品中的分析物的方法，所述方法包括下列步骤：
-提供样品，该样品含有能量转移供体、若干在光谱学上不同的量子点物质(species)以及分析物，其中：
-将分析物配置成在由能量转移供体和第一量子点物质(specie)所提供的第一能量转移供体-受体对内介导能量转移，
-将能量转移供体配置成在第一能量转移供体-受体对中用作能量转移供体，和
-将第一量子点物质配置成在第一能量转移供体-受体对中用作能量转移受体，
-用来自激发光源的激发光照射样品，
-在第一能量转移供体-受体对中，将来自通过激发光激发的能量转移供体的激发能量转移至第一量子点物质，所述能量转移通过分析物来介导，和
-检测第一量子点物质在接收到激发能量后发出的发射光。
根据本发明的另一个方面，提供了用于在多路复用FRET分析中检测一种或多种分析物的试剂盒，尤其用于根据前面的权利要求中至少一项的方法中，所述试剂盒包含若干在光谱学上不同的量子点物质和至少一种能量转移供体，其中将所述若干在光谱学上不同的量子点物质和所述至少一种能量转移供体配置成在包含一种或多种分析物的样品中提供一个或多个能量转移供体-受体对，而且其中当所述至少一种能量供体光激发时，能量转移通过在一个或多个能量转移供体-受体对中的一种或多种分析物来介导。
发射光的检测可以通过稳态测量和时间分辨测量中的至少一种来进行。
本发明提供了在一份或相同的样品(多路复用的)中使用一个以上的量子点(QD)作为能量转移(ET)受体来用于分析物的检测，尤其是用于生物学和生物化学的应用。在一份样品内测量不同的分析物具有特殊的利益，这是由于经济上的原因如较短的时间、较小的空间、较少的样品制备物、较小的样品成分容量，这些都将节省时间和金钱。重量的领域如即时现场(point-of-care)和高通量筛选都能显著地获益于本发明。
在一个实施方案中，将具有长发光寿命的镧系元素复合物(LC)用作ET供体。其它的分子或粒子也可能成为ET供体。在一份样品内同时提供了几个不同的QD，例如最多五个或以上不同的QD。
本发明可以在光谱学和显微镜检查中用于各种各样的测量，优选在约1nm至20nm的能量转移距离发挥作用的情况下。定量测量可以是例如其中供体和受体被标记了不同的抗体、适体、抗原、或蛋白质的免疫分析，并且必须要测量标记蛋白如肿瘤标记物的浓度(定量信号)。定性测量可以是例如在蛋白质折叠内、基于RNA或DNA的复合物内、或例如细胞中信号转导的研究的细胞基测量内的距离测量。这种在1nm至20nm范围内的ET距离测量有时被称作“光谱学标尺”。
在一个实施方案中，其中所述方法还包括下列步骤：
-提供样品，该样品含有与所述分析物不同的附加分析物，其中：
-将附加分析物配置成在由能量转移供体和与所述第一量子点物质不同的第二量子点物质所提供的第二能量转移供体-受体对内介导能量转移，
-将能量转移供体配置成在第二能量转移供体-受体对中用作能量转移供体，和
-将第二量子点物质配置成在第二能量转移供体-受体对中用作能量转移受体，
-在第二能量转移供体-受体对中，将来自通过激发光激发的能量转移供体的激发能量转移至第二量子点物质，其中能量转移通过附加分析物来介导，和
-检测第二量子点物质在接收到激发能量后发出的发射光，第二量子点物质发出的发射光与第一个量子点物质发出的发射光在光谱学上不同。
在又一个实施方案中，所述方法还包括下列步骤：
-提供样品，该样品含有与所述能量转移供体不同的另外的能量转移供体，其中：
-将分析物配置成在由另外的能量转移供体和第一、第二以及第三量子点物质之一所提供的另外的能量转移供体-受体对内介导能量转移，
-将另外的能量转移供体配置成在另外的能量转移供体-受体对中用作能量转移供体，和
-将第一、第二或第三量子点物质配置成在另外的能量转移供体-受体对中用作能量转移受体，
-在另外的能量转移供体-受体对中，将来自通过激发光激发的另外的能量转移供体的激发能量转移至第一、第二以及第三量子点物质之一，其中能量转移通过分析物来介导，和
-检测第一、第二以及第三量子点物质之一在接收到激发能量后发出的发射光，所述发射光与在第一能量转移供体-受体对中的第一量子点物质发出的发射光以及在第二能量转移供体-受体对中的第二量子点物质发出的发射光在光谱学上不同。
所述第三量子点物质与第一和第二量子点物质不同。
在另外的实施方案中，所述方法还包括同时检测由在第一能量转移供体-受体对中的第一量子点物质发出的发射光、由在第二能量转移供体-受体对中的第二量子点物质发出的发射光、以及由在所述另外的能量转移供体-受体对中的第一、第二以及第三量子点物质之一发出的发射光中的至少两种的步骤。
在又一个实施方案中，所述方法还包括提供具有至少三种不同的分析物的样品的步骤，每种分析物都被配置成在样品中的能量转移供体-受体对中选择性地介导能量转移。
在另一个实施方案中，所述方法还包括从所检测的发射光中获得结构信息的步骤。
在又一个实施方案中，获得结构信息的步骤包括在第一能量转移供体-受体对、第二能量转移供体-受体对以及所述另外的能量转移供体-受体对至少之一中测定用于激发能量转移的能量转移供体-受体距离的步骤。
在又一个实施方案中，测定用于激发能量转移的能量转移供体-受体距离的步骤包括测定在约1nm至约20nm之间的能量转移供体-受体距离的步骤。
在又一个实施方案中，测定用于激发能量转移的能量转移供体-受体距离的步骤包括在选自下列结构组的结构中测定能量转移供体-受体距离的步骤：化学结构，生化结构，和生物学结构如DNA或RNA结构、蛋白质折叠结构或细胞结构。
在又一个实施方案中，所述方法还包括从所检测的发射光中获得浓度信息的步骤。
在另又一个实施方案中，所述方法还包括提供作为被标记样品的样品的步骤，其中将若干在光谱学上不同的量子点物质用选自下列标记物质组的不同的标记物质来标记：化学结构和生物分子如抗体、适体、抗原、蛋白质、激素、DNA、RNA、细胞或病毒。
在又一个实施方案中，所述方法还包括检测由能量转移供体和另外的能量转移供体中至少之一发出的发射光的步骤。对发射光的检测可以通过稳态测量和时间分辨测量中的至少一种来进行。能量转移供体发射的分析可以用于，例如获得进一步的浓度和/或结构信息或对通过能量转移受体发射分析所发现的信息进行证实。能量转移供体发射的分析还可用于校正样品中的波动效应如样品成分或样品中干扰性化合物的浓度波动、或激发和检测设置如光强度波动、干扰性背景发射，这可能会产生更高的灵敏度、更低的检测限制、以及更好的精确度和重复性。
本发明优选实施方案的描述
下面将通过实施例，并参照不同的实施方案来对本发明进行更为详细的描述。在附图中：
图1显示了使用量子点(QD)作为受体的多路复用能量转移(ET)生物分析的原理的示意图，
图2显示了若干抗体或适体(1-X a/b-特异于标记蛋白1-X)使用一个供体(D)和用于彩色多路复用的若干受体(A1-AX)来标记的均相免疫分析原理的示意图，
图3显示了光谱学标尺测量，其中供体(D)和受体(A)之间的距离具有重要性，
图4显示了链霉亲和素与量子点的结合的示意图，
图5显示了Tb镧系元素复合物(LC)和五个QD的发射光谱，
图6显示了当用作受体以及Tb复合物作为受体时，不同的QD的光谱学数据，和
图7A至7E显示了在QD的不同发射波长下测量的五个QD的强度比率(在100-1200μs的时间窗内QD供体的强度除以Tb受体的强度)的示意图。
图1图示了使用量子点(QD)作为受体的多路复用能量转移(ET)生物分析的原理。所述原理显示了QD数量n＝3(三路复用)的多路复用实施例，这代表了几个不同的QD(n＞1)。在顶端的图中，3个不同的QD(不同的发射波长)使用不同的生物分子(生物分子的数量m≥1，这里为4)B、E、以及G(例如抗体、蛋白质、RNA、DNA等)来标记。这些生物分子可以与其它分子(这里为X、Y、以及Z)结合，所述其它分子的数量可以是p≥0(对于p＝0来说，B将直接与C、E将直接与F、以及G将直接与H结合；对于p≥1来说，X、Y、以及Z将由不同分子的复合物组成)。
将配对的生物分子(这里为C、F、以及H)与发光的ET供体(D)如镧系元素复合物(LC)结合。这些供体可以是相同的(例如D总是相同的LC)或是不同的种类(例如不同的LC)。一旦将不同的分子复合物(在顶端图中的左侧、中间、以及右侧)在一份样品中混合在一起，那么它们就可以如在中间图中所示的那样彼此结合。这一结合导致了供体如LC与受体(QD)在约1nm至约20nm的范围内的靠近，且ET(黑色的弯箭头)在供体的激发后变得可能(底部的图)。这一ET导致了QD的激发，然后是不同QD的具有不同波长的发射。
供体和受体发射的时间分辨测量产生了由ET引起的发射或通过直接激发的发射之间有差异。每个时间依赖性ET发射信号(具有不同颜色)都是由供体与受体之间的特异性复合物引起的。在这个实施例中QD1发射产生了复合物BCX的定量信号以及关于该复合物长度的定性信号、QD2产生了关于EYF的相同信号、且QD3产生了关于GZH的相同信号。因此可以测量分子(例如生物分子如抗原、蛋白质等)的浓度以及在1至20nm的范围内的距离。
图2图示了若干抗体或适体(1-X a/b-特异于标记蛋白1-X)使用一个供体(D)和用于彩色多路复用的若干受体(A1-AX)来标记的均相免疫分析的原理。在没有蛋白质(图2的左侧)标记的情况下，仅有D显示了脉冲光激发后长久的发光信号(大的D-A距离→无FRET)。添加不同的蛋白质(图2的右侧)导致了特异性结合以及所伴随的来自A1-AX的特异性(色彩)的长久发光信号(小的D-A距离→FRET)。
所述免疫分析并非必须由夹心式复合物“Xa-X-Xb”组成。对于一些应用(例如当标记蛋白仅结合了一个抗体或适体时)来说，直接使用供体或受体来标记X以及进行竞争性分析(使用标记和未标记的X)也是可能和必要的。
图3显示了光谱学标尺测量，其中供体(D)和受体(A)之间的距离具有重要性。黑色弯箭头代表FRET。a)FRET信号是关于D和A之间的距离的量度。因此，可以对蛋白质(黑色曲线)折叠机制内的距离进行详细的研究。D和A相隔得越远则信号将越弱。b)细胞中的信号转导非常重量。FRET可以用于例如测量离子通道内的相互作用。
图4图示了链霉亲和素与量子点的结合。一旦将在本发明中以大约12个Tb LC标记的链霉亲和素(sAV)与生物素化的(B)QD在溶液中混合，则强大的生物素-链霉亲和素结合会形成供体-受体复合物，且从Tb至QD的FRET变得可能。通常，使用一个或多个Tb LC进行标记是可能的。
为了实验性地证实将量子点(QD)用作FRET受体的多路复用，使用了在表面上标记了约3至6个生物素分子的、具有525、565、605、655以及705nm的发射波长的五个不同的QD。除了具有CdSeTe/ZnS类型的QD705之外，所有QD都是在核/壳结构周围具有进一步的聚合物壳和生物相容性壳的CdSe/ZnS类型的QD。将这些生物素化的QD与标记了约12个Tb复合物的链霉亲和素混合。生物素与链霉亲和素的强大结合使Tb-LC(作为供体)与QD(作为受体)紧密靠近(参见图4)，这使从Tb至不同QD的FRET成为可能。
使用在315nm下的脉冲UV光激发后，Tb和所有QD都显示了长久的发光，这些是不同的FRET信号。图5显示了Tb LC和五个QD的发射光谱。所有的发射是同时存在于多路复用分析内的。将发射强度归一化以统一所有的发射峰。
当用作受体以及Tb复合物作为受体时，不同QD的重要光谱学数据显示在图6的表中。
在表1中显示了在生物素-链霉亲和素生物分析中将QD用作受体且一个TbLC作为受体的距离的多路复用表征。FRET数据显示了供体发射和受体吸收的光谱重叠以及所产生的
Figure BPA00001407217800111
半径。供应商(Invitrogen)给出了估计的尺寸。对Tb(供体通道)和每个QD进行时间分辨发射的分析。τ是在不存在FRET(τD)和存在FRET(τDA)时的发光衰减时间。η是FRET效率且r代表D-A距离。因为有许多标记了链霉亲和素的Tb-LC且点不全是球形的，而是还有椭圆形的，所以有几种可能的距离。为了计算的原因，选择了能代表所有其它可能的距离的两个平均距离。可以看出计算出的距离与估计的尺寸以及主要影响D-A距离的不同QD的模型拟合相当好。
可以看出，
Figure BPA00001407217800121
半径、QD的尺寸和几何形状(球形或椭圆形)非常不同。供体发射和受体发射的时间分辨分析分别显示了可以测出由QD尺寸的差异所致的D和A之间的不同距离(D-A距离随着QD尺寸的增加而增加)。这明确地证实了本发明可以对多路复用分析内的距离(多路复用光谱学标尺)进行测量。
为了证实灵敏性定量分析，将小容量的1nM Biot-QD添加至1nM的Tb-sAv中，并在改进的商业免疫分析仪(Cezanne的KRYPTOR和BRAHMS)上测量时控的(time gated)的长久发射(在0.1至1.2毫秒之间)。所述添加导致了结合并产生了从Tb至QD的FRET以及所伴随的长久QD发射。可以在一份和相同的样品内使用亚皮摩尔(sub-picomolar)检测限制来检测所有的Biot-QD。使用纯的Tb-LC进行对照实验以显示发射信号是通过由链霉亲和素-生物素结合所致的FRET引起的、而不是由溶液内的漫射引起的。
图7A至7E显示了在QD的不同发射波长下测量的所有五个QD的强度比率(在100-1200μs的时间窗内QD供体的强度除以Tb受体的强度)的示意图。正方形显示了由生物素和链霉亲和素的结合以及所伴随的从Tb至不同QD的ET所致的相对比率(规一化以在零浓度进行统一)的强增长。圆点显示了其中所用的Tb不含链霉亲和素的对照实验。在这里没有发现比率的增加，这证实了ET是通过在生物分析中生物素与链霉亲和素的结合来实现的。检测极限(在零浓度下30个测量结果的3倍标准偏差除以递增比率曲线的直线部分的斜率)在相同的样品内都是亚皮摩尔，这显示了将QD作为受体的多路复用生物分析的高灵敏度。
在说明书、权利要求书、以及附图中的至少一个中公开的特征可以是单独或在各种组合中的用于在本发明的各种实施方案中实现发明的材料。

Claims (15)

1.通过多路复用FRET(福斯特共振能量转移)分析来检测样品中的分析物的方法，所述方法包括下列步骤：
-提供样品，该样品含有能量转移供体、若干在光谱学上不同的量子点物质以及分析物，其中：
-将分析物配置成在由能量转移供体和第一量子点物质所提供的第一能量转移供体-受体对内介导能量转移，
-将能量转移供体配置成在第一能量转移供体-受体对中用作能量转移供体，和
-将第一量子点物质配置成在第一能量转移供体-受体对中用作能量转移受体，
-用来自激发光源的激发光照射样品，
-在第一能量转移供体-受体对中，将来自通过激发光激发的能量转移供体的激发能量转移至第一量子点物质，所述能量转移通过分析物来介导，和
-检测第一量子点物质在接收到激发能量后发出的发射光。
2.根据权利要求1的方法，其中所述方法还包括下列步骤：
-提供样品，该样品含有与所述分析物不同的附加分析物，其中：
-将附加分析物配置成在由能量转移供体和与第一量子点物质不同的第二量子点物质所提供的第二能量转移供体-受体对内介导能量转移，
-将能量转移供体配置成在第二能量转移供体-受体对中用作能量转移供体，和
-将第二量子点物质配置成在第二能量转移供体-受体对中用作能量转移受体，
-在第二能量转移供体-受体对中，将来自通过激发光激发的能量转移供体的激发能量转移至第二量子点物质，其中能量转移通过附加分析物来介导，和
-检测第二量子点物质在接收到激发能量后发出的发射光，第二量子点物质发出的发射光与第一量子点物质发出的发射光在光谱学上不同。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述方法还包括下列步骤：
-提供样品，该样品含有与能量转移供体不同的另外的能量转移供体，其中：
-将分析物配置成在由另外的能量转移供体和第一、第二以及第三量子点物质之一所提供的另外的能量转移供体-受体对内介导能量转移，
-将另外的能量转移供体配置成在另外的能量转移供体-受体对中用作能量转移供体，和
-将第一、第二或第三量子点物质配置成在另外的能量转移供体-受体对中用作能量转移受体，
-在另外的能量转移供体-受体对中，将来自通过激发光激发的另外的能量转移供体的激发能量转移至第一、第二以及第三量子点物质之一，其中能量转移通过分析物来介导，和
-检测第一、第二以及第三量子点物质之一在接收到激发能量后发出的发射光，所述发射光与在第一能量转移供体-受体对中的第一量子点物质发出的发射光以及在第二能量转移供体-受体对中的第二量子点物质发出的发射光在光谱学上不同。
4.根据权利要求2或3的方法，其中所述方法还包括同时检测下列中的至少两种的步骤：
-由在第一能量转移供体-受体对中的第一量子点物质发出的发射光，
-由在第二能量转移供体-受体对中的第二量子点物质发出的发射光，和
-由在另外的能量转移供体-受体对中的第一、第二以及第三量子点物质之一发出的发射光。
5.根据前面的权利要求中的一项的方法，其中所述方法还包括提供具有至少三种不同的分析物的样品的步骤，每种分析物都被配置成在样品中的能量转移供体-受体对中选择性地介导能量转移。
6.根据前面的权利要求中的一项的方法，其中所述方法还包括从所检测的发射光中获得结构信息的步骤。
7.根据权利要求6的方法，其中获得结构信息的步骤包括在第一能量转移供体-受体对、第二能量转移供体-受体对以及另外的能量转移供体-受体对中至少之一中测定用于激发能量转移的能量转移供体-受体距离的步骤。
8.根据权利要求7的方法，其中测定用于激发能量转移的能量转移供体-受体距离的步骤包括测定在约1nm至约20nm之间的能量转移供体-受体距离的步骤。
9.根据权利要求7或8的方法，其中测定用于激发能量转移的能量转移供体-受体距离的步骤包括在选自下列结构组的结构中测定能量转移供体-受体距离的步骤：化学结构，生化结构，和生物学结构如DNA或RNA结构、蛋白质折叠结构或细胞结构。
10.根据前面的权利要求中的一项的方法，其中所述方法还包括从所检测的发射光中获得浓度信息的步骤。
11.根据前面的权利要求中的一项的方法，其中所述方法还包括提供作为被标记样品的样品的步骤，其中将若干在光谱学上不同的量子点物质用选自下列标记物质组的不同的标记物质来标记：化学结构和生物分子如抗体、适体、抗原、蛋白质、激素、DNA、RNA、细胞或病毒。
12.根据前面的权利要求中的一项的方法，其中所述方法还包括检测由能量转移供体和另外的能量转移供体中至少之一发出的发射光的步骤。
13.用于在多路复用FRET分析中检测一种或多种分析物的试剂盒，尤其用于根据前面的权利要求中至少一项的方法中，所述试剂盒包含若干在光谱学上不同的量子点物质和至少一种能量转移供体，其中将所述若干在光谱学上不同的量子点物质和所述至少一种能量转移供体配置成在包含一种或多种分析物的样品中提供一个或多个能量转移供体-受体对，而且其中当所述至少一种能量供体光激发时，能量转移通过在一个或多个能量转移供体-受体对中的一种或多种分析物来介导。
14.根据权利要求13的试剂盒，其中所述试剂作为免疫分析类型试剂盒被提供。
15.根据权利要求12或13的试剂盒，其中所述试剂盒作为距离测量试剂盒被提供。
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