IT201800008274A1 - Metodo immunometrico per analisi cliniche biologiche - Google Patents

Description

Descrizione del trovato avente per titolo:

“METODO IMMUNOMETRICO PER ANALISI CLINICHE BIOLOGICHE”

CAMPO DI APPLICAZIONE

Il presente trovato si riferisce ad un metodo immunometrico per analisi cliniche biologiche, basato sul “quenching” di fluorescenza utilizzando anticorpi o aptameri funzionalizzati con sostanze fluorescenti o luminescenti e nanoparticelle.

STATO DELLA TECNICA

Sono noti nella tecnica vari tipi di sistemi immunofluorescenti di tipo “sandwich” per tecniche che utilizzano il “quenching” di fluorescenza, alcuni dei quali vengono utilizzati per la rilevazione di proteina C reattiva (CRP).

Ad esempio, nell’articolo “ Long-Range Fluorescence Quenching by Gold Nanoparticles in a Sandwich Immnnoassay far Cardiac Troponin ”, Fernando D. Stefani and Jochen Feldmann, Nanoletters 2009, è stato riportato un saggio immunologico di tipologia sandwich in fase omogenea, basato sull’emissione di fluorescenza per la determinazione della troponina cardiaca T (cTnT), in cui vengono sfrutate le nanoparticelle d’oro (Au n) come quencher di fluorescenza. Il funzionamento è correlato all’interazione simultanea di anticorpi coniugati con una molecola fluorescente (donatore) ed anticorpi coniugati con una nanoparticella (accettore) in presenza dell’antigene.

In questo assay è importante notare che le nanoparticelle d’oro agiscono come quencher di fluorescenza in maniera molto efficace, ed a distanze tra donatore ed accetore (3-22 nm) decisamente maggiori di quelle alle quali può avvenire il trasferimento di energia tra donatori e accetori molecolari (tipo molecole fluorescenti). In particolare, il sistema consente un più basso limite di rilevamento per l’analita in questione, pari a 0.02 nM (0.7 ng/mL).

Questo sistema è specifico per una sola tipologia di proteina, cioè la proteina troponina cardiaca T, utilizza un solo e specifico tipo di anticorpo+accetore, ed una particolare tipologia di donatore. Questo sistema ha inoltre un limite di rilevazione molto ristreto in quanto l’aggregato a sandwich è favorito solo a basse concentrazioni di analita. Dall’Articolo: ‘'''Energy transfer with gold nanoparticles far analy ficai applications in thè fìelds of biochemical and pharmaceutical Sciences ”, Jian Lingab and Cheng Zhi Huang, Analytical Methods 2010, vengono riportati diversi esempi di utilizzo di nanoparticelle d’oro come quencher di fluorescenza per la rilevazione di determinate sequenze di DNA. Sfruttando un principio simile sono stati elaborati metodi che prevedono l’utilizzo di aptameri al posto degli anticorpi, e di quantum dot come donatori.

Questi sistemi si riferiscono in generale ad analiti diversi dalla CRP, ed utilizzano un solo tipo di anticorpo+accettore.

DaH’Artìcolo: “ Ultra-sensitive detection of prion protein with a longrange resonance, Hunag, Chemcomm, 2010 ” è noto un sistema ultra sensibile per il rilevamento di proteine prioniche che si basa sul “long range resonance energy transfer” (LrRET) da quantum dot come donatori a nanoparticelle d’oro come accettori.

Le distanze di separazione vanno da 9 a 22 nm. Il quantum dot è funzionalizzato con un terminale che lega chimicamente e in modo selettivo il prione. Si sfrutta quindi l’interazione simultanea a sandwich del coniugato nanoparticella-aptamero con l’antigene (PrP ) coniugato al quantum dot per ottenere quenching di fluorescenza.

Anche in questo caso viene individuato un analita specifico; inoltre, la selettività del donatore per l’ analita è basata su una reazione chimica specifica.

Nell’Articolo: “ Flnoroimmunoassay far Antigen Based on Fluorescence Quenching Signal of Gold Nanoparticles , Feng Gao, Anal. Chem. 2006, 78, 1104-1106” viene sviluppato un saggio di immunofluorescenza con particelle sia d’oro che magnetiche. Viene formato un sandwich tra particelle magnetiche funzionalizzate con anticorpi, l’antigene e particelle d’oro coniugate agli anticorpi. Dopo la separazione magnetica dell’aggregato, i rimanenti anticorpi coniugati a particelle d’oro in soluzione reagiscono con FITC (fluoresceina isotiocianato) e si valuta il quenching di fluorescenza per quantificare la presenza di analita.

Nell’Articolo: “ Competitive homogeneous digoxìgenin immunoassay based on fluorescence quenching by gold nanoparticles, J Feldmann, Analytica Chimica Acta 646 (2009) 119-122 ” si descrive un sistema in cui, per verificare la quantità di uno specifico antigene (aptene), un antigene di controllo viene marcato con un colorante fluorescente (antigene+donatore), mentre lo specifico anticorpo è coniugato a nanoparticelle d’oro (anticorpo+accettore). La presenza di antigene nel campione andrà a saturare gli anticorpi presenti sulle nanoparticelle, per cui l’aggiunta successiva di antigeni+donatore produrrà quenching di fluorescenza in misura limitata al numero di anticorpi ancora disponibili. Il segnale di fluorescenza risulta proporzionale alla quantità di aptene presente nel campione (ovvero alla quantità di aptene+donatore rimasto libero).

Nell’Articolo: “ A high-throughput homogeneous immunoassay based on Forster Resonance energy transfer between quantum dots and gold nanoparticles, Songqin Liu, Analytica Chimica Acta 763 (2013) 43-49 ” viene descritto un dispositivo che sfrutta la formazione di un sistema sandwich omogeneo tra un anticorpo policlonale di capra anticarcinoembryonic antigen (CEA) funzionalizzato con quantum dot (a base di CdTe) come donatore ed un anticorpo monoclonale anti-CEA coniugato a nanoparticelle d’oro come accettore, per rilevare marker tumorali. La rilevazione avviene attraverso quenching di fluorescenza. Nell’Articolo: “ A competitive fluorescence quenching-based immunoassay far bisphenol A employing functionalized silica nanoparticles and nanogold, RSC Adv., 2016, 6, 38950-38956 ” un anticorpo anti-bisfenolo A (BPA) e DNA a singolo filamento funzionalizzato con FITC sono stati inclusi in nanoparticelle di silice. All’aggiunta dell’ antigene (BPA), si forma un sistema a sandwich con nanoparticelle d’oro funzionalizzate con anti-BPA. Viene promosso così il quenching di fluorescenza della FITC presente sulla nanoparticella di silice e la rilevazione dell’analita.

L’US20040002089A1 “ Methods employing fluorescence quenching by metal surfaces, 2004 ” descrive un metodo per la rilevazione di oligonucleotidi che prevede l’utilizzo di nanoparticelle come quencher di fluorescenza. In assenza di analita, donatore e accettore sono situati in prossimità l’uno dell’altro, così da dare luogo a quenching di fluorescenza. In presenza di analita, la catena di DNA subisce una modifica di conformazione che allontana donatore e accettore, producendo un aumento del segnale di fluorescenza.

In generale, tutti questi sistemi si caratterizzano per l’utilizzo di un analita specifico e di particolari costituenti.

Nell’Articolo: “ Fluorescent Excitation Transfer Immunoassay”, Edwin F. Ullman, The Journal Of Biological Chemistry Vol 251 Issue of July 25 4172-4178, 1976, viene descritto un sistema di anticorpi coniugati con due molecole fluorescenti differenti che agiscono da donatore ed accettore (fluoresceina e rodamina), i quali, in presenza dell‘antigene, vanno a formare un sistema a sandwich in cui è promosso il trasferimento energetico. Il quenching di fluorescenza risulta essere proporzionale alla quantità di antigene presente. Il sistema è stato ideato per 20 anticorpi anti-morfina aventi come antigene dei coniugati morfina-albumina.

L’US4160016A descrive un principio di funzionamento simile a quello descritto nell’articolo sopra citato.

L’US5229302A, “Fluorescente immunoassay method utilizing pseudo-antigens combined with fluorescent quenchers ” descrive un sistema che sfrutta il recupero di fluorescenza dopo il riconoscimento antigene-anticorpo, dovuto ad un sistema costituito da due componenti: anticorpo+donatore, “falso antigene”+accettore.

In assenza di antigene, il “falso antigene”+accettore è legato (reversibilmente) all’ anticorpo+donatore, dando luogo a quenching di fluorescenza per trasferimento di energia. In presenza di antigene, questo va a scalzare il “falso antigene”+accettore dall’ anticorpo+donatore, portando ad un aumento del segnale di fluorescenza.

L’US 9575069B2, Menchen et al 2014, l’US4261968A. Ulmann, 1979, e l’US4277437A, T. Maggio, 1978, descrivono altri sistemi analoghi a quelli sopra citati.

Per la rilevazione della CRP, -nell’Articolo: Label-free RNA aptamerbased capacitive biosensor far thè detection of C reactive protein, Javed H. Niazi, Phys. Chem. Chem. Phys., 2010, 12, 9176, la rilevazione avviene monitorando la variazione di un segnale di capacità tramite non-Faradaic impedance spectroscopy (NFIS) in corrispondenza della formazione di un addotto aptamero-CRP.

L’US 8624008 descrive l’utilizzo di un aptamero per CRP modificato con biotina, più particelle magnetiche funzionalizzate con streptavidina. L’interazione biotina-avidina permette di formare un unico agglomerato aptamero-nanoparticelle magnetiche.

Quando la CRP è presente come analita, viene legata dall’aptamero, il che ne permette la separazione dal fluido soprastante tramite separazione magnetica. Nell’ultima fase, vengono inseriti degli anticorpi anti-CRP coniugati a fluorescenti. La rilevazione dell’antigene è proporzionale all’emissione di fluorescenza.

L’Articolo: Development of a bead-based aptamer/antibody detection System far C-reactive protein, Rocio Aranda-Rodriguez, Analytical Biochemistry, 472 (2015) 67-74, l’Articolo: Aptamer-antibody on-chip sandwich immunoassay far detection of CRP in spiked serum, Claudia Preininger, Biosensors and Bioelectronics, 24 (2009) 1456-1461, e l’Articolo: Detection of C-reactive protein nsing nanoparticle-enhanced surface plasmon resonance nsing an aptamer-antibody sandwich assay, Kemin Wang, Chem. Commun., 2016, 52, 3568 descrivono ulteriore stato dell’arte per la rilevazione della CRP.

In quest’ultimo documento, si descrive la realizzazione di una serie di aptameri per la CRP che vengono immobilizzati su una superfìcie d’oro (film di oro). Quando la CRP viene aggiunta, gli aptameri immobilizzati catturano la CRP e si registra la variazione di segnale SPR. La rilevazione dell’antigene risulta ancora più efficace se vengono utilizzate in concomitanza delle nanoparticelle d’oro funzionalizzate con anticorpo che si legano a sandwich e incrementano il segnale SPR.

L’Articolo: Immunoturbidimetric Determination of C-Reactive Protein (CRP) and High-Sensitivity CRP on Heparin Plasma. Comparison with Serum Determination, Jean Paul Cristol, Clin Chem Lab Med, 2003; 41(7)948-949 descrive la determinazione immunoturbidimetrica della CRP.

Il CN1 02539785 A descrive un sistema di rilevazione di CRP che si basa su fluorescenza diretta e immunocromatografia.

L’US4902630A descrive un metodo di “fluorescence polarization immunoassay ( FPIA )" per determinare la proteina C-reattiva in liquidi, specialmente in fluidi biologici come siero, plasma, fluido spinale, liquido amnionico e urina. Lo FPIA consiste in un semplice metodo di preparazione e lettura, senza l'obbligo di fasi di separazione o lavaggio, in quanto sfrutta un antigene legato al fluoroforo che, quando legato aH'anticorpo di interesse, aumenterà la polarizzazione della fluorescenza.

In generale, come si vede anche in letteratura, l’utilizzo di test immunologici con struttura a sandwich, in cui due anticorpi legano due distinti siti di riconoscimento di un antigene, è una strategia consolidata in ambito scientifico e brevettuale.

Alcuni di questi saggi sfruttano la variazione di fluorescenza in seguito all’interazione tra sistemi donatori e accettori in presenza dell’antigene specifico. In particolare, sistemi donatori e accettori possono essere costituiti da anticorpi funzionalizzati con molecole fluorescenti, quantum dots, o altri sistemi in grado, da un lato, di emettere luce (sostanza luminescente), e dall’altro lato di accettare energia da una sostanza luminescente, spegnendo la luminescenza di quest’ultima.

La variazione di fluorescenza dipende dall’efficienza del processo di trasferimento di energia dal donatore all’accettore, e come parametro fondamentale viene individuata la loro distanza.

Al fine di incrementare l’efficienza del processo, l’utilizzo di nanoparticelle d’oro in sistemi di tipo sandwich si è rivelato essere di fondamentale importanza, grazie alla loro capacità di essere ottimi “quencher” di fluorescenza.

Sebbene il quenching di fluorescenza sia favorito dalla presenza di nanoparticelle d’oro, l’intervallo dinamico di rilevazione, ovvero l’intervallo che va dalla minima alla massima quantità di analita rivelabile, risulta piuttosto limitato in quanto, in presenza di un eccesso di antigene rispetto alla quantità di anticorpo marcato con donatori e accettori, la formazione di sistemi di tipo sandwich anticorpo+donore/analita/anticorpo+accettore è statisticamente sfavorita rispetto alla formazione di coppie anticorpo+donore/analita e anticorpo+accettore/analita.

Ciò impone un’attenta valutazione del range massimo di concentrazione di analita che può essere presente nei campioni da analizzare.

Esiste quindi la necessità di perfezionare un metodo immunometrico per analisi cliniche biologiche che risolva almeno alcuni degli inconvenienti della tecnica nota.

Per risolvere le suddette problematiche ed ottenere i vantaggi nel seguito evidenziati, la Proponente ha studiato, sperimentato e realizzazione il presente trovato.

ESPOSIZIONE DEL TROVATO

Il presente trovato è espresso e caratterizzato nella rivendicazione indipendente.

Le rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del presente trovato o varianti dell’idea di soluzione principale.

Il presente trovato si riferisce allo sviluppo di un test a rilevazione immediata per la determinazione di antigeni, tramite l'uso di anticorpi policlonali, monoclonali o aptameri funzionalizzati con molecole fluorescenti e l'ausilio di anticorpi legati a nanoparticelle.

In particolare, più specificatamente, il trovato viene vantaggiosamente, anche se non limitatamente, utilizzato per la rilevazione della proteina C-reattiva mediante un metodo che comprende l’utilizzo di anticorpi policlonali funzionalizzati con due diverse molecole fluorescenti che agiscono rispettivamente come sistema donatore ed accettore, e anticorpi coniugati a nanoparticelle anch’esse con azione di accettori.

In una soluzione preferenziale, le due molecole fluorescenti vengono utilizzare in forma di miscela.

Il trovato permette di avere una risposta immediata tramite analisi fluorimetrica, la quale consente di rilevare il legame antigene-anticorpo in seguito ad una diminuzione dell’intensità di emissione di fluorescenza proporzionale alla quantità di antigene presente.

L’utilizzo combinato, come accettori, di nanoparticelle e molecole organiche fluorescenti, presenta il vantaggio di un maggiore intervallo di linearità rispetto al sistema con solo nanoparticelle come quencher, in quanto le strutture a sandwich necessarie per la rilevazione sono presenti anche ad elevate concentrazioni di antigene, alle quali risultano ancora favorite le strutture a sandwich tra anticorpi+donatore e anticorpi+accettore.

Inoltre, il metodo presenta il vantaggio di essere di tipo omogeneo per cui non si ha la necessità di passare attraverso la fase di lavaggio al fine di eliminare la quota di anticorpi che non hanno interagito con l'antigene. Ciò permette di fornire una risposta sostanzialmente immediata a seguito della emissione di luce successivamente al legame antigene-anticorpo. Il trovato permette quindi di sviluppare test a rilevazione immediata per la determinazione di antigeni tramite l’uso di anticorpi policlonali o monoclonali o aptameri, e l’ausilio di anticorpi legati a nanoparticelle. Nel seguito, verrà fornito un esempio di realizzazione del presente trovato, con riferimento alle figure allegate 1-7.

Esempio

La ricerca è iniziata legando un anticorpo a varie sostanze fluorescenti quali ad esempio fluoresceina, eosina, nanoparticelle d’oro o sue leghe. Va notato che anche altre molecole fluorescenti ed altre nanoparticelle metalliche, quali d’argento, o sue leghe, potrebbero fungere allo stesso scopo.

I componenti utilizzati Ab (anticorpo), FITC (Fluoresceina Isotiocianato), EITC (Eosina Isotiocianato), OPSS-PEG (orthopyridyldisulfide- polyethyleneglycol-N-hydroxysuccinimide) sono noti e disponibili in commercio.

Anche le nanoparticelle d’oro (Au n) sono disponibili in commercio o possono essere autoprodotte mediante tecniche chimiche o fisiche.

Nell’esecuzione della procedura, è stato funzionai izzato un anticorpo con due sostanze fluorescenti, cioè fluoresceina ed eosina come illustrato in Fig. 1.

La funzionalizzazione dell’anticorpo con fluoresceina o eosina è possibile grazie alla formazione di un legame chimico di tipo tiourea, in buffer carbonato (pH= 8.5-9.0), per un tempo di reazione di 3 ore. La purificazione del coniugato è possibile in seguito all’incubazione attraverso dialisi e centrifugazione a 2000 rcf.

Il legame che si forma tra anticorpo e sostanze fluorescenti è di tipo chimico e quindi stabile nel tempo. E inoltre possibile quantificare il grado di bioconiugazione dell’Ab, ovvero il rapporto Ab:fluorescenti, tramite spettroscopia di assorbimento UV-vis.

La fig. 1 illustra anche che il legame a sandwich dell’ antigene (Ag) da parte di due Ab coniugati, rispettivamente, con fluoresceina ed eosina, può dare quenching di fluorescenza tramite un meccanismo di “energy transfer” dal donore (fluoresceina) all’accettore (eosina), nelle opportune condizioni sperimentali (fluorimetro, eccitazione a 485 nm, rilevazione della fluorescenza a 518 nm).

Lo stesso principio di rilevazione viene illustrato in Fig. 2 in cui si aggiunge un nuovo componente che consiste in Ab coniugato con Au n. Il nuovo coniugato, definito Au n - Ab, ha la funzione di quencher di fluorescenza secondo lo stesso principio illustrato in Fig. 1.

In una forma di realizzazione del presente trovato, il coniugato Abnanoparticelle di oro è stato ottenuto con un processo in due stadi: a) Coniugazione di un particolare PEG (2000 Da, OPSS-PEG) ad anti-CRP, il quale va a formare un legame tiourea stabile con esso, che richiede buffer bicarbonato pH 8.0 a 0 °C e incubazione di 12 h seguito da purificazione mediante dialisi a 2000 rcf (pore size 10 KDa)

b) Coniugazione di anti-CRP-OPSSPEG a Np in buffer bicarbonato pH 8.0, in H2O e incubazione di 30 min, seguito da purificazione mediante sedimentazione a 10000 rcf a 20°C. Il coniugato è stato poi risospeso nel buffer di misura.

Fig. 3 illustra la procedura di attacco dell’ anticorpo con la nanoparticella di oro utilizzando OPSS-PEG che consente di ottenere un legame ammidico stabile per formare il bioconiugato Au n - OPSS-PEG - Ab.

L’introduzione del OPSS-PEG sull’Ab risulta indispensabile per fornire stabilità colloidale al coniugato Ab-nanoparticelle di oro, mentre il ricoprimento delle Au n con Ab puro— porta ad aggregati di nanoparticelle. Sempre in Fig. 3 viene dimostrata la presenza di Ab sulle Au n tramite spettroscopia infrarossa (FTIR) e microscopia elettronica in trasmissione.

In genere si identificano come concentrazioni di interesse per la CRP i seguenti valori:

PERSONA SANA < 8.0 mg/L

INFIAMMAZIONE (10-1 000) mg/L

per cui il sistema è stato testato per un intervallo di concentrazione di analita che comprendesse entrambe le condizioni.

La Fig. 4 mostra che la misura è stata svolta considerando due parametri in funzione della concentrazione di Ag:

- Delta I.F.: la variazione dell’integrale dell’area dello spettro di fluorescenza raccolto dalla miscela di Ab+donore e Ab+accettori;

- Delta Imax: l’intensità di picco della stessa.

La Fig. 5 mostra il risultato nel caso siano presenti solo Ab+fluoresceina (FITC-Ab), solo Ab+eosina (EITC-Ab) oppure la miscela composta da Ab+fluoresceina come Ab+donore e Ab+eosina come Ab+accettore (FITC-Ab+EIT-Ab), al crescere della concentrazione di CRP.

Dalla Fig. 5 si osserva una chiara variazione di segnale al crescere della quantità di Ag, ma l’intervallo di linearità e il range dinamico sono molto ristretti e di ridotta applicabilità per analisi cliniche biologiche. La Fig. 6 mostra il risultato per la miscela composta da Ab+fluoresceina come Ab+donore e da Ab+eosina e Au n - OPSS-PEG - Ab come Ab+accettori (FITC-Ab EITC-Ab Au n-OPSS-PEG-Ab). Questo sistema mostra un intervallo di linearità ed un range dinamico nettamente migliori.

In Fig. 6 viene illustrata la buona rilevazione del segnale ottenuta dalla miscela FITC-Ab EITC-Ab Au n-OPSS-PEG-Ab utilizzando come parametro Delta Imax.

In Fig. 6 viene anche dimostrato come l’aggiunta di 60 microlitri di tre campioni contenenti tre diverse concentrazioni di CRP (normale: Norm, patologico: Path, elevato: Calibrator), si collochino perfettamente all’interno dell’intervallo di linearità del sensore, che dunque risulta adatto ad analisi cliniche biologiche. L’analisi richiede semplicemente l’aggiunta del suddetto volume di campione ad un volume prestabilito di miscela Ab+donore e Ab+accettori, e la registrazione dell’intensità di fluorescenza, senza alcun lavaggio o incubazione.

In Fig. 7 viene illustrata la procedura sperimentale, in cui vengono dichiarate le quantità in mg/L e nanomolare utilizzate per la miscela di misura al fine di avere la giusta proporzione o ricetta analitica per il buon funzionamento del sistema a tre componenti.

Il trovato consente pertanto la rilevazione di qualunque antigene o sostanza ritenuta tale tramite l’uso di anticorpi, siano essi mono- o policlonali o aptameri di sorta.

L’azione combinata di un accettore di tipo molecolare (EITC-Ab) e di nanoparticelle metalliche (Au n - OPSS-PEG - Ab), le quali forniscono un quenching aggiuntivo anche a distanza relativamente grande tra donatore e accettore, determina Γ emissione di un segnale di fluorescenza misurabile e quantificabile in base alla quantità di analita presente.

Il trovato consente di realizzare, con qualunque fluorimetro disponibile sul mercato, una misura rapida qualitativa e quantitativa dell’ analita ricercato.

Claims (9)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo immunometrico per analisi cliniche biologiche, in particolare per la rilevazione di antigeni, caratterizzato dal fatto di utilizzare due diverse molecole fluorescenti che agiscono rispettivamente come sistema donatore ed accettore, e anticorpi coniugati a nanoparticelle anch’esse con azione di accettori.
2. 2. Metodo immunometrico come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che prevede di utilizzare una miscela composta da dette due molecole fluorescenti, e nanoparticelle.
3. 3. Metodo immunometrico come alla rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che dette molecole fluorescenti sono fluoresceina ed eosina.
4. 4. Metodo immunometrico come ad una o l’altra delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che dette nanoparticelle sono nanoparticelle d’oro o nanoparticelle d’argento o loro leghe.
5. 5. Metodo immunometrico come ad una o l’altra delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detti anticorpi sono mono- o policlonali o aptameri.
6. 6. Metodo immunometrico come ad una o l’altra delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che prevede di rilevare il legame antigene-anticorpo in seguito ad una diminuzione dell’intensità di emissione di fluorescenza proporzionale alla quantità di antigene presente.
7. 7. Metodo immunometrico come ad una o l’altra delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che quando vengono coniugate nanoparticelle metalliche ed anticorpi, il coniugato Ab-nanoparticelle di oro è ottenuto mediante un PEG (2000 Da, OPSS-PEG) idoneo a formare un legame tiourea stabile con l’anti-CRP.
8. 8. Metodo come alla rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che il processo di coniugazione è un processo in due stadi, rispettivamente: a) coniugazione di un PEG (2000 Da, OPSS-PEG) ad anti-CRP, che forma un legame tiourea stabile con esso; b) coniugazione di anti-CRP-OPSSPEG a Np in buffer bicarbonato pEl 8.0 e ri-sospensione del coniugato nel buffer di misura.
9. 9. Metodo immunometrico come ad una o l’altra delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che la presenza di Ab sulle nanoparticelle d’oro (Au n) viene verificata tramite spettroscopia infrarossa e microscopia elettronica in trasmissione.