CN113125420B - 基于化学发光的多元分析光子晶体芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN113125420B CN202011623660.7A CN202011623660A CN113125420B CN 113125420 B CN113125420 B CN 113125420B CN 202011623660 A CN202011623660 A CN 202011623660A CN 113125420 B CN113125420 B CN 113125420B
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Abstract

本发明涉及化学发光检测领域，公开了一种基于化学发光的多元分析光子晶体芯片及其制备方法和应用，该多元分析光子晶体芯片包括芯片基底，所述芯片基底至少一侧表面设置有光子晶体微阵列，所述光子晶体微阵列包括两个以上的光子晶体位点；在至少一个所述光子晶体位点表面设置用于化学发光共振能量转移的特异性识别体。本发明的多元分析光子晶体芯片具有含有不同结构色的光子晶体，易于编码，同时光子晶体作为荧光增强介质，与所述光子晶体表面的特异性识别体共同形成相应的化学发光体系，能特异性的对不同种类/或不同浓度的癌症标志物，药物，微生物，分子，离子进行高通量筛选；其体积小，结构稳定，灵敏度高，应用范围广，具有特异性和选择性。

Description

基于化学发光的多元分析光子晶体芯片及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及化学发光检测领域，具体涉及一种基于化学发光的多元分析光子晶体芯片及其制备方法和应用。
背景技术
化学发光方法不需要光源的激发，因此具有背景低和设备简单的优点。化学发光最常用的反应液是鲁米诺和过氧化氢，在催化剂存在的情况下，鲁米诺被过氧化氢氧化，从基态跃迁到激发态，回到基态产生化学发光。而化学发光免疫分析法因其选择性好，灵敏度高、操作方便、设备简单、易于实现自动化等优点，越来越受到广泛关注。
Willner教授团队提供了一种对金属离子、小分子和DNA的特异性化学发光检测方法(参见Ronit Freeman,Xiaoqing Liu,and Itamar Willner.J.Am. Chem.Soc.2011,133,11597–11604)，但是该方法无法同时进行多种物质的检测，同时需要复杂的移液步骤；还提供了一种基于鲁米诺和联吡啶钌的电位分辨电致化学发光检测方法(参见CN103884707A)，该方法虽然可以同时进行两种抗原的检测，但无法同时进行多种抗原的检测。
光子晶体是一类具有光学尺度的周期性介电结构材料，因其独特的光子调控性质，自发现以来便受到了极大的关注和深入的研究。但是，关于光子晶体在检测领域中的应用未见报道。
癌症的早期诊断对其最终的控制和预防有着至关重要的作用。在癌症发展的过程中，一种有效的早期癌症诊断手段是对癌症标志物的检测。目前临床医学中对肿瘤疾病的筛查主要依靠临床表现，影像学检查、血清学检查、穿刺活检等多种手段。肿瘤起病隐匿，症状不明显，症状表现及影像学检查对早期肿瘤诊断不敏感，仍无法及时对早期肿瘤进行诊断。
目前临床中检测人体血清中肿瘤标志物的方法主要有传统的酶联免疫检测法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)及电化学发光免疫分析法 (ECLIA)，例如CN103884707A、CN104458710A所公开的技术方案，其中化学发光免疫分析法具有高度的准确性和特异性，是目前世界公认先进的标记免疫测定技术，但总的来说，目前所采用的方法存在缺陷，包括癌症标志物检测限较高，检测目标单一，利用当前技术很少能够同时实现灵活的高灵敏，多组分的检测。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的癌症标志物检测限较高，检测目标单一，不能同时实现灵活的高灵敏、多组分检测的缺陷。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种基于化学发光的多元分析光子晶体芯片，包括芯片基底，所述芯片基底至少一侧表面设置有光子晶体微阵列，所述光子晶体微阵列包括两个以上的光子晶体位点；在至少一个所述光子晶体位点的表面设置有用于化学发光共振能量转移的特异性识别体。
本发明第二方面提供一种制备前述第一方面所述的多元分析光子晶体芯片的方法，包括：
(1)在芯片基底上设置两个以上光子晶体位点以形成光子晶体微阵列，获得含有所述光子晶体微阵列的薄膜芯片；
(2)在所述薄膜芯片中，将至少一个光子晶体位点中光子晶体的表面设置特异性识别体。
本发明第三方面提供所述的多元分析光子晶体芯片在癌症检测、肿瘤靶向治疗、药物研发、药物及细胞筛选中的应用。
与现有技术相比，本发明的多元分析光子晶体芯片中，采用光子晶体为荧光增强介质，一方面，能够显著地增强受体物质的发光，从而能够明显降低癌症标志物等的检测限，大大提高对癌症标志物检测的灵敏度；另一方面，能够实现特异性检测，能够实现同时对同一样品中的多种癌症标志物等进行多组分、高灵敏和特异性检测，实现了高通量检测，提高了检测效率。
本发明的多元分析光子晶体芯片具有含有不同结构色的光子晶体，易于编码，同时光子晶体作为荧光增强介质，与所述光子晶体表面的特异性识别体共同形成相应的化学发光体系，能特异性的对不同种类/或不同浓度的癌症标志物，药物，微生物，分子，离子进行高通量筛选；其体积小，结构稳定，灵敏度高，应用范围广，具有特异性和选择性；能够应用在癌症检测、肿瘤靶向治疗、药物研发、药物及细胞筛选中，尤其适用于癌症标志物的检测。
本发明的制备方法，不需要复杂的移液步骤，试剂用量少，所需样品少，反应速度快，容易操作，实现了高效率、低成本、方便快捷的对癌症标志物进行检测，容易操作。
本发明的多元分析光子晶体芯片体积小，结构稳定，检测灵敏度高，具有特异性和选择性，检测时操作简便。
本发明的其他特征和优点会在下述的具体实施方式中予以详细说明。
附图说明
图1是本发明提供的一种优选的具体实施方式的多元分析光子晶体芯片的结构示意图。
图2是本发明的一种优选实施方式的多元分析光子晶体芯片的光子晶体微阵列形貌图。
图3是本发明实施例1中不同浓度PSA抗原的荧光强度关系曲线。
图4是本发明实施例1中不同浓度CA125抗原的荧光强度关系曲线。
图5是本发明实施例1中不同浓度AFP癌胚抗原的荧光强度关系曲线。
图6是本发明实施例1中对含有PSA抗原、CA-125抗原和AFP癌胚抗原的混合物的检测荧光强度图。
附图标记说明
1芯片基底 2光子晶体位点Ⅰ
3光子晶体位点Ⅱ 4单链DNA碱基序列
5受体物质 6空白位点
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
如前所述，本发明第一方面提供了一种基于化学发光的多元分析光子晶体芯片，如图1所示，包括芯片基底1，所述芯片基底1至少一侧表面设置有光子晶体微阵列，所述光子晶体微阵列包括两个以上的光子晶体位点；在至少一个所述光子晶体位点的表面设置有用于化学发光共振能量转移的特异性识别体。
本发明中，所述“光子晶体位点”是指在所述芯片基底1表面附着光子晶体而形成的位点。所述特异性识别体设置在所述光子晶体位点中光子晶体表面。本发明中，所述光子晶体能够增强发光。
本发明中，所述两个以上的光子晶体位点例如包括图1所示的光子晶体位点Ⅰ2和光子晶体位点Ⅱ3。本发明中，所述两个以上的光子晶体位点分别具有不同禁带(即具有不同的结构色)，同一种光子晶体位点具有相同禁带(即具有相同的结构色)。
本发明中，优选地，所述光子晶体位点为多个，各个所述光子晶体位点可以具有彼此相同或者不同的禁带(例如同一行的禁带相同，不同列的禁带不同)，各个所述光子晶体位点上的特异性识别体彼此相同或不同，相同的禁带与一种特异性识别体相对应以表现出相同的颜色，不同的禁带分别与不同的特异性识别体相对应以表现出不同的颜色。优选地，所述光子晶体微阵列上至少具有两种不同的禁带和两种不同的特异性识别体以实现特异性识别。例如如图2所示的一种实施方式中，所述光子晶体位点呈6行8列分布，每行的光子晶体位点具有不同的禁带，每列的光子晶体位点具有相同的禁带，从而通过发光来实现特异性识别。
本发明中，一般地，至少一个所述光子晶体位点为空白位点6，即在该光子晶体位点上不设置特异性识别体。优选地，在每行或每列的第一个光子晶体位点设为空白位点6。
本发明中所述光子晶体可以为商购得到，也可以通过现有的方法制备得到，；均可以用于本发明中，本文在此不再赘述。
本发明对所述光子晶体的具体种类可选范围较宽，优选地，所述光子晶体位点中的光子晶体为含有或不含有连接基团的光子晶体。所述连接基团可以为所述光子晶体上自带的，也可以为通过化学修饰现有的光子晶体而获得；所述化学修饰可以采用现有技术中任何能起到修饰所需基团的方法，本文在此不再赘述。
本发明中，对所述连接基团可选范围较宽，只要能起到连接特异性识别体的作用即可；优选地，所述连接基团选自氨基、羧基、羟基、巯基中的至少一种。
根据本发明，优选地，所述光子晶体为蛋白石光子晶体、反蛋白石光子晶体、二维光子晶体中的至少一种。采用该优选方案，能够进一步充分发挥化学发光增强作用。
优选地，本发明中，所述光子晶体由光子晶体填充物质围成孔结构而形成。
优选地，所述光子晶体填充物质为纤维素酯。本发明对所述纤维素酯的具体种类可选范围较宽，例如醋酸纤维素酯，本文在此不再列举。
优选地，所述孔结构的孔径为100-1000nm，更优选为100-800nm，进一步优选为100-400nm。不同孔结构的光子晶体对应不同的禁带，例如不同孔径使得光子晶体具有蓝色、绿色或红色禁带，此为现有技术，本文在此不再赘述。
本发明的所述光子晶体微阵列中，优选地，所述多个光子晶体位点呈点阵分布，如图1所示。
本发明中，所述特异性识别体优选采用核酸适配体识别(例如碱基序列) 进行特异性识别，特异性识别能力极高，甚至高于抗原抗体结合的识别能力。所述碱基序列包括金属离子、小分子、聚合物及其他的碱基序列，能够特异性识别目标分子，优选可特异性识别癌症抗原的特异性DNA分子。当然，所述特异性识别体也可以采用其他能对所需检测样品进行特异性识别的物质，不限于对癌症标志物的识别检测。
进一步优选地，所述特异性识别体包括具有特异性识别功能的碱基序列，所述碱基序列的一端连接有受体物质。本发明中，所述受体物质用于与标志物结合形成发光体系，发出特定颜色的光。所述特异性识别体可以通过市售得到，也可以通过现有方法制备得到，本文在此不再赘述。所述碱基序列的一端连接有受体物质的方法，可以采用现有技术中任何能将碱基序列的一端连接所需受体物质的方法，本文在此不再赘述。
本发明中，所述特异性识别体可以接枝在所述光子晶体位点上的光子晶体上，也可以不进行接枝，而是直接放置于所述光子晶体表面。在前者的方案下，进一步优选地，所述碱基序列的另一端接枝在所述光子晶体位点上。
本发明中，所述的光子晶体为颜色单一且纯度高的光子晶体，具有各自的禁带。所述两个以上的光子晶体位点分别具有不同禁带是指：每个光子晶体位点各自独立地具有一种禁带，当其检测时，每个光子晶体位点上对应的受体物质与相对应的抗原结合，受体物质各自独立地仅发出一种颜色的光，该光子晶体位点上的光子晶体能够增强该种颜色的光，从而能够提高本发明的芯片用于检测时的灵敏度；在所述多元分析光子晶体芯片上含有至少两种禁带，以实现同时检测两种以上的癌症标志物。
根据本发明，优选地，所述碱基序列为DNA碱基序列，优选为单链或双链的DNA碱基序列，更优选为单链DNA碱基序列(如图1所示的单链 DNA碱基序列4)；所述DNA碱基序列的一端接枝在所述光子晶体位点上，另一端连接有受体物质5。
优选地，所述单链或双链的DNA碱基序列为可特异性识别癌症抗原的特异性DNA分子。
优选地，所述碱基序列选自用于检测PSA抗原的碱基序列、用于检测 CA125抗原的碱基序列、用于检测AFP抗原的碱基序列、用于检测CEA抗原的碱基序列中的至少一种。本发明对各个碱基序列的来源没有任何限制，例如，可以为市售得到，也可以通过现有的方法制备得到；所述用于检测 PSA抗原的碱基序列例如5'-半导体纳米晶 -ACGCTCGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG-NH2-3')，所述用于检测 CA125抗原的碱基序列例如5'-半导体纳米晶 -TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAA-NH2-3'，所述用于检测AFP抗原的碱基序列例如5'-半导体纳米晶 -GGCAGGAAGACAAACAAGCTTGGCGGCGGGAAGGTGTTTAAATTCCC GGGTCTGCGTGGTCTGTGGTGCTGT-NH2-3'。
进一步优选地，所述碱基序列的一端修饰有接枝基团，通过所述接枝基团将所述碱基序列连接在所述光子晶体位点上。本发明中，所述碱基序列的一端也可以不修饰接枝基团，而是直接将碱基序列及其连接的受体物质组成的特异性识别体直接放置在所述光子晶体的表面。优选地，所述光子晶体通过连接基团与所述接枝基团化学键接。本发明中，该处的连接基团是指前述所述光子晶体位点上的光子晶体中的连接基团。
优选地，所述接枝基团选自为氨基、羧基、羟基、巯基中的至少一种。
所述碱基序列与所述光子晶体位点优选通过氨基和羧基通过化学键连接。
优选地，所述受体物质选自半导体纳米晶、金属纳米晶和荧光染料标记分子中的至少一种。
进一步优选地，所述半导体纳米晶和金属纳米晶各自独立地选自二氧化硅纳米晶体颗粒、二氧化钛纳米晶体颗粒、氧化锆纳米晶体颗粒、三氧化二铝纳米晶体颗粒、氧化锌纳米晶体颗粒、硫化锌纳米晶体颗粒、硫化镉量子点、硒化镉量子点、碲化镉量子点中的至少一种。
进一步优选地，所述荧光染料标记分子选自罗丹明B、罗丹明6G、荧光素、荧光素钠中的至少一种。
在本发明的一种优选的实施方式中，各个所述光子晶体位点上的特异性识别体彼此不同，如图1所示。检测时多个光子晶体位点各自独立地分别表现不同颜色的光，所得到的光谱数据为单一光子晶体位点发出的光的数据。
在本发明的另一种优选的实施方式中，各个所述光子晶体位点上的特异性识别体彼此部分相同、部分不同，具体为：同一列或行中，各个所述光子晶体位点上的特异性识别体彼此相同；不同的列或行之间，各列或行所述光子晶体位点上的特异性识别体彼此不同。检测时每列或行的光子晶体位点分别发出同一种颜色的光，所得到的光谱数据采用同一列或行中光子晶体位点发出的同一颜色的光的均值。
本发明对所述芯片基底没有任何限制，优选地，所述芯片基底为表面具有基底膜的支撑基底。本发明中所述基底膜附着在所述支撑基底的至少一侧表面。本发明中，所述光子晶体微阵列设置在所述基底膜表面。
本发明中对所述基底膜没有任何限制，优选地，所述基底膜选自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚苯乙烯和聚丙烯中的至少一种。
本发明中对所述支撑基底没有任何限制，优选地，所述支撑基底选自玻璃片、硅片、铝片中的一种，更优选为玻璃片。
如前所述，本发明的第二方面提供了一种制备所述多元分析光子晶体芯片的方法，包括：
(1)在芯片基底上设置两个以上光子晶体位点以形成光子晶体微阵列，获得含有所述光子晶体微阵列的薄膜芯片；
(2)在所述薄膜芯片中，将至少一个光子晶体位点中光子晶体的表面设置特异性识别体。本领域技术人员可以根据实际需求在多个光子晶体位点的表面分别设置不同的特异性识别体。
优选地，所述特异性识别体接枝(即化学键合)或者直接放置在所述光子晶体位点中光子晶体表面。
本发明对所述芯片基底的制备方法不作特别限定；本发明提供一种所述芯片基底的优选制备方法，包括：在基底支撑部上涂PDMS(即聚二甲基硅氧烷)后进行加热(即干燥)，获得芯片基底。本发明对所述PDMS的涂覆厚度不作特别限定，例如涂覆厚度为30μm。本发明对该制备方法中的工艺参数不作特别限定，优选地，所述PDMS通过单体(乙烯基封端的聚二甲基硅氧烷):交联剂(聚二甲基氢硅氧烷)摩尔比为(5-15):1进行制备得到；加热条件优选为：温度为55-90℃，时间为20-50min；也可以不加热使PDMS 自然干燥固化。
根据本发明的一种优选实施方式，该方法还包括采用含有如下步骤制备所述光子晶体微阵列：
(A)将至少两种含有模板材料的乳液分别与所述芯片基底表面进行接触以形成微阵列，然后进行第一干燥；其中，至少两种所述含有模板材料的乳液中的模板材料的粒子粒径不同；
(B)将光子晶体填充物质溶液与步骤(A)得到的微阵列中的模板材料进行接触并进行第二干燥，然后除去所述模板材料，获得光子晶体微阵列。
优选地，所述第一干燥的条件为：温度70-90℃，时间10-20min。
优选地，所述第二干燥的条件包括：温度为70-90℃，时间为1-10h。
优选地，所述光子晶体填充物质溶液的质量浓度(即光子晶体填充物质的浓度)为1-3％，例如可以为1％、1.5％、2％、2.5％或3％，以及它们之间的任意点值。
本发明中，所述(A)中的接触优选采用将所述含有模板材料的乳液通过打印法(例如喷墨打印法)或滴涂法进行滴加在所述芯片基底表面；所述 (B)中的接触优选采用将光子晶体填充物质溶液渗入所述光子晶体表面，更优选通过牺牲模板法渗入进行。
本发明中，优选地，所述模板材料为纳米粒子，更优选为胶体纳米粒子。进一步优选地，所述纳米粒子为单分散颗粒。
所述单分散颗粒中的“单分散”是指颗粒的颗粒尺寸分布窄。一般地，所述单分散颗粒的粒径波动在5％以内(即，粒径分布的标准偏差在5％以内)。本发明实施例中使用的单分散颗粒的粒径分布的标准偏差均在5％以内。本发明中，平均颗粒尺寸以及粒径分布的标准偏差均由体积平均粒径确定，采用激光粒度仪测定。所述单分散颗粒可以商购得到，也可以采用常规方法制备，本文不再详述。
优选地，所述单分散颗粒为有机颗粒、无机颗粒、有机-无机复合颗粒和量子点中的一种或两种以上的组合，更优选为具有核壳结构的聚合物颗粒、氧化硅颗粒、聚苯乙烯颗粒、聚丙烯酸颗粒、金颗粒、银颗粒、铂颗粒、铜颗粒、氧化锌颗粒、氧化铁颗粒、四氧化三铁颗粒、氧化钛颗粒、碳颗粒、多巴胺颗粒、硅颗粒和量子点中的一种或两种以上。
本发明模板材料的粒子粒径不同的所述含有模板材料的乳液能够通过普通市售得到，也可以通过普通自制得到；自制时通过乳液聚合方法得到。
所述单分散颗粒的粒径影响了制得的光子晶体具有的禁带，例如当单分散颗粒粒径为284nm时，制得的光子晶体具有绿色波段的禁带，检测时能够增强此波段的光。
优选地，所述单分散颗粒在所述纳米粒子乳液中的质量浓度为0.5-5％，，例如可以为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％，以及它们之间的任意点值；更优选1.5-2.5％。
本发明的方法提供的所述光子晶体微阵列具有良好的形貌和稳定性。
本发明的特异性识别体可以含有或不含有接枝基团。在不含有接枝基团的特异性识别体中，该方法还包括采用如下步骤获得所述特异性识别体：对各个碱基序列的一端进行化学修饰以使得各个碱基序列的一端连接有受体物质。在含有接枝基团的特异性识别体中，优选地，该方法还包括采用如下步骤获得所述特异性识别体：对各个碱基序列的两端进行化学修饰以使得各个碱基序列的一端连接有接枝基团，另一端连接有受体物质。
优选地，该方法还包括将所述特异性识别体接枝在光子晶体上的步骤：先将所述光子晶体与活化溶液接触以进行活化，得到活化的光子晶体，然后将所述特异性识别体与所述活化的光子晶体的表面接触以进行反应；并将反应后得到的光子晶体进行清洗(优选为通过PBS缓冲溶液(即磷酸缓冲盐溶液)进行清洗)。本发明中，优选地，在所述活化之前还包括，先将所述光子晶体浸于酸溶液(例如98wt％的醋酸)中浸泡(时间例如24h)；然后再进行所述活化。
根据本发明，优选地，所述活化溶液中含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，所述N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为10-200mg/mL，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为1-100mg/mL。溶剂优选为水。
本发明对所述活化的条件可选范围较宽，只要经活化使得所述特异性识别体与所述活化的光子晶体更容易发生反应即可。本发明对所述反应的条件可选范围较宽，只要能够使得所述特异性识别体接枝在所述光子晶体的表面即可。
如前所述，本发明第三方面提供所述的多元分析光子晶体芯片在癌症检测、肿瘤靶向治疗、药物研发、药物及细胞筛选中的应用。
本发明提供的所述多元分析光子晶体芯片还能够应用于其它需要特异性检测的化学反应领域。
本发明还提供了一种所述的多元分析光子晶体芯片的应用方法，例如包括：在修饰有多种特异性识别体的所述多元分析光子晶体芯片上加入化学发光液和抗原物，利用化学发光分析仪分析发光强度，从而测得抗原混合物中存在的癌症标志物及其含量。所述化学发光液优选为Luminol溶液(例如浓度为50uM)和H2O2溶液(例如浓度为300uM)。
优选地，所述多种特异性识别体发出的颜色光与癌症标志物的对应关系为：蓝光-PSA抗原、绿光-CA125抗原、红光-AFP抗原，黄光-CEA抗原。
本发明中，所述特异性识别体与检测时加入的化学发光液、癌症标志物 (即抗原)形成化学发光体系。所述的化学发光体系选自鲁米诺化学发光体系、吖啶酯化学发光体系、AMPPD化学发光体系、电化学发光体系、铁氰化钾化学发光体系、过氧化草酸化学发光体系、N-溴代琥珀亚酰胺发光体系、高锰酸钾化学发光体系、Ce(IV)化学发光体系、罗丹明族化合物化学发光体系中的一种，优选鲁米诺化学发光体系。
现有技术中通常需要外界激发光进行激发，激发后的荧光易受背景激发光的影响；而本发明利用化学发光原理自身产生荧光，不需要外界激发光激发，而且能够消除背景光的干扰。
本发明在所述多元分析光子晶体芯片上同时构建不同种用于化学发光共振能量转移检测的体系，如图1所示，每种检测体系可特异性识别不同癌症标志物，进而实现对同一样品中的多种癌症标志物进行高灵敏和特异性检测。
以下将通过实例对本发明进行详细描述。以下实例中，所有原料和设备除有特别说明，均为普通市售品。
实施例1
本实施例为本发明在癌症标志物检测中的应用。
1)多元分析光子晶体芯片的制备(反蛋白石光子晶体用于多元分析光子晶体芯片的制备)
A、制备芯片基底：将PDMS(单体：交联剂摩尔比为10:1)旋涂在 1cm×1cm的玻璃基底上，旋涂厚度为30μm，然后置于60℃烘箱中加热 15min，之后取出，此时PDMS处于半固化状态，得到芯片基底。
B、制备特异性识别体溶液：
选取用于检测PSA抗原的特异性识别体(5'-半导体纳米晶 -ACGCTCGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG-NH2-3')、用于检测 CA125抗原的特异性识别体(5'-半导体纳米晶-TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAA-NH2-3')、用于检测AFP抗原的特异性识别体(5'-半导体纳米晶 -GGCAGGAAGACAAACAAGCTTGGCGGCGGGAAGGTGTTTAAATTCCC GGGTCTGCGTGGTCTGTGGTGCTGT-NH2-3')，将其溶解于PBS缓冲溶液 (pH＝7.4)中，得到特异性识别体溶液。其中，三种特异性识别体的浓度均为5uM。
C、之后通过滴涂法，将不同粒径的三种纳米粒子乳液(溶剂为水；三种纳米粒子均为二氧化硅颗粒，质量浓度均为2％，不同粒径使得所得的光子晶体分别具有蓝色、绿色、红色禁带)分别滴(约8uL)在芯片基底的PDMS 上形成微阵列(共三列三行，第一行第一列的第一个位点设为空白位点，其余位点中，每一列的各个位点采用同一平均粒径的纳米粒子乳液，具有相同禁带；每一行之间采用不同平均粒径的纳米粒子乳液，具有不同禁带)，将微阵列放置于75℃的烘箱上干燥15min，得到形貌良好的蛋白石光子晶体微阵列。
然后将10uL质量浓度为1.5％的醋酸纤维素酯溶液(溶剂为N,N-二甲基甲酰胺)渗入到蛋白石光子晶体结构中在75℃干燥1h，之后用氢氟酸除去二氧化硅模板基材获得光子晶体微阵列，从而得到反蛋白石光子晶体的聚合物薄膜芯片。
D、将所述薄膜芯片浸于98wt％的醋酸(醋酸用量使得覆盖反蛋白石光子晶体即可)中浸泡24h，之后用乙醇洗涤三次，然后用NHS/EDC的混合溶液(其中，NHS浓度为30mg/mL，EDC浓度为6mg/mL)中将反蛋白石光子晶体中的羧基活化2h；其中，混合溶液用量使得覆盖反蛋白石光子晶体即可。然后将薄膜芯片取出，在每个光子晶体位点表面滴加2uL的所述特异性识别体溶液，置于80％RH的环境湿度下反应12h。最后，使用PBS缓冲溶液(pH＝7.4)对反蛋白石光子晶体表面进行冲洗，即可得到多元分析光子晶体芯片。
2)针对一种癌症标志物的检测
使用上述得到的多元分析光子晶体芯片测定荧光强度与同一种癌症标志物浓度关系。
具体步骤为：事先对本发明的芯片进行光谱测试，以得到每个光子晶体位点上的禁带，具体分别为蓝色禁带位点、绿色禁带位点、红色禁带位点；在具有增强蓝色禁带位置的光子晶体位点上，滴加200uL含有25mM的 HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、20mM的KNO3和200mM的NaNO3的混合溶液以营造pH环境，之后加入不同浓度的PSA抗原溶液，接着加入 50uL的10nM的Hemin溶液，1小时后加50uL的50uM的Luminol溶液和 200uL的300uM的H2O2溶液，通过化学发光分析仪立刻(约10s内)测量发光强度，从而测定荧光强度(峰的强度)与加入不同浓度PSA抗原溶液的关系。测定结果如图3所示。
对CA125抗原和AFP癌胚抗原分别进行重复上述步骤的关系测定。测定结果分别如图4和图5所示。
从图3、图4和图5可以看出，随着PSA抗原，CA125抗原，AFP抗原浓度的增加，荧光峰的强度也随之增加；表明本发明的多元分析光子晶体芯片能够测定不同抗原的浓度。
3)针对多种癌症标志物的检测
使用上述制备得到的多元分析光子晶体芯片对含有PSA抗原、CA-125 抗原和AFP癌胚抗原的混合物的检测。具体步骤如下：
将含有200uL的25mM的HEPES，20mM的KNO3和200mM的NaNO3的混合溶液分别滴加到所述多元分析光子晶体芯片上且覆盖所有光子晶体位点，用于营造pH环境，然后加入含有PSA抗原、CA-125抗原和AFP抗原的混合物，之后加入50uL的10nM的Hemin溶液，1小时后加50uL的50uM的Luminol溶液和200uL的300uM的H2O2溶液，通过化学发光分析仪立刻(10s内)测量发光强度，利用峰的强度来推断癌症标志物的有无及含量。测试结果如图6所示。
从实验结果图6可以看出：荧光光谱在蓝光波长470nm处有峰，说明存在PSA抗原；荧光光谱在绿光波长520nm处有峰，说明存在CA125抗原；荧光光谱在红光波长600nm处有峰，说明存在AFP癌胚抗原。根据峰强度与之前测定的癌症标志物浓度关系(即图3-图5所示的浓度-荧光峰强度的关系曲线)测得不同抗原的含量。
实施例2
本实施例为本发明在药物研发中的应用。
分别取含相同含量的肝癌细胞培养液，将抗癌药物(盐酸阿霉素)按一定浓度梯度分别加入肝癌细胞培养液中，形成含有不同含量的抗癌药物的肝癌细胞培养液，并设立对照组，在细胞培养箱中培养24h，之后在实施例1 制备的多元分析光子晶体芯片上，滴加含有200uL的25mM的HEPES、 20mM的KNO3和200mM的NaNO3的混合溶液，再加入前述含有不同抗癌药物的肝癌细胞培养液，接着加入50uL的10nM的Hemin溶液，1小时后加50uL的50uM的Luminol溶液和200uL的300uM的H2O2溶液，通过化学发光分析仪立刻(10s内)测量发光强度。根据蓝光荧光光谱峰强度与对应抗癌药物含量的关系，来评估药物对肝癌细胞的治疗效果。从测试结果可以看出，随着盐酸阿霉素含量的增加，AFP抗原含量减少，在蓝色光处的荧光强度降低；表明盐酸阿霉素含量的增加，肝癌细胞的存活率不断降低。
实施例3
本实施例为本发明在细胞筛选中的应用。
准备含有乳腺癌、前列腺癌、肝癌细胞的混合细胞培养液，在细胞培养箱中培养24h，之后在实施例1制备的多元分析光子晶体芯片上，滴加含有 25mM的HEPES、20mM的KNO3和200mM的NaNO3的混合溶液，再加入混合细胞培养液，后加入10nM的Hemin溶液，1小时后加50uM的Luminol 溶液和300uM的H2O2溶液，通过化学发光分析仪立刻(10s内)测量发光强度。根据荧光光谱峰的位置以及强度来判断抗原的种类和含量，进而判断细胞培养液中癌细胞的种类和含量。
结合实施例1中得到的峰强度和抗原的含量对应关系可知，本实施例中，测得的颜色光与各抗原、细胞的对应关系为：蓝光-PSA抗原-前列腺癌细胞，绿光-CA125抗原-乳腺癌细胞，红光-AFP抗原-肝癌细胞。
从测试结果可以看出，荧光光谱在470nm(蓝光)处有峰，说明存在前列腺癌细胞；荧光光谱在520nm(绿光)处有峰，说明存在乳腺癌细胞；荧光光谱在600nm(红光)处有峰，说明存在肝癌细胞。
实施例4
本实施例用于说明蛋白石光子晶体用于多元分析光子晶体芯片的制备。
按照与实施例1类似的方法进行，所不同之处在于，步骤C不同，具体地，步骤C为：按照实施例1相同的方法制备得到形貌良好的蛋白石光子晶体微阵列，然后直接将所述蛋白石光子晶体微阵列中的蛋白石光子晶体表面进行化学修饰以接枝羧基，得到蛋白石光子晶体的聚合物薄膜芯片；然后用 NHS/EDC的混合溶液(同实施例1)将光子晶体中的羧基活化2h。然后将薄膜芯片取出，在每个光子晶体位点表面滴加2uL的所述特异性识别体溶液，置于80％RH的环境湿度下反应12h。最后，使用PBS缓冲溶液(pH＝7.4) 对蛋白石光子晶体表面进行冲洗，即可得到多元分析光子晶体芯片，其余后续检测步骤与实施例1相同。
本实施例的检测结果与实施例1类似，均能检测出不同抗原及其含量。
实施例5
本实施例用于说明二维光子晶体用于多元分析光子晶体芯片的制备。
按照与实施例1类似的方法进行，所不同之处在于，步骤C不同，具体地，步骤C为：通过界面捕获法，将不同粒径的纳米粒子乳液(组成中，质量浓度均为2.5％，粒径分布同实施例1，其他与实施例1相同)分别滴(约 8uL)在芯片基底的PDMS上形成微阵列(共三列，每一列的各个位点采用同一平均粒径的纳米粒子乳液，不同列之间采用不同平均粒径的纳米粒子乳液)，将微阵列放置于75℃的烘箱上干燥15min，待水分蒸发后得到形貌良好的二维光子晶体微阵列，将该微阵列中的二维光子晶体表面进行化学修饰以接枝羧基基团，得到二维光子晶体的聚合物薄膜芯片；然后用NHS/EDC 的混合溶液(同实施例1)中将光子晶体中的羧基活化2h。然后将薄膜芯片取出，在每个光子晶体位点表面滴加2uL的所述特异性识别体溶液，置于 80％RH的环境湿度下反应12h。最后，使用PBS缓冲溶液(pH＝7.4)对二维光子晶体表面进行冲洗，即可得到多元分析光子晶体芯片，其余后续检测步骤与实施例1相同。
本实施例的检测结果与实施例1类似，均能检测出不同抗原及其含量。
实施例6
本实施例用于说明碱基序列非接枝于光子晶体上用于多元分析光子晶体芯片的制备。
按照与实施例4类似的方法进行，所不同之处在于，步骤C中得到蛋白石光子晶体微阵列后，无需进行化学修饰，且不进行步骤D中的特异性识别体接枝，而是直接将相同用量的所述特异性识别体溶液直接放到蛋白石光子晶体微阵列中的光子晶体表面形成多元分析光子晶体芯片，其余后续检测步骤与实施例1相同。
本实施例的检测结果与实施例1类似，均能检测出不同抗原及其含量。
从上述实施例1-6可以看出，本发明的多元分析光子晶体芯片能够实现同时对同一样品中的多种癌症标志物进行多组分、高灵敏和特异性检测，实现了高通量检测，提高了检测效率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
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<130> I55735ICAS
<160> 3
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<210> 1
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgctcgatg ccactacagg ttggggtcgg gcatgcgtcc ggagaagggc aaacgagagg 60
tcaccagcac gtccatgag 79
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taatacgact cactataggg agacaagaat aaacgctcaa 40
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggcaggaaga caaacaagct tggcggcggg aaggtgttta aattcccggg tctgcgtggt 60
ctgtggtgct gt 72

Claims (28)

1.一种基于化学发光的多元分析光子晶体芯片，其特征在于，包括芯片基底，所述芯片基底至少一侧表面设置有光子晶体微阵列，所述光子晶体微阵列包括两个以上的光子晶体位点，两个以上的所述光子晶体位点分别具有不同禁带；在至少一个所述光子晶体位点的表面设置有用于化学发光共振能量转移的特异性识别体；所述光子晶体位点中的光子晶体为含有或不含有连接基团的光子晶体；所述连接基团选自氨基、羧基、羟基、巯基中的至少一种，所述光子晶体为蛋白石光子晶体、反蛋白石光子晶体、二维光子晶体中的至少一种；
所述光子晶体由光子晶体填充物质围成孔结构而形成，所述孔结构的孔径为100-1000nm；
所述特异性识别体包括具有特异性识别功能的碱基序列，所述碱基序列的一端连接有受体物质；所述碱基序列选自用于检测PSA抗原的碱基序列、用于检测CA125抗原的碱基序列、用于检测AFP抗原的碱基序列、用于检测CEA抗原的碱基序列中的至少一种；所述受体物质选自半导体纳米晶、金属纳米晶和荧光染料标记分子中的至少一种；
所述多元分析光子晶体芯片用于检测癌症标志物。
2.根据权利要求1所述的多元分析光子晶体芯片，其中，所述光子晶体填充物质为纤维素酯。
3.根据权利要求1所述的多元分析光子晶体芯片，其中，所述孔结构的孔径为100-800nm。
4.根据权利要求1所述的多元分析光子晶体芯片，其中，所述孔结构的孔径为100-400nm。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的多元分析光子晶体芯片，其中，所述碱基序列的另一端接枝在所述光子晶体位点上。
6.根据权利要求5所述的多元分析光子晶体芯片，其中，所述碱基序列为单链或双链的DNA碱基序列。
7.根据权利要求6所述的多元分析光子晶体芯片，其中，所述单链或双链的DNA碱基序列为可特异性识别癌症抗原的特异性DNA分子。
8.根据权利要求1所述的多元分析光子晶体芯片，其中，所述半导体纳米晶和所述金属纳米晶各自独立地选自二氧化硅纳米晶体颗粒、二氧化钛纳米晶体颗粒、氧化锆纳米晶体颗粒、三氧化二铝纳米晶体颗粒、氧化锌纳米晶体颗粒、硫化锌纳米晶体颗粒、硫化镉量子点、硒化镉量子点、碲化镉量子点中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的多元分析光子晶体芯片，其中，所述荧光染料标记分子选自罗丹明B、罗丹明6G、荧光素中的至少一种。
10.根据权利要求1-4中任意一项所述的多元分析光子晶体芯片，其中，至少一个所述光子晶体位点为空白位点。
11.根据权利要求1-4中任意一项所述的多元分析光子晶体芯片，其中，所述芯片基底为表面具有基底膜的支撑基底。
12.根据权利要求11所述的多元分析光子晶体芯片，其中，所述基底膜选自聚二甲基硅氧烷、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚苯乙烯和聚丙烯中的至少一种。
13.根据权利要求11所述的多元分析光子晶体芯片，其中，所述支撑基底选自玻璃片、硅片、铝片中的一种。
14.一种制备权利要求1-13中任意一项所述的多元分析光子晶体芯片的方法，其特征在于，包括：
(1)在芯片基底上设置两个以上光子晶体位点以形成光子晶体微阵列，获得含有所述光子晶体微阵列的薄膜芯片；
(2)在所述薄膜芯片中，将至少一个光子晶体位点中光子晶体的表面设置特异性识别体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述特异性识别体接枝或者直接放置在所述光子晶体位点中光子晶体表面。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，该方法还包括采用含有如下步骤制备所述光子晶体微阵列：
(A)将至少两种含有模板材料的乳液分别与所述芯片基底表面进行接触以形成微阵列，然后进行第一干燥；其中，至少两种所述含有模板材料的乳液中的模板材料的粒子粒径不同；
(B)将光子晶体填充物质溶液与步骤(A)得到的微阵列中的模板材料进行接触并进行第二干燥，然后除去所述模板材料，获得光子晶体微阵列。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第一干燥的条件为：温度70-90℃，时间10-20min。
18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第二干燥的条件包括：温度为70-90℃，时间为1-10h。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，所述光子晶体填充物质溶液的质量浓度为1-3％。
20.根据权利要求16-19中任意一项所述的方法，其中，所述模板材料为纳米粒子。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述纳米粒子为单分散颗粒。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述单分散颗粒在所述含有模板材料的乳液中的质量浓度为0.5-5％。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述单分散颗粒在所述含有模板材料的乳液中的质量浓度为1.5-2.5％。
24.根据权利要求21所述的方法，其中，所述单分散颗粒为有机颗粒、无机颗粒、有机-无机复合颗粒和量子点中的一种或两种以上的组合。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述单分散颗粒为具有核壳结构的聚合物颗粒、氧化硅颗粒、聚苯乙烯颗粒、聚丙烯酸颗粒、金颗粒、银颗粒、铂颗粒、铜颗粒、氧化锌颗粒、氧化铁颗粒、四氧化三铁颗粒、氧化钛颗粒、碳颗粒、多巴胺颗粒、硅颗粒和量子点中的一种或两种以上。
26.根据权利要求14或15所述的方法，其中，该方法还包括采用如下步骤获得所述特异性识别体：对各个碱基序列的两端分别进行化学修饰以使得各个碱基序列的一端连接有接枝基团，另一端连接有受体物质。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，该方法还包括将所述特异性识别体接枝在所述光子晶体上的步骤：先将所述光子晶体与活化溶液接触以进行活化，得到活化的光子晶体，然后将所述特异性识别体与所述活化的光子晶体的表面接触以进行反应；并将反应后得到的光子晶体进行清洗。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述活化溶液中含有N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为10-200mg/mL，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为1-100mg/mL。
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