CN107356570A - 一种固态上转换荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固态上转换荧光探针及其制备方法与应用。固态上转换荧光探针的制备方法包括以下步骤：a.制备蛋白石光子晶体；b.制备上转换纳米粒子；c.上转换纳米粒子功能化修饰；d.上转换纳米粒子与蛋白石光子晶体复合，制成固态上转换荧光探针。本发明还公开了上述方法制备的固态上转换荧光探针及使用该探针检测肿瘤标记物的方法。本发明利用光子晶体效应对发光的调控，增强上转换发光强度，提高检测的灵敏度，降低检测下限；本发明提供的荧光探针是基于近红外光源激发的，所以能够很好地克服背景荧光干扰；本发明提供的荧光探针是固态探针，能够避免液态荧光探针中溶液浓度及分散性等因素对检测造成的干扰。

Description

一种固态上转换荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及化学检测技术领域，具体涉及一种固态上转换荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
癌症是威胁人类生命健康最重要的疾病之一，据全国肿瘤登记中心发布的《2015年中国肿瘤登记年报》显示我国2015年新发肿瘤病例约429万例，平均每分钟有8人被诊断为癌症，有5人死于癌症，且恶性肿瘤的发病率也呈逐年上升和年轻化趋势。恶性肿瘤发病率和死亡率逐年上升的最重要的原因是大多数恶性肿瘤患者在发病初期并无明显临床表现，癌症发现时大多数已处于中晚期，错过了黄金救治阶段。据世界卫生组织统计，早期癌症的治愈率可达到83％，尤其是一些发病率较高的癌症，如胃癌、乳腺癌、宫颈癌、口腔癌等，若能及早发现并妥善治疗可以极大地增加治愈率、提高患者的生存质量。癌症早期诊断最新、最有效的方法是通过血液检查寻找肿瘤标志物。因此，快速、灵敏、准确地检测出患者体液中的肿瘤标志物含量对癌症早期诊断具有重要的意义。近年来，随着科学技术的发展，肿瘤标志物检测技术已经有了巨大的进展，为癌症的诊断和预后判断提供了重要依据。其中，荧光检测方法与常规的免疫标记法、电化学免疫分析法等相比由于具有信号易于传导、响应速度快、特异性强等优点尤为受到关注。
稀土掺杂的上转换纳米材料可通过多光子机制将长波长的近红外光转换成短波长的可见光或紫外光，其发射光的波长及强度可由掺杂稀土元素的种类和浓度进行调控。上转换发光材料的激发光波长在红外光区域，可以有效地减小生物体被激发所产生的背景荧光、提高信噪比、减小光漂白，从而提高对复杂体系中生物分子或离子检测灵敏度、降低检测下限，因此，被认为是作为荧光检测中传感材料的理想选择。
近年来，科研人员在利用上转换纳米粒子作为荧光探针在生物检测方面已经进行了初步应用并取得了重要的研究成果。但是其面向实用化的过程中仍然存在两个主要问题：一是荧光探针不稳定：以往报道的上转换荧光检测大多是在液相环境中进行的，而作为荧光探针的纳米粒子溶液的浓度及粒子在溶液中的分散程度都会影响荧光探针的稳定性；二是上转换纳米粒子的发光效率低：稀土离子的电子跃迁主要来源于内壳层的4f-4f跃迁，导致吸收截面小，同时上转换纳米粒子合成过程中无法避免地会引入一些大声子振动官能团，导致发光效率低，这会严重影响生物检测的灵敏度和检测限。因此，研发一种具有高发光强度的固态荧光探针用于生物检测是非常重要的。
发明内容
本发明针对以上问题的提出，而研究设计一种固态上转换荧光探针及其制备方法与应用。本发明采用的技术手段如下：
一种固态上转换荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
a.制备蛋白石光子晶体：将微球分散在水中，制成浑浊液，将玻璃基板垂直插入该浑浊液中，28-40℃恒温20-30小时，优选32℃，通过溶液挥发过程中的表面张力将微球有序地组装到玻璃基板上，制成蛋白石光子晶体，将所述蛋白石光子晶体放置到100-120℃环境中40-60分钟，优选120℃，增加其机械强度；
b.制备上转换纳米粒子：将聚醚酰亚胺、NaCl及稀土硝酸盐放入乙二醇中进行充分搅拌，制成溶液一，将NH4F和乙二醇加入另一容器中进行充分搅拌，制成溶液二，将溶液二滴加至溶液一中，继续搅拌至溶液澄清后装入反应釜，180-240℃反应2-8小时，优选200℃，待反应釜自然降温至室温后，离心收集，并用乙醇和去离子水离心清洗，得到上转换纳米粒子；
c.上转换纳米粒子功能化修饰：将上转换纳米粒子分散在PBS缓冲液中，加入上转换纳米粒子质量10％-15％的活化生物素，在室温下搅拌4-8小时，生物素通过酰胺键共价连接到上转换纳米粒子上，产物经过离心收集并用PBS溶液清洗去除未连接的生物素，向溶液中加入亲和素修饰的肿瘤标记物捕获抗体；
d.上转换纳米粒子与蛋白石光子晶体复合：将步骤c所得的修饰好的上转换纳米粒子分散在PBS缓冲液中，制成修饰上转换纳米粒子分散液，将步骤a所得的长有蛋白石光子晶体的玻璃基板用PDMS封片后插入到所述修饰上转换纳米粒子分散液中，20-35℃恒温至修饰上转换纳米粒子分散液的溶剂全部挥发，优选25℃，制成固态上转换荧光探针。
进一步地，所述溶液一中，NaCl与稀土硝酸盐的物质的量比为2.5:1，NaCl与聚醚酰亚胺的质量比为1:2.74，NaCl与乙二醇的质量比为1:114.6，所述溶液二中，NH4F与乙二醇的质量比为1:75.4。
进一步地，所述微球为二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯。
进一步地，所述肿瘤标记物捕获抗体为CEA捕获抗体或CA-125捕获抗体。
进一步地，所述上转换纳米粒子为NaYF4:Yb,Er，所述稀土硝酸盐包括0.78-0.8摩尔份数的Y(NO3)3、0.18-0.2摩尔份数的Yb(NO3)3和0.02-0.05摩尔份数的Er(NO3)3。
进一步地，所述上转换纳米粒子为NaYF4:Yb,Tm，所述稀土硝酸盐包括0.79-0.8摩尔份数的Y(NO3)3、0.18-0.2摩尔份数的Yb(NO3)3和0.001-0.002摩尔份数的Tm(NO3)3。
一种固态上转换荧光探针，由本发明所述的固态上转换荧光探针的制备方法制得。
一种肿瘤标记物检测方法，使用本发明所述的固态上转换荧光探针。
进一步地，所述肿瘤标记物检测方法过程如下：将含有肿瘤标记物抗原的溶液与所述的固态上转换荧光探针接触，然后滴加BSA溶液作为封闭剂，再滴加相应的染料标记的肿瘤标记物抗体溶液，经过冲洗去除未连接的肿瘤标记物抗体，通过固态上转换荧光探针的光谱的变化检测肿瘤标记物的含量。
进一步地，所述肿瘤标记物为CEA或CA-125，所述染料为异硫氰酸荧光素(FITC)或罗丹明B(RB)。
与现有技术比较，本发明所述的固态上转换荧光探针及其制备方法具有以下优点：
1、利用光子晶体效应对发光的调控，增强上转换发光强度，提高检测的灵敏度，降低检测下限；
2、本发明提供的荧光探针是基于近红外光源激发的，所以能够很好地克服背景荧光干扰；
3、本发明提供的荧光探针是固态探针，能够避免液态荧光探针中溶液浓度及分散性等因素对检测造成的干扰。
附图说明
图1是本发明实施例1的固态上转换荧光探针在980nm红外光激发下，对不同浓度CEA检测的荧光光谱图。
图2是本发明实施例2的固态上转换荧光探针在980nm红外光激发下，对不同浓度CA-125检测的荧光光谱图。
图3是本发明实施例3的固态上转换荧光探针在980nm红外光激发下，对不同浓度CA-125检测的荧光光谱图。
具体实施方式
实施例1固态上转换荧光探针的制备及用于癌胚抗原(CEA)的检测
将PMMA微球分散在水中，将玻璃基板垂直插入PMMA微球的浑浊液中，然后放到28℃烘箱中30小时。通过溶液挥发过程中的表面张力将PMMA微球有序地组装到玻璃基板上。然后，将PMMA光子晶体放到120℃烘箱中40min来增加其机械强度。
将0.4g聚醚酰亚胺(PEI)、2.5mmolNaCl，0.798mmolY(NO3)3，0.2mmol Yb(NO3)3和0.002mmol Tm(NO3)3放置在烧杯中，加入15ml乙二醇充分搅拌，称取4mmol NH4F粉末于另一烧杯中，加10ml乙二醇，并搅拌；待两个样品搅拌至澄清溶液，将后者滴加至前者中继续搅拌至澄清装入反应釜中，本实施例中，将后者滴加至前者中继续搅拌10分钟后装入反应釜中，180℃反应8个小时，待反应釜自然降温至室温后，离心收集，并用乙醇和去离子水离心清洗3次，然后分散在PBS溶液中备用。
将已制备好的50mg PEI-NaYF4:Yb,Tm纳米粒子分散在PBS缓冲液中，然后加入5mg活化生物素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产的活化生物素)，混合溶液在室温下搅拌4小时。生物素通过酰胺键共价连接到纳米粒子上。产物经过离心收集并用PBS溶液清洗3次去除未连接的生物素。向溶液中加入亲和素修饰的CEA捕获抗体。
将已修饰好的上转换纳米粒子分散在PBS缓冲液中。将长有蛋白石光子晶体的玻璃基板用PDMS封片，然后竖直插入到PBS溶液中，放置在20℃烘箱中至溶液全部挥发，由于毛细管力的作用，上转换纳米粒子自组装到蛋白石的空隙中。
分别将0、1、20、80、100ng/mL的含有肿瘤标志物抗原CEA的溶液与荧光探针接触，然后滴加BSA溶液作为封闭剂，最后滴加染料FITC标记的CEA抗体溶液，经过冲洗去除未连接的抗体，由于抗原与抗体的特异性结合使得上转换纳米粒子与染料发生荧光共振能量传递效应，通过荧光探针光谱的变化检测肿瘤标志物的含量，用980nm激光器作为激发源，用光谱仪测试荧光探针的发光光谱，如图1所示。本发明使用的近红外激发光源成本低,小型便于携带。在实验结果中，我们可以观察到随着CEA抗原的加入，上转换纳米粒子的蓝光发射逐渐减弱，FITC黄绿色发光逐渐增强。这种探针的检测灵敏度高，可检测到的CEA抗原浓度低至1ng/mL。
实施例2固态上转换荧光探针的制备及用于糖类抗原(CA-125)的检测
将PS微球分散在水中，然后将玻璃片垂直插入PS微球的浑浊液中，然后放到32℃烘箱中24小时。通过溶液挥发过程中的表面张力将PS微球有序地组装到玻璃基底上。然后，将PS光子晶体放到110℃烘箱中40min来增加其机械强度。
将0.4g聚醚酰亚胺(PEI)、2.5mmolNaCl，0.78mmolY(NO3)3，0.2mmol Yb(NO3)3和0.02mmol Er(NO3)3放置在烧杯中，加入15ml乙二醇充分搅拌，称取4mmol NH4F粉末于另一烧杯中，加10ml乙二醇，并搅拌；待两个样品搅拌至澄清溶液，将后者滴加至前者中继续搅拌10分钟后装入反应釜中，200℃反应4个小时，待反应釜自然降温至室温后，离心收集，并用乙醇和去离子水离心清洗3次，然后分散在PBS溶液中备用。
将已制备好的50mg PEI-NaYF4:Yb,Er纳米粒子分散在PBS缓冲液中，然后加入6mg活化生物素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产)，混合溶液在室温下搅拌6小时。生物素通过酰胺键共价连接到纳米粒子上。产物经过离心收集并用PBS溶液清洗3次去除未连接的生物素。向溶液中加入亲和素修饰的CA-125捕获抗体。
将已修饰好的上转换纳米粒子分散在PBS缓冲液中。将长有PS蛋白石光子晶体的玻璃基板用PDMS封片，然后竖直插入到PBS溶液中，放置在25℃烘箱中保持6小时，至溶液全部挥发，由于毛细管力的作用，上转换纳米粒子自组装到蛋白石的空隙中。
分别将0、1、20、80、100ng/mL的含有肿瘤标志物抗原CA-125的溶液与荧光探针接触，，然后滴加BSA溶液作为封闭剂，最后滴加染料RB标记的CA-125抗体溶液，经过冲洗去除未连接的抗体，用980nm激光器作为激发源，用光谱仪测试荧光探针的发光光谱，如图2所示。在实验结果中，我们可以观察到随着CA-125抗原的加入，上转换纳米粒子的绿光发射逐渐减弱，RB红光发射逐渐增强。这种探针的检测灵敏度高，可检测到的CA-125抗原浓度低至1ng/mL。
实施例3
将SiO2微球分散在水中，然后将玻璃片垂直插入SiO2微球的浑浊液中，然后放到40℃烘箱中20小时。通过溶液挥发过程中的表面张力将SiO2微球有序地组装到玻璃基底上。然后，将SiO2光子晶体放到100℃烘箱中60min来增加其机械强度。
将0.4g聚醚酰亚胺(PEI)、2.5mmolNaCl，0.79mmolY(NO3)3，0.18mmol Yb(NO3)3和0.03mmol Er(NO3)3放置在烧杯中，加入15ml乙二醇充分搅拌，称取4mmol NH4F粉末于另一烧杯中，加10ml乙二醇，并搅拌；待两个样品搅拌至澄清溶液，将后者滴加至前者中继续搅拌10分钟后装入反应釜中，240℃反应2个小时，待反应釜自然降温至室温后，离心收集，并用乙醇和去离子水离心清洗3次，然后分散在PBS溶液中备用。
将已制备好的50mg PEI-NaYF4:Yb,Er纳米粒子分散在PBS缓冲液中，然后加入7.5mg活化生物素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产)，混合溶液在室温下搅拌8小时。生物素通过酰胺键共价连接到纳米粒子上。产物经过离心收集并用PBS溶液清洗3次去除未连接的生物素。向溶液中加入亲和素修饰的CA-125捕获抗体。
将已修饰好的上转换纳米粒子分散在PBS缓冲液中。将长有SiO2蛋白石光子晶体的玻璃基板用PDMS封片，然后竖直插入到PBS溶液中，放置在35℃烘箱中至溶液全部挥发，由于毛细管力的作用，上转换纳米粒子自组装到蛋白石的空隙中。
分别将0、2、10、50、80ng/mL的含有肿瘤标志物抗原CA-125的溶液与荧光探针接触，然后滴加BSA溶液作为封闭剂，最后滴加染料RB标记的CA-125抗体溶液，经过冲洗去除未连接的抗体，用980nm激光器作为激发源，用光谱仪测试荧光探针的发光光谱，如图3所示。在实验结果中，我们可以观察到随着CA-125抗原的加入，上转换纳米粒子的绿光发射逐渐减弱，RB红光发射逐渐增强这种探针的检测灵敏度高，可检测到的CA-125抗原浓度低至2ng/mL。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种固态上转换荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
a.制备蛋白石光子晶体：将微球分散在水中，制成浑浊液，将玻璃基板垂直插入该浑浊液中，28-40℃恒温20-30小时，制成蛋白石光子晶体，将所述蛋白石光子晶体放置到100-120℃环境中40-60分钟增加其机械强度；
b.制备上转换纳米粒子：将聚醚酰亚胺、NaCl及稀土硝酸盐放入乙二醇中进行充分搅拌，制成溶液一，将NH4F和乙二醇加入另一容器中进行充分搅拌，制成溶液二，将溶液二滴加至溶液一中，继续搅拌至溶液澄清后装入反应釜，180-240℃反应2-8小时，待反应釜自然降温至室温后，离心收集，并用乙醇和去离子水离心清洗，得到上转换纳米粒子；
c.上转换纳米粒子功能化修饰：将上转换纳米粒子分散在PBS缓冲液中，加入上转换纳米粒子质量10％-15％的活化生物素，在室温下搅拌4-8小时，生物素通过酰胺键共价连接到上转换纳米粒子上，产物经过离心收集并用PBS溶液清洗去除未连接的生物素，向溶液中加入亲和素修饰的肿瘤标记物捕获抗体；
d.上转换纳米粒子与蛋白石光子晶体复合：将步骤c所得的修饰好的上转换纳米粒子分散在PBS缓冲液中，制成修饰上转换纳米粒子分散液，将步骤a所得的长有蛋白石光子晶体的玻璃基板用PDMS封片后插入到所述修饰上转换纳米粒子分散液中，20-35℃恒温至修饰上转换纳米粒子分散液的溶剂全部挥发，制成固态上转换荧光探针。
2.根据前权利要求1所述的上转换纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述溶液一中，NaCl与稀土硝酸盐的物质的量比为2.5:1，NaCl与聚醚酰亚胺的质量比为1:2.74，NaCl与乙二醇的质量比为1:114.6，所述溶液二中，NH4F与乙二醇的质量比为1:75.4。
3.根据前权利要求1所述的固态上转换荧光探针的制备方法，其特征在于：所述微球为二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯。
4.根据前权利要求1所述的固态上转换荧光探针的制备方法，其特征在于：所述肿瘤标记物捕获抗体为CEA捕获抗体或CA-125捕获抗体。
5.根据前权利要求1所述的固态上转换荧光探针的制备方法，其特征在于：所述上转换纳米粒子为NaYF4:Yb,Er，所述稀土硝酸盐包括0.78-0.8摩尔份数的Y(NO3)3、0.18-0.2摩尔份数的Yb(NO3)3和0.02-0.05摩尔份数的Er(NO3)3。
6.根据前权利要求1所述的固态上转换荧光探针的制备方法，其特征在于：所述上转换纳米粒子为NaYF4:Yb,Tm，所述稀土硝酸盐包括0.79-0.8摩尔份数的Y(NO3)3、0.18-0.2摩尔份数的Yb(NO3)3和0.001-0.002摩尔份数的Tm(NO3)3。
7.一种固态上转换荧光探针，其特征在于，由权利要求1至6中任意一项所述的方法制得。
8.一种肿瘤标记物检测方法，其特征在于，使用权利要求7所述的固态上转换荧光探针。
9.根据权利要求8所述的肿瘤标记物检测方法，其特征在于，过程如下：将含有肿瘤标记物抗原的溶液与所述的固态上转换荧光探针接触，然后滴加BSA溶液作为封闭剂，再滴加相应的染料标记的肿瘤标记物抗体溶液，经过冲洗去除未连接的肿瘤标记物抗体，通过固态上转换荧光探针的光谱的变化检测肿瘤标记物的含量。
10.根据权利要求9所述的肿瘤标记物检测方法，其特征在于，所述肿瘤标记物为CEA或CA-125，所述染料为异硫氰酸荧光素或罗丹明B。
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