CN110373193A - 基于发光寿命变化的同能级稀土发光探针的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物成像技术领域，尤其涉及一种基于发光寿命变化的同能级稀土发光探针的制备及应用。该稀土发光寿命探针包含发光给体Ln、能量受体Qe、连接材料Link，结构通式为Ln‑Link‑Qe，发光给体由稀土纳米粒子(能量吸收与荧光发射发生于同一电子态能级)组成；能量受体与稀土纳米粒子的发光波段相匹配，并发生能量传递过程而改变荧光寿命；连接材料通过静电吸附、共价偶联或缠绕的方式使发光给体和能量受体结合以促使能量传递。该探针的稀土发光给体的发光过程符合一级反应动力学，其能量受体相对于发光给体的数目与稀土材料的荧光寿命呈线性关系，从而可以利用寿命信号，实现在复杂环境内的目标物检测，在生物检测领域有着重大的应用前景。

Description

基于发光寿命变化的同能级稀土发光探针的制备及应用
技术领域
本发明涉及生物成像技术领域，尤其涉及一种基于发光寿命变化的同能级稀土发光探针的制备及应用。
背景技术
生物成像技术目前已被广泛应用于医学检测等多个领域，其包括X射线成像、核磁共振成像、荧光成像等技术。生物成像技术具有非侵入、结果直观等优势，其中荧光成像技术凭借其成本低、操作简单、结果直观等优越特性，在生物成像领域占据重要地位。因此，目前已发展出多种荧光探针，用于体内外的荧光成像示踪和检测，如有机染料、无机量子点、碳纳米管、无机稀土纳米材料等。为了实现准确的生物示踪和检测，研究人员进一步地发展了一系列荧光探针：近红外区域的荧光探针，可以降低生物自发荧光对检测信号的影响；基于荧光强度的强度比信号检测的荧光探针，可以避免因探针浓度改变而导致的检测信号不准确。但在复杂环境内，不同波长荧光的散射、折射程度不尽相同；且在生物体内，不同厚度的组织的阻挡程度亦不同。因而基于荧光强度作为检测信号的荧光成像检测技术，仍难以实现在复杂环境的准确定量检测。
荧光寿命是荧光材料的本征特性，定义为发光强度衰减为初始强度1/e所需要的时间。当激发态的衰减过程符合一级反应动力学，则激发态的寿命只与反应速度常数成反比，而与初始激发布居数无关。将激发态上的能量转移至具有光谱重叠的能量受体，通过影响激发态的布居数来改变材料的荧光寿命，即共振能量转移过程。能量转移过程的构建能够用于目标物的检测。同时利用时间分辨荧光技术用脉冲激光激发荧光探针，延迟一定时间后才收集荧光(此时激发光关闭)，就可以完全滤除激发光的信号；同时，短寿命也会因为时间门控的存在而被滤除。
荧光寿命成像技术是一种基于荧光寿命变化的分子成像技术手段，例如用于钙离子成像和氧含量检测等。在这些应用实例当中，通常是检测分子与待检测物响应后，分子结构的改变引起的其寿命变化。利用寿命作为检测信号，能有效避免激发光强度、探针浓度、分布区域大小以及组织或组织液的吸收和散射等的影响。因此，荧光寿命成像技术有望成为生物、医学基础研究的重要研究手段。然而，发明人发现，目前寿命探针材料限于纳秒级，而生物体内许多自发荧光寿命亦处于该范围，因而无法避免生物体内自发荧光寿命的干扰。故要求进一步开发出长寿命的荧光寿命探针。尽管目前已有少量微秒级材料的报道，但仍然受限于材料的种类和表面亲水修饰。
稀土纳米材料具有丰富的发光能级，并且具备寿命长、发光稳定、表面易修饰等特性，适用于荧光成像。发明人发现，由于某些稀土离子独特的4f电子的能级结构，使得稀土离子的能量吸收和受激发射在同一电子态能级发生，该类过程理论上不存在除了吸收和发射以外的能量损失，具有极高的能量转换效率。例如，仅具有两个电子态能级的Yb3+离子，在975nm左右具有吸收峰，使用该波长的半导体激光器进行脉冲激发，随后使用时间门控关闭激发光，收集荧光，发射峰也在975nm处。其余如Er3+离子在1550nm、975nm左右，Tm3+离子在800nm、1208nm、1670nm左右，Nd3+离子在730nm、808nm、860nm左右，Ho3+离子在550nm左右等，它们都在相应波长处具有较大的吸收截面和合适的激发态寿命，可以在吸收光子后直接发出同一能级的荧光，特异性地用于时间分辨的高灵敏发光检测和成像。
最近，李富友等发展并保护了一种基于同一能级激发和发射的稀土纳米发光材料(CN108956556A)，此种材料的荧光衰减过程符合一级反应动力学，适合用于荧光寿命成像。但在在该专利申请中，同一能级激发和发射的稀土纳米发光材料仅被应用于成像示踪方面，而未对外界环境进行响应，也未能实现在简单或复杂环境下的检测。需要设计一种应用于对复杂体系(如生物体环境)进行准确检测和成像的荧光探针。因此，本发明开发了一种具有荧光寿命响应的稀土发光寿命探针，其稀土发光给体符合一级反应动力学，其能量受体相对于发光给体的数目与稀土材料的荧光寿命呈线性关系，可以实现在复杂环境内的目标物检测。具体而言，此探针结合了发光给体和受体，其中，发光给体具有单能级激发和发射的发光特征，发光受体具有较短的荧光寿命，激发态的寿命与反应速度常数成比例关系，寿命在微秒量级以上发生变化，尺寸为纳米量级，并且在亲水的溶剂相内均匀分散。本发明所开发的探针尺寸小、荧光寿命在微秒量级以上、检测灵敏、能用于检测诸生物体内等复杂环境下的荧光检测，在生物检测领域有着重大的应用前景。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种稀土发光寿命探针、其制备及其应用。
本发明第一方面涉及一种稀土发光寿命探针(也称为稀土发光寿命复合探针或稀土寿命复合探针，或简称为复合探针或寿命探针)，所述稀土发光寿命探针包含发光给体Ln、能量受体Qe、连接材料Link，且结构通式为Ln-Link-Qe，所述发光给体由稀土纳米粒子组成；所述稀土纳米粒子的能量吸收与荧光发射发生于同一电子态能级，且荧光发射波长处于近红外区；所述能量受体与所述稀土纳米粒子的发光波段相匹配，并发生能量传递过程，进而改变所述稀土纳米粒子的荧光寿命；所述连接材料通过静电吸附、共价偶联或缠绕的方式使所述发光给体和所述能量受体相结合，以促使二者之间的能量传递过程。
进一步地，所述稀土纳米粒子由发光内核和/或核壳Shell组成，当所述稀土纳米粒子仅由发光内核组成时，它的结构通式为AB1-xCxF4；当所述稀土纳米粒子由发光内核和核壳组成时，它的结构通式为AB1-xCxF4@Shell；其中，A选自Li、Na、K、Ca或Ba，B选自Gd、La、Sc或Y，C选自Nd、Er、Tm或Yb，且0<x≤1；核壳包括但不限于NaYF4、NaLuF4、NaGaF4、NaLaF4及CaF2；连接材料包括但不限于卵磷脂、聚乙二醇、聚丙烯酸、抗原抗体适配子及链霉亲和素-生物素；能量受体包括但不限于有机染料、贵金属材料、配合物及无机纳米材料。
优选地，A为Na，B为Y，C为Tm，x＝0.01，所述连接材料为链霉亲和素-生物素或卵磷脂，所述能量受体为金纳米棒或IR-820花菁染料。
进一步地，所述稀土发光寿命探针能分散于液体环境中并形成均相溶液，所述液体环境包括但不限于水、缓冲液、DMSO、DMF、乙醇、生理盐水及血液。
本发明另一方面涉及一种制备所述稀土发光寿命探针的方法，该方法包括以下步骤：
5.1、在110℃下，使所述稀土纳米粒子中A、B和C所代表元素的氯化盐在油酸溶剂中搅拌溶解；
5.2、加入氟源，除去水分及其他低沸点化合物，经无水无氧处理后，在氮气氛围下升温至290-310℃，反应50-60分钟；
5.3、反应结束后，使反应液自然冷却至室温，用无水乙醇洗涤，然后离心，得到表面为油酸配体的稀土发光固体材料，将该固体材料分散于环己烷溶液中；
5.4、将步骤5.3所得溶液与四氟硼酸亚硝胺饱和二氯甲烷溶液进行充分混合，直至不再产生沉淀；
5.5、对步骤5.4所得溶液进行离心处理，得到固体沉淀，用少量无水乙醇洗涤该固体沉淀，再次进行离心处理，收集固体沉淀，并将该固体沉淀分散于无水乙醇中。
进一步可选地，该方法还可以包括以下步骤：
5.6、将步骤5.5所得溶液加至单口烧瓶中，然后往烧瓶中加入卵磷脂并混合均匀，再往烧瓶中加入用乙醇制备的IR-820花菁染料溶液，并另外再加10mL无水乙醇，避光条件下剧烈搅拌所得溶液8至12小时以充分混合；
5.7、通过减压蒸馏装置除去步骤5.6所得溶液中的溶剂，得到干燥的固体材料；
5.8、将步骤5.7所得固体材料分散于水中，然后离心以将没有包覆在材料表面的染料除去，再次将离心所得沉淀固体分散于水中。
本发明还涉及一种利用所述稀土发光寿命探针定量检测目标物质的方法，检测系统包括样品台、滤光片、汇聚镜头、检测器、波形发生器、激发光源、计算机，该方法包括以下步骤：
7.1、将不同浓度的目标物质的标准品溶液加至所述稀土发光寿命探针的水溶液中，使用近红外激光激发，并用检测器收集荧光衰减信号，获取不同时间的荧光成像图，计算各个荧光寿命值，进而得到与目标物质相关的荧光寿命工作曲线；
7.2、将待检测样品加至所述稀土发光寿命探针的水溶液中，通过同样的步骤得到待检测样品的荧光寿命值；
7.3、将步骤7.2中测得的待检测样品的荧光寿命值代入荧光寿命工作曲线中，得到样品中目标物质的含量。
进一步地，所述方法可利用荧光寿命作为检测信号，用于体外检测或者在活体内检测所述目标物质；当使用所述探针在活体内检测时，通过包括注射、口服在内的方式使所述探针进入生物体内，到达待检测目标位置后即可进行检测。
进一步地，所述方法可以实现对金属离子、活性氧物质、蛋白分子的检测；所述金属离子包括但不限于Cu、Zn、Hg，所述活性氧物质包括但不限于HClO、O2·-、H2O2、·OH、等，所述蛋白分子包括但不限于链霉亲合素蛋白、抗原抗体适配子。
进一步地，所述激发光源包括但不限于波长为660nm、785nm、808nm、975nm、1525nm的氙灯或LED灯；所述检测器包括但不限于电子倍增CCD、像增强型CCD、CMOS、InGaAs相机、光电倍增管、光纤光谱仪以及其他任何符合需求的光谱、成像设备；在时间门控系统控制下，激发光为脉冲光，与检测设备联用后，不受激发光和短寿命荧光的影响，所检测荧光与激发光的波长相同或者波长相差小于10nm。
在一个优选实施方式中，所述探针的结构通式为NaY0.99Tm0.01F4-SB-Au，其中SB为特异性识别的蛋白质(如链霉亲和素和生物素、抗原和抗体等)，分别修饰在稀土纳米材料和金表面；Au为金纳米棒，吸收波长与稀土材料的发射波长匹配，能够实现链霉亲和素的检测。具体地，当环境中存在吸附有链霉亲和素的金纳米棒时，会与表面修饰了生物素的稀土发光纳米材料识别而拉近两者的距离。此时用激发波长为780nm的激光激发该优选材料的稀土发光给体，同时发光给体激发态的能量转移到了金纳米棒，稀土发光给体的寿命相应的变短，从而实现链霉亲和素的检测。
在一个更优选实施方式中，所述探针的结构通式为：NaY0.99Tm0.01F4-PC-IR820，其中，PC为卵磷脂两亲性材料，IR-820为一种对次氯酸具有特异性响应的有机小分子染料。该稀土发光寿命探针能够分散在水溶液当中，通过IR-820染料对次氯酸的特异性定量响应，从而实现稀土发光材料的寿命调控来实现次氯酸的定量检测。
一个比较典型的检测体系构建方案如表1所示。
表1
进一步地，稀土发光寿命探针的结构通式为AB1-xCxF4-Link-Qe或AB1-xCxF4@Shell-Link-Qe。
进一步地，本发明还提供上述稀土发光寿命探针材料的制备方法。
(1)取稀土发光中心对应的Na、Y和L元素的氯化盐，在110℃下于油酸溶剂中搅拌溶解。
(2)加入氟源之后除去水分及其他低沸点化合物，经过无水无氧处理后，在氮气氛围下升温到290-310℃，反应50-60分钟。
(3)反应结束后使反应液自然冷却至室温，用无水乙醇洗涤后离心分离得到固体，即为表面为油酸配体的稀土发光材料，将固体材料分散在环己烷溶液中。
(4)将步骤(3)中的分散有固体材料的环己烷溶液和四氟硼酸亚硝胺饱和二氯甲烷溶液混合，剧烈震荡、充分混合到不再产生沉淀。
(5)将上述混合溶液用离心分离得到沉淀固体。用少量无水乙醇洗涤后再次用离心收集固体，将固体材料分散在无水乙醇当中。
(6)优选的，将步骤(5)中的分散有稀土材料的无水乙醇溶液加入到单口烧瓶中，然后加入卵磷脂混合均匀，再加入分散在乙醇当中的IR-820花菁染料溶液及另外再加10mL无水乙醇。混合溶液剧烈搅拌8-12小时，保持避光状态。
(7)优选的，将步骤(6)中的混合材料用减压蒸馏装置除去体系当中的溶剂，材料在烧瓶表面呈干燥的固体状态。
(8)优选的，将步骤(7)中的固体材料用水分散，然后用离心分离方法将没有包覆在材料表面的染料除去。得到固体后最后再用水分散。
优选的，本发明所提供的稀土发光寿命探针，可以在同能级激发和发射后，利用该激发态能级的荧光寿命变化作为检测信号，应用在复杂体系或生物体内以及实现活性氧物质的特异准确检测，其具体方法为：
将上述稀土-卵磷脂发光寿命探针的水溶液保持在1-5mg/mL，皮下注射到小动物体内，注射剂量为15μL。使用功率密度5-100mW/cm2，波长为780nm的近红外激光激发，用像增强相机(EmICCD)收集荧光衰减信号。具体的，通过波形发生器调节激光的脉冲宽度和相位，并且同步相机的延迟时间和信号采集的宽度和采集时间范围。在获取一系列不同时间的荧光成像图后，将图片中的强度信息和时间信息提取出来后，拟合随时间变化的荧光衰减图，从而计算得出荧光寿命值。
将上述稀土-染料发光寿命探针的水溶液进行活性氧物质次氯酸滴定时，稀土发光寿命探针的浓度保持在1mg/mL，次氯酸浓度为0.01M。使用基于单光子计数法的光电倍增管PMT测定在800nm处的发光寿命变化。通过OPO纳米激光进行激发，激发波长为780nm。次氯酸缓慢加入到寿命探针的水溶液当中，通过磁力搅拌混合均匀，反应完全后进行寿命测试，获得体外滴定的发光寿命工作曲线。将上述稀土-染料发光寿命探针分别与不同浓度的次氯酸在体外混合好后，皮下注射到小鼠体内，用发光寿命成像系统进行发光衰减的系列成像，从而获得活体内的荧光寿命滴定工作曲线。
将该稀土发光寿命探针的水溶液保持在1-5mg/mL，注射到构建关节炎模型的小鼠的炎症部位和正常部位，待10分钟后进行发光寿命成像，使用10-100W/cm2的785nm激光对小鼠注射材料部位进行照射，对获得的一系列发光寿命成像图进行分析后获得发光寿命变化值。通过对比体内的工作曲线而获得关节炎模型处的活性氧含量，实现准确、高灵敏度的检测。
优选的，将稀土发光纳米材料给体用酸洗法去除表面的油酸配体后，加入适量的柠檬酸三钠固体到去配体的稀土纳米材料中。用CTAB法制成的金纳米棒吸收在520nm和800nm，加入到柠檬酸配体的稀土纳米粒子溶液当中，以一定比例混合后，将混合液加入到比色皿中，比色皿放在样品台上，使用波长为785nm的近红外激光激发，用像增强相机(EmICCD)收集荧光衰减信号。在获取一系列不同时间的荧光成像图后，将图片中的强度信息和时间信息提取出来后，得到随时间变化的荧光衰减图。将去配体后的稀土纳米粒子表面修饰生物素，金纳米棒表面修饰链霉亲合素。将两者以一定比例混合后，测定荧光衰减曲线。
优选的，荧光寿命探针实现复杂环境内目标物检测是基于探针与目标检测物发生特异性识别，通过改变探针的荧光寿命而实现的检测，具有抗外界干扰的特点。测试寿命衰减曲线的方法中，激发光源为660nm、785nm、808nm、975nm、1525nm等波段的光源或氙灯、LED灯等光源；检测设备包括电子倍增CCD、像增强型CCD、CMOS、InGaAs相机、光电倍增管、光纤光谱仪等光谱、成像设备。使用相应的脉冲激光激发材料，通过波形发生器设定激光频率后与相机的延迟时间同步，在一定的曝光之后采集信号，得到相应的时间分辨荧光成像图，经过电脑软件处理获得的图像后，得到对应的寿命值。附图33为本发明的实施方式中的信号收集和处理的发光寿命探测系统的结构示意图。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明稀土发光纳米材料给体具有同一能级激发和发射的特点；以及尺寸均一，激发和发射波长处于近红外区，荧光寿命处于微秒级，且寿命不易受外界环境影响的优点。该发光给体的发光过程符合一级反应动力学，其荧光寿命的变化将不受激发光功率和材料浓度的变化的影响。
(2)本发明所提供的稀土发光寿命探针，具有尺寸小、生物相容性好、可修饰性强等优点。以及具有发光寿命变化作为检测信号的特点，能够进一步的避免环境、检测条件等带来的检测误差，实现更高灵敏度、准确度的检测。
(3)本发明提供的稀土发光寿命探针的构建思路，具有可替代性强的特点。基于能量转移过程的建立，可以改变能量受体和能量给体的组合，实现不同物质的特异性、高灵敏度、准确检测；通过改变结合方式，可以满足不同方式的检测要求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式，下面将结合附图作简单的介绍。显然，下述附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。为了使本发明更清楚，附图不一定按实际比例进行绘制。
图1是实施例1的NaYF4:Tm发光探针的透射电子显微成像照片；
图2是实施例2中NaYF4:Yb发光探针的透射电子显微成像照片；
图3是实施例2中NaYF4:Nd发光探针的透射电子显微成像照片；
图4是实施例2中NaYF4:Er发光探针的透射电子显微成像照片；
图5是实施例3中LiYF4:Nd发光探针的透射电子显微成像照片；
图6是实施例3中KYbF3发光探针的透射电子显微成像照片；
图7是实施例3中CaYbF4发光探针的透射电子显微成像照片；
图8是实施例3中BaYbF4发光探针的透射电子显微成像照片；
图9是实施例4中LiLuF4:Nd发光探针的透射电子显微成像照片；
图10是实施例4中NaGdF4:Nd发光探针的透射电子显微成像照片；
图11是实施例4中NaScF4:Nd发光探针的透射电子显微成像照片；
图12是实施例4中NaLaF4:Yb发光探针的透射电子显微成像照片；
图13是实施例5中外层包覆NaYF4发光探针的透射电子显微成像照片；
图14是实施例5中外层包覆NaLuF4发光探针的透射电子显微成像照片；
图15是实施例5中外层包覆NaGaF4发光探针的透射电子显微成像照片；
图16是实施例5中外层包覆NaLaF4发光探针的透射电子显微成像照片；
图17是实施例5中外层包覆CaF2发光探针的透射电子显微成像照片；
图18是实施例6中表面配体为卵磷脂的复合发光材料NaYF4:Tm@PC的透射电子显微成像照片；
图19是实施例7中NaLuF4:Tm@PEG-IR820材料的紫外吸收光谱；
图20是实施例8中NaGaF4:Tm@PAA-IR820材料的傅里叶变换红外光谱图；
图21是实施例9中NaLuF4:Tm@PEG-IR820的寿命衰减曲线；
图22是实施例9中NaLuF4:Tm@PEG-IR820的寿命滴定曲线；
图23是实施例9中NaLuF4:Tm@PEG-IR820的组织覆盖寿命对比关系图；
图24是实施例10中NaGaF4:Tm@PAA-IR820复合探针在正在活体内的次氯酸检测实例；
图25是实施例11中表面配体为卵磷脂的稀土发光寿命探针NaScF4:Yb@PC-Cy890的紫外吸收光谱图；
图26是实施例12中NaLuF4:Yb@NaLuF4@PC-Cy890复合探针的次氯酸荧光滴定图；
图27是实施例12中NaLuF4:Yb@NaLuF4@PC-Cy890复合探针的强度衰减曲线；
图28是实施例13中金纳米棒的透射电子显微成像照片；
图29是实施例14中金纳米棒表面链霉亲合素修饰的紫外吸收光谱图；
图30是实施例15中用HABA-Avidin试剂表征稀土纳米粒子表面的生物素的紫外吸收光谱图；
图31是实施例16中稀土材料和淬灭剂金的电荷吸附模型；
图32是实施例17中稀土材料和淬灭剂金的检测蛋白模型寿命衰减图；
图33是本发明具体实施方式中的信号收集和处理的发光寿命探测系统结构示意图；
图34是本发明的稀土发光寿命探针的工作原理示意图；
其中，1-样品台，2-滤光片，3-汇聚镜头，4-检测器，5-波形发生器，6-光源，7-计算机。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明的各实施方式进行详细的阐述。所使用的每个实施例或示例性语言(例如，“例如”)旨在解释本发明，而非以任何形式限制本发明。除非另有说明，否则术语“包含”、“包括”、“具有”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求要素对于本发明的实践是必不可少的。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求中列出的数值参数应理解为由术语“约”修饰(即，为近似值)，其可以根据实际需要而进行改变。尽管阐述本文所提出主题事项的数值范围和参数为近似值，但具体实施例中尽可能地给出了精确的数值。应理解，任何数值本身都包含由每次实验操作所引起的误差。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义。本发明使用化学元素的常用化学缩写来对该化学元素进行讨论例如，用化学缩写F表示氟，Y表示钇，等等。
在以下实施例中，核壳结构中的@表示被核壳(shell)包裹，即，@前的物质为发光内核，@后的物质为核壳。
实施例1：纳米粒子NaYF4:Tm的合成
取0.99mmol的YCl3和0.01mmol的TmCl3固体粉末加至含有6mL油酸、15mL十八烯的100mL三口瓶中，加入磁子和温度计后搭建空气冷凝装置。在氮气氛围下将温度上升至110℃，待氯化物完全溶解后再降至室温。边搅拌边将配好的溶解有4mmol氟化铵和2.5mmol氢氧化钠的10mL甲醇溶液逐滴滴加至反应瓶中，反应溶液逐渐变浑浊。然后在室温下搅拌15分钟后逐渐升温至110℃，在流动氮气的氛围中除掉甲醇。接着抽真空除去剩余的低沸点物质后，在氮气氛围下快速升温至300℃反应1小时。反应结束后关闭加热，保持搅拌。待温度降至室温后，加入20mL乙醇析出产物，15000rpm离心分离后取沉淀。然后用乙醇重复洗三遍后，分散在10mL环己烷中保存。
图1是本实施例中的NaYF4:Tm发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为27nm，材料分散性好，粒径均一。
实施例2：纳米粒子NaYF4:Yb、NaYF4:Nd、NaYF4:Er的合成
NaYF4:Yb、NaYF4:Nd、NaYF4:Er纳米粒子的合成步骤和NaYF4:Tm纳米粒子的合成相同，其中需要把TmCl3固体粉末换成YbCl3、NdCl3或ErCl3。
图2是本实施例中的NaYF4:Yb发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为10nm，材料分散性好，粒径均一。
图3是本实施例中的NaYF4:Nd发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为6.5nm，材料分散性好，粒径均一。
图4是本实施例中的NaYF4:Er发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为38nm，材料分散性好，粒径均一。
实施例3：纳米粒子LiYF4:Nd、KYbF3、CaYbF4、BaYbF4的合成
LiYF4:Nd、KYbF3、CaYbF4、BaYbF4纳米粒子的合成步骤和NaYF4:Tm纳米粒子的合成相同，其中需要把TmCl3固体粉末换成YbCl3或NdCl3，把NaOH固体换成LiOH、KOH、Ca(OH)2或者Ba(OH)2。
图5是本实施例中的LiYF4:Nd发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为31nm，材料分散性好，粒径均一。
图6是本实施例中的KYbF3发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为5nm，材料分散性好，粒径均一。
图7是本实施例中的CaYbF4发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为10nm，材料分散性好，粒径均一。
图8是本实施例中的BaYbF4发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为32nm，材料分散性好，粒径均一。
实施例4：纳米粒子LiLuF4:Nd、NaGdF4:Nd、NaScF4:Nd、NaLaF4:Yb的合成
LiLuF4:Nd、NaGdF4:Nd、NaScF4:Nd、NaLaF4:Yb纳米粒子的合成步骤和NaYF4:Tm纳米粒子的合成相同，其中需要把TmCl3固体粉末换成YbCl3或NdCl3，NaOH换成LiOH，YCl3换成LuCl3、GdCl3、ScCl3或LaCl3。
图9是本实施例中的LiLuF4:Nd发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为10nm，材料分散性好，粒径均一。
图10是本实施例中的NaGdF4:Nd发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为7.5nm，材料分散性好，粒径均一。
图11是本实施例中的NaScF4:Nd发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为88nm，材料分散性好，粒径均一。
图12是本实施例中的NaLaF4:Yb发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为8nm，材料分散性好，粒径均一。
实施例5：核壳NaYF4、NaLuF4、NaGaF4、NaLaF4、CaF2的包裹
发光探针核壳的包裹以NaYF4:Yb@NaYF4为例(其中，NaYF4:Yb为发光内核，@表示核壳包裹，NaYF4为核壳)，其他发光探针的包覆只需加入相应的发光探针内核即可。具体的合成步骤为：取0.25mmol分散在环己烷中的NaYF4:Yb，以及0.5mmol的Y(CF3COO)3和0.5mmol的CF3COONa，加至含有20mmol油酸和20mmol十八烯的100mL三口烧瓶中。在氮气氛围下除去环己烷，在真空状态下，保持110℃使固体粉末完全溶解。在氮气氛围下快速升温至300℃，反应45分钟后关闭加热，保持搅拌状态。待温度降至室温后，加入20mL乙醇析出产物，15000rpm离心分离后取沉淀。然后用乙醇重复洗三遍后，分散在10mL环己烷中保存。
核壳NaLuF4、NaGaF4、NaLaF4、CaF2的包裹的合成步骤和NaYF4:Yb@NaYF4纳米粒子的合成相同，其中需要把Y(CF3COO)3固体粉末换成Lu(CF3COO)3、Ga(CF3COO)3、La(CF3COO)3或Ca(CF3COO)3。
图13是本实施例中外层包覆NaYF4的发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为15nm，材料分散性好，粒径均一。
图14是本实施例中外层包覆NaLuF4的发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为56nm，材料分散性好，粒径均一。
图15是本实施例中外层包覆NaGaF4的发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为9nm，材料分散性好，粒径均一。图16是本实施例中外层包覆NaLaF4的发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为18nm，材料分散性好，粒径均一。
图17是本实施例中外层包覆CaF2的发光探针的透射电子显微成像照片，材料尺寸为14nm，材料分散性好，粒径均一。
实施例6：稀土发光寿命探针NaYF4:Er-PC-Rh730的制备
取1mL表面为油酸的稀土纳米粒子环己烷溶液，加入2-3倍体积的饱和NOBF4二氯甲烷溶液后开始出现沉淀，充分震荡直到不再产生新的沉淀。用14000rpm离心10分钟后，除去上清液，将沉淀复分散在200μL无水乙醇中，用15000rpm离心10分钟后留沉淀，然后再次将沉淀分散在1mL无水乙醇中待用。
取250μL(约5mg)分散在乙醇中的去配体纳米材料，与5mg分散在1mL二氯甲烷溶液中的卵磷脂一同加至含有10mL乙醇的单口瓶中，充分混匀后用旋转蒸发仪缓慢除去乙醇和二氯甲烷溶液。待溶液完全除去后，加入1mL水重新分散得到的复合材料待用。记为NaYF4:Er@PC，浓度为5mg/mL。
取250μL(约5mg)分散在乙醇中的去配体纳米材料、30μL分散在乙醇中的Rh730(1μmol/mL)和5mg分散在1mL二氯甲烷溶液中的卵磷脂一同加至含有10mL乙醇的单口瓶中，充分混匀后用旋转蒸发仪缓慢除去乙醇和二氯甲烷溶液。待溶液完全除去后，加入1mL水重新分散得到的复合材料待用。记为NaYF4:Er@PC-Rh730，浓度为5mg/mL。其中，Rh730表示吸收在730nm处的罗丹明染料。
图18是本实施例中转到水溶液中，表面配体为卵磷脂的复合发光材料NaYF4:Tm@PC的透射电子显微成像照片。纳米颗粒的粒径为27nm，粒径均一，分散性好，表明已制备出实用级的复合纳米材料。
实施例7：稀土发光寿命探针NaLuF4:Tm-PEG-IR820的制备
NaLuF4:Tm纳米材料分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，浓度为5mg/mL，加入20mg甲氧基氨基聚乙二醇固体后，再用1mL的N,N-二甲基甲酰胺稀释，充分混匀十二小时后，离心洗涤一次，得到NaLuF4@PEG。然后用与NaYF4:Er@PC-Rh720相同的方法包裹染料IR820，得到NaLuF4:Tm@PEG-IR820。
图19是本实施例中的NaLuF4:Tm@PEG-IR820材料的紫外吸收光谱，证明IR820染料已成功包覆在稀土发光纳米粒子表面。
实施例8：稀土发光寿命探针NaGaF4:Tm-PAA-IR820的制备
NaGaF4:Tm@PAA-IR820纳米材料表面配体去除的方法与NaYF4:Er@PC-Rh730相同，其中将NaYF4:Er替代为NaGaF4:Tm，卵磷脂PC替代为聚丙烯酸PAA，Rh720替代为染料IR820，得到NaGaF4:Tm@PAA-IR820。
图20是本实施例中NaGaF4:Tm@PAA-IR820材料的傅里叶变换红外光谱图，如图所示，聚丙烯酸成功包在材料外面，该复合纳米结构已被成功构建。
实施例9：稀土寿命探针NaLuF4:Tm-PEG-IR820的次氯酸检测
荧光寿命在爱丁堡FLS920荧光光谱仪上测得，激发光源为OPO激光器。用1cm*1cm石英比色皿盛放待测样品。取200μL的NaLuF4:Tm@PEG-IR820复合探针(5mg/mL)加至比色皿中，用水稀释至1.5mL。配置3.7mmol/mL的次氯酸钠水溶液，逐渐将次氯酸滴加至复合探针溶液中，充分搅拌反应完全后进行寿命测试。将得到的荧光衰减曲线图用寿命公式计算后得到相应的寿命。将100μL，与上述同样浓度的NaLuF4:Tm@PEG-IR820复合探针加至96孔板中，分别加入不同体积的3.7mmol/mL的次氯酸钠水溶液。使用785nm的脉冲激光激发材料，通过波形发生器将激光频率设定为1KHz，占空200μs，同步相机的延迟20μs采集信号，每次采集曝光时间为50μs，采集时间为7520μs。用厚度为1mm的猪肉片覆盖在装有材料的96孔板的孔上，分别采集覆盖猪肉片前后的时间分辨荧光成像图，经过电脑软件处理获得的图像后，得到对应的寿命值。
图21为本实例中复合材料NaLuF4:Tm@PEG-IR820在不同次氯酸浓度时对应的寿命衰减曲线图。
图22为本实例中用寿命衰减曲线计算得到的寿命值，随着次氯酸浓度的增加，寿命逐渐增大，从100μs到700μs的寿命变化。其中，在次氯酸浓度不大于30μM、不小于1μM的范围内，寿命变化与次氯酸浓度呈线性关系。但是由于淬灭剂染料为反应型探针，因此其线性检测范围与淬灭剂的负载量有关。淬灭剂负载量越少，检测灵敏度越高。
图23为覆盖1mm猪肉片前后的荧光寿命值与不同次氯酸浓度的关系图。如图所示，随着次氯酸浓度的增加，NaLuF4:Tm@PEG-IR820复合探针的寿命逐渐恢复，并且覆盖猪肉片前后其荧光寿命在误差范围内保持不变。
实施例10：稀土寿命复合探针NaGaF4:Tm-PAA-IR820用于活体次氯酸检测
将制备好的50μL角叉菜胶水溶液(10mg/mL)通过足垫注射到小白鼠(Balb/c)的右后掌，建立关节炎模型。4小时后麻醉小白鼠，分别将50μL的NaGaF4:Tm@PAA-IR820水溶液(5mg/mL)通过足垫注射的方式注入小鼠左右后掌内，用异氟烷气体麻醉小鼠后，立即用EmICCD相增强相机进行寿命成像。使用785nm的脉冲激光激发材料，通过波形发生器将激光频率设定为1KHz，占空200μs，同步相机的延迟20μs采集信号，每次采集曝光时间为50μs，采集时间为7520μs。经电脑收集处理获得图谱后，进一步地，我们可以获得在正常组织和关节炎处的材料的荧光寿命分布图。
图24为本实施例中的NaGaF4:Tm@PAA-IR820复合探针在正常组织和关节炎处的荧光寿命分布图。用高斯函数拟合后得到材料的平均寿命相差100μs，结合在体外得到的工作曲线，不考虑材料的解体和染料的光淬灭，可以认为关节炎处小鼠的次氯酸含量不超过9nmol。
实施例11：稀土寿命复合探针NaScF4:Yb-PC-Cy890的制备
取250μL(约5mg)表面为油酸的稀土纳米粒子环己烷溶液，与30μL，1μmol/mL分散在二氯甲烷中的Cy890，5mg分散在1mL二氯甲烷溶液中的卵磷脂一同加至含有10mL二氯甲烷的单口瓶中，充分混匀后用旋转蒸发仪缓慢除去环己烷和二氯甲烷溶液。待溶液完全除去后，加入1mL水重新分散得到的复合材料待用。记为NaScF4:Yb@PC-Cy890，浓度为5mg/mL。
图25是本实施例中转到水溶液中，表面配体为卵磷脂的稀土发光寿命探针NaScF4:Yb@PC-Cy890的紫外吸收光谱图，证明已成功构建包裹了染料的稀土寿命探针。
实施例12：稀土寿命复合探针NaLuF4:Yb@NaLuF4-PC-Cy890用于次氯酸检测
将稀土发光寿命探针溶液NaLuF4:Yb@NaLuF4@PC-Cy890存放于比色皿中，一边加入一定浓度的次氯酸溶液，一边进行荧光强度光谱和荧光寿命的测试。激发光源为980nm激光器，其他测试条件与NaLuF4:Yb@NaLuF4@PC-Cy890相同。
图26为本实施例NaLuF4:Yb@NaLuF4@PC-Cy890复合探针在滴加次氯酸过程中的荧光强度光谱。
图27为本实施例NaLuF4:Yb@NaLuF4@PC-Cy890复合探针在不同次氯酸浓度的条件下测定的荧光强度衰减曲线，可以直观地看到在存在次氯酸的情况下荧光寿命为1017μs，不存在次氯酸的情况下荧光寿命为1299μs。
实施例13：金纳米棒的合成和表面修饰
将5mL氯金酸溶液(0.5mM)和5mL的CTAB溶液(0.2M)混合在离心管中，加入0.6mL冷冻的0.01M的硼氢化钠溶液，剧烈震荡2分钟后在25℃恒温箱中静置2小时，为晶种液。取5mL的CTAB溶液(0.2M)、5mL的氯金酸溶液(1mM)、0.5mL的硝酸银溶液(4mM)和0.07mL的抗坏血酸(0.1M)混合后，搅拌2分钟混匀，然后加入0.012mL的晶种液，剧烈搅拌2分钟后，在25℃恒温箱中静置12小时。反应结束后12000rpm离心10分钟后，用水洗涤一次，分散于4mL水中。
图28是本实施中金纳米棒的电子显微镜图，金纳米棒的长轴约100nm，短轴约20nm，分散性良好。
实施例14：金纳米棒的表面修饰
取10μg合成的金纳米棒分散于PBS缓冲液中，加入30μg的链霉亲合素蛋白，室温混匀20分钟后，离心去除多余的链霉亲合素蛋白，得到表面吸附有链霉亲和素的金纳米棒溶液。
图29为表面吸附有链霉亲合素蛋白的金纳米棒的紫外吸收表征。通过与未修饰蛋白的金纳米棒吸收峰进行对比，可以得知金纳米棒表面成功吸附了链霉亲合素蛋白。
实施例15：稀土发光寿命探针NaYF4:Er的表面修饰
取5mg分散在环己烷溶液中的NaYF4:Er稀土发光材料至25mL单口瓶中，加入5mL二氯甲烷溶液稀释后，加入5mg分散在二氯甲烷溶液中的卵磷脂-聚乙二醇-生物素聚合物溶液，充分搅拌均匀后，用减压蒸馏的方式除去二氯甲烷和环己烷溶液，然后用2mL水超声分散。12000rpm的转速离心洗涤两次之后，分散在2mL水中待用。
图30为用HABA-Avidin试剂表征稀土纳米粒子表面的生物素的紫外吸收光谱图。从光谱图中我们可以得知纳米粒子表面成功修饰有生物素。
实施例16金纳米棒作用稀土寿命变化的检测验证
通过CTAB法合成的长轴直径为60nm的金棒吸收在520nm和800nm，表面带正电荷。将500μL表面为油酸的稀土纳米粒子环己烷溶液置于2mL离心管中，加入1mL丙酮混匀后，再加入8μL浓HCl，超声10分钟后，用10000rpm离心6分钟后，留下固体沉淀。加入300μL无水乙醇分散后，再用14000rpm离心15分钟后留沉淀，然后再次将沉淀分散在500μL去离子水中。加入10mg柠檬酸三钠固体到去配体的稀土纳米粒子水溶液中，充分搅拌12小时后，15000rpm离心10分钟后留下沉淀，去除多余的柠檬酸三钠配体。
将表面配体为柠檬酸三钠的NaYF4:Tm纳米粒子分散在500μL水中。取200μL加至比色皿中，比色皿放在样品台上，使用785nm的脉冲激光激发材料，通过波形发生器将激光频率设定为1KHz，占空200μs，同步相增强相机emICCD相机的延迟20μs采集信号，每次采集曝光时间为50μs，采集时间为7520μs。将表面配体为柠檬酸三钠的NaYF4:Tm纳米粒子和表面配体为CTAB的金纳米棒以摩尔比为8:1、5:2混合后，分别测试在800nm处的荧光寿命变化。
图31为本实施例中的发光探针NaYF4:Tm与不同浓度金棒混合之后的寿命衰减曲线图。对图中的曲线进行寿命拟合如图所示，随着金纳米棒的增加，结合体的荧光寿命从1.23ms逐渐降低为1.06ms和0.76ms。
实施例17：金稀土复合物的链霉亲合素和抗原抗体的检测模型
取10-3mmol表面配体为CTAB的Au与10-4mmol聚丙烯酸混合，分散在100μL的氯化钠溶液(10mM)中搅拌30分钟后离心洗涤，分散在pH7.4的缓冲溶液中，加入一定比例的EDC/NHS后，室温搅拌60分钟，离心洗涤后再次分散在pH8.6的缓冲溶液中，然后加入一定量的链霉亲合素，室温搅拌60分钟后离心洗涤，保存于pH7.4的缓冲液中。将500μL表面为油酸的稀土纳米粒子环己烷溶液置于2mL离心管中，加入1mL丙酮混匀后，再加入8μL浓HCl，超声10分钟后，用10000rpm离心6分钟后，留下固体沉淀。加入300μL无水乙醇分散后，再用14000rpm离心15分钟后留沉淀，然后再次将沉淀分散在500μL去离子水中。取50μL去配体的NaLuF4:Er纳米粒子到2mL小离心管中，加入0.5mg生物素水溶液(5mg/mL)，再加入10μL氨水，混匀30分钟。然后14000rpm离心10分钟，再用去离子水洗涤一次后，分散在50μL水中，保存于4度冰箱中待用。
将表面为生物素的NaLuF4:Er纳米粒子和表面为链霉亲合素的Au棒以1:6和1:1比例混合后，加至比色皿中，比色皿放在样品台上，使用785nm的脉冲激光激发材料，通过波形发生器将激光频率设定为1KHz，占空200μs，同步相增强相机emICCD相机的延迟20μs采集信号，每次采集曝光时间为50μs，采集时间为7520μs，分别测试在800nm处的荧光寿命变化。然后将1:1比例混合的结合物放在载玻片中，待溶液完全挥发后在进行时间分辨成像测试。
图32为本实施例中的寿命衰减曲线，通过寿命拟合公式计算得到荧光寿命，如图所示，随着金棒数目增加，荧光寿命逐渐降低。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。例如，将一个实施例描述的部分特征与另一个实施例进行结合以产生又一个实施例；将一个或多个要素进行替换或组合以得到新的要素。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
本文提及的所有专利文献和非专利文献均通过引用被并入本文，达到如同每个参考文献被单独且具体指出的程度，以在本文中被完整地阐述。

Claims (10)

1.一种稀土发光寿命探针，其特征在于，所述稀土发光寿命探针包含发光给体Ln、能量受体Qe、连接材料Link，且结构通式为Ln-Link-Qe，所述发光给体由稀土纳米粒子组成；所述稀土纳米粒子的能量吸收与荧光发射发生于同一电子态能级，且荧光发射波长处于近红外区；所述能量受体与所述稀土纳米粒子的发光波段相匹配，并发生能量传递过程，进而改变所述稀土纳米粒子的荧光寿命；所述连接材料通过静电吸附、共价偶联或缠绕的方式使所述发光给体和所述能量受体相结合，以促使二者之间的能量传递过程。
2.如权利要求1所述的稀土发光寿命探针，其特征在于，所述稀土纳米粒子由发光内核和/或核壳Shell组成，当所述稀土纳米粒子仅由发光内核组成时，它的结构通式为AB1- xCxF4，所述稀土发光寿命探针的结构通式为AB1-xCxF4-Link-Qe；当所述稀土纳米粒子由发光内核和核壳组成时，它的结构通式为AB1-xCxF4@Shell，所述稀土发光寿命探针的结构通式为AB1-xCxF4@Shell-Link-Qe；其中，A选自Li、Na、K、Ca或Ba，B选自Gd、La、Sc或Y，C选自Nd、Er、Tm或Yb，且0<x≤1；核壳包括但不限于NaYF4、NaLuF4、NaGaF4、NaLaF4及CaF2；连接材料包括但不限于卵磷脂、聚乙二醇、聚丙烯酸、抗原抗体适配子及链霉亲和素-生物素；能量受体包括但不限于有机染料、贵金属材料、配合物及无机纳米材料。
3.如权利要求1或2所述的稀土发光寿命探针，其特征在于，A为Na，B为Y，C为Tm，x＝0.01，所述连接材料为链霉亲和素-生物素或卵磷脂，所述能量受体为金纳米棒或IR-820花菁染料。
4.如权利要求1至3中任一项所述的稀土发光寿命探针，其特征在于，所述稀土发光寿命探针能分散于液体环境中并形成均相溶液，所述液体环境包括但不限于水、缓冲液、DMSO、DMF、乙醇、生理盐水及血液。
5.一种制备如权利要求1至3中任一项所述稀土发光寿命探针的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
5.1、在110℃下，使所述稀土纳米粒子中A、B和C所代表元素的氯化盐在油酸溶剂中搅拌溶解；
5.2、加入氟源，除去水分及其他低沸点化合物，经无水无氧处理后，在氮气氛围下升温至290-310℃，反应50-60分钟；
5.3、反应结束后，使反应液自然冷却至室温，用无水乙醇洗涤，然后离心，得到表面为油酸配体的稀土发光固体材料，将该固体材料分散于环己烷溶液中；
5.4、将步骤5.3所得溶液与四氟硼酸亚硝胺饱和二氯甲烷溶液进行充分混合，直至不再产生沉淀；
5.5、对步骤5.4所得溶液进行离心处理，得到固体沉淀，用少量无水乙醇洗涤该固体沉淀，再次进行离心处理，收集固体沉淀，并将该固体沉淀分散于无水乙醇中。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
5.6、将步骤5.5所得溶液加至单口烧瓶中，然后往烧瓶中加入卵磷脂并混合均匀，再往烧瓶中加入用乙醇制备的IR-820花菁染料溶液，并另外再加10mL无水乙醇，剧烈搅拌所得溶液8至12小时以充分混合，保持避光状态；
5.7、通过减压蒸馏装置除去步骤5.6所得溶液中的溶剂，得到干燥的固体材料；
5.8、将步骤5.7所得固体材料分散于水中，然后离心以将没有包覆在材料表面的染料除去，再次将离心所得沉淀固体分散于水中。
7.一种利用如权利要求1至3中任一项所述稀土发光寿命探针定量检测目标物质的方法，检测系统包括样品台、滤光片、汇聚镜头、检测器、波形发生器、激发光源、计算机，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
7.1、将不同浓度的目标物质的标准品溶液加至所述稀土发光寿命探针的水溶液中，使用近红外激光激发，并用检测器收集荧光衰减信号，获取不同时间的荧光成像图，计算各个荧光寿命值，进而得到与目标物质相关的荧光寿命工作曲线；
7.2、将待检测样品加至所述稀土发光寿命探针的水溶液中，通过同样的步骤得到待检测样品的荧光寿命值；
7.3、将步骤7.2中测得的待检测样品的荧光寿命值代入荧光寿命工作曲线中，得到样品中目标物质的含量。
8.如权利要求7中所述的方法，其特征在于，利用荧光寿命作为检测信号，所述方法可用于体外检测或者在活体内检测所述目标物质；当使用所述探针在活体内检测时，通过包括注射、口服在内的方式使所述探针进入生物体内，到达待检测目标位置后即可进行检测。
9.如权利要求7中所述的方法，其特征在于，所述方法可以实现对金属离子、活性氧物质、蛋白分子的检测；所述金属离子包括但不限于Cu、Zn、Hg，所述活性氧物质包括但不限于HClO、O2·-、H2O2、·OH、等，所述蛋白分子包括但不限于链霉亲合素蛋白、抗原抗体适配子。
10.如权利要求7中所述的方法，其特征在于，所述激发光源包括但不限于波长为660nm、785nm、808nm、975nm、1525nm的氙灯或LED灯；所述检测器包括但不限于电子倍增CCD、像增强型CCD、CMOS、InGaAs相机、光电倍增管、光纤光谱仪以及其他任何符合需求的光谱、成像设备；在时间门控系统控制下，激发光为脉冲光，与检测设备联用后，不受激发光和短寿命荧光的影响，所检测荧光与激发光的波长相同或者波长相差小于10nm。
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