CN106442456B - 利用近红外二区荧光量子点探针检测锌离子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利用近红外二区荧光量子点探针检测锌离子的方法，首先配制硫化银荧光量子点探针缓冲体系，根据加入锌离子标准溶液前后探针荧光强度的变化值与锌离子的浓度建立线性方程，再于相同条件下将所述硫化银荧光量子点探针缓冲体系注射到生物体内，或者向所述硫化银荧光量子点探针缓冲体系中加入待测样品溶液，检测反应前后探针荧光强度的变化值，代入上述线性方程，即可根据荧光强度的变化计算得出生物体内或待测样品溶液中锌离子的含量。本发明的硫化银荧光量子点探针具有良好的选择性和灵敏度，对锌离子的检测限达到1μM。本方法成本低廉、操作简单、检测快速，在活体生物荧光检测等方面具有巨大的潜在应用价值。

Description

利用近红外二区荧光量子点探针检测锌离子的方法
技术领域
本发明涉及功能纳米材料技术领域，具体地说，涉及一种利用近红外二区荧光量子点探针检测锌离子的方法。
背景技术
半导体量子点是指在三维尺度上都小于激发波尔半径的一类纳米材料。由于量子局限效应，量子电具有优异的光学特性。相较于传统有机染料，量子点还具有抗光漂白性强、生物相容性好、光稳定性优异等特点，并被广泛应用在传感，生物诊断，细胞成像，离子检测等方面。而具有近红外二区荧光特性的量子点，由于较小的自身荧光及微弱的自散射，在生物组织中具有更高的空间分辨率，在生物相关检测等领域具有巨大的应用潜力。
锌是一种重要的人体必需的微量元素，广泛分布于人体的细胞和体液中。锌离子参与了很多生物学过程，例如DNA合成、基因表达、微管的多聚化、基体免疫、酶催化等诸多方面，其重要性得到了广泛的认同。人体内锌离子紊乱会导致诸多疾病，比如老年痴呆症，帕金森综合症，中风以及肾结石等。因此锌离子的检测，受到了人们越来越多的关注。
不同于其它过渡金属离子(如二价铁离子、锰离子、铜离子)，由于最外层电子分布为3d104s0，锌不显现任何波谱或磁信号，因此常用的紫外光谱、圆二色谱、核磁共振、电子顺磁共振和穆斯保尔光谱仪等均不适用于锌离子的测定，而常用的分析方法中，荧光法用于测定锌离子具有选择性好、灵敏度高、简便、快捷等优点。目前为止，关于锌离子检测的量子点荧光探针的荧光范围均处在1000nm以下，在生物检测应用领域受限于其自身的波长范围，开发具有近红外二区的荧光量子点对于锌的生物检测具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用近红外二区荧光量子点探针检测锌离子的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的利用近红外二区荧光量子点探针检测锌离子的方法，配制硫化银荧光量子点探针缓冲体系，根据加入锌离子标准溶液前后探针荧光强度的变化值与锌离子的浓度建立线性方程，再于相同条件下将所述硫化银荧光量子点探针缓冲体系注射到生物体内，或者向所述硫化银荧光量子点探针缓冲体系中加入待测样品溶液，检测反应前后探针荧光强度的变化值，代入上述线性方程，即可根据荧光强度的变化计算得出生物体内或待测样品溶液中锌离子的含量。
所述方法包括以下步骤：
S1、配制硫化银荧光量子点探针缓冲体系：将Ag无机盐和十二烷硫醇，在氨水存在的碱性条件下，利用水热合成法制成油溶性的硫化银量子点，然后用巯基乙酸(或巯基丙酸)对所述油溶性的硫化银量子点进行表面官能团改性，获得水溶性的硫化银量子点，经过过滤、透析、冷冻干燥后得到硫化银量子点粉末；取一定量的硫化银量子点粉末，加入到4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(或三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液)中得到硫化银荧光量子点探针缓冲体系；
S2、绘制锌离子浓度与相对荧光强度的标准曲线：配制不同浓度的锌离子溶液，加入到所述硫化银荧光量子点探针缓冲体系中，测得不同锌离子浓度下量子点发射的近红外二区荧光的强度，以相对荧光增强强度为纵坐标，以锌离子浓度为横坐标绘制标准曲线，并建立线性方程；
S3、检测样品溶液中锌离子的浓度：于相同条件下，向硫化银荧光量子点探针缓冲体系中加入待测样品溶液，测得加入待测样品溶液前后近红外二区荧光量子点的相对荧光增强强度，代入步骤S2的线性方程中，计算得出待测样品溶液中锌离子的浓度。
步骤S1具体为：
S11、将Ag无机盐溶于水，搅拌条件下滴加浓氨水得到混合液；
S12、向S11的混合液中加入十二烷硫醇，在100-200℃条件下反应；
S13、将S12的反应产物静置或离心，收集沉淀，向沉淀中加入适量水后与巯基乙酸混合，超声后将生成液经过过滤、透析、冷冻干燥后得到硫化银量子点粉末；
S14、取一定量的硫化银量子点粉末，加入到4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中得到硫化银荧光量子点探针缓冲体系。
步骤S11将Ag无机盐溶于水，所得溶液中Ag离子的摩尔浓度为0.01-100mol/L；然后在搅拌条件下逐滴加入浓氨水直至生成的棕色沉淀完全消失，得到混合液。
步骤S12中所述混合液与十二烷硫醇的体积比为1：0.01-100，于100-200℃反应1-10h。
步骤S13向沉淀中按料液比0.1-10g：10mL加入水，然后向此混合物中加入巯基乙酸，所述混合物与巯基乙酸的体积比为1：0.01-100。
步骤S13中超声功率为50-300W(优选150W)，超声时间1-10h。
步骤S13中采用针式过滤器进行过滤，过滤器的孔径为100-500nm。
步骤S13透析在透析袋MWCO中进行，截留分子量为100-2000Da(优选500Da)，透析液为水。
步骤S14将1-1000mg硫化银量子点粉末加入到1-100mL所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中得到硫化银荧光量子点探针缓冲体系。
步骤S2中绘制标准曲线时，利用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液配制浓度分别为0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6、24×10-6、28×10-6、32×10-6、36×10-6、40×10-6M的氯化锌溶液。
本发明所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的浓度为1mM，以水配制。
本发明中，所述硫化银荧光量子点探针对锌离子的检测限小于1μM。
利用本发明方法制备的硫化银量子点纳米材料，该纳米材料具有近红外二区荧光特性(近红外二区波长范围为1.0-1.7μm)，纳米粒径为5nm左右。发射峰峰值为1000-1300nm，无明显吸收峰。该区域的光线拥有更强的组织穿透性和更高的空间分辨率，在活体检测领用具有较高的应用价值。本发明制备的荧光探针对锌的识别基于光致电子转移机制，锌离子对探针的荧光强度具有显著的增强效应。
本发明还提供一种基于近红外二区荧光量子点探针检测锌离子的硫化银荧光量子点探针缓冲体系：将Ag无机盐和十二烷硫醇，在氨水存在的碱性条件下，利用水热合成法制成油溶性的硫化银量子点，然后用巯基乙酸(或巯基丙酸)对所述油溶性的硫化银量子点进行表面官能团改性，获得水溶性的硫化银量子点，经过过滤、透析、冷冻干燥后得到硫化银量子点粉末；取一定量的硫化银量子点粉末，加入到4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(或三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液)中得到硫化银荧光量子点探针缓冲体系。
本发明进一步提供一种基于近红外二区荧光量子点探针检测锌离子的试剂盒，所述试剂盒中含有上述硫化银荧光量子点探针缓冲体系。
本发明具有以下优点：
(一)本发明的硫化银荧光量子点探针具有近红外二区的荧光特性，具有较小的自身荧光和微弱组织散射的特点。检测方法基于光致电子转移，锌离子对探针的荧光强度具有显著增强效应，而其他离子则为猝灭或相对不变，因而具有很高的选择性。该探针的检测限小于1μM，灵敏度较高。
(二)本发明的硫化银荧光量子点探针表面富有亲水基团，具有很好的水溶性及生物相容性。
(三)本发明方法简便、易于操作、重现性好，在生物检测领域具有较好的应用前景。。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的硫化银荧光量子点探针的电镜图。
图2为本发明实施例1制备的硫化银荧光量子点探针的实物图(右上方)及吸光光谱图。
图3为本发明实施例1中利用荧光探针检测锌离子的机理，在此过程中发生了光致电子转移。
图4为本发明实施例2中利用荧光探针检测锌离子时，不同锌离子浓度对荧光强度的影响。
图5为本发明实施例2中锌离子浓度与相对荧光增强强度之间的线性关系。
图6为本发明实施例3中向荧光探针中分别加入锌离子及干扰离子后，其荧光强度的变化结果比较。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，其浓度为1mM，以水配制。
实施例1利用近红外二区荧光量子点探针检测锌离子的方法
(1)将5mmol AgNO3溶解于20ml去离子水中形成无色透明的溶液，随后向其中逐滴加入浓氨水直至生成的棕色沉淀完全消失。转移至反应釜中后，加入3ml十二烷硫醇，并置于200℃的烘箱中反应2h。收集反应物并加入2ml巯基乙酸，超声处理1h后，将产物通过孔径为220nm的过滤器进行过滤，然后利用MWCO截留分子量为500DA的透析袋隔夜透析，冷冻干燥后得到硫化银量子点粉末。将100mg粉末溶解在50ml pH＝7.3的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中配制成具有近红外二区荧光特性的量子点探针。其在透射电子显微镜下观察的结果见图1，平均粒子直径为3.85±0.04nm。测试其吸光光谱，如图2所示，可以看出其在200-1000nm的光谱范围内并没有明显的吸收峰。
(2)向11个石英比色皿中分别加入2mL步骤(1)制得的具有近红外二区荧光特性的量子点探针缓冲体系。利用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液配制浓度分别为0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6、24×10-6、28×10-6、32×10-6、36×10-6、40×10-6M的氯化锌溶液，并用移液枪分别将2mL不同浓度的氯化锌溶液加入上述装有荧光量子点的比色皿中，放入红外荧光测试系统检测其荧光强度。选择激发波波长490nm，检测发射波波长为1120nm。绘制相对荧光增强强度随锌离子浓度的变化曲线，并对其进行拟合，得到拟合曲线公式：y＝0.016x+0.023。在检测过程中发生了光致电子转移过程，如图3所示。锌离子通过氢键连接到硫化银量子点探针上，改变了原有结构的电子状态，使得造成荧光猝灭的电子转移过程不再发生，探针的荧光强度得到了显著的增强。
(3)向2个石英比色皿中分别加入2mL步骤(1)制得的具有近红外二区荧光特性的量子点探针缓冲体系。利用移液枪将2mL未知浓度的氯化锌溶液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液分别加入上述装有荧光量子点的比色皿中，放入红外荧光测试系统检测其荧光强度。选择激发波波长490nm，检测发射波波长为1120nm。计算待测氯化锌溶液的相对荧光增强强度，根据步骤(2)中所得到的线性关系曲线，计算锌离子的浓度为5.7×10-6M。
实施例2利用近红外二区荧光量子点探针检测锌离子的方法
(1)将5mmol AgNO3溶解于20ml去离子水中形成无色透明的溶液，随后向其中逐滴加入浓氨水直至生成的棕色沉淀完全消失。转移至反应釜中后，加入3ml十二烷硫醇，并置于200℃的烘箱中反应2h。收集反应物并加入2ml巯基乙酸，超声处理1h后，将产物通过孔径为220nm的过滤器进行过滤，然后利用MWCO截留分子量为500DA的透析袋隔夜透析，冷冻干燥后得到硫化银量子点粉末。将100mg粉末溶解在50ml pH＝7.3的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中配制成具有近红外二区荧光特性的量子点探针。
(2)向8个石英比色皿中分别加入2mL步骤(1)制得的具有近红外二区荧光特性的量子点探针缓冲体系。利用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液配制浓度分别为0、10×10-5、20×10-5、40×10-5、80×10-5、120×10-5、160×10-5、200×10-5M的氯化锌溶液，并用移液枪分别将2mL不同浓度的氯化锌溶液加入上述装有荧光量子点的比色皿中，放入红外荧光测试系统检测其荧光强度，每个样品测试5遍。选择激发波波长490nm，检测发射波波长为1120nm。其荧光光谱如图4所示，随着锌离子浓度的增加，近红外二区荧光强度增强。
(3)计算每个样品相对荧光增强强度的平均值和方差，绘制相对荧光增强强度随锌离子浓度的变化曲线，如图5所示。相对荧光增强强度与锌离子浓度具有良好的线性关系，R2＝0.99。基于3σ/slope所计算出的荧光探针对锌离子的检测限小于1μM。
实施例3利用近红外二区荧光量子点探针检测不同金属离子
(1)将5mmol AgNO3溶解于20ml去离子水中形成无色透明的溶液，随后向其中逐滴加入浓氨水直至生成的棕色沉淀完全消失。转移至反应釜中后，加入3ml十二烷硫醇，并置于200℃的烘箱中反应2h。收集反应物并加入2ml巯基乙酸，超声处理1h后，将产物通过孔径为220nm的过滤器进行过滤，然后利用MWCO截留分子量为500DA的透析袋隔夜透析，冷冻干燥后得到硫化银量子点粉末。将100mg粉末溶解在50ml pH＝7.3的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中配制成具有近红外二区荧光特性的量子点探针。
(2)向11个石英比色皿中分别加入2mL步骤(1)制得的具有近红外二区荧光特性的量子点探针缓冲体系。利用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液配制浓度均为200×10-5M的KCl、NaCl、MgCl2、NiCl2、CuCl2、FeCl3、FeCl2、CaCl2、AgCl、ZnCl2溶液以及4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液参照组，并用移液枪分别将2mL含有不同金属离子的溶液加入上述装有荧光量子点的比色皿中，放入红外荧光测试系统检测其荧光强度。选择激发波波长490nm，检测发射波波长为1120nm。
(3)绘制不同金属离子溶液荧光强度的柱形图，如图6所示，可以看出，除了锌离子对探针的荧光强度有显著增强效果外，其他金属离子对探针的荧光产生抑制作用或无明显影响。说明本发明的硫化银荧光量子点探针具有很高的离子选择性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.利用近红外二区荧光量子点探针检测锌离子的方法，其特征在于，配制硫化银荧光量子点探针缓冲体系，根据加入锌离子标准溶液前后探针荧光强度的变化值与锌离子的浓度建立线性方程，再于相同条件下向所述硫化银荧光量子点探针缓冲体系中加入待测样品溶液，检测反应前后探针荧光强度的变化值，代入上述线性方程，即可根据荧光强度的变化计算得出待测样品溶液中锌离子的含量；
所述方法包括以下步骤：
S1、配制硫化银荧光量子点探针缓冲体系：将Ag无机盐和十二烷硫醇，在氨水存在的碱性条件下，利用水热合成法制成油溶性的硫化银量子点，然后用巯基乙酸对所述油溶性的硫化银量子点进行表面官能团改性，获得水溶性的硫化银量子点，经过过滤、透析、冷冻干燥后得到硫化银量子点粉末；取一定量的硫化银量子点粉末，加入到4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中得到硫化银荧光量子点探针缓冲体系；
S2、绘制锌离子浓度与相对荧光强度的标准曲线：配制不同浓度的锌离子溶液，加入到所述硫化银荧光量子点探针缓冲体系中，测得不同锌离子浓度下量子点发射的近红外二区荧光的强度，以相对荧光增强强度为纵坐标，以锌离子浓度为横坐标绘制标准曲线，并建立线性方程；
S3、检测样品溶液中锌离子的浓度：于相同条件下，向硫化银荧光量子点探针缓冲体系中加入待测样品溶液，测得加入待测样品溶液前后近红外二区荧光量子点的相对荧光增强强度，代入步骤S2的线性方程中，计算得出待测样品溶液中锌离子的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1具体为：
S11、将Ag无机盐溶于水，搅拌条件下滴加浓氨水得到混合液；
S12、向S11的混合液中加入十二烷硫醇，在100-200℃条件下反应；
S13、将S12的反应产物静置或离心，收集沉淀，向沉淀中加入适量水后与巯基乙酸混合，超声后将生成液经过过滤、透析、冷冻干燥后得到硫化银量子点粉末；
S14、取一定量的硫化银量子点粉末，加入到4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中得到硫化银荧光量子点探针缓冲体系。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S11将Ag无机盐溶于水，所得溶液中Ag离子的摩尔浓度为0.01-100mol/L；然后在搅拌条件下逐滴加入浓氨水直至生成的棕色沉淀完全消失，得到混合液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S12中所述混合液与十二烷硫醇的体积比为1：0.01-100，于100-200℃反应1-10h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S13向沉淀中按料液比0.1-10g：10mL加入水，然后向此混合物中加入巯基乙酸，所述混合物与巯基乙酸的体积比为1：0.01-100；
超声功率为50-300W，超声时间1-10h；
采用针式过滤器进行过滤，过滤器的孔径为100-500nm；
透析在透析袋MWCO中进行，截留分子量为100-2000Da，透析液为水。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S14将1-1000mg硫化银量子点粉末加入到1-100mL所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中得到硫化银荧光量子点探针缓冲体系。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2绘制标准曲线时利用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液配制浓度分别为0、4×10-6、8×10-6、12×10-6、16×10-6、20×10-6、24×10-6、28×10-6、32×10-6、36×10-6、40×10-6M的氯化锌溶液。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的浓度为1mM，以水配制。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述硫化银荧光量子点探针对锌离子的检测限小于1μM。
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