CN112342014A

CN112342014A - 一种单分散聚合物荧光微球的制备方法

Info

Publication number: CN112342014A
Application number: CN202011171654.2A
Authority: CN
Inventors: 杨承凤; 周梦圆
Original assignee: Anhui Weizhen Bioengineering Technology Co ltd
Current assignee: Anhui Weizhen Bioengineering Technology Co ltd
Priority date: 2020-10-28
Filing date: 2020-10-28
Publication date: 2021-02-09

Abstract

本发明公开了一种单分散聚合物荧光微球的制备方法，包括下列步骤：（1）采用配位反应合成含铕的三元配合物；（2）采用无皂乳液聚合法制备羧基聚苯乙烯微球；（3）通过一步种子溶胀法将铕的配合物渗透入功能微球内部，得到荧光物质包裹于微球内部的荧光羧基聚苯乙烯微球。本发明采用的是一步溶胀法获得包埋有荧光的功能微球，所用于溶胀的种子微球来源于无皂乳液聚合方式得到的羧基乳胶微球，操作简单，所得微球尺寸均一可控，表面规整。

Description

一种单分散聚合物荧光微球的制备方法

技术领域

本发明涉及一种单分散聚合物荧光微球的制备方法。

背景技术

近年来，聚合物微球因其形态结构规整稳定、单分散性良好、比表面积可调、粒径分布窄、表面可功能化等特点受到了广泛的研究和关注，在生物医学、临床化学分析、免疫检测等高新技术领域得到了一致青睐。如血液细胞待测抗原检测、血流分析、药物筛选等。通过苯乙烯与羧基功能单体的共聚反应来使微球表面功能化，从而达到可标记的高分子免疫乳胶，但国内外目前产出的高分子微球大多为乳白色，对比度不明显，不易为肉眼所见。因此对微球进行染色或荧光标记，使微球带有色彩或荧光信号是目前发展的趋势。尤其是当通过微球表面功能基团交联上抗体（或抗原）后成为高分子免疫乳胶，可通过特异性乳胶凝聚反应检测出与之对应的抗原（或抗体），此方法简洁、快速、肉眼可察易于检测，从而大幅度提高了检测的灵敏度。

与活性分子进行反应的微球表面的功能基团可通过后修饰法和一步法得到，后修饰法需通过多步聚合反应，大大增加了时间人力成本，微球形态可能受到影响；一步法是在制备微球过程中直接引入功能单体聚合，该法操作过程简洁有效，并且表面所得基团可调。

在荧光材料方面，稀土有机配合物具有较长的荧光寿命、良好的光稳定性、窄而对称的发射谱，较大的Stokes位移，较为理想的生物相容性等性能，使其所结合成的荧光微球在生物标记、活体成像以及时间分辨荧光分析、荧光免疫层析等方面获得很好的应用。将荧光物质固定到微球上主要分为物理法和化学法两类制备方式，包括聚合包覆法，包埋法、直接吸附法，表面修饰法、化学键合法等。聚合包覆法是在单体聚合过程中，添加荧光物质，使其包覆到微球内部，但此法大多会使聚合反应受阻甚至不聚合，并且影响最终荧光微球的数量和尺寸分布。通过表面吸附法使得荧光物质包覆在微球外端，会导致功能基团的损失，使检测的灵敏度下降。表面修饰法是荧光分子与微球表面的功能团反应，从而达到修饰效果，虽得到的荧光微球荧光强度高，但化学修饰占据太多表面功能基团，同样存在直接吸附法中的弊端，化学键合虽得到的荧光寿命长，但此法易造成微球表面的粘连，难以得到单分散性良好的微球，同时经过化学键合后，荧光分子的结构及性质有可能发生改变。而物理包埋法是将荧光物质包覆在微球内部，维持了微球的荧光强度，并具可调的包覆率，对微球原始形态以及表面不造成任何影响。

聚合物荧光功能微球结合了聚合物微球的高活性表面积、单分散，荧光物质的特异性、发光效率高、长寿命以及微球表面基团的可调节性及可标记性，使其在荧光免疫层析技术中实现了通过荧光示踪对检测结果进行精准定量，获得可观的信噪比、灵敏度以及检测范围。

目前，制备聚合物羧基荧光微球的报道较多，但仍然缺少一种简易有效的制备技术来获得尺寸均一可控、单分散性好、荧光强度高并且稳定的高分子微球。

发明内容

本发明的目的在于提供一种尺寸均一可控、表面羧基密度可调、荧光强度高的单分散聚合物荧光微球的制备方法。

本发明的技术解决方案是：

一种单分散聚合物荧光微球的制备方法，其特征是：包括下列步骤：（1）采用配位反应合成含铕的三元配合物；

（2）采用无皂乳液聚合法制备羧基聚苯乙烯微球；

（3）通过一步种子溶胀法将铕的配合物渗透入功能微球内部，得到荧光物质包裹于微球内部的荧光羧基聚苯乙烯微球。

步骤（1）的具体方法是：取含铕化合物溶于乙醇中得到A溶液，取无水乙醇溶入二苯甲酰甲烷和邻菲罗啉形成配体溶液B置于40 ~ 60℃水浴中通过磁力搅拌进行分散，然后将A溶液分2 min滴入或2秒钟滴入B溶液中，溶液通过酸碱调节剂来调节总溶液pH至6-7，之后继续反应；经过陈化，抽滤，洗涤，干燥，最终得到浅黄色铕的配合物。

步骤（1）中，所使用的含铕化合物用量与所用溶剂乙醇用量比为0.5 g:15 mL~ 1g:40 mL；所述B溶液中的二苯甲酰甲烷和邻菲罗啉质量比为2 ~ 4，二苯甲酰甲烷与所用溶剂无水乙醇用量比为1 g : 15 mL~ 1 g : 20 mL；A溶液与B溶液的体积比为1:0.5 ~ 1:1；步骤（1）所述含铕化合物选自下列物质：三氟甲磺酸铕、氧化铕、硝酸铕(III) 六水合物、无水氯化铕(III)、溴化铕(II)、无水氟化铕(III)。

步骤（2）中无皂乳液聚合法为：取分散水系于水浴槽中，在氮气保护下，先后加入苯乙烯单体和功能单体，通过电子数显搅拌器搅拌均匀，15 min后，向单体体系中加入基于苯乙烯单体用量的0.1 ~ 0.55 wt%的引发剂进行溶解，然后水浴加热，到聚合温度后停留保持4 ~ 24 h进行聚合反应，得到羧基聚苯乙烯微球种子乳液。

步骤（2）的聚合反应在200 ~ 600 rpm搅拌速度下进行，聚合温度为60 ~ 80℃；加入引发剂与开始加热间隔时间为30 ~ 60 min；苯乙烯与功能单体体积比为0.1 ~ 0.4：1；

步骤（2）所述功能反应单体选自下组：甲基丙烯酸、甲基丙烯酸-2-氨基乙酯盐酸盐、甲基丙烯酸二甲氨基丙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基丙酯、丙烯酸、丙烯酸二甲氨基丙酯、丁烯酸；

步骤（2）所述引发剂为水相引发剂，为过硫酸钾、过硫酸钾与硫代硫酸钠的混合物、过硫酸铵或高锰酸钾与草酸的混合物中的一种或几种。

步骤（3）中，将羧基功能化微球种子乳液分散于溶胀介质中，将步骤（1）得到的含铕三元配合物溶于溶胀剂中，微球与配合物两者体积比为25：1~32：1，混合均匀后避光进行溶胀反应；通过旋转蒸发仪去除溶胀剂；之后，对剩余微球加入去离子水稀释，对微球表面进行超声清洗，反复操作5 ~ 6次，通过高速离心，去除上清液，获得荧光微球沉淀物。

步骤（3）中，溶胀温度为室温；溶胀反应搅拌速度为200 ~ 600 rpm；溶胀反应搅拌时间为3 ~ 24 h；羧基聚苯乙烯微球种子乳液体积是溶胀介质体积的0.5 ~ 1倍；

步骤（3）所述溶胀介质选自下组：十二烷基硫酸钠、月桂酸钾、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基氯化铵。优选的溶胀介质浓度为0.25 wt% ~ 0.5 wt%；

步骤（3）所述溶胀剂选自下组：四氢呋喃、四氯甲烷、三氯甲烷、二氯甲烷，己烯丙酮、甲苯、二氯乙烷、己二酸二辛酯、正辛烷、正己烷或以上的不同组合,优选的溶胀剂所用体积为5 ~ 30 mL。

步骤（3）中还加入稳定剂；所述稳定剂为含铕三元配合物、十六烷、十六醇、聚乙烯醇、葡萄糖中的一种或几种。

本发明采用的是一步溶胀法获得包埋有荧光的功能微球，所用于溶胀的种子微球来源于无皂乳液聚合方式得到的羧基乳胶微球，操作简单，所得微球尺寸均一可控，表面规整。

本专利的有益效果还在于：

1）本发明选取了稀土有机配合物作为荧光物质，有效地改善了微球荧光强度弱及荧光不稳定等问题。

2）选取了无皂乳液的聚合方法得到表面规整的微球种子，避免加入过多的添加剂例如表面活性剂、稳定剂、疏水剂等使得种子后续的溶胀反应产生不必要的变量，并且难以清洗干净。功能微球的制备采用的是一步聚合法为微球表面引入羧基基团，并且通过改变功能单体用量来调节微球表面羧基密度，并且不影响微球形态与单分散性；通过调节搅拌速率及搅拌温度等因素来调控微球尺寸及单分散性。

3）本发明是采用溶胀包埋的方式将荧光物质均匀包覆于微球内部，避免了物理和化学法制备荧光微球所产生的缺点，保障了荧光物质的荧光稳定性及强度。

4）本发明制备的聚合物荧光功能微球，表面洁净、尺寸分布均一、荧光性能稳定。

5）本发明制备的聚合物荧光微球可通过表面活性功能基团与抗体（或抗原）结合，来达到荧光示踪对检测结果精确定量的目的。其检测性能指标远远高于胶体金等传统快速检测技术，在生物医学检测行业具有较大的应用前景。

6）采用双抗体夹心法模式，研制荧光微球免疫层析检测试纸条，通过化学偶联方法标记抗体，形成抗体与微球的稳定结合，既继承了胶体金试纸条的方便快速特点，又结合了荧光免疫技术，实现高灵敏定量检测的优点。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是苯乙烯与功能单体体积比为0.1时微球的扫描电镜图。

其中a尺标为500 nm；b尺标为1 μm；c尺标为2 μm。

图2是表面未功能化的聚苯乙烯微球的红外光谱图。

图3是表面羧基化聚苯乙烯微球红外光谱图。

图4.是2019-nCoV新型冠状病毒免疫荧光层析试纸条示意图。

图5是不同浓度质控品（a：500 pg/mL，b：250 pg/mL，c：100 pg/mL，d：50 pg/mL，e：10 pg/mL f：2 pg/mL）滴于样品垫上的检测结果示意图。

具体实施方式

试剂与仪器

水合三氯化铕（EuCl3 ·6H2O），纯度为99.9%，购于鱼台县清达精细化工厂；二苯甲酰甲烷，邻菲罗啉，苯乙烯，丙烯酸，过硫酸钾，二氯乙烷, 十二烷基磺酸钠均购于国药集团。

扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶红外光谱仪（FTIR）

铕三元配合物的合成

称取EuCl3 ·6H2O 0.73 g溶于20 mL乙醇中，另取20 mL乙醇，加入二苯甲酰甲烷1.34g，邻菲罗啉0.40 g置于50℃油浴中，同时磁力搅拌。然后将 EuCl3 ·6H2O的乙醇溶液缓慢滴入配体溶液中，用NaOH调节pH至６～７,继续反应1h，陈化，抽滤，洗涤，干燥，得到浅黄色铕配合物，通过元素分析和ＥＤＴＡ容量滴定法测定Eu3+含量，确定其元素组成为Eu(DMB)3phen。

无皂乳液合成羧基聚苯乙烯微球

首先将100 mL去离子水加入500 mL三口烧瓶中，通入氮气，去除反应体系中的氧气，先加入11 mL苯乙烯再加入1.1 ~ 4.4 mL丙烯酸，开始搅拌，搅拌速度为300 rpm/min, 15min 后加入引发剂（0.1~ 0.5 g溶于10 mL去离子水中），搅拌均匀，30 min后，开始加热升温，升温至70℃后保持4 ~ 24 h得到乳白色羧基聚苯乙烯微球种子。

溶胀法制备羧基聚苯乙烯荧光微球

量取15 ~ 35 mL微球种子分散于160 ~ 140 mL 0.25 wt%的溶胀介质SDS水溶液，搅拌均匀，形成溶液A，取60 mg的Eu(DMB)3phen溶于5 mL溶胀剂CH₃CH₂Cl₂中，超声均匀，形成溶液B，将溶液B加入溶液A中，进行搅拌，探究不同搅拌速率对溶胀结果的影响，反应3 ~ 24 h后，通过旋蒸除去溶胀剂，再对剩余液体进行高速离心分离，弃去上清液，加入蒸馏水，重复此步骤4~5次，最终得到含铕配合物的淡黄色荧光聚苯乙烯羧基微球。

本实施例提供了羧基荧光微球偶联抗体过程及一种2019-nCoV新型冠状病毒免疫层析检测试纸条：

本发明中试纸条是由四部分组成：样本垫、结合垫、NC膜以及吸水垫。将其按一定顺序以相互重叠的方式（重叠部分约为 2 mm）粘贴于 PVC底板上，组装好后形成完整的试纸条体系。如图4所示，采用画膜喷金仪在NC膜上进行划线，包被有单克隆N抗体和羊抗鼠IgG抗体作为试纸条的检测线（T 线）与质控线（C 线）。由于试纸条检测所用荧光纳米探针粒径大小以及检测物性质直接影响其在试纸条上层析速率以及流畅性，因此为了减少试纸条检测过程中批内批间差异，试纸条可根据具体实验情况进行相应优化处理如结合垫的优化及玻璃纤维膜的活化等。

本发明中喷于结合垫上的荧光微球标记物在偶联标记抗体过程中所需主要溶液的配制：

1）羧基化荧光纳米微球活化缓冲液：50 mM MES，pH 6.0；

2）羧基荧光纳米微球活化试剂ａ：含1% EDC的上述MES溶液； 3）羧基荧光纳米微球活化试剂ｂ：含1% sulfo-NHS的上述MES溶液；

4）羧基荧光纳米微球与蛋白偶联缓冲液：25 mM PB, pH 7.0;

5）洗涤液：25 mM Tris-base，0.2% Tween 20，0.15 M NaCl，0.05% ProClin 300, pH7.8；

6）封闭液：50 mM PB，含5% BSA，pH 8.0；

7）保存液：25 mM Tris-base，0.05% Tween 20，0.15 M NaCl，0.05% ProClin 300, 1%BSA，5%海藻糖，pH 7.2；

8）标记微球稀释液：25 mM Tris-base，0.05% Tween 20， 0.05% ProClin 300，1%BSA，5%海藻糖，20%蔗糖，pH 9.0；

9）包被液：10 mM Na₂HPO₄·12H₂O，0.15 M NaCl，0.3%海藻糖，0.1% NaN₃，pH7.4；

10)样品垫预处理液：10 mM四硼酸钠，1% PVP，0.2%酪蛋白酸钠，1% Trition-X100，1%S9，0.02% NaN₃；

11）结合垫预处理液：50 mM Na₂HPO₄·12H₂O，1% Trition-X100，0.5% PVA，0.5% BSA，pH 7.4；

12）定标品稀释液：50 mM Tris-base，0.15 M NaCl，0.1% ProClin 300，0.01% Tween-20，1.5% BSA，pH 7.8。

荧光微球偶联标记抗体方法，具体实施步骤如下：

1）羧基化荧光纳米微球的预处理：

取50 μL（2 mg）4%固含量的于1 mL离心管中，在4℃下，以15000 rpm/min离心速率离心15 min，小心离去上清液；重复此过程2次，确保除去荧光微球表面的杂质。

2）羧基化荧光纳米微球的活化：

a）加入1 mL羧基化荧光纳米微球活化缓冲液于上述离心沉淀物中，用旋涡混合器充分均匀悬浮荧光微球，在4℃下，以15000 rpm/min离心速率离心15 min，小心离去上清液；重复此过程1次，加入1 mL羧基化荧光纳米微球活化缓冲液，再次混匀重悬；

b）加入4.8 μL活化试剂a和48 μL活化试剂b，超声重悬，之后在冰浴下用细胞超声破碎仪以功率5%，工作1s，间隔3s，持续1 min的条件进行均匀分散，于垂直混合仪上室温旋转30min。在4 ºC下，以15000 rpm/min离心速率离心15 min，小心离去上清液；

c）加入1ml 微球偶联缓冲液，用旋涡混合器充分均匀悬浮荧光微球，并且超声重悬，在4℃下，以15000 rpm/min离心速率离心15 min，小心离去上清液；重复此过程1次。

3）羧基化荧光纳米微球与抗体偶联：

a) 将上述加入1ml微球偶联缓冲液后超声重悬，加入50 μL(2.4 mg/mL)N28新冠抗体，再用漩涡混合器充分混匀悬浮羧基荧光纳米微球，在37 ºC旋转条件下，偶联反应２小时。在4℃下，以10000 rpm/min离心速率离心15 min，小心离去上清液；

b) 加入1mL微球洗涤液，超声重悬，在4℃下，以10000 rpm/min离心速率离心15 min，小心离去上清液；重复此过程1次。

4）羧基化荧光纳米微球的封闭及保存：

a）加入1 mL封闭液，超声重悬羧基荧光纳米微球，再用漩涡混合器充分混匀悬浮羧基荧光纳米微球，旋转封闭1小时。

b）将上述1.5 mL离心管的微球悬浮液在4℃下，以10000 rpm/min离心速率离心15min，小心离去上清液；

c）加入1 mL保存液，超声重悬羧基荧光纳米微球，在4℃下，以10000 rpm/min离心速率离心15 min，小心离去上清液；重复该步骤１次；

d）将标记好的羧基化铕螯合物荧光纳米微球用保存液稀释至2 mg/mL，存放于2~8ºC，避光保存备用。

本发明对于检测结果分析符合如下：

检测结果呈阳性时所呈现的荧光图像为两条荧光反应线出现，一条在T区（检测线），一条在C区（质控线）

检测结果呈阳性时所呈现的荧光图像为仅在质控线C区有一条亮的反应线出现，在检测区无可见荧光条带。

结果分析：

由图5可知，本发明制备的稀土荧光聚苯乙烯羧基微球通过一系列最优化条件控制实验偶联新冠N28抗体，用于新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测，随着质控品浓度的升高，信噪比（ST/SC）逐渐升高。以上结果表明该试纸条高灵敏度、高特异性。

Claims

1.一种单分散聚合物荧光微球的制备方法，其特征是：包括下列步骤：（1）采用配位反应合成含铕的三元配合物；

（2）采用无皂乳液聚合法制备羧基聚苯乙烯微球；

2. 根据权利要求1所述的单分散聚合物荧光微球的制备方法，其特征是：步骤（1）的具体方法是：取含铕化合物溶于乙醇中得到A溶液，取无水乙醇溶入二苯甲酰甲烷和邻菲罗啉形成配体溶液B置于40 ~ 60℃水浴中通过磁力搅拌进行分散，然后将A溶液分2 min滴入或2秒钟滴入B溶液中，溶液通过酸碱调节剂来调节总溶液pH至6-7，之后继续反应；经过陈化，抽滤，洗涤，干燥，最终得到浅黄色铕的配合物。

3. 根据权利要求2所述的单分散聚合物荧光微球的制备方法，其特征是：步骤（1）中，所使用的含铕化合物用量与所用溶剂乙醇用量比为0.5 g:15 mL~ 1 g:40 mL；所述B溶液中的二苯甲酰甲烷和邻菲罗啉质量比为2 ~ 4，二苯甲酰甲烷与所用溶剂无水乙醇用量比为1 g : 15 mL~ 1 g : 20 mL；A溶液与B溶液的体积比为1:0.5 ~ 1:1；步骤（1）所述含铕化合物选自下列物质：三氟甲磺酸铕、氧化铕、硝酸铕(III) 六水合物、无水氯化铕(III)、溴化铕(II)、无水氟化铕(III)。

4. 根据权利要求1、2或3所述的单分散聚合物荧光微球的制备方法，其特征是：步骤（2）中无皂乳液聚合法为：取分散水系于水浴槽中，在氮气保护下，先后加入苯乙烯单体和功能单体，通过电子数显搅拌器搅拌均匀，15 min后，向单体体系中加入基于苯乙烯单体用量的0.1 ~ 0.55 wt%的引发剂进行溶解，然后水浴加热，到聚合温度后停留保持4 ~ 24 h进行聚合反应，得到羧基聚苯乙烯微球种子乳液。

5. 根据权利要求4所述的单分散聚合物荧光微球的制备方法，其特征是：步骤（2）的聚合反应在200 ~ 600 rpm搅拌速度下进行，聚合温度为60 ~ 80℃；加入引发剂与开始加热间隔时间为30 ~ 60 min；苯乙烯与功能单体体积比为0.1 ~ 0.4：1；

6. 根据权利要求1、2或3所述的单分散聚合物荧光微球的制备方法，其特征是：步骤（3）中，将羧基功能化微球种子乳液分散于溶胀介质中，将步骤（1）得到的含铕三元配合物溶于溶胀剂中，微球与配合物两者体积比为25：1~32：1，混合均匀后避光进行溶胀反应；通过旋转蒸发仪去除溶胀剂；之后，对剩余微球加入去离子水稀释，对微球表面进行超声清洗，反复操作5 ~ 6次，通过高速离心，去除上清液，获得荧光微球沉淀物。

7. 根据权利要求6所述的单分散聚合物荧光微球的制备方法，其特征是：步骤（3）中，溶胀温度为室温；溶胀反应搅拌速度为200 ~ 600 rpm；溶胀反应搅拌时间为3 ~ 24 h；羧基聚苯乙烯微球种子乳液体积是溶胀介质体积的0.5 ~ 1倍；

步骤（3）所述溶胀介质选自下组：十二烷基硫酸钠、月桂酸钾、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基氯化铵；优选的溶胀介质浓度为0.25 wt% ~ 0.5 wt%；

8.根据权利要求2所述的单分散聚合物荧光微球的制备方法，其特征是：步骤（3）中还加入稳定剂；所述稳定剂为含铕三元配合物、十六烷、十六醇、聚乙烯醇、葡萄糖中的一种或几种。