FI98863C - Vesipitoinen suspensio diagnostisia kokeita varten ja menetelmä sen valmistamiseksi sekä diagnostisia menetelmiä ja niissä käytettäviä reagensseja ja testipakkauksia - Google Patents

Description

98863

Vesipitoinen suspensio diagnostisia kokeita varten ja menetelmä sen valmistamiseksi sekä diagnostisia menetelmiä ja niissä käytettäviä reagensseja ja testipakkauksia 5 Keksintö koskee vesipitoista suspensiota diagnosti sia tai immunodiagnostisia testejä varten, joka suspensio sisältää ei-polymeerisiä ytimiä, joita ympäröi funktionaalisia ryhmiä sisältävä hydrofiilinen kopolymeeri, sekä myös menetelmää tämän suspension valmistamiseksi.

10 Keksintö koskee myös menetelmää spesifisesti sitou tuvan aineen tai immunokemiallisesti aktiivisen komponentin toteamiseksi testinesteestä sekä reagenssia ja testi-pakkausta käytettäväksi mainittuja toteamismenetelmiä käytettäessä .

15 Yllä mainittu suspensio ja menetelmä suspension valmistamiseksi tunnetaan US-patenttijulkaisusta 4 157 323. Tässä kuvattujen suspensioiden partikkelit ovat mikropalloja, jotka muodostuvat kopolymeeristä, jolla hienojakoinen metalli tai metallioksidi on päällystetty, ku- 20 ten kuviossa 1 on esitetty.

Immunodiagnostisissa kokeissa käytetään usein hyväksi leimaan kytkettyjä proteiineja. Leimana käytetään kolloidisia partikkeleita, joihin proteiini adsorboidaan fysikaalisesti. Tähän liittyviä huonoja puolia ovat muun _· 25 muassa koemateriaalin valmistuksen huono toistettavuus ja proteiinin vuotaminen. Jälkimmäinen seikka tarkoittaa sitä, ettei aktiivinen proteiini ole kiinnittynyt stabiililla tavalla partikkeleihin, mistä on seurauksena se, että testin herkkyys laskee säilytyksen aikana.

30 Sellaisten leimojen, joihin proteiini voidaan sitoa kovalenttisesti, kuten US-patenttijulkaisussa 4 157 323 on kuvattu, käyttö voi olla ratkaisu tämäntyyppisiin ongelmiin. Tässä tapauksessa ei-polymeeriset partikkelit muodostavat varsinaisen leiman. Leimalla ymmärretään kompo- 2 98863 nenttia, joka voidaan todeta spesifisen ominaisuuden (värin, radioaktiivisuuden ja vastaavan) ansiosta.

Yllä mainitun patenttijulkaisun suspensiolla on useita huonoja puolia. Ensiksikin tämän suspension kiinteä 5 aine sisältää enintään 50 paino-% ei-polymeerisiä ytimiä. Tämä merkitsee testin herkkyyden ja sovellutusmahdollisuuksien lukumäärän vähenemistä verrattuna leimoihin, joissa proteiini on suoraan sitoutunut ytimiin. Toiseksi, kultasoolia agglutinaatiotestitarkoituksiin ei voida käyt-10 tää tässä suspensiossa. Kultapartikkelit muodostavat kuitenkin erittäin sopivan leiman sen ominaisuuden ansiosta, että stabiilin kultasoolin väri on punainen ja väri muuttuu siniseksi höytelöitymisen tapahtuessa (partikkeleiden agglomeroituessa testeissä todettavan proteiinin vaikutuk-15 sesta). Kun kultaytimiä käytetään US-patenttijulkaisun 4 157 323 mukaisessa suspensiossa, suspendoituneiden partikkeleiden väri on sininen tai punainen, mutta tämä väri ei voi muuttua höytelöityessä.

Kun partikkelit ovat sinisiä, kultaytimet ovat pak-20 kautuneet niin lähekkäin, että agglomeroitumista voidaan jo katsoa tapahtuvan jokaisessa partikkelissa; katso kuvio 2.

Kun partikkelit ovat punaisia, kopolymeeri erottaa ytimet toisistaan, ja ne jäävät sellaiseksi jopa polymee-25 ripallojen agglomeroituessa, mistä on seurauksena se, ettei väri muutu (katso kuvio 3).

Tässä suspensiolla on lisäksi huonoja puolia käytettäessä väriainesooleja ytimenä. EP-julkaisusta 0 032 270 tunnetaan, että väriainesoolien lopullisessa 30 toteamisessa värin voimakkuutta voidaan lisätä antamalla soolipartikkeleiden liueta orgaaniseen liuottimeen. US-patentti julkaisun 4 157 323 mukaisessa tapauksessa, jossa väriainepartikkelit ovat paksun polymeerikuoren ympäröimiä, tämä ei ole enää mahdollista.

li 3 98863

Keksinnön mukaisen suspension kiinteät aineosat sisältävät vähintään 50 paino-% ei-polymeerisiä ytimiä ja tämä suspensio sallii värin muuttumisen agglomeroituessa kultaytimiä käytettäessä. Lisäksi ytimiä ympäröivä poly-5 meeri on tarpeeksi ohut mahdollistaakseen, turpoamalla, väriaineytimien liukenemisen orgaaniseen liuottimeen.

Keksinnössä yllä mainitun tyyppisessä, tunnetussa suspensiossa ei-polymeeriset ytimet ovat kukin erikseen oman kopolymeerikuorensa ympäröimiä. Tämä on valaistu esi-10 merkillä kuviossa 4.

Rakenteeltaan tämäntyyppisissä partikkeleissa yhdistyvät polymeeripinnan hyvät puolet ytimen ominaisuuksiin suhteessa, joka on mahdollisimman edullinen. Ei-poly-meeristen ydinten määrä riippuu ydintyypistä ja polymeeri-15 kuoren paksuudesta. Kullan ollessa kyseessä se saattaa olla yli 90 %. Kuoren paksuus voi vaihdella välillä noin 3 - 70 nm mm. koeolosuhteista riippuen.

Ei-polymeerisiä ytimiä ovat esimerkiksi metalli-, metallioksidi- tai metalliyhdisteytimet, jolloin metalli 20 ei ole magneettisesti herkkä, muista epäorgaanisista yhdisteistä, kuten piidioksidista, orgaanisista väriaineista tai orgaanisista pigmenteistä ja synteettisten, eläin-, kasvi- tai mineraaliöljyemulsiopisaroista muodostuvat ytimet. Ei-polymeeriset ytimet, jotka voidaan parhaiten tode-25 ta silmiinpistävän ominaisuutensa ansiosta, ovat edullisia. Tällaisia ovat kulta jo mainitun agglomeroituessa tapahtuvan värimuutoksensa ansiosta ja hematiitti (Fe:.0-.) punainen-ruskea-värinsä ansiosta.

Kun kolorimetrisissä testeissä käytetään väriainei-30 ta, on mahdollista valitsemalla oikein väriaine saada korkeampia moolisia absorptioita ja siten korkeampi herkkyys kuin metallisooleilla. Lisäksi, kuten yllä on mainittu, väriä voidaan voimistaa jälkeenpäin.

Funktionaalisia ryhmiä sisältävillä kopolymeereillä 35 tarkoitetaan kopolymeerejä, jotka sisältävät sellaisia 4 98863 ryhmiä kuin OH, NH2, COOH, CHO, SH ja NNX1', joihin proteiinit voivat sitoutua suoraan tai kemiallisen käsittelyn jälkeen kovalenttisesti.

Keksintö koskee myös menetelmää yllä kuvatun kek-5 sinnön mukaisen suspension valmistamiseksi. US-patentti-julkaisun 4 157 323 mukaisella tunnetulla menetelmällä suspensiot valmistetaan kopolymeroimalla in situ veteen liuotettu monomeerinseos ei-polymeeripartikkeleiden läsnäollessa, jolloin monomeeriseos sisältää seuraavanlaisia 10 monomeereja: etyleenisesti tyydyttymätön monomeeri, joka hydrolysoimatta tai hydrolyysin jälkeen sisältää ainakin yhden kovalenttisesti sitovan funktionaalisen ryhmän, hydrofobinen monomeeri ja 15 liittävä monomeeri.

Tällä menetelmällä ei-polymeeriset partikkelit dis-pergoidaan monomeeriliuokseen. Sen seikan lisäksi, että muodostuneilla partikkeleilla on edellä mainittuja huonoja puolia, menetelmällä on myös useita haittoja. Niinpä ha-20 vaitaan muodostuvan myös puhtaita polymeeripalloja ilman ydintä. Nämä ovat ei-haluttuja sivutuotteita, jotka on poistettava. Lisäksi havaitaan, ettei partikkeleiden agg-lomeroitumista voida välttää. Tämä estetään lisäämällä stabiloivaa ainetta, esimerkiksi ionitonta pinta-aktiivis-25 ta ainetta. Proteiinien leimoissa tämäntyyppinen aine yleensä häiritsee proteiinien sitoutumista ja konformaa-tiota. Käytettäessä tämäntyyppisellä menetelmällä valmistettuja partikkeleita immunodiagnostisiin testeihin erikseen lisätyt pinta-aktiiviset aineet täytyy poistaa. Tämä 30 onnistuu kuitenkin usein vain osittain.

Keksinnön mukaisella menetelmällä tavoitteena on antaa käyttöön ei-polymeeripartikkeleita omissa erillisissä kopolymeerikuorissaan, jolloin on mahdollista välttää pinta-aktiivisten aineiden käyttö, eikä puhtaita kopoly-35 meeripalloja muodostu.

li 5 98863

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on ominaista, että lähtöaineena käytetään magneettisesti epäherkkien, ei-polymeeristen partikkeleiden pysyvää, kolloidista dispersiota ja että tähän lisätään monomeeriseos, joka vali-5 taan siten, että syntyvän kopolymeerin varaus on merkiltään identtinen alkuperäisen dispersion varauksen kanssa.

Elektroforeettinen liikkuvuus määrää aiotun varauksen merkin. Alan ammattimiehet tuntevat tämän käsitteen, eikä sitä tarvitse selittää tässä yksityiskohtaisemmin.

10 Kun alkuperäisen dispersion tai emulsion ja kuori- polymeerin varausten merkit eivät ole identtisiä, kuoren muodostuessa dispersio koaguloituu, jollei käytetä pinta-aktiivisia aineita. Merkiltään identtiset varaukset saadaan käyttämällä polymeroinnin aikana käynnistäjää, joka 15 saa aikaan varattuja jäännösryhmiä, joilla on oikeanmerk-kinen varaus, ja/tai käyttämällä varattuja monomeereja, joilla on tuonmerkkinen varaus.

Alkuperäinen dispersio voidaan stabiloida peptisoi-malla ionit ja myös adsorboimalla heikosti pinta-aktiivi-20 siä aineita. Tässä vaiheessa käytetyt heikosti adsorboituvat pinta-aktiiviset aineet voidaan hyvin poistaa mikro-suodattamalla, eivätkä ne estä suspension käyttöä immuno-diagnostisissa testeissä.

Etyleenisesti tyydyttymättömät monomeerit, joissa 25 on vähintään yksi kovalenttisesti sitoutuva funktionaalinen ryhmä, voidaan valita monomeereista, jotka sisältävät OH-, NH2-, COOH-, CHO-, SH- tai NN+Cl~-ryhmän. Näistä esimerkkejä ovat etyleeni-imiini, 2,3-dihydroksipropyylimet-akrylaatti, maleiinihappo, akryyliamidi, metyloliakryyli-30 amidi, (met)akryylihappo, aldonihappo, allyyliamidit, kuten arabinonallyyliamidi, glukonallyyliamidi, a-glukohep-tonallyyliamidi, laktobionallyyliamidi, natriumvinyylisul-fonaatti, metallyylisulfonaatti, dimetyyliaminoetyylimeta-krylaatti, vinyylipyridiinisuolat, polyetyleeniglykolin 6 98863 (met)akryylihappoesterit ja vinyylipyridiini matalassa pH:ssa.

On myös mahdollista käyttää monomeereja, jotka hyd-rolyysin jälkeen sisältävät kovalenttisesti sitoutuvan funktionaalisen ryhmän. Näistä esimerkkejä ovat: 5 vinyyliasetaatti (hydrolyysituote: vinyylialkoholi) N-vinyyli-tert.butyylikarbamaatti (hydrolyysituote: vinyyliamiini), glysidyylimetakrylaatti (hydrolyysituote: 2,3-di- hydroksipropyylimetakrylaatti) , 10 dietyylimaleaatti (hydrolyysituote: maleiinihappo)

Hydrofobiset monomeerit voidaan valita monomeereis-ta, joiden liukoisuus veteen on vähintään 35 g/1 20 °C:ssa. Esimerkkejä näistä ovat styreeni, butadieeni, bu-tyyliakrylaatti, vinylideenikloridi, vinyylikloridi, etee-15 ni, metyylimetakrylaatti, etyyliakrylaatti, vinyylieste-rit, dietyylimaleaatti, glysidyylimetakrylaatti ja 2,3-epitiopropyylimetakrylaatti.

Edullisimpia hydrofobisia monomeereja ovat kuitenkin sellaiset monomeerit, jotka sisältävät hydrolysoituvan 20 ryhmän, jolloin polymeeriin muodostuu hydrofiilinen yksikkö. Esimerkkejä näistä ovat samat, yllä kuvatut hydrolysoituvat monomeerit.

Esimerkkejä liittävistä monomeereista ovat N,N-me- t tyleenibisakryyliamidi, etyleeniglykolidimetakrylaatti, 25 diallyyliftalaatti, pentaerytritolitriakrylaatti ja N,N-diallyyliviinihapon diamidi. Kun hydrofiiliseksi ja hydrofobiseksi monomeeriksi valitaan monomeerit, kuten glysidyylimetakrylaatti ja metyloliakryyliamidi, jotka ovat jo liitettäviä, erillisen liittävän monomeerin lisäys on tar-30 peetonta. Liittävää ainetta ei tarvita myöskään, kun polymeeri on tarpeeksi liukenematon polymerointiväliaineeseen. Näin on styreeni- ja akryyliamidikopolymeerin tapauksessa.

Suhde, jossa monomeerit valitaan, riippuu valittavista monomeereista.

Il 7 98863

On oleellista, että muodostuneella kuoripolymeeril-la on stabiloivia ominaisuuksia. Tämä voidaan osoittaa sallimalla monomeerin polymeroitua, kun ydinpartikkeleita ei ole läsnä ja kun myöskään pinta-aktiivisia aineita ei 5 ehkä ole läsnä. Tällöin sopivista monomeeriseoksista muodostuu kopolymeeri, joka muodostaa pysyvän lateksin, jonka partikkelikoko on 50 - 300 nm.

Reagenssi tai immunokemiallinen reagenssi kuuluu myös keksintöön. Termi reagenssi tarkoittaa, että hydro-10 fiilinen kopolymeeri, joka ympäröi ei-polymeeristä ydintä, on varustettu reagoivalla aineella.

Reagoivat aineet, joita voidaan käyttää, ovat aineita, joiden kanssa joko reseptori tai ligandi reseptori-ligandi-yhdistelmissä voi reagoida. Tällaisissa reseptori-15 ligandi-yhdistelmissä reseptorilla ja ligandilla on suora tai epäsuora affiniteetti toisiaan kohtaan. Sopivia resep-tori-ligandi-yhdistelmiä ovat esimerkiksi avidiini-biotii-ni tai DNA-DNA- tai DNA-RNA-hybridit. Sitten mainittua reagenssia voidaan käyttää menetelmässä testinesteessä 20 olevan spesifisesti sitoutuvan aineen toteamiseksi, jolla aineella on sitoutumisaffiniteetti reagenssissa olevaa reagoivaa ainetta kohtaan.

Termi immunokemiallinen reagenssi tarkoittaa, että hydrofiilinen kopolymeeri, joka ympäröi ei-polymeeristä 25 ydintä, on varustettu immunokemiallisesti aktiivisella aineella (reagoivana aineena). Vasta-ainetta, antigeeniä tai hapteenia voidaan käyttää immunokemiallisesti aktiivisena aineena.

Sitten tätä immunokemiallista reagenssia voidaan 30 käyttää menetelmässä testinesteessä olevien immunokemial-listen komponenttien toteamiseksi. Immunokemiallinen reaktio, jonka tulisi tapahtua toteamismenetelmää käytettäessä, on edullisesti kaksikerrosreaktio, agglutinaatioreak-tio, kompetetiivinen reaktio tai inhibitioreaktio.

8 98863

Esimerkiksi antigeenin osoittamiseksi testinestees-tä, antigeeniä vastaan muodostettu vasta-aine voidaan sitoa sopivaan kantajaan, jonka jälkeen testineste saatetaan kosketukseen kantajan kanssa ja testinesteessä olevan an-5 tigeenin ja vasta-aineen välille muodostuneiden immuuni-kompleksien läsnäolo todetaan lisäämällä kantajaan sopivaa keksinnön mukaista immunokemiallista reagenssia sen jälkeen, kun immuunikompleksi on muodostunut.

Kantajia, joita voidaan käyttää, ovat mikrotesti-10 kuopan, putken tai kapillaarin sisäseinä, kalvo, suodatin, testiliuska tai partikkelin, kuten esimerkiksi lateksipar-tikkelin, erytrosyytin, väriainesoolin, metallisoolin tai soolipartikkelina käytetyn metalliyhdisteen pinta.

Keksinnön mukaisen testipakkauksen täytyy sisältää 15 oleellisena komponenttina mainittu reagenssi tai immunoke-miallinen reagenssi.

Keksintöä valaistaan alla seuraavien sitä rajoittamattomien esimerkkien ja siihen kuuluvien kuvioiden 1-4 avulla.

20 Kuvio 1 esittää tekniikan tason mukaisen suspension partikkeleita. Tässä erilaiset ydinpartikkelit on ympäröity partikkelia kohti.

Kuvio 2 esittää tekniikan tason mukaisen suspension partikkeleita, jossa ytimet on ympäröity lähekkäin toisi-25 aan.

Kuvio 3 esittää tekniikan tason mukaisen suspension partikkeleita, joissa kopolymeeri erottaa ytimet toisistaan .

Kuvio 4 esittää keksinnön mukaisen suspension par-30 tikkeleita. Tässä tapauksessa jokaisella ytimellä on oma kopolymeerikuorensa.

Esimerkki 1

Kultapartikkeleiden päällystys polymeerikuorella

Siemenkultasooli, jonka partikkelikoko on noin 35 20 nm, valmistetaan Frens'in menetelmällä [Nature, Physi- l· 9 98863 cal Sei. 241 (1973) 20]. Kultasoolin kiinteiden aineiden pitoisuus on 0,006 paino-%. 80 ml tätä soolia lämmitetään 70-°C:iseksi kaksoisseinäisessä, termostaatilla kontrolloidussa reaktioastiassa sekoitusnopeudella 200 kierrosta 5 minuutissa. Sitten 0,1 g kaliumpersulfaattia ja 0,06 g natriumbikarbonaattia 5 ml:aan tislattua vettä liuotettuna lisätään kultasooliin ja sen jälkeen lisätään 7 ml seuraa-vaa monomeeriliuosta: 2 g metyylimetakrylaatti 10 1 g natriumvinyylisulfonaatti 1 g N-metyleenibisakryyliamidi 50 ml tislattu vesi 50 ml metanoli

Seosta sekoitetaan 70 °C:ssa 18 tuntia, minkä jäl-15 keen se jäähdytetään huoneen lämpötilaan. Sentrifugointi-kokeet osoittavat, ettei erillisiä polymeeripartikkeleita ole muodostunut. Näkyvän valon absorptiospektrit osoittavat, ettei partikkeliryhmiä esiinny ja että polymeerikuori on muodostunut. Dynaamisen valon sirontakokeet ja trans-20 missioelektronimikroskopia osoittavat, että kuoren paksuus on 77 nm.

Esimerkki 2

Monameeriseos, joka sisältää hydrolysoituvaa, hydrofobista monomeeria 25 2.1 Kultaparikkeleiden päällystys ohuella polymee- rikuorella

Siemensoolin valmistus

Kultasooli valmistetaan pelkistämällä tetrakloori-auriinihappoliuos natriumsitraalilla Frens'in [Nature, 30 Physical Sei. 241 (1973) 20] kuvaaman menetelmän mukaisesti. Kiinteiden aineiden pitoisuus on 0,032 paino-% kultaa. Keskimääräinen partikkelikoko on 55 nm. Näin valmistettu sooli on kolloidisesti pysyvä pinta-aktiivisia aineita lisäämättä.

10 98863 Päällystysmenetelmä 800 ml siemensoolia siirretään termostaatilla kontrolloituun yhden litran reaktioastiaan ja lämmitetään 70-°C:iseksi hitaasti sekoittaen (200 kierrosta minuutissa, 5 pöhjasekoittaja). Sitten 10 ml liuosta, joka sisältää 0,32 g kaliumpersulfaattia ja 0,2 g natriumbikarbonaattia 50 ml:ssa tislattua, deionisoitua vettä, lisätään tipot-tain kultasooliin. Tämän jälkeen 25 ml liuosta, jolla on seuraavassa esitetty koostumus, lisätään tipottain sekoi-10 tettuun, lämpimään kultasooliin yhden tunnin kuluessa. Syötetty monomeerikoostumus: 0,75 g glysidyylimetakrylaatti 0,38 g natriumvinyylisulfonaatti 0,38 g N-metyleenibisakryyliamidi 15 50 ml tislattu vesi 50 ml metanoli

Saman ajanjakson kuluessa lisätään jäljelle jäänyt osa käynnistys/puskuriliuosta. Kun monomeerit ja käynnistin on lisätty, seosta sekoitetaan vielä 15 tuntia 70 20 °C:ssa. Kun sama koe suoritetaan käyttäen kultasoolin tilalla samaa tilavuutta vettä, muodostuu stabiili lateksi, jonka partikkelikoko on noin 100 nm.

Päällystetyn kultasoolin ominaisuudet 200 ml valmistettua soolia puhdistetaan mikrosuo-25 dattamalla käyttäen 6 000 ml tislattua vettä. Transmissio-elektronimikroskooppiset ja kvasielastinen valonsironta -analyysit osoittavat, että jokainen yksittäinen kultapar-tikkeli on päällystetty 11 nm paksulla polymeerikuorella. Muodostuu alle 5 % polymeeripartikkeleita, joissa ei ole 30 kultaydintä. Jokainen päällystetty partikkeli sisältää yhden ainoan kultaytimen.

Puhdistettu, mikrosuodatettu sooli pysyy kolloidi-sesti pysyvänä 0,2 mol/1 natriumkloridin vesiliuoksessa jopa 60 tunnin kuluttua. Päinvastoin lähtösiemensooli höy-35 telöityy 0,04 mol/l:n natriumkloridipitoisuudella.

li 11 98863 Päällystetyn soolin väri on oleellisesti identtinen siemensoolin värin kanssa. Maksimiabsorptio tapahtuu aallonpituuksilla 539 ja 533 nm. Höytelöityessä esim. nat-riumkloridin vaikutuksesta todetaan luonteenomainen värin 5 vaihtuminen punainen-vaaleanpunaisesta siniseksi ja lopuksi harmaa-värittömäksi sekä siemensoolille että päällystetylle soolille.

2.2 Immunoglobuliini G:n (anti-humaanikorionqona- dotropiini, a-hCG) kemiallinen, kovalenttinen sito-10 minen polymeerillä päällystettyyn kultasooliin

Aldehydiryhmien vienti 100 ml kapseloitua, mikrosuodatettua kultasoolia esimerkistä 2.1 sekoitetaan 8,7 ml:aan 0,5 mol/1 natrium-perjodaattiliuosta pH:ssa 4,6.

15 Päällystettyä, mikrosuodatettua kultasoolia, joka on sekoitettu 8,7 ml:aan tislattua vettä, pidetään tyhjä-kokeena .

Näitä seoksia pidetään 75 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sitten hapettuminen pysäytetään lisäämällä 304 ml 20 etyleeniglykolia, jonka jälkeen seoksia sekoitetaan vielä 60 minuuttia. Sitten soolit mikrosuodatetaan käyttäen 20-kertaista tilavuutta tislattua vettä.

a-hCG 293A:n kemiallinen sitoutuminen aldehydiryh-miä sisältävään päällystettyyn kultasooliin 25 100 ml aldehydi-funktionaalisia ryhmiä sisältävää kultasoolia sekoitetaan 5 ml:aan puskuroitua a-hCG-liuosta (boraattipuskuri, pH 9a) . Vertailun vuoksi kontrolli (tyh-jäkoe) käsitellään samalla tavalla.

Seoksia inkuboidaan huoneen lämpötilassa 18 tuntia, 30 minkä jälkeen ne suodatetaan karkean nailonsuodattimen läpi.

Sitten soolit pestään kahdesti Tris-puskurilla, pH 8bl, sentrifugoimalla sooleja 60 minuuttia kiihtyvyydellä 700 g.

12 98863

Sedimentit suspendoidaan uudelleen Tris-puskuriin.

Päällystetyt kultasoolit, jotka on käsitelty tällä tavalla, testataan niiden immunologisen aktiivisuuden suhteen käyttäen Predictor-tikkua (Chefaro International).

5 Tähän tarkoitukseen 0,3 ml konjugaattia (optinen tiheys 8,33) sekoitetaan 0,2 ml:aan virtsaa, joka sisältää 0, 50 ja 1 000 kansainvälistä yksikköä (I.U.) hCG:tä litraa kohti, vastaavasti. Monoklonaalisella a-hCG:llä (147B) päällystetty tikku viedään kultasooli/virtaseokseen, ja tikkua 10 inkuboidaan 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sitten tikku pestään vedellä ja väri luetaan. Tulokset on annettu alla olevassa taulukossa I.

Taulukko I

15 hCG:n pitoisuus Kontrollisooli Aldehydisooli I.U./l 20 0 50 - + 1 000 - + 25 - tarkoittaa, ettei tikussa näy väriä + tarkoittaa, että tikussa näkyy punainen-vaalean-punainen väri a) boraattipuskurin koostumus: liuos A: 0,2 mol/1 boorihappo + 0,2 mol/1 kalium- 30 kloridi liuos B: 0,2 mol/1 natriumkarbonaatti

Liuoksen A pH saatetaan arvoon pH 9 lisäämällä liuosta B.

Puskuroitu a-hCG-liuos: 1 tilavuusosa a-hCG:tä (9,9 35 mg/ml) ja 8,4 tilavuusosaa 0,2 mol/1 boraattipuskuria.

13 98863 b; Tris-puskurin koostumus: 0,25 mol/1 Tris(2-amino-2-(hydroksimetyyli)-1,3-propaanidioli) 0,25 mol/1 natriumkloridi 5 1,29 g naudan seerumin albumiinia litrassa 0,025 g tiomersaalia litrassa

Liuoksen pH saatetaan arvoon pH 8 lisäämällä väkevää kloorivetyhappoa.

2.3 Paksun polymeerikuoren valmistaminen yksittäis-10 ten kultapartikkeleiden ympärille

Kultapartikkeleiden päällystykseen valitaan esimerkin 2.1 menetelmä lukuunottamatta syötetyn monomeerin koostumusta.

Syötetty monomeerikoostumus: 15 1,70 g glysidyylimetakrylaatti 0,85 g natriumvinyylisulfonaatti 0,85 g N-metyleenibisakryyliamidi 50 ml tislattu vesi 50 ml metanoli 20 200 ml näin saatua soolia mikrosuodatetaan käyttäen 6 000 ml tislattua vettä ja karakterisoidaan. Käyttäen transmissioelektronimikroskopiaa polymeerikuoren paksuudeksi arvioidaan runsaat 25 nm; kvasielastisella valonsi-ronnalla saadaan kuoren paksuudeksi 40 nm, mikä osoittaa 25 polymeerikuoren turpoavan vedessä. Suurin osa (>95 %) partikkeleista muodostuu yhdestä ainoasta polymeerikuoren ympäröimästä kultaytimestä.

Päällystetty, mikrosuodatettu kultasooli ei höyte-löidy 0,4 mol/1 natriumkloridiliuoksessa edes 60 tunnin 30 kuluttua. Höytelöitymistä tapahtuu huomattavasti korkeammissa natriumkloridipitoisuuksissa, mutta värinmuodostus-ta, mikä on luonteenomaista päällystämättömien kultasoo-lien höytelöitymiselle, ei enää tapahdu. Sen sijaan todetaan punainen-vaaleanpunaisia höytelöitä. Jos siemenkulta-35 sooli korvataan vastaavalla tilavuudella vettä, monomee- 14 98863 rien polymeroituminen johtaa pysyvään lateksiin, jonka partikkelikoko on runsaat 120 nm.

Esimerkki 3 Väriainesoolin päällystys 5 3.1 Siemensoolin valmistus 50 g Palanil light red -väriä (disperssi väriaine-liete, BASF n:o 7 764 060) sekoitetaan 1 000 ml:aan tislattua vettä 45 minuutin aikana huoneen lämpötilassa. Tämä väriainesooli puhdistetaan pesemällä kuusi kertaa peräk-10 käin tislatulla vedellä. Ensimmäiset viisi pesuvaihetta suoritetaan sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 2 000 g 30 minuutin ajan ja dispergoimalla uudelleen tislattuun veteen. Viimeinen sentrifugointivaihe suoritetaan kiihtyvyydellä 125 g 60 minuutin ajan. Tämä puhdistusprosessi pois-15 taa tehokkaasti ylimääräisen pinta-aktiivisen aineen. Lisäksi tapahtuu jonkin verran fraktioitumista. Raakasoolin pintajännitys on 43,5 dyne/cm, puhdistetun soolin pintajännitys on 71,1 dyne/ml molemmat mitattuna kiinteiden aineiden pitoisuudella 4,8 g väriainetta litrassa.

20 3.2 Päällystys 125 ml laimeaa, pestyä väriainesoolia (0,145 %) lämmitetään 70-°C:iseksi ja sekoitetaan (200 kierrosta minuutissa) reaktioastiassa. Sitten lisätään 12,5 ml liuosta, joka sisältää 0,10 g natriumbikarbonaattia ja 25 0,10 g kaliumpersulfaattia vedessä. Tämän jälkeen lisätään 12,5 ml monomeeriliuosta, jolla on seuraavassa esitetty koostumus, peristalttista pumppua käyttäen yhden tunnin kuluessa.

Syötetty monomeeri: 30 2 g glysidyylimetakrylaatti 1 g natriumvinyylisulfonaatti 0,5 g N-metyleenibisakryyliamidi 50 ml tislattu vesi 50 ml metanoli 15 98863

Soolikoostumus jäähdytetään 16 tunnin kuluttua ja 100 ml puhdistetaan mikrosuodattamalla käyttäen 2 500 ml tislattua vettä. Päällystetyn soolin halkaisija on 86 nm suurempi kuin alkuperäisen soolin, joka on 316 nm. Sooli-5 koostumuksen sentrifugointi 52-%:isessa (w/w) glukoosive-siliuoksessa, jonka tiheys on 1,23 g/ml, johtaa putken pohjalle sedimentoituneisiin punaisiin partikkeleihin. Supernatanttinesteen pinnalla ei havaita erillisiä poly-meeripartikkeleita. Erillisiä partikkeleita ei todeta 10 myöskään "sedimentation field flow fractination" -kokeissa .

Pinnan modifioinnin vaikutus proteiinien adsorptioon on huomattava. Kaksi neljän millilitran putkea täytetään yhdellä millilitralla päällystämätöntä, puhdistet-15 tua soolia ja yhdellä millilitralla päällystettyä, puhdistettua väriainesoolia, vastaavasti. Kumpikin putki sisältää 0,054 g väriainetta. 1,75 ml fosfaattipuskuria1, pH

7,4, ja sitten 0,76 ml liuosta, joka sisältää 2,67 mg/ml naudan seerumin albumiinia (R-tyyppi, Organon Teknika), 20 lisätään näihin putkiin.

Putkia ravistellaan huoneen lämpötilassa kaksi tuntia, minkä jälkeen ne sentrifugoidaan. Supernatanttinesteen naudan seerumin albumiini -pitoisuus määritetään HPSECrllä (korkeapainegeelisuodatus) . 0,28 mg/m- proteiinia 25 on adsorboitunut päällystämättömään, puhdistettuun soo- liin; päällystetyssä soolissa ei todeta adsorboitunutta proteiinia.

Fosfaattipuskurin koostumus:

Liuos A: 9,0772 g kaliumdivetyfosfaattia yhdessä 30 litrassa vettä,

Liuos B: 11,8586 g dinatriumvetyfosfaattia yhdessä litrassa vettä. Sekoita 5 osaa liuosta A 24 osaan liuosta B.

16 98863 3.3 Immunoglobuliini G:n (anti-humaanikoriongona-dotropiini, a-hCG) kemiallinen, kovalenttinen sitoutuminen polymeerillä päällystettyyn väriainesoo-liin 5 3.3.1 Aldehydiryhmien vienti

Kapseloitu, mikrosuodatettu väriainesooli esimerkistä 3.2 ja muita näytteitä, joiden polymeerikerroksen paksuus on erilainen, varustetaan aldehydiryhmillä esimerkissä 2.2 kuvatulla tavalla.

10 3.3.2 a-hCG 293A:n kemiallinen sitoutuminen pääl lystettyyn, aldehydiryhmiä sisältävään väriainesoo-liin a-hCG:n kytkentä aldehydi -funktionaalisia ryhmiä sisältäviin sooleihin suoritetaan esimerkissä 2.2 kuvatul-15 la tavalla.

3.4 Immunologinen määritys Näin valmistettujen (a-hCG)-väriainesoolikonjugaat-tien immunologinen aktiivisuus testataan a-hCG:n kaksiker-ros-immunologisella määritysmenetelmällä, kuten esimerkis-20 sä 2.2 on kuvattu, inkuboimalla a-hCG:llä (147B) päällystettyä upotustikkua (Predictor stick, Chefaro Interna tional) huoneen lämpötilassa seoksessa, jossa on hCG:tä sisältävää virtsaa ja konjugaattia (Ajg0 = 8,3) . Sitten tikku huuhdotaan vedellä ja väri luetaan. Tulokset on annettu 25 taulukossa II.

li 17 98863

Taulukko II

Väriainesooli-(a-hCG)-konjugaatit testattuina upo-tustikkukaksikerros -immunologisella määritysmenetelmällä (Predictor stick, Chefaro International) 5 hCG:n Inkubointi- ACI-113* ACI-124* ACI-125* ACI-126* ACI-127* 10 pitoisuus aika 0 0,5 - - - 15 200 0,5 + /- +/- 1 000 0, 5 + */- 10 000 0,5 + + + 20 +/- +/- 0 1,0 - - - 25 200 1,0 +/- +/- + /- 1 000 1,0 + + + +/- 10 000 1,0 + + + 30 + + 0 2,0 - - - 35 200 2,0 +/- + +/- 1 000 2,0 + + + +/- +/- 10 000 2,0 + + + 40 + + *’ konjugaatti perustui polymeerillä päällystettyihin väriainesooleihin, 45 joiden päällystyskerroksen paksuus väitteli seuraavasti (mitattu dynami-sella valonsironnalla/QELS) : ACI-113 : 86 nm ACI-124: 88 nm ACI-125 : 58 nm ACI-126 : 30 nm ACI-127 : 35 nm 50 + valkoisessa tikussa punainen-vaaleanpunainen väri - valkoisessa tikussa ei näy väriä 18 98863

Esimerkki 4

Kultapartikkeleiden päällystys kuoripolymeerin liu-koisuusrajan yläpuolella 800 ml siemenkultasoolia (0,032 paino-%; katso esi-5 merkistä 1 tämän siemensoolin valmistus) lämmitetään 70-°C:iseksi termostaatilla kontrolloidussa reaktioastiassa, jossa on palautusjäähdytin ja sekoittaja. 10 ml liuosta, joka sisältää 0,32 g kaliumpersulfaattia ja 0,32 g natriumkarbonaattia 50 ml:ssa tislattua vettä, lisätään ti-10 pottain, ja 10 ml monomeeriliuosta, jonka koostumus on esitetty seuraavassa, lisätään tipottain yhden tunnin kuluessa .

Syötetty monomeeriliuos: 12 g vinyyliasetaatti 15 4 g dietyylimaleaatti 3 g dietyyliviinihapon diamidi 50 ml vesi 50 ml metanoli Jäljelle jäänyt käynnistin/puskuriliuos lisätään 20 monomeerien lisäyksen aikana. 24 tunnin kuluttua monomee-rien lisäyksestä reaktioastia jäähdytetään huoneen lämpötilaan, ja sooli puhdistetaan mikrosuodattamalla käyttäen 25-kertaista tilavuutta vettä suhteessa alkuperäiseen soo-lin tilavuuteen. Polymeerikuoria ei voida todeta partikke-25 leiden ympärillä, ja kolloidinen stabiilius on aivan yhtä alhainen kuin "päällystämättömällä" siemensoolilla. Poly-meroinnin toistaminen käyttäen vettä siemensoolin sijasta ei tuota liukenematonta polymeeriä: liuos pysyy kirkkaana. Jos polymerointiprosessi kuitenkin suoritetaan lisäämällä 30 ei 10 ml vaan 80 ml yllä olevaa monomeeriliuosta tunnin kuluessa, saadaan ilman siemensoolia lateksi, jonka partikkelikoko on 152 nm. Kultapartikkeleiden läsnäollessa muodostuu kultapartikkeleiden ympärille polymeerikuori, jonka paksuus on 27 nm. Kolloidinen stabiilius on myös 35 selvästi suurempi kuin siemensoolilla.

Il 19 98863

Esimerkki 5

Kultapartikkeleiden päällystys päällystysmonomeerin liukoisuusrajan alapuolella 100 ml 0,032 paino-%:ista siemensoolia (katso val-5 mistus esimerkistä 1) lämmitetään 70-°C:iseksi typpikuvun alla. 5 ml liuosta, joka sisältää 0,1 g kaliumpersulfaat-tia ja 0,1 g natriumbikarbonaattia, lisätään tipottain tähän sooliin. Tämän jälkeen lisätään 2,2 ml monomeeri-liuosta, jonka koostumus on esitetty seuraavassa, peris-10 talttisen pumpun avulla.

Monomeerin syöttökoostumus: 5 g styreeni 1 g akryyliamidi 80 ml metanoli 15 Kun seosta on sekoitettu ja lämmitetty 70 °C:ssa 24 tunnin ajan, reaktioastia jäähdytetään huoneen lämpötilaan. Kultasooli mikrosuodatetaan käyttäen 25-kertaista tilavuutta vettä. Puhdistettu sooli kestää 0,10 mol/1 nat-riumkloridia seisottuaan 24 tuntia. Toisen sukupolven po-20 lymeeripartikkeleita ei ole muodostunut. Näissä olosuh teissa styreenimonomeeri liukenee täydellisesti reaktio-seokseen .

Kun tämä polymerointi suoritetaan ilman kultasoolia käyttäen vettä sen tilalla, muodostuu kolloidinen, pysyvä 25 lateksi, jonka partikkelikoko on 120 nm.

Jos kuitenkin käytetään korkeampaa syöttömonomeeri-pitoisuutta lisäämällä 3,4 ml seuraavaa koostumusta: 10 g styreeni 2 g akryyliamidi 30 80 ml metanoli syntyy uusi polymeeripartikkelisukupolvi. Tässä korkeammassa monomeeripitoisuudessa styreenimonomeeri ei enää liukene seokseen. Lisäksi näin käsitellyt kultapartikkelit kestävät suolaa huonosti ja puhdistuksen jälkeen sooli 35 höytelöityy jo 0,04 mol/1 NaCl:lla, mikä on sama pitoisuus 20 98863 kuin lähtösoolille (siemensooli). Voidaan tehdä se johtopäätös, ettei tässä tapauksessa partikkeleiden päällystystä polymeerillä tapahdu. Päinvastoin kuin kultapartikke-lit, vasta muodostetut polymeeripartikkelit kestävät suu-5 rempia natriumkloridipitoisuuksia kuin 0,1 mol/1.

Esimerkki 6

Vertailuesimerkki, joka on analoginen US-patentti- julkaisun 4 157 323 esimerkin 3 kanssa 1,8 g hydroksietyylimetakrylaattia, 0,3 g N-mety- 10 leenibisakryyliamidia, 0,6 g akryyliamidia ja 0,3 g metak-ryylihappoa liuotetaan 90 ml:aan deionisoitua (Milli-Q) vettä kaksoisseinämäisessä reaktioastiassa.

Liuos lämmitetään 70-C:iseksi, ja sitä sekoitetaan kierrosnopeudella 200 kierrosta minuutissa. Sitten lisä-15 tään 0,1 g kaliumpersulf aattia ja 0,1 g natriumbikarbonaattia liuotettuna 10 ml:aan vettä.

Noin 3-5 minuutin kuluttua muodostuu suuria, valkoisia höytelöitä. Tämä osoittaa ei-kolloidisen polymeerin muodostumista.

20 Vertailuesimerkki, joka on analoginen US-patentti julkaisun 4 157 323 esimerkin 11 kanssa 0,64 g hydroksietyylimetakrylaattia, 0,70 g metyy-limetakrylaattia, 0,64 g metakryylihappoa ja 0,224 g ety-leeniglykolidimetakrylaattia liuotetaan 90 ml:aan deioni-25 soitua (Milli-Q) vettä kaksoisseinäisessä reaktioastiassa.

Reaktiolämpötilaksi valitaan huoneen lämpötila. 0,08 g kaliumpersulfaattia ja 0,04 g natriumbisulfiittia liuotettuna 10 ml:aan vettä lisätään seokseen.

15 minuutin kuluttua todetaan pysymätön lateksi 30 (höytelöitynyt polymeeri).

Claims (13)

98863

1. Diagnostisiin testeihin tarkoitettu vesipitoinen suspensio, joka sisältää ei-polymeeriytimiä, joita ympäröi 5 funktionaalisia ryhmiä sisältävä, hydrofiilinen kopolymee-ri, tunnettu siitä, että ei-polymeeriytimet eivät ole magneettisesti herkkiä ja ovat kukin erikseen oman kopolymeerikuorensa ympäröimiä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen vesipitoinen sus- 10 pensio iramunodiagnostisiin testeihin.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen vesipitoinen suspensio, tunnettu siitä, että ydin on metalli, metallioksidi tai metalliyhdiste, jolloin metalli ei ole magneettisesti herkkä, epäorgaaninen yhdiste, or- 15 gaaninen väriaine, orgaaninen pigmentti tai synteettisen, eläin-, kasvi- tai mineraaliöljyemulsion pisara.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen vesipitoinen suspensio, tunnettu siitä, että ydin on kultasooli tai väriainesooli.

5. Menetelmä vesipitoisen suspension valmistamisek si diagnostisiin tai immunodiagnostisiin testeihin in situ -kopolymeroimalla veteen liuotettu monomeeriseos ei-poly-meeripartikkeleiden läsnä ollessa, jolloin monomeeriseos sisältää seuraavantyyppisiä monomeereja: !. 25 etyleenisesti tyydyttymättömän monomeerin, joka hydrolysoimatta tai hydrolyysin jälkeen sisältää ainakin yhden kovalenttisesti sitovan funktionaalisen ryhmän, hydrofobisen monomeerin ja liittävän monomeerin, tunnettu siitä, että 30 suspensio valmistetaan käyttäen lähtöaineena magneettisesti epäherkkien ei-polymeeripartikkeleiden pysyvää, kolloidista dispersiota ja lisätään tähän monomeeriseos, joka on valittu siten, että muodostuvan kopolymeerin varaus on identtinen alkuperäisen dispersion varauksen kanssa. 98863

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetty hydrofobinen mono-meeri on monomeeri, joka sisältää ryhmiä, jotka voidaan hydrolysoida hydrofiilisiksi ryhmiksi, ja että polymeroin- 5 nin jälkeen nämä hydrolysoituvat ryhmät hydrolysoidaan.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monomeeriseos sisältää: 2-98 paino-% glysidyylimetakrylaattia, 0-96 paino-% natriumvinyylisulfonaattia ja 10 2-40 paino-% N,N-metyleenibisakryyliamidia.

8. Diagnostisiin testeihin tarkoitettu reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää magneettisesti epäherkkiä ei-polymeeriytimiä, joita kutakin ympäröi hyd-rofiilistä kopolymeeria oleva oma kuori, jolloin kopoly- 15 meeri on varustettu reagoivalla aineella.

9. Immunokemiallinen reagenssi tunnettu siitä, että se sisältää magneettisesti epäherkkiä ei-polymeeriytimiä, joita kutakin ympäröi hydrofiilistä kopolymeeria oleva oma kuori, jolloin kopolymeeri on varustettu 20 immunokemiallisesti aktiivisella aineella.

10. Menetelmä spesifisesti sitoutuvan aineen toteamiseksi testinesteestä, tunnettu siitä, että käytetään vähintään yhtä patenttivaatimuksen 8 mukaista rea-genssia, jolloin mainitulla spesifisesti sitoutuvalla ai- 25 neella on sitoutumisaffiniteettia reagenssissa olevaa reagoivaa ainetta kohtaan.

11. Menetelmä immunokemiallisesti aktiivisen komponentin toteamiseksi testinesteestä, tunnettu siitä, että käytetään vähintään yhtä patenttivaatimuksen 9 30 mukaista immunokemiallista reagenssia, jolloin mainitulla immunokemiallisesti aktiivisella komponentilla on sitoutumisaf f initeettia immunokemiallisessa reagenssissa olevaa immunokemiallisesti aktiivista ainetta kohtaan. Il 98863

12. Testipakkaus käytettäväksi diagnostisessa testissä, tunnettu siitä, että se sisältää vähintään yhden patenttivaatimuksen 8 mukaisen reagenssin.

13. Testipakkaus käytettäväksi immunologisessa mää-5 ritysmenetelmässä, tunnettu siitä, että se sisältää vähintään yhden patenttivaatimuksen 9 mukaisen immuno-kemiallisen reagenssin. 98863