JPH02183165A - 診断テスト用水性懸濁液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、官能基を含む親水性コポリマーによって包囲
されている非ポリマー核を含有する診断または免疫診断
テスト用水性懸濁液と、該懸濁液の製造方法とに関する
。

更に本発明は、テスト流体中の特異的結合物質または免
疫化学的活性成分を検出する方法と、該検出方法を用い
る場合に使用される試薬及びテストキットとに関する。

上記懸濁液及びその製造方法は米国特許第４．１５７．
３２３号明細書から公知である。該特許に記載の懸濁液
の粒子は、第１図に示したように、ｍ細に分割された金
属または金属酸化物が埋め込まれたコポリマーで構成さ
れる微小球（ｍｉｅｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）である。

免疫診断テストには標識（ｌａｂｅｌ）に結合されたタ
ンパク質が頻繁に使用される。即ち、タンパク質が物理
的に吸着したコロイド粒子が標識として使用される。こ
れに伴なう欠点は、特に、テスト材料の製造の再現性が
乏しいこと、及びタンパク質の漏出があることである。

タンパク質の漏出とは、活性タンパク質が粒子に安定し
て結合されず、その結果、保管中にテスト感度が落ちる
ことを意味する。

米国特許第４，１５７，３２３号明細書に記載のように
、タンパク質が共有結合され得る標識の使用は、この種
の問題点の解決策となり得る。この場合、非ポリマー粒
子が実際の標識を構成する。標識とは特定の特性（色、
放射能等）によって検出され得る成分を意味すると理解
されたい。

上記特許の懸濁液は幾つかの欠点を有する。第１に、こ
の懸濁液中の固体材料は多くとも５０重量％の非ポリマ
ー核しか含有しない、これではテスト感度が小さくなり
、タンパク質が核に直接結合する標識と比較し、適用可
能な用途の数は減少する。第２に、この懸濁液では凝集
テストの目的で金ゾルを使用することができない、しか
しながら金粒子は、安定した金ゾルの色は赤であるが凝
集（検出されるべきタンパク質の作用下のテストにおけ
る粒子のアグロメレーション）すると色が青に変化する
特性の故に非常に適した標識となる。

米国特許下４，１５７，３２３号明細書に記載の懸濁液
において金核を使用すると、懸濁粒子の色は青または赤
であるが、この色は凝集に際して変化し得ない 粒子が青色である場合には金核は相互に密着して埋め込
まれており、各粒子において既に凝集していると見なさ
れ得る（第２図参照）。

粒子が赤色である場合には核はコポリマーによって相互
に分離されており、ポリマー球が凝集しても一様のまま
であり、その結果、色が変化しない（第３図参照）。

更にこの懸濁液は、核として染料ゾルを使用する際にも
欠点を有する６欧州特許第００３２２７０号明細書から
、染料ゾルの最終的な検出において、ゾル粒子を有機溶
剤中に溶解させることにより色強度を増強し得ることが
公知である。米国特許下４．１５７，３２３号明細書の
厚いポリマーシェル（殻）中に埋め込まれた染料粒子の
場合には、これはもはや不可能である。

本発明の懸濁液の固体構成成分は少なくとも５０重量％
の非ポリマー核を含有し、この懸濁液は、金核を使用し
た場合に凝集によって色が変化する。

更に、核を包囲するポリマーは、膨潤によって染料核が
有機溶剤中に溶解できるほど充分に薄い。

本発明は、上記公知のタイプの懸濁液における非ポリマ
ー核がそれぞれ個々のコポリマーシェルによって別個に
包囲されていることからなる。これを第４図に示す。

この種の構成を有する粒子は、ポリマー表面の長所と核
の特性とを出来るだけ好ましい比で結び付ける。非ポリ
マー核の含有量は、核の種類及びポリマーケーシングの
厚さに依存する。金の場合であれば含有量は９０％以上
とできる。ゲージングの厚さは、特に実験条件に応じて
約３〜７０ｎｍに変化し得る。

非ポリマー核としては例えば、金属、金属酸化物、金属
化合物、シリカのごとき他の無機化合物、有機染料また
は有機顔料、及び合成油、動物油、植物油または鉱油の
エマルジョン小滴（ｄｒｏｐｌｅｔｓ）の核を挙げるこ
とができる。非ポリマー核は、顕著な特性によって最も
良く検出し得るものが好ましい、好ましい非ポリマー核
は、既に記載したように凝集に際しての色が変化するこ
とがら金、赤褐色であることから赤鉄鉱（Ｆｅ２０−）
及び磁気特性があることから磁鉄鉱（Ｆｅ＝０．）であ
る。

比色テストに染料を使用する場合には、染料を正しく選
択すれば、金属ゾルを使用するよりもより高いモル吸光
が可能であり、即ちより感度を高くできる。更に、前記
したように、その後に色彩強化をなし得る。

官能基を含むコポリマーとは、タンパク質が直接に結合
できるまたは化学処理後に共有結合できるＯＨ，ＮＨ２
、Ｃ０ＯＨ，Ｃｌｌ０１ＳＨ，ＮＨ”ＣＩ−のような基
を含むコポリマーを意味すると理解されたい。

更に本発明は、上記本発明の懸濁液を製造する方法に関
する。米国特許下４，１５７，３２３号明細書に記載の
公知の方法を使用し、水に溶解したモノマー混合物を非
ポリマー粒子の存在下にその場（ｉｎｓｉｔｕ）共重合
することにより懸濁液を製造する。

前記モノマー混合物は、 加水分解せずともまたは加水分解後に少なくとも１つの
共有結合官能基を含むエチレン性不飽和モノマー 疎水性モノマー 架橋モノマー（ｌｉｎｋｉｎｇ　ｍｏｎｏｍｅｒ）、と
いった種預のモノマーを含有する。

この方法においては、非ポリマー粒子をモノマー溶液中
に分散させる。形成された粒子は上記欠点を有すること
に加え、この方法は更に幾つかの欠点を有する。即ち、
核をもたない純然たるポリマー球（ｓｐｈｅｒｅｓ）の
形成も見られる。これらは、除去されるべき望ましくな
い副産物である。更に、粒子の凝集は避けられないもの
であることが見出される。これは、例えば非イオン性界
面活性剤のごとき安定剤を加えることによって回避され
る。

タンパク質に対する標識においては、この種の物質は一
般的にタンパク質の結合及び立体配座（ｃｏｎｆｏｒｅ
＋ａｔｉｏｎ）を妨害しかつ乱す、この種の方法に従っ
て製造された粒子を免疫診断テストに使用する場合には
、別々に加えた界面活性剤を再度除去せねばならない、
しかしながら、これは部分的にしか成功しないことが多
い。

本発明の方法を使用する目的は、個々にコポリマーシェ
ルを備えた非ポリマー粒子を提供し、界面活性剤の使用
を回避することを可能とし且つ純然たるコポリマー球が
形成されなくすることである。

本発明の方法の特徴は、非ポリマー粒子の安定なコロイ
ド分散液を出発材料として使用し、これに、得られるコ
ポリマーがもとの分散液の電荷と同一の符号の電荷を有
するように選択されたモノマー混合物を加えることであ
る。

目的とする電荷の符号は電気泳動移動度によって決定さ
れる。この概念は当業者には公知であり、ここでは詳細
な説明はしない。

当初の分散液またはエマルジョンの電荷とシェルポリマ
ーの電荷とが同一の符号でない場合、界面活性剤がない
とシェルの形成の最中に分散液が凝固する。同一符号の
電荷は、重合に際して正しい符号の電荷を有する荷電残
基を与える開始剤及び／または正しい符号の電荷を有す
る荷電モノマーを使用することにより得られる。

当初の分散液は、解凝固イオン（ｐｅｐｔｉｚｉｎｇ　
１ｏｎｓ）によって、また弱吸着性界面活性剤によって
安定化することができる。この、段階で使用される弱１
吸着性界面活性剤は精密濾過によってうまく除去するこ
と°ができ、免疫診断テストにおける懸濁液の使用を妨
害しない。

少なくとも１つの共有結合官能基を含むエチレン性不飽
和モノマーは、Ｏｉｌ、　Ｎｉ１．、Ｃ００Ｈ１Ｃ１１
０、Ｓｌ！またはＮＨ″Ｃ１−基を含むモノマーから選
択することができる。これらの例としては、エチレンイ
ミン、メタクリル酸２，３−ジヒドロキシプロピル、マ
レイン酸、アクリルアミド、メチロールアクリルアミド
、（メト）アクリル酸、アルドン酸、アリルアミド（例
えばアラビノンアリルアミド、グルコンアリルアミド、
α−グルコヘプトンアリルアミド、ラクトビオンアリル
アミド）、とニルスルホン酸ナトリウム、スルホン酸メ
タリル、メタク、リル酸ジメチルアミノエチル、ビニル
ピリジン塩、ポリエチレングリコールの（メト）アクリ
ル酸エステル及び低ｐｎでのビニルピリジンを挙げるこ
とができる。

加水分解後に共有結合官能基を含むモノマーを使用する
ことも可能である。それらの例としては、酢酸ビニル（
加水分解生成物：ビニルアルコール）、Ｎ−ビニル−第
三ブチルカルバメート（加水分解生成物：ビニルアミン
）、 メタクリル酸グリシジル（加水分解生成物：メタクリル
酸２，３−ジ−ヒドロキシプロピル）、マレイン酸ジエ
チル（加水分解生成物：マレイン酸）を挙げることがで
きる。

疎水性モノマーは、２０℃で少なくとも３５ｇ、＃の水
への溶解度を有するモノマーから選択することができる
。それらの例としては、スチレン、ブタジェン、アクリ
ル酸ブチル、塩化ビニリデン、塩化ビニル、エテノ、メ
タクリル酸メチル、アクリル酸エチル、ビニルエステル
類、マレイン酸ジエチル、メタクリル酸グリシジル及び
メタクリル酸２．３−エビチオプロピルを挙げることが
できる。

しかしながら最も有利な疎水性モノマーは、ポリマー中
に親水性単位が形成されるように加水分解可能な基を有
するものである。それらの例と−しては、上記と同じ加
水分解可能なモノマーを挙げることができる。

架橋モノマーの例としてはＮ、Ｎ−メチレン−ビスアク
リルアミド、エチレングリコールジメタクリレート、フ
タル酸ジアリル、トリアクリル酸ペンタエリトリトール
及びＮ、Ｎ−ジアリル−酒石酸ジアミドを挙げることが
できる。親水性及び疎水性モノマーとしてメタクリル酸
グリシジル及びメチロールアクリルアミドのごとき既に
架橋可能なモノマーを選択した場合には、別の架橋モノ
マーを加える必要はない、また、架橋剤は、コポリマー
が重合媒質に実質的に不溶性である場合にも必須ではな
い、これは、スチレン及びアクリルアミドのコポリマー
の場合に当てはまる。

モノマーを使用する比は、とのモノマーを選択するかに
従って選択し得る。

形成されたシェルポリマーが安定化特性を有することが
不可欠である。これは、モノマー混合物を核粒子なしで
、しかも場合によって界面活性剤もなしで重合させるこ
とによって判る。粒径が５０〜３００ｎｍの安定ラテッ
クスを形成するコポリマーは、好適なモノマー混合物か
ら形成される。

試薬または免疫化学試薬もまた本発明に属する。

試薬なる用語は、非ポリマー核を包囲する親水性コポリ
マーに反応物質が付与されていることを意味する。

使用し得る反応物質は、レセプターリガンドの組合せに
おけるレセプタまたはリガンドのいずれかが反応できる
物質である。かかるレセプターリガンドの組合せにおい
て、レセプタ及びリガンドは相互に、直接的または間接
的な結合親和力を有する。適当なレセプターリガンドの
組合せとしては、例えばアビジン−ビオチンまたはＤＮ
Ａ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮ＾ハイブリッドがある。

前記試薬は、テスト流体中の特異的結合物質を検出する
方法に使用することができる。この物質は、試薬中に存
在する反応物質に対する結合親和力を有する。

免疫化学試薬なる用語は、非ポリマー核を包囲する親水
性コポリマーに（反応物質として）免疫化学的活性物質
が備わっていることを意味する。免疫化学的活性物質と
しては抗体、抗原またはハプテンを使用することができ
る。

この免疫化学試薬は、テスト流体中の免疫化学的活性成
分を検出する方法に使用することができる。この検出方
法を使用する場合に生起すべき免疫化学反応は好ましく
は、サンドイッチ反応、凝集反応、拮抗反応または阻害
反応である。

例えばテスト流体中の抗原を示すためには、抗原に対す
る抗体を適当な支持体に結合し、次いでテスト流体をこ
の支持体と接触させ、テスト流体中の抗原と抗体との間
に免疫複合体が形成された後に、形成された免疫複合体
の存在を、本発明の適当な免疫化学試薬を支持体に加え
ることにより検出することができる。

使用することができる支持体は、マイクロテストウェル
の内壁、チューブもしくは毛細管、膜、フィルター、テ
ストストリップまたは粒子表面（例えばラテックス粒子
、赤血球、染料ゾル、金属ゾルもしくはゾル粒子として
の金属化合物）である。

本発明のテストキットは、必須構成要素として、前記試
薬または免疫化学試薬を包含する必要がある。

以下、本発明を非限定的な実施例及び第１図から第４図
によって説明する。

粒径的２０ｎｍの金シードゾル（ｓｅｅｄ　５ｏｌ）を
Ｆｒｅｎｓの方法（Ｎａｔｕｒｅ、Ｉ’ｈｙｓｉｃａｌ
　Ｓｃｉ、２４１（１９〕３）　、２０）によって製造
した。金ゾルの固体含有量はｏ　、　ｏｏｅ重量％であ
った。このゾル８ｏｒｎｅを二重壁のサーモスタット制
御反応器内で撹拌速度２００回転回転上し７０℃にまで
暖めた。この金ゾルに、蒸留水５ｍｉ中に溶解した過硫
酸カリウム０．１ｇ及び重炭酸ナトリウム０．０６ｇを
加え、次いで組成： メタクリル酸メチル　　　　　　２゜ ビニルスルホン酸ナトリウム　　１ｇ Ｎ−メチレンビスアクリルアミド　　１ｇ蒸留水　　　
　　　　　　　　　５０ｍ１メタノール　　　　　　　
　　　５０ｍ１のモノマー溶液７ｔａｌを加えた。

この混合物を７０℃で１８時間撹拌し、次いで室温にま
で冷却した。遠心分離テストによって、別の（ｓｅｐａ
ｒａｔｅ）ポリマー粒子は形成されなかったことが判っ
た。可視光吸収スペクトルは、粒子の集塊が存在しない
こと及びポリマーシェルが形成されたことを示した。動
的光散乱テスト及び透過電子顕微鏡からシェルの厚さが
７７ｎｍであることが判った。

支ｍ ｔ疎　　モノマーを　むモノマー 含〕 Ｆｒｅｎｓ（Ｎａｔｕｒｅ、Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｓｃｉ
、２４１（１９７３）、２０）の方法に従い、テトラク
ロル金酸溶液をクエン酸ナトリウムで還元することによ
り金ゾルを製造した。

固体含有量は０．０３２重量％であり、平均粒径は５５
ｎｍであった。このように製造したゾルは、界面活性剤
を加えなくともコロイド状に安定していた。

１１盪１ シードゾル８００ｎ＋４！を１リツトルのサーモスタッ
ト制御反応器に移し、ゆっくり撹拌しながらく２００回
転／分、アンカー撹拌機）７０℃にまで暖めた。この金
ゾルに、過硫酸カリウム０．３２ｇ及び重炭酸ナトリウ
ム０．２ｇを蒸留脱イオン水５０ｍ１中に溶解した溶液
１０ｍ１を滴下して加えた。この暖かい金ゾルに撹拌し
ながら１時間かけて、組成： メタクリル酸グリシジル　　　　０．７５ｇビニルスル
ホン酸ナトリウム　　０　、３８ｇＮ−メチレンビスア
クリルアミド　０．３８ｆＩ蒸留水　　　　　　　　　
　　　５０ｍ１メタノール　　　　　　　　　　５０ｍ
１の溶液２５ｍ１を滴下して加えた。

これと並行して、残りの開始剤／緩衝液を加えた。モノ
マー及び開始剤を加えた後、混合物を７０℃で更に１５
時間撹拌した。金ゾルの容積分を水に代えて同じ実験を
実施すると、粒径が約１００ｎｎの安定したラテックス
が形成された。

金ゝルの、 このように製造したゾル２００ｍ４を、蒸留水６，００
０論！を用いた精密濾過によって精製した。透過電子顕
微鏡及び準弾性光散乱による分析によって、それぞれ個
々の金粒子が厚さ１ｉｎＩ１１のポリマーシェルによっ
て被覆されたことが判った。５％未満のポリマー粒子が
金核を含まずに形成された。被覆された粒子はそれぞれ
が単一の金核を包含していた。

精密−過した精製ゾルは、６０時間経過した後も０．２
Ｍ塩化ナトリウム水溶液中でコロイド状に安定していた
。それに反して、出発シードゾルは、濃度０．０４Ｍの
塩化ナトリウムによって凝集した。

被覆ゾルの色はシードゾルのものとほぼ同一であった。

最大吸光は波長５３９ｎｎ及び５３３ｎｍで起こった１
例えば塩化ナトリウムの作用による凝集においては、赤
〜桃色から青色へと変化し最終的に灰色〜無色になると
いう特徴的な色の変化が、シードゾル及び被覆ゾルの両
方について検知された。

実施例２．．１で製造した精密濾過後の封入金ゾル１０
０ｍ１’をｐＨ４，６の０．５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム
溶液８．７ｍｌと混合した。

精密濾過した金ゾルを蒸留水８．７ｍｌと混合したもの
をブランク実験とした。

上記混合物を室温で７５分間放置し、次いでエチレング
リコール３０４社を加えることにより酸化を中止し、そ
の後、混合物を更に６０分間撹拌した。

次いで、ゾルを２０倍８の蒸留水を用いて精密濾過した
。

アルデヒド官能基を含む金ゾル１００ｍＮをａ　−ｈ　
ＣＧ　緩衝溶液（ホウ酸（ｂｏｒａｔｅ）緩衝液、ｐＨ
＝９”）５ｍｉ’と混合した。比較のために、コントロ
ール（ブランク）にも同様の処理をした。

上記混合物を室温で１８時間インキュベートし、次いで
粗ナイロンフィルタを通して濾過した。

次いでこれらのゾルをトリス［ｆｆｒ液、ｐｌ＋＝８ｂ
＋を用い、７００ｇで６０分間遠心分離することにより
２回洗浄した。

沈降物をトリスＭ街液中に再度懸濁した。

この処理をした被覆金ゾルの免疫学的活性を、計測ステ
ィック（Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ　５ｔｉｃｋ）（Ｃｈｅｆ
ａｒ。

Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用してテストした。

このために、抱合体（光学濃度＝　８．３３）０．３ｍ
ｆを、１１当たりそれぞれ０．５０及び１，０００１ｉ
際単位（１，Ｕ、）ノｈＣＧを含有する尿０．２ｍｊ！
と混合した。モノクローナルａ−ｈＣＧ（１４７Ｂ）で
被覆したスティックを金ゾル／尿混合物中に置き、室温
で３０分間インキュベートした。

次いでスティックを水で洗浄し、色を読み取った。

この結果を下記の表１に示す。

及ユ はスティック上に着色が見られなかったことを示す。

＋はスティック上に赤〜桃色の着色があったことを示す
。

１ホウ酸　街液組成： 溶液＾：０．２Ｍホウ酸＋０．２Ｍ塩化カリウム溶液Ｂ
・０．２Ｍ炭酸ナトリウム 溶液へを溶液Ｂを加えることによりｐＨ＝　９．０にし
た。

ａ−ｈＣＧ緩ｆＦｒ溶液：ａ−ｈＣＧ　１容量部（９，
９Ｂ／ｍｌ）及び０．２Ｍホウ酸緩衝液８．４容量部 Ｉ　Ｉス　・ ０．２５Ｍ　）リス（２−アミノ−２−（ヒドロキシメ
チル）１．３−プロパンジオール） ０．２５Ｍ塩化ナトリウム ウシ血清アルブミン１．２９ｇ／ｌ チオメルサール０．０２５ｇ＃ 濃塩酸を加えることによりｐＨ＝８にした。

２．３・　々の金　　　　の　　ポリマーシェルの造 モノマー溶液の組成を除き実施例２．１に記載したのと
同じ方法を選択し、金粒子を被覆した。モノマー溶液の
組成は、 メタクリル酸グリシジル　　　　　１．７０゜ビニルス
ルホン酸ナトリウム　　　０．８５ｇＮ−メチレンビス
アクリルアミド　　０．８５ｇ蒸留水　　　　　　　　
　　　　　５０ｍ１メタノール　　　　　　　　　　　
５０社とした。

このように得られたゾル２００ｍ１を蒸留水６．ＯＯＯ
ｍｆを用いて精密濾過し、特性化した。透過電子顕微鏡
を使用し、ポリマーシェルの厚さが２５ｎＩ１１余りで
あることを推定し、準弾性光散乱がら、シェルの厚さが
４０ｎｓであることが誘導された。これは、ポリマーシ
ェルが水中で膨潤したことを示す。大部分の粒子（９５
％以上）は、単一の金核がポリマーシェルに包囲されて
できていた。

精密濾過した被覆金ゾルは、６０時間経過しても０．４
Ｍ塩化ナトリウム溶液中で凝集しなかった。

著しく高い濃度の塩化すＩ・リウムにおいては凝集が起
こったが、非被覆金ゾルの凝集を特徴付ける色の変化は
もはや起こらなかった。その代わりに赤〜桃色の魂が検
出された。金シードゾルを対応する容積の水と置き換え
ると、モノマーの重合により粒径１２０ｎｍ余りの安定
なラテックスが得られた。

３．１２二」］ρに１童 Ｐａ　ｌａｎ　ｉ　ｌ濃赤（分散染料スラリーＢＡＳＦ
　７）６４０６０番）５０ｇを蒸留水１，０００ｍ１中
に入れ室温で４５分撹拌した。この染料ゾルを蒸留水で
６回続けて洗浄して精製した。最初の５回の洗浄ステッ
プは加速度２．０００ｇで３０分間遠心分離し、次いで
蒸留水中に再度分散することにより実施し、最後のステ
ップは加速度１２５ｇで６０分間遠心分離した。この精
製方法は、過剰な・界面活性剤を除去するのに有効であ
る。

更にいくらか分別が起こる。１１当たりの染料の固体含
有量４．８ｇで測定すると、粗ゾルは表面張力４３．５
ダイン／ｃｍを有し、精製ゾルは表面張カフ１．１ダイ
ン／ｃｍを有した。

３．２１ 洗浄及び希釈した染料ゾル（０，１４５％）１２５ｍｔ
’を７０℃にまで暖め、反応器内で撹拌しく２００回転
／分）、次いで重炭酸ナトリウム０．１０ｇ及び過硫酸
カリウム０．１ｈの水溶液１２．５ｍ１を加えた。次い
で、組成：メタクリル酸グリシジル　　　　　２ｇビニ
ルスルホン酸ナトリウム　　　１ｇＮ−メチレンビスア
クリルアミド　　ｏ、ｓｌＦ蒸留水　　　　　　　　　
　　　　５０ｍ１メタノール　　　　　　　　　　　５
０ｎ＋／のモノマー溶液１２．５ｍｌを１時間かけて蛎
動ポンプで計量しながら加えた； 複合ゾルを１６時間冷却し、１００ｍ１を蒸留水２，５
００ｍ１を用いて精密濾過により精製した。被覆ゾルの
直径は当初のゾルより８６ｎｎ大き（，３１６ｎｍであ
つた。密度１．２３９７ｍ１のグルコース／水溶液５冫
量％中で複合ゾルを遠心分離すると、チューブの底に赤
色粒子が沈降した。上澄み液の頂部に別のポリマー粒子
は検出されなかった．「沈降フィールドフロー分別（ｓ
ｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｆｉｅｌｄ　ｆｌｏｗｆｒ
ａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）　Ｊ実験を行なっても別のポ
リマー粒子は検出されなかった。

タンパク質吸着における表面変性の効果は充分であった
：２つの４ｍｌ試験管にそれぞれ非被覆の精製ゾルｌｌ
１ｌ＆及び被覆した精製ゾル１ｍｌを入れた。

各試験管はそれぞれ０．０５ｈの染料を含有した。こ本
） れらの試験管に、ｐＨ＝７．４のリン酸［漬液　１，７
５１と、ウシ血清アルブミン（Ｒタイプ、Ｏｒ［Ｉａｎ
ｏｎＴｅｋｎｉｋａ）２．６７ｍｙ／ｍ１を含有する溶
液０．７５ｍ１とを順次加えた。

上記試験管を室温で２時間振盪し、次いで遠心分離した
．上澄み液のウシ血清アルブミン含有量を）ＩＰｓＥｃ
（高性能サイズ排除クロマトグラフィー）によって測定
しな。非被覆の精製ゾルには０．２８Ｂ／　ｍ　１のタ
ンパク質が吸着していたが、被覆ゾルにはタンパク質の
吸着は検出されなかった。

＊）リン酸緩衝液の組成： 溶液＾ニリン酸二水素カリウム９。０７７２ｇを水１１
中に溶解した溶液 溶液Ｂニリン酸水素二ナトリウム１１．８５８６ｇを水
１！に溶解した溶液 溶液６５部及び溶液８　２４部の混合物３、３．１．　
　ルーヒト　の 実施例３．２で製造した精密濾過した封入染料ゾルと、
ポリマー被覆の層の厚さが異なる他の試料とに実施例２
．２に記載したようにアルデヒド基を付与した。

３．３，２．　ａ−ｈｃＧ　２９３＾のアル−ヒト基を
　するａ−ｈＣＧのアルデヒド官能基を有するゾルへの
結合を実施例２．２に記載したように実施した。

３．４イムノアツセイ このように製造した（ａ−ｈＣＧ）−染料ゾル抱合体の
免疫学的活性を、実施例２．２と同様に、ｈＣＧに対す
るサンドイッチイムノアッセイ、即ちａ−ｈＣＧ（１４
７Ｂ）被覆デイツプスティック（計測スティック；Ｃｈ
ｅｆａｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、ｈＧＣ
含有尿及び抱合体の混合物中で室温にてインキュベート
することにより（＾・１ｃｍ１５８０＝　８．３）テス
トした１次いでこのスティックを水で濯ぎ、色を読み取
った。この結果を下記の表■に示す。

塞ＪＬＬ４ユ 覆 金シードゾル（０，０３２重量％、このシードゾルの製
造は実施例１を参照のこと）８００ｍｉ’を還流冷却器
及び撹拌器を備えたサーモスタット制御反応器内で７０
℃にまで暖めた。過硫酸カリウム０．３２ｇ及び炭酸ナ
トリウム０．３２．を蒸留水５０ｍ１に溶解した溶液１
０ｍＺを滴下し、組成： 酢酸ビニル　　　　　　　　　　　１２゜マレイン酸ジ
エチル　　　　　　　４ｇジエチル酒石酸ジアミド　　
　　　　３ｇ水　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　５０ｍ１メタノール　　　　　　　　　　　５
０ｍ１のモノマー溶液１０社を１時間かけて滴下して加
えた。

モノマーを加えている間に残りの開始剤／緩衝液溶液を
加えた。モノマー添加の２４時間後、反応器を室温まで
冷却し、ゾルを、もとのゾルの容積の２５倍の容積の水
で精密−過することにより精製した８粒子の周りにポリ
マーシェルは検量されず、コロイド安定性は「非被覆」
シードゾルのものと同程度に低かった。シードゾルに代
えて水を使用し、重合過程を繰り返しても不溶性ポリマ
ーは得られず、溶液は透明なままであった。しかしなが
ら、上記モノマー溶液を１０ｍ１ではなくて８０ｍ１を
１時間かけて加えることにより重合過程を実施すると、
シードゾルがなくとも粒径１５２ｎｍのラテックスが得
られた。金粒子が存在すると、厚さ２７社ｍのポリマー
シェルが金粒子の周りに形成された。コロイド安定性は
シードゾルのそれよりも著しく大きかった。

０．０３２重量％のシードゾル（製造については実施例
１を参照）１００ｍｌを窒素でガスシールして７０℃に
まで暖めた。このゾルに、過硫酸カリウム０．１ｇ及び
重炭酸ナトリウム０．１ｇの溶液５ｍｌを滴下して加え
た０次いで組成： スチレン　　　　　　　　　　　　５ｇアクリルアミド
　　　　　　　　　　１ｇメタノール　　　　　　　　
　　　８０削ｌのモノマー溶液２．２ｍｊ＋を螺動ポン
プによって加えた。

２４時間撹拌しながら７０℃に暖めた後、反応器を室温
に冷却した。金ゾルを２５倍の容積の水を用いて精密沢
過した。精製ゾルは、２４時間放置した後に０．１０Ｍ
塩化ナトリウム中で安定であることが立証された。第２
世代のポリマー粒子は形成されなかった。上記条件下で
、スチレンモノマーは反混合物中に完全に溶解した。

金ゾルを使用せずその代わり水を使用してこの重合を行
った場合には、粒径１２０ｎｍの安定なコロイドラテッ
クスが形成された。

しかしながら、組成 スチレン　　　　　　　　　　　　ｌｈアクリルアミド
　　　　　　　　　　２ｇメタノール　　　　　　　　
　　　８０ｎ＋１のモノマー溶液３．４ｍｌを加えるこ
とにより、より高い濃度のモノマー溶液を使用すると、
新たな世代のポリマーが生成された。このより高い濃度
のモノマーでは、スチレンモノマーはもはや混合物に溶
解しなかった。更に、このように処理した金粒子は塩に
耐え得ないことが立証され、精製後、ゾルは出発ゾル（
シードゾル）と同じ濃度の０．０４ＭＮａＣ１で早くも
凝集した。以上から、この場合には粒子のポリマー被覆
が生じなかったという結論になる。金粒子とは反対に、
新たに形成されたポリマー粒子は、０．１Ｍよりも高い
濃度の塩化ナトリウムに耐えることができる。

火１月玉 ８．１　　　　　４１５７３２３”　　　　　　３に仮
ｆｆｌ勿 メタクリル酸ヒドロキシエチル　　１．８ｇトメチレン
ビスアクリルアミド　　０．３ｇアクリルアミド　　　
　　　　　　０．６゜メタクリル酸　　　　　　　　　
　０．３゜を二重壁反応器内で脱イオン水（Ｍｉｌｌｉ
−Ｑ）９０ｍＮに溶解した。

この溶液を７０℃にまで暖め、２００回転／分で撹拌し
た１次いで、過硫酸カリウム０．１．及び重炭酸ナトリ
ウム０．１ｇを水ＬＯｍ＆に溶解した溶液を加えた。

３〜５分後、白色の大きな塊が形成された。これは非コ
ロイド状ポリマーの形成を意味する。

メタクリル酸しドロキシエチル　　　０．６４ｇメタク
リル酸メチル　　　　　　　　０．７０゜メタクリル酸
　　　　　　　　　　　ｏ、ｅ４．。

ジメタクリル酸エチレングリコール　０．２２４ｇを二
重壁反応器内で脱イオン水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）９０ｍｌ
に溶解した。

反応温度は室温とした。この混合物に、過硫酸カリウム
０．０８ｇ及び重亜硫酸ナトリウム０．０４９を水１０
ｍ１に溶解した溶液を加えた。

１５分後、不安定なラテックス（凝集ポリマー）が検出
された。

【図面の簡単な説明】

第１図は１つの粒子に種々の核粒子が埋め込まれた従来
技術の懸濁液の粒子を示す図、第２図は核が相互に密集
して埋め込まれている従来技術の懸濁液の粒子の図、第
３図は核がコポリマーによって相互に分離している従来
技術の懸濁液の粒子の図、第４図はそれぞれの核が個々
のコポリマーシェルを有する本発明の懸濁液の粒子の図
である。 図面の浄書（内容に変更なし） 第１ 図 第２図 第３ 図 第４図 ■ ■ ■ ■ 手続補正臼

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）官能基を含む親水性コポリマーに包囲された非ポ
   リマー核を含有する診断テスト用水性懸濁液であって、
   前記非ポリマー核がそれぞれ個々のコポリマーシェルに
   よって別々に包囲されていることを特徴とする水性懸濁
   液。
2. （２）免疫診断テスト用である請求項１に記載の水性懸
   濁液。
3. （３）前記核が金属、金属酸化物、金属化合物、無機化
   合物、有機染料、有機顔料または、合成油、動物油、植
   物油もしくは鉱油のエマルジョン小滴で構成されている
   ことを特徴とする請求項１または２に記載の水性懸濁液
   。
4. （４）前記核が金ゾルまたは染料ゾルで構成されている
   ことを特徴とする請求項３に記載の水性懸濁液。
5. （５）水に溶解したモノマーの混合物を非ポリマー粒子
   の存在下にその場共重合することによる、診断または免
   疫診断テスト用水性懸濁液の製造方法であって、前記モ
   ノマー混合物が、 加水分解せずともまたは加水分解後に少なくとも１つの
   共有結合官能基を含むエチレン性不飽和モノマー、 疎水性モノマー、 架橋モノマー、 といったタイプのモノマーを含有しており、請求項１ま
   たは２に記載の懸濁液が、出発材料として非ポリマー粒
   子の安定なコロイド分散液を使用し、これに前記モノマ
   ー混合物を加えて製造され、このモノマー混合物が、得
   られるコポリマーがもとの分散液の電荷と同一の符号の
   電荷を有するように選択されることを特徴とする方法。
6. （６）前記使用される疎水性モノマーが、親水性基に加
   水分解可能な基を含有するモノマーであり、重合後にこ
   れら加水分解可能な基を加水分解することを特徴とする
   請求項５に記載の方法。
7. （７）前記モノマー混合物が、 メタクリル酸グリシジル２〜９８重量％、 ビニルスルホン酸ナトリウム０〜９６重量％、及びＮ，
   Ｎ−メチレンビスアクリルアミド２〜４０重量％で構成
   されていることを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. （８）請求項１に記載の親水性コポリマーによって包囲
   されている非ポリマー核を含有し、前記コポリマーに反
   応物質が付与されている試薬。
9. （９）請求項２に記載の親水性コポリマーによって包囲
   されている非ポリマー核を含有し、前記コポリマーに免
   疫化学的活性物質が付与されている免疫化学試薬。
10. （１０）テスト流体中の特異的結合物質を検出する方法
    であって、請求項８に記載の少なくとも１種の試薬を使
    用し、前記特異的結合物質が、前記試薬中に存在する反
    応物質に対する結合親和力を有することを特徴とする方
    法。
11. （１１）テスト流体中の免疫化学的活性成分を検出する
    方法であって、請求項９に記載の少なくとも１種の免疫
    化学試薬を使用し、前記免疫化学活性成分が、前記免疫
    化学試薬中に存在する免疫化学的活性物質に対する結合
    親和性力を有することを特徴とする方法。
12. （１２）請求項８に記載の試薬を少なくとも１種含む診
    断テストに使用されるテストキット。
13. （１３）請求項９に記載の免疫化学試薬を少なくとも１
    種含むイムノアッセイに使用されるテストキット。